Liliana Francois Martín del Campo DKFZ (Centro Alemán de Investigación en Cancer), Universidad de Heidelberg Dr. Bernhard Radlwimmer Doctorado en Biología [email protected] biosensores, FRET, cancer, metabolismo

Desarrollo de biosensores FRET para la caracterización del metabolismo tumoral

Introducción Para mantener el crecimiento y división celular activa, las células cancerígenas alteran su metabolismo. Normalmente, las células que forman nuestros órganos y tejidos, tienen un metabolismo basado en la respiración aeróbica mitocondrial. Los tumores, sin embargo, obtienen energía a partir de la glucólisis anaeróbica, y además, reprograman otras vías metabólicas para generar biomasa y sustentar el rápido crecimiento y la división celular (Vander Heiden, Cantley, and Thompson). Novedosos estudios buscan desarrollar estrategias de tratamiento de cáncer que reviertan dicha reprogramación metabólica (Galluzzi et al.). Para poder entender con mayor precisión el metabolismo en las células cancerígenas, es necesario desarrollar técnicas que permitan medir y monitorear metabolitos con resolución subcelular. En las últimas décadas ha habido un creciente desarrollo de biosensores basados en Transmisión de Energía de Resonancia (FRET) que han permitido revelar a nivel subcelular, cambios en metabolitos y entender con mayor detalle el metabolismo celular (Aoki et al.; Hou et al.). La FRET es el proceso mediante el cual, una molécula fluorescente excitada (donante) trasfiere la energía emitida a una molécula aceptora. La eficiencia de la FRET depende, entre otros factores, de la distancia entre las dos moléculas. La ventaja que proporcionan los sensores basados en FRET es la posibilidad de medir cambios en células individuales, lo cual no es posible con métodos estándares que requieren grandes cantidades de células (Deuschle et al.). Ya que los tumores son una masa heterogénea de células que se comportan de manera diferente, el empleo de sensores FRET ofrecen una oportunidad para entender con más detalle el metabolismo del cáncer y así lograr diseñar estrategias de tratamiento más efectivas.

Problemática Dentro de los tumores del sistema nervioso central, el Glioblastoma Multiforme (grado IV), es el más frecuente y agresivo. Hasta la fecha no existe un tratamiento efectivo contra este tipo de cáncer. Los pacientes diagnosticados con glioblastoma, presentan un pronóstico muy desfavorable con una esperanza media de vida menor a un año (Parker et al.). Recientemente, se descubrió en nuestro grupo que en el subtipo de glioblastoma más agresivo, la enzima Transaminasa de Aminoácidos de Cadena Ramificada (BCAT1, por sus siglas en inglés) se encuentra altamente expresada con respecto a otros subtipos de gliomas y al tejido normal cerebral (Tönjes et al.). BCAT1 es importante para el metabolismo de aminoácidos de cadena ramificada: leucina, isoleucina y valina. BCAT1 cataboliza la trasferencia de la cadena ramificada al α-cetoglutarato (αKG) para producir glutamato y cetoácidos de cadena ramificada (BCKA) lo cuáles pueden ser metabolizados en Acetil-CoA o succinil-CoA para ingresar al ciclo de Krebs y producir ATP y precursores de macromoléculas. Estudios preliminares, sugieren que los niveles de αKG disminuyen debido a la alta actividad de BCAT1, lo cual podría estar relacionado con la alta proliferación y agresividad de estos tumores. Este estudio pretende entender de que manera la expresión y actividad incrementada de BCAT1 afecta los niveles de αKG y el metabolismo celular en los tumores cerebrales. Como herramienta de investigación, se desarrollará un sensor FRET que permita detectar y medir cambios en los niveles intracelulares de αKG en vivo. Se modulará la expresión y la activad de la BCAT1 mediante RNA de interferencia (shRNA) y/o inhibidores farmacéuticos y se medirán los niveles de αKG y otros metabolitos mediante biosensores FRET. La importancia de este proyecto en el desarrollo tecnológico, es que por medio de este novedoso sensor, se podrá entender más sobre el metabolismo del cáncer. Además, el αKG es un metabolito intermediario del ciclo de Krebs que interviene en múltiples procesos celulares en plantas, bacterias y animales por lo que el sensor podría tener aplicaciones en otras áreas de investigación..

Hipótesis La alta expresión y actividad de la enzima BCAT1 provoca alteraciones metabólicas resultando en una disminución intracelular de αKG, lo cual favorece el desarrollo y progresión de tumores cerebrales. Los cambios en los niveles de αKG asociados a la expresión de BCAT1 podrán ser observados en vivo con el empleo de biosensores FRET.

