HERENCIA DE LA RESISTENCIA GENÉTICA A Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. EN FRIJOL INHERITANCE OF GENETIC RESISTANCE TO Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. IN COMMON BEAN Netzahualcóyotl Mayek-Pérez1 , Cándido López-Castañeda2 , Ernesto López-Salinas3 y Jorge A. Acosta-Gallegos3 1

Departamento de Química, Universidad Autónoma de Aguascalientes. Universidad 940, Aguascalientes, México. 20100. Fax (49) 108401. ([email protected]). 2 Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas. Montecillo, Texcoco, México. Carretera México-Texcoco km. 35.5. 56230. 3 Programa de Frijol. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). SAGAR. Apartado Postal Núm. 10, Chapingo, México. 56230.

RESUMEN

ABSTRACT

Se realizaron estudios para determinar el tipo de herencia de la resistencia genética a M. phaseolina (Tassi) Goid. en genotipos resistentes (BAT 477 y TLP 19) y susceptibles (Pinto UI-114 y Río Tibagi) de frijol. El trabajo se hizo en condiciones de campo en Cotaxtla, Veracruz y en invernadero en Montecillo, Estado de México e incluyó a los progenitores, las generaciones F1 y F2 y los retrocruzamientos F1 -progenitor. Se evaluó la reacción de las líneas F3 a un aislamiento altamente patogénico de M. phaseolina en invernadero. Los resultados indicaron que la resistencia a M. phaseolina en frijol está gobernada por dos pares de genes con efectos complementarios y que la resistencia a la pudrición carbonosa parece estar controlada en forma cuantitativa con efectos mayores de dos pares de genes. Esto se debió a que la información en poblaciones F2 mostró distribuciones cuasi-normales en algunos casos y en F3 se ajustó a distribuciones normales en las frecuencias de reacción a la pudrición carbonosa, pero se ajustó a una segregación de resistencia determinada por dos pares de genes con efectos epistáticos variables, dependiendo de los genotipos utilizados en las cruzas. Se confirmó que BAT 477 posee resistencia a M. phaseolina controlada por dos genes dominantes complementarios (epistasis doble recesiva), similar a la exhibida por TLP 19, el otro genotipo resistente al patógeno.

Studies to determine genetic resistance inheritance to M. phaseolina (Tassi) Goid. on resistant (BAT 477 and TLP 19) and susceptible (Pinto UI-114 and Rio Tibagi) common bean cultivars were carried out. Experiments were conducted under field conditions at Cotaxtla, Veracruz and in greenhouse at Montecillo, Estado de México. Parents, F1 and F2 generations and F1 -parent backcrosses were included in the studies. Reaction of F3 lines to a highly virulent isolate of M. phaseolina was evaluated under greenhouse conditions. Results indicated that resistance to M. phaseolina in common bean is controlled by two pairs of epistatic genes with complementary effects, and that resistance to charcoal rot could be quantitatively controlled by major effects of two genes. This was suggested by data in F2 populations that showed normal-like distributions in some cases, and in F3 it was adjusted to normal distributions on their frequency of reaction to charcoal rot; suggesting resistance segregations determined by two epistatic genes with variable effects, depending on the genotype used as parent. It was confirmed that BAT 477 is resistant to M. phaseolina, and that resistance is controlled by two complementary dominant genes (double recessive epistasis), akin to the exhibited by TLP 19, the other resistant genotype.

Palabras clave: Phaseolus vulgaris L., genética de la resistencia, pudrición carbonosa.

INTRODUCTION

Key words: Phaseolus vulgaris L., genetic resistance, charcoal rot.