Metodología Cultivo celular Para los estudios de caracterización del sensor se usó como modelo de glioblastoma la línea celular U87. Para estudiar los efectos de BCAT1 en los niveles de αKG, se empleará un sistema inducible (pLKO-Tet-On) que inhibe la expresión de BCAT1 por medio de shRNA. Clonación del sensor FRET de αKG El sensor FRET es una proteína recombinante formada por la unión de la proteína Pii a dos proteíans fluorescentes: mCerulean (proteína fluorescente cian, CFP) y Venus (proteína fluorescente amarilla, YFP), las cuáles son ampliamente usadas como pares FRET. La proteína recombinante se diseñó en el laboratorio del Dr. Forchhammer de la Universidad de Tübingen (Alemania) donde también se realizaron los estudios in vitro de sensibilidad y selectividad del sensor a aKG. Para poder monitorear los cambios intracelulares de αKG en células humanas, la secuencia codificante del sensor FRET se insertó en el vector de expresión pcDNA3.1(-). Las células que incorporaron el plásmido y por lo tanto expresan el sensor, se seleccionaron con Neomicina por dos semanas. Microscopía confocal Para los estudios en células vivas en tiempo real, los cambios en FRET se visualizaron en un microscopio confocal láser de barrido Leica TCS-SP5, con un lente Plan Apocromático de inmersión en aceite con magnificación 40x. Para minimizar el fotodaño, se activó el escáner de resonancia y para reducir el ruido se usaron detectores híbridos. Para la excitación se usó un láser UV (405 nm) y las señales emitidas de detectaron la las longitudes de onda de correspondientes al espectro del CFP y YFP. El escaneo se realizó de manera secuencial para evitar el cruce de señal. Las imágenes adquiridas se procesaron en ImageJ (FIJI).

Resultados Caracterización del sensor FRET a) Estudios in vitro El sensor FRET de αKG se diseñó y desarrolló en el laboratorio del Dr. Forchhammer en Tübingen. Así mismo, la caracterización de las propiedades de sensibilidad y selectividad al αKG y a otros

metabolitos se realizaron con la proteína purificada en dicho laboratorio. De ellos, obtuvimos dos variantes del sensor con diferentes rangos de sensibilidad: una variante que mayor sensibilidad, permitiendo detectar concentraciones de 0.1 a 100 µM, y una menos sensible permitiendo la detección de 1 a 1000 µM de αKG (Figura 1A). La parte del sensor que detecta el αKG es la proteina Pii de bacterias (Synechococcus elongatus). Cuando esta proteína se une al αKG cambia su conformación. Para crear la proteína recombinante que funciona como sensor FRET, se unió a sus extremos dos proteínas fluorescentes, por lo tanto, el de conformación afecta la cercanía de las dos proteínas. En presencia de altas concentraciones de αKG, la distancia entre las dos proteínas es mayor y por lo tanto la transferencia de energía de una molécula fluorescente a otra es menor. El proceso de FRET es frecuentemente medido como el radio resultante de dividir la intensidad emitida por la molécula aceptora (en este caso YFP) entre la intensidad emitida por la molécula donante (CFP), radio FRET=YFP/CFP. El sensor presenta una selectividad al αKG de al menos 500 veces mayor que as otros metabolitos (Figura 1B), concentraciones suprafisiológicas. Hasta ahora, este sensor sólo había sido usado para aplicaciones in vitro, en condiciones aisladas. Estos resultados muestran que el sensor responde a cambios de concentraciones de αKG con cierta selectividad.

A

B

Figure 1. Sensibilidad y selectividad del sensor de αKG (Jan Lüddecke, comunicación directa)

b) Estudios in vivo

Para poder medir y visualizar cambios en los niveles de αKG con el sensor FRET, es necesario primero determinar el comportamiento FRET del sensor en un sistema in vivo. Primero, se realizó un escaneo en Lamba, el cual mide la intensidad de fluorescencia emitida a través de todo el espectro de

longitud de onda. Las células expresando el sensor se incubaron en medio conteniendo o no dimetil αcetoglutarato (dm-αKG), una versión del αKG permeable a la membrana celular, y por medio de el escaneo en lambda se determinaron los mayores picos de emisión correspondientes a las proteínas CFP y YFP al excitar a 405 nm. La señal obtenida de la YFP en realidad corresponde al proceso de FRET, es decir que la energía emitida de la CFP se transfiere a la YFP. La figura 2A representa el espectro de emisión obtenido bajo condiciones en presencia o ausencia de 10 mM de dm-αKG. En presencia de dm-αKG, se observó una disminución de la intensidad de la YFP y aumento de la señal de CFP, resultando en una reducción de 15% en el radio FRET a comparación de la condición control.

Figure 2. Escaneo en lamba. Cambios en FRET en células U87 incubadas en presencia o ausencia de 10 mM de αKG. Se observó un cambio en el radio FRET de 15% en presencia de αKG.

El siguiente paso consistió en determinar, en lapsos de tiempo, los cambios en FRET en respuesta a diferentes concentraciones de dm-αKG. Para esto, se registró cada 40 segundos la fluorescencia emitida antes y después de agregar 0, 5, 10 o 20 mM de dm-αKG (Figura 3A). Es observó un decremento drástico en el radio FRET después de la adición del metabolito en el medio (fleche roja). Lo cuál sugiere que el metabolito es rápidamente internalizado y metabolizado en las células. Así mismo, se puede ver que la magnitud del cambio en FRET es dependiente de las concentraciones añadidas, sin embargo, es posible que concentraciones mayores a 10 mM saturan al sensor y por lo tanto no pueden ser determinadas por medio de este sensor. El objetivo final de este proyecto es poder usar el sensor FRET como herramienta para observar cambios en metabolitos como resultado del metabolismo celular. Para este fin, se agregó en el medio citrato, un metabolito precursor de αKG. El citrato es transportado al interior de las células y convertido en αKG en el ciclo de Krebs (Figura 3C). Después de añadir 5 o 10 mM de citrato, se observó una disminución del radio FRET, lo cual indica que, como previsto, el citrato fue metabolizado

por las células para producir αKG. Estos resultados muestran que el sensor puede ser usado para indicar cambios dinámicos en los niveles de αKG en células tumorales en cultivo. A

B

C

Figure 3. Microscopía de lapso de tiempo.

Discusión y conclusión Este es el primer estudio que emplea sensores FRET para medir concentraciones de αKG en células tumorales. Los resultados preliminares reportados aquí muestran que este sensor responde a cambios intracelulares resultantes de la adición de metabolitos en el medio. Es necesario evaluar si es posible detectar cambios en los niveles intracelulares menos drásticos. Nuestro interés final, es emplear el sensor FRET como herramienta para entender mas sobre en rol de la encima BCAT1 en la regulación de los niveles de αKG. Para esto, mediremos los cambios en FRET resultantes de la inhibición de la expresión y actividad de BCAT1. Es posible que los cambios no sean suficientemente grandes para ser detectados y visualizados por medio de este sensor. Dentro de

nuestros planes a futuro es mejorar el rango de cambio de FRET, lo que nos permitirá tener mejores resultados en aplicaciones de modelos in vivo, no solo de experimentos en cultivo celular, sino también en modelos animales. Otras aplicaciones que hemos contemplado es dirigir la expresión del sensor a organelos de interés. Esto nos permitirá revelar la distribución subcelular y si existe compartamentalizacion de αKG, por ejemplo en la mitocondria. Podremos estudiar así si la distribución deferencial de αKG en los organelos juga un papel importante en el metabolismo celular y si alteraciones en los niveles normales están relacionados con el desarrollo y progresión del cáncer.

Bibliografía Aoki, Kazuhiro et al. “Stable Expression of FRET Biosensors: A New Light in Cancer Research.” Cancer Science 103.4 (2012): 614–619. Web. 10 Sept. 2015. Deuschle, Karen et al. “Genetically Encoded Sensors for Metabolites.” Cytometry Part A 2005. Web. Galluzzi, Lorenzo et al. “Metabolic Targets for Cancer Therapy.” Nature reviews. Drug discovery 12.11 (2013): 829–46. Web. Hou, Bi-Huei et al. “Optical Sensors for Monitoring Dynamic Changes of Intracellular Metabolite Levels in Mammalian Cells.” Nature protocols 6.11 (2011): 1818–33. Web. 23 Sept. 2015. Parker, Nicole Renee et al. “Molecular Heterogeneity in Glioblastoma: Potential Clinical Implications.” Frontiers in Oncology (2015): n. pag. Web. Tönjes, Martje et al. “BCAT1 Promotes Cell Proliferation through Amino Acid Catabolism in Gliomas Carrying Wild-Type IDH1.” Nature Medicine 19.7 (2013): 0–1. Web. Vander Heiden, Matthew G, Lewis C Cantley, and Craig B Thompson. “Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation.” Science (New York, N.Y.) (2009): n. pag. Web.