D

evelopment of bean resistant germplasm to diseases is one of the best alternatives to obtain new cultivars for dryland areas with high incidence of charcoal rot [Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid.] in México as well as in other growing regions around the world (Songa et al., 1997). A limitation to produce resistant germplasm to M. phaseolina has been the characterization and determination of the basis of inheritance involved on resistance to this pathogen. It has been difficult due to traditional procedures of inoculation and the effects of several climate factors during development of the disease at host which have masked the plant response to the pathogen. This situation has

INTRODUCCIÓN

E

l desarrollo de germoplasma de frijol resistente a enfermedades es una de las mejores opciones para la obtención de nuevos cultivares para áreas de secano con problemas de pudrición carbonosa [Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid.] en México y otras regiones productoras en el mundo (Songa et al., 1997). Una limitación para obtener germoplasma resistente a M. Recibido: Enero, 2001. Aprobado: Diciembre, 2001. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 35: 637-648. 2001. 637

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AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 6, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2001

phaseolina ha sido la falta de caracterización y determinación del tipo de herencia involucrada en la resistencia a este fitopatógeno. Esto ha sido difícil debido a que los procedimientos tradicionales de inoculación utilizados, así como el efecto de diversos factores ambientales durante el desarrollo de la enfermedad en el hospedante, han enmascarado la respuesta de la planta al patógeno; situación que ha conducido a errores en la caracterización de germoplasma segregante (Olaya et al., 1996). Estudios sobre la reacción de germoplasma de Phaseolus a M. phaseolina (Pastor-Corrales y Abawi, 1988; Mayek-Pérez et al., 1996) han permitido la identificación de genotipos resistentes a la pudrición carbonosa. Sin embargo, aún se desconoce la base genética de la resistencia al hongo en cultivares promisorios que pudieran utilizarse como fuentes de resistencia genética. Olaya et al. (1996) encontraron, en condiciones controladas de evaluación, que la resistencia a M. phaseolina en la línea BAT 477 es gobernada por un par de genes dominantes con efectos complementarios. Miklas y Beaver (1994) determinaron que la resistencia de campo a M. phaseolina es de naturaleza poligénica. Se ha identificado un número variable de loci de caracteres cuantitativos (LCC) asociados con la resistencia a la pudrición carbonosa, en campo, en familias derivadas de la cruza XAN-176 (resistente) x Dorado (susceptible) los cuales a su vez explicaron entre 12 y 19 % de la variación fenotípica para la resistencia a M. phaseolina observada en la cruza (Miklas et al., 1998). La caracterización de la base genética de la resistencia a M. phaseolina en germoplasma de frijol puede contribuir a facilitar el diseño de estrategias de mejoramiento genético más efectivas para la incorporación de la resistencia genética a M. phaseolina en materiales comerciales susceptibles, ampliamente cultivados en México. Esta investigación se realizó con la hipótesis de que la resistencia genética a M. phaseolina está gobernada de una manera simple (máximo dos pares de genes) y es dominante. El objetivo fue identificar fuentes de resistencia al patógeno y caracterizar la base genética de su herencia en condiciones de invernadero y campo, con el propósito de diseñar estrategias de mejoramiento genético más adecuadas para incorporar dicha resistencia a cultivares comerciales susceptibles de frijol.

MATERIALES

Y

MÉTODOS

Se desarrollaron tipos segregantes, con genotipos contrastantes en su reacción a M. phaseolina, realizando cruzamientos entre las líneas de frijol BAT 477 y TLP 19 (resistentes) y los genotipos susceptibles Pinto UI-114 y Rio Tibagí, para determinar la herencia de la resistencia a la pudrición carbonosa (Pastor-Corrales y Abawi, 1988; Mayek-Pérez et al., 1996) (Cuadro 1). En 1996 y 1997 se obtuvo semilla de seis líneas F1 y sus generaciones F2 y F3 , resultantes de la cruza directa entre todos los genotipos, además de las retrocruzas de

conducted to errors on the characterization of segregant germplasm (Olaya et al., 1996). Studies on the reaction to M. phaseolina in Phaseolus germplasm (Pastor-Corrales y Abawi, 1988; Mayek-Pérez et al., 1996) have allowed the identification of charcoal rot resistant genotypes. However, genetic basis of resistance to the fungus in promissory germplasm that could be useful as genetic resistance sources remains unknown. Olaya et al. (1996) found that under controlled conditions, resistance of BAT 477 to M. phaseolina was governed by a couple of dominant genes with complementary effects. Miklas and Beaver (1994) determined that field resistance to M. phaseolina was polygenic. A variable number of quantitative trait loci (QTL) associated to charcoal rot resistance under field conditions have been detected in families derived from XAN-176 (resistant) x Dorado (susceptible); these QTL explained 12 to 19% of the phenotypic variation of M. phaseolina resistance (Miklas et al., 1998). The characterization of genetic basis of M. phaseolina resistance in bean germplasm could contribute to make more effective the design of genetic improvement strategies to incorporate M. phaseolina genetic resistance to commercial susceptible cultivars broadly cultivated in México. This research was carried out under the hypothesis that M. phaseolina genetic resistance is governed in a simple way (a maximun of two pairs of genes) and it is dominant. The objective was to identify sources of resistance and to characterize the genetic basis of inheritance under greenhouse and field conditions, in order to design genetic improvement strategies more suitable to incorporate such resistance to bean commercial susceptible cultivars.

MATERIALS

AND

METHODS

Segregant types were developed by using contrasting genotypes for their reaction to M. phaseolina. Crosses among bean lines BAT 477 and TLP 19 (resistant) and susceptible genotypes Pinto UI-114 and Rio Tibagí were carried out in order to determine the inheritance of resistance to charcoal rot (Pastor-Corrales and Abawi, 1988; MayekPérez et al., 1996) (Table 1). In 1996 and 1997, seed from the six F1 lines and their F2 and F3 generations were produced from direct crosses among all genotypes, and the backcrosses of each F1 and their respective parent. Crosses were done in greenhouse at Montecillo (19o 29’ N, 98o 53’ W, 2250 m) and Chapingo, Estado de México (19o 27’ N, 98 o 51’ W, 2240 m). A portion of F1 seeds obtained from crosses was sown in 1997 under greenhouse conditions at Montecillo to produce seeds of F2 and F3 lines. Discrimination between selfpollination and hybridizations included morphological markers as seed color coat and seedling hypocotyl color. Experiments that included the four parents and F1 and F2 generations were established under field conditions at Cotaxtla,

MAYEK-PÉREZ et al.: RESISTENCIA GENÉTICA A Macrophomina phaseolina

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Cuadro 1. Material genético utilizado en los experimentos de campo e invernadero y algunas de sus características agronómicas. Table 1. Germplasm used at field and greenhouse experiments and some of its agronomical characteristics. Genotipo

BAT 477 TLP 19 Pinto UI-114 Rio Tibagi

Raza†

M M D M

Reacción a M. phaseolina¶ R R S S

Semilla

Tipo de materialÞ

Origen

Tamaño§

Color de la testa Beige Negro Beige con manchas café Negro

P M G P

LM LM VM VC

Hábito de crecimiento¤

Colombia Costa Rica Estados Unidos Brasil

III II III II

† M=Mesoamérica, D=Durango (Singh et al., 1991). ¶ R=Resistente, S=Susceptible (Pastor-Corrales y Abawi, 1988; Mayek-Pérez et al., 1996). § P=Pequeño, M=Mediano, G=Grande (CIAT, 1987). Þ LM=Línea mejorada, VM=Variedad mejorada, VC=Variedad criolla. ¤ Singh (1982).

Veracruz, México (18o 44’ N, 95o 58’ W, 16 m) and greenhouse conditions at Montecillo. F3 lines were evaluated under greenhouse during 1999 at Montecillo. The field and greenhouse evaluations were conducted using a highly virulent isolate of M. phaseolina (M-CF) obtained from bean plants collected on naturally infested soil at Cotaxtla, Veracruz (Mayek-Pérez et al., 1997). The isolate caused a susceptible reaction in susceptible parents, while resistant parents included in this work showed resistance to the isolate at previous evaluations under controlled conditions (Mayek-Pérez et al., 1996). The isolates were stored in potato-dextrose-agar medium and mineral oil under laboratory conditions. Rice seeds were used as sustrate to increase the inoculum in each experiment; inoculum was prepared using the protocol of Abawi and Pastor-Corrales (1990).

cada F1 con sus respectivos progenitores. Los cruzamientos se hicieron en invernadero en Montecillo (19o 29’ N, 98o 53’ O, 2250 m) y Chapingo, Estado de México (19o 27’ N, 98o 51’ O, 2240 m). Parte de la semilla F1 obtenida en los cruzamientos se sembró en 1997 en condiciones de invernadero en Montecillo, para producir la semilla de las líneas F2 y F3 . La discriminación entre autofecundaciones e hibridaciones consideró como marcadores morfológicos el color de la testa de la semilla y el color del hipocotilo de las plántulas. Los experimentos en que se evaluaron los cuatro progenitores y las generaciones F1 y F2 se establecieron en condiciones de campo en Cotaxtla, Veracruz, México (18o 44’ N, 95o 58’ O, 16 m) y bajo condiciones de invernadero en Montecillo. Las líneas F3 se evaluaron en invernadero durante 1999 en Montecillo. En las evaluaciones de campo e invernadero se utilizó un aislamiento de M. phaseolina (M-CF) altamente virulento en frijol, el cual se obtuvo de plantas de frijol colectadas en un suelo infestado con el patógeno en forma natural en Cotaxtla, Veracruz (Mayek et al., 1997). El aislamiento causó reacción de susceptibilidad en los progenitores susceptibles, mientras que los progenitores resistentes incluidos en este trabajo mostraron resistencia al aislamiento en evaluaciones previas realizadas en condiciones controladas (Mayek-Pérez et al., 1996). El aislamiento se conservó en papa-dextrosa-agar y aceite mineral en condiciones de laboratorio. Como sustrato para el incremento del inóculo en cada experimento se utilizó semilla de arroz, preparada de acuerdo con la metodología de Abawi y Pastor-Corrales (1990).

Two hundred seeds of each parent and F2 line and a variable number of seeds of each F1 generation were established at Cotaxtla on October 19, 1997, in rows separed to 0.8 m. Generations were randomly sown in the evaluation plot where no fertilizers or pesticides were used. The inoculum of M. phaseolina was applied together with the seeds at sowing in a ratio of 10 g per meter of row. Irrigation was applied on October 20 to favour germination and emergence of germplasm. Maximum/minimum average temperatures were 29.1/ 18.7 o C and 65 mm of precipitations was registered.

Experimento de campo

Greenhouse experiments

El 19 de octubre de 1997 se sembraron 200 semillas de cada progenitor y cada línea F2 , mientras que se estableció un número variable de semillas de las generaciones F1 en Cotaxtla, en surcos espaciados a 0.8 m. Las generaciones se establecieron al azar en el lote de evaluación, el cual no fue fertilizado ni tratado con plaguicidas. El inóculo de M. phaseolina se aplicó junto con la semilla al momento de la siembra en una proporción de 10 g por metro lineal de surco. Se aplicó un riego el 20 de octubre para favorecer la germinación y emergencia del germoplasma establecido. Las temperaturas promedio máxima/mínima fueron 29.1/18.7 o C y se registró una precipitación total de 65 mm durante el experimento.

At the first evaluation, variable number of seeds of each parent, F1 and F2 generations and F1-parent backcrosses were sown on March 20, 1998, in a soil sterilized with methyl-bromide and inoculated before sowing with M. phaseolina inoculum at 5% ratio (w/w). The experiment was carried out under maximum/minimum average temperatures of 34.3/19.4 o C, and 44.3% relative humidity. At the second evaluation, reaction of F3 lines produced from different F2 plants obtained from each cross was determined. In this experiment we included a variable number of seeds of each cross. Families were established under a Completely Ramdomized Design with three replications and were sown on January 9, 1999. The

Field experiment

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AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 6, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2001 Experimentos de invernadero

En la primera evaluación, números variables de semillas de los progenitores, las generaciones F1 y F2 y los retrocruzamientos de las líneas F1 , con cada progenitor, se sembraron el 20 de marzo de 1998 en un suelo esterilizado con bromuro de metilo e inoculado con el sustrato colonizado con M. phaseolina en una proporción del 5% (peso/ peso). El experimento se llevó a cabo bajo temperaturas máxima/mínima de 34.3/19.4 o C y humedad relativa promedio de 44.3%. En la segunda evaluación se determinó la reacción de líneas F3 derivadas de las diferentes plantas F2 obtenidas de cada cruzamiento, considerándose un número variable de ellas, dependiendo de la cantidad de semilla disponible para cada cruza. Las familias fueron comparadas en un diseño Completamente al Azar con tres repeticiones, y fueron sembradas el 9 de enero de 1999. La unidad experimental consistió de 10 semillas sembradas en suelo esterilizado con bromuro de metilo e inoculado con el sustrato colonizado con M. phaseolina en una proporción del 5% (peso/peso). Las temperaturas promedio máxima y mínima fueron 19.5 y 9.3 o C y la humedad relativa fue 39.4% durante el experimento. Todos los experimentos se hicieron en condiciones de humedad edáfica cercana a la capacidad de campo. Se determinó la severidad de la enfermedad causada por M. phaseolina en plantas extraídas del suelo 30 días después de la siembra en todos los experimentos de campo e invernadero. La severidad se evaluó considerando la escala descrita por Abawi y PastorCorrales (1990), la cual tiene nueve grados de daño (1 a 9) donde 1=síntomas no visibles, 5=hasta un 25% de los tejidos de la raíz con lesiones necróticas o lesiones extendidas de los cotiledones hasta 2 cm a lo largo del tallo y 9=75% o más de los tejidos de la raíz con lesiones necróticas o la mayor parte de tallo, peciolos y puntos de crecimiento infectados y muerte de la planta. Las plantas con valores de severidad de la enfermedad de 1 a 3 se consideraron resistentes y las que presentaron valores entre 4 y 9 se clasificaron como susceptibles. La información de cada experimento se analizó por separado. Para las evaluaciones de las líneas F1 y F2 , en campo e invernadero, se realizaron pruebas de ajuste de ji-cuadrada, considerando diferentes relaciones teóricas de segregación de genes de resistencia a la pudrición carbonosa. Se aceptó la relación de segregación hipotética con el mejor ajuste entre las proporciones esperadas y las observadas, con un nivel de probabilidad de 5%. Se determinó la normalidad de las distribuciones de frecuencias de las líneas F3 por su reacción a la pudrición carbonosa con la estadística W de la prueba de Shapiro-Wilk. Se utilizó una probabilidad menor a 0.05 para indicar la ausencia de ajuste a una distribución normal (Miklas et al., 1998).

RESULTADOS Reacción de las líneas F1 , F2 y retrocruzas a M. phaseolina Los progenitores resistentes a M. phaseolina, BAT 477 y TLP 19 mostraron resistencia al patógeno, mientras que

experimental unit was 10 seeds sown in sterilized soil with methylbromide and inoculated with M. phaseolina inoculum at 5% ratio (w/ w). Maximum/minimum average temperatures were 19.5/9.3 oC and 39.4 % relative humidity. All experiments were conducted under soil moisture levels near field capacity. Disease severity caused by M. phaseolina was determined in plants taken off from soil 30 days after sowing in all field and greenhouse experiments. Disease severity was evaluated using the scale described by Abawi and Pastor-Corrales (1990). The scale has nine levels of damage (1 to 9), where: 1=No symptoms, 5=25% or less of root tissues with necrotic lesions or lesions in cotyledons of 2 cm length at stem and 9=75% or more of root tissues with necrotic lesions or high proportion of stem, petioles and growth points infected and death of plant. Plants with disease severity ratings from 1 to 3 were classified as resistant and plants with ratings from 4 to 9 were classified as susceptible. Data of each experiment were analyzed individually. Data from experiments that included F1 and F2 lines under field and greenhouse conditions were subjected to chi-square goodness-fit tests includying different theoretical segregation ratios of charcoal rot resistance genes. We accepted the hypothetical segregation ratio with the best adjustment between expected and observed ratios at 5% probability level. Normality of frequency distributions of F3 lines by their reaction to charcoal rot was determined using W value of the Shapiro-Wilk test. The abscence of adjustment to normal distribution was determined by using a probability level lower than 0.05 (Miklas et al., 1998).

RESULTS Reaction of F1 and F2 lines and backcrosses to M. phaseolina Resistant parents to M. phaseolina, BAT 477 and TLP 19 showed resistance to the pathogen, while susceptible parents, Pinto UI-114 and Río Tibagi showed susceptibility at experiments established under field and greenhouse conditions. F1 and F2 lines and F1 -parent backcrosses showed a segregation ratio similar under both field and greenhouse conditions. For this reason, data of germplasm reaction to M. phaseolina were jointly analyzed. The F1 obtained from the crossing between both resistant parents and from resistant x susceptible parents exhibited resistance to charcoal rot. These results suggest that inheritance of resistance to M. phaseolina in both resistant parents is dominant. Progenies derived from crossing between susceptible parents showed susceptibility to charcoal rot. The F2 generations produced from the crossing between resistant parents showed a resistant:susceptible ratio of 15:1, which confirms that the hypothesis of resistance to M. phaseolina in both parents is controlled by two pairs of dominant genes with epistatic effects. Crossing between resistant x susceptible parents produced a resistant:susceptible ratio of 9:7, suggesting that the resistance to charcoal rot in each

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los susceptibles Pinto UI-114 y Río Tibagi mostraron su susceptibilidad en los experimentos establecidos en campo e invernadero. Las líneas F1 , F2 y las retrocruzas de la F1 con sus respectivos progenitores mostraron una relación de segregación en su reacción a M. phaseolina en campo similar a la observada en plantas de invernadero; por esta razón, los resultados de la reacción del material genético a M. phaseolina se analizaron de manera conjunta. Las F1 resultantes del cruzamiento entre progenitores resistentes y entre progenitores resistentes x susceptibles, exhibieron resistencia a la pudrición carbonosa; estos resultados sugieren que el tipo de herencia de la resistencia a M. phaseolina en ambos progenitores resistentes es dominante. Las progenies derivadas del cruzamiento entre los progenitores susceptibles mostraron una reacción de susceptibilidad a la pudrición carbonosa. Las generaciones F2 derivadas del cruzamiento entre progenitores resistentes mostraron una proporción de plantas resistentes:susceptibles de 15:1, proporción consistente con la hipótesis de que la resistencia en ambos genotipos a M. phaseolina está controlada por dos genes dominantes duplicados con efectos epistáticos. El cruzamiento entre progenitores resistentes x susceptibles resultó en una proporción resistentes:susceptibles de 9:7, consistente con la hipótesis de que la resistencia a la pudrición carbonosa en cada progenitor resistente participante en cada cruzamiento específico está controlada por dos genes dominantes duplicados con efectos epistáticos. El cruzamiento entre genotipos susceptibles resultó en una relación de segregación de 1:15 de plantas resistentes:susceptibles, lo que confirmó la hipótesis de que la herencia de la resistencia está determinada por genes dominantes (Cuadro 2). La retrocruza entre plantas F1 y sus respectivos progenitores confirmó el número de genes que se habían determinado en el control de la resistencia a M. phaseolina en los genotipos resistentes en las generaciones F2 . El retrocruzamiento de las generaciones F1 , resultantes de la cruza entre los progenitores resistente x resistente o resistente x susceptible, con genotipos resistentes, mostró, en todos los casos, una proporción de segregación de 1:0 (todas resistentes al hongo); mientras que la retrocruza de generaciones F1 , resultantes de la cruza entre los progenitores resistente x susceptible con genotipos susceptibles, mostró una relación de segregación consistente en una proporción de 1:3 (resistentes:susceptibles). Para el caso del retrocruzamiento de generaciones F1 , resultantes de progenitores susceptibles, todas las plantas producidas y evaluadas fueron susceptibles a la pudrición carbonosa (Cuadro 3). La escala de evaluación de la severidad de la enfermedad causada por M. phaseolina, utilizada en los experimentos de campo e invernadero, no permitió que la mayoría de las plantas de las generaciones F2 exhibieran

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parent, for each specific cross is governed by two pairs of dominant genes with epistatic effects. The crossing between susceptible genotypes produced a 1:15 segregation ratio of resistant:susceptible plants, which confirms the hypothesis that inheritance of resistance is determined by dominant genes (Table 2). Backcrosses between F1 plants and their parents confirmed the number of genes involved on resistance to M. phaseolina in resistant genotypes at F2 generations. Backcrosses of F1 generations obtained from the crossing between resistant x resistant parents or resistant x susceptible parents to a resistant parents showed in all cases a 1:0 segregation ratio (all plant resistant to the fungus); while backcrosses of F1 generations, which resulted from the crossing between resistant x susceptible parents with susceptible genotypes, produced a segregation ratio of 1:3 (resistant:susceptible). Backcrosses of F1 generations produced from susceptible parents, showed susceptibility to charcoal rot for all the plants (Table 3). The evaluation scale of disease severity caused by M. phaseolina that was used at field and greenhouse experiments, did not allow that most plants of F2 generations exhibited the phenotype of reaction to the disease from their parents. This result suggested that besides the presence and action of two pairs of major resistance genes, it is possible that minor genes are influencing the resistance. Frequency distributions of F2 plants of reactions to M. phaseolina, showed in some cases a quasi-normal distribution under both field (Figure 1) and greenhouse conditions (Figure 2). The evaluation scale of reaction to the fungus was effective to separate resistant from susceptible plants, simplifying the expected segregation ratios, under the fact that few genes are involved on resistance to M. phaseolina in beans. However, the used scale did not allow to detect the presence of minor resistance genes. Reaction of F3 lines to M. phaseolina. Frequency distributions of reactions in F3 lines to M. phaseolina under greenhouse conditions adjusted to the normal distribution (p0.05).

et al. (1996), misma que fue sugerida y descrita por Abawi y Pastor-Corrales (1990), la información que mostraba una distribución cuasi-normal en las frecuencias de reacción a la pudrición carbonosa en generaciones segregantes F2 , se ajustó a una segregación de resistencia determinada por dos pares de genes con efectos epistáticos variables, dependiendo de los genotipos utilizados en los cruzamientos. La línea de división entre resistencia y susceptibilidad se estableció entre los valores de 3 y 4 de la escala visual empleada, pues mientras el valor de 3 equivale al desarrollo de lesiones limitadas a los tejidos cotiledonales y lesiones muy restringidas en tallos (de 1 a 2 m de longitud), un valor de 4 indica que las lesiones de los tejidos cotiledonales habían alcanzado al tallo y por consiguiente habían ocasionado lesiones de cerca de 1 cm de largo en dicho órgano. Lo anterior significa que lesiones de

frequencies through the distinct reaction ranges was influenced by the method of inoculation used in this work, different to that designed by Olaya et al. (1996). These authors used an inoculation technique focused to reduce the escape to the disease, while our technique reflected the pressure caused by M. phaseolina under natural field conditions. The advance on obtaining resistance to M. phaseolina in breeding programs has been difficult due to factors such as infestation procedures and environmental factors that influenced the development of disease which seems to be related to the finding that field resistance to M. phaseolina is polygenic (Miklas and Beaver, 1994; Miklas et al., 1998). Moreover, there have been problems to relate reactions of segregant germplasm under field conditions to their response under controlled conditions, where probably seedling resistance is being evaluated, whereas,

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más de 1 cm de longitud tienen mayor probabilidad de progresar rápidamente, cubriendo por completo al tallo en pocos días, lo que eventualmente ocasiona la muerte de la planta (Abawi y Pastor-Corrales. 1990). La definición precisa de las categorías de resistencia y de susceptibilidad a la pudrición carbonosa no es crítica para evaluar material segregante de frijol. El problema es definir objetivamente donde situar los grados intermedios de daño (valores de 4 a 6 en la escala utilizada). En estudios futuros de la herencia de la resistencia de M. phaseolina en frijol, para evaluar diferentes hipótesis o modelos genéticos de resistencia al hongo, se tendrá que definir la escala. Las frecuencias de reacción a M. phaseolina en algunas generaciones F 2 mostraron una distribución aproximada a la distribución normal, mientras que las frecuencias de reacción en las líneas F 3 se ajustaron en todos los casos a una distribución normal de probabilidades. Miklas et al. (1998) señalaron que las frecuencias de reacción que muestran distribuciones normales son indicadoras de resistencia poligénica a la pudrición carbonosa en frijol común. Sin embargo, la información de este trabajo sugiere que en la resistencia a M. phaseolina están involucrados dos loci que explican la mayor parte de la respuesta observada. Se confirmó que BAT 477 posee resistencia a M. phaseolina controlada por dos genes dominantes complementarios (epistasis doble recesiva), similar a la exhibida por TLP 19, el otro genotipo resistente al patógeno. Posiblemente, la amplitud de frecuencias de reacción a través de los distintos rangos de reacción fue influída por el método de inoculación empleado en este trabajo, distinto al diseñado por Olaya et al. (1996), quienes utilizaron una técnica de inoculación enfocada a reducir el escape a la enfermedad, mientras que la técnica utilizada en el presente estudio reflejó más bien la presión que M. phaseolina muestra en condiciones de campo. El avance en la obtención de resistencia a M. phaseolina en los programas de mejoramiento se ha dificultado por factores como los procedimientos de inoculación y por el efecto de factores ambientales en el desarrollo de la enfermedad. Esto parece estar relacionado con la observación de que la resistencia de campo a M. phaseolina es poligénica (Miklas y Beaver, 1994; Miklas et al., 1998). Además, han existido problemas para relacionar la reacción de germoplasma segregante en campo con su reacción en condiciones controladas, en las cuales es probable que se esté evaluando la resistencia en plántula, mientras que en campo en plantas adultas se esté cuantificando la resistencia integrada a través de todo el ciclo de cultivo. Por ejemplo, en evaluaciones de campo no se observaron altas frecuencias de muerte de plántulas en pre- y post-emergencia, efectos que constituyen una componente importante del daño en las

under field conditions the integrated resistance throughout the crop cycle af adult plant is measured. For example, under field evaluations, high frequencies of both pre- and post-emergence seedling death were not found, an important component of seedling damage (Miklas et al., 1998). These authors suggested that it is necessary to define and use a suitable selection pressure level to facilitate the separation between resistant and susceptible genotypes. These suggestions indicate that a reduced selection pressure could contribute to high frequencies of escape to the pathogen and less reproducibility of multiloci models that provide a better explanation of resistance. Moreover, when resistance is quantitative, it is appropriate to assess a great number of individuals over multiple environments to identify the resistant genotypes. Therefore, under controlled conditions and using a scale that includes few damage degrees, the inheritance of resistance to M. phaseolina is simple, while our results under field conditions suggest the action of various genes with additive effects. Miklas et al. (1998) assessed under field conditions the inheritance of resistance to charcoal rot at bean recombinant inbred population derived from the cross between XAN 176 (resistant) and Dorado (susceptible). Inheritability in restricted-sense was intermediate, with values from 0.53 to 0.57, and frequency distributions of reactions to the fungus near normal and the absence of discrete classes of segregation were found. These results suggested the presence of quantitative resistance. RAPD analysis indicated the presence of three to five quantitative trait loci (QTL) that explained from 12 to 19% of phenotypical variation. Multiple regression models of QTL’s explained more than 28% of phenotypical variation detected between recombinant inbred lines. The five QTL’s from resistand parent showed additive effects. These results are not promising to be used as molecular markers for screening of M. phaseolina resistant genotypes from segregant generations, due to the low values of explained phenotypical variation. Phenotype variation may be strongly influenced by variable conditions to pathogen selection pressure level prevalent under field conditions. The variation on genetic basis of the inheritance of resistance could depend on genetic nature of each host and assessment conditions of segregant germplasm. Lodha and Solanki (1993) found the presence of epistatic effects in resistant genotypes of Cyamopsis tetragonoloba L.; besides, they found the presence of dominance and additivity effects. Meanwhile, Sinhamahapatra and Das (1992) found that sesame (Sesamum indicum L.) has a dominance component that plays a major role in controlling charcoal rot resistance (specific combinatorial ability). Lodha and Solanki (1993) determined that the environment has an important role on the expression of

MAYEK-PÉREZ et al.: RESISTENCIA GENÉTICA A Macrophomina phaseolina

plántulas (Miklas et al., 1998). Estos autores señalaron que es necesario definir y utilizar una presión de selección adecuada de la enfermedad para facilitar la separación entre genotipos resistentes y susceptibles. Lo anterior indica que una presión de selección reducida puede contribuir a una mayor frecuencia de escape al patógeno y, por tanto, a una menor reproducibilidad de modelos multiloci que expliquen mejor la resistencia. Además, si la resistencia es de tipo cuantitativo, es conveniente evaluar un gran número de individuos en ambientes múltiples de selección para identificar, a los genotipos resistentes. Por tanto, en condiciones controladas y con el uso de una escala que considere pocas clases de grados de daño, la herencia de la resistencia a M. phaseolina es simple, mientras que los resultados obtenidos en condiciones de campo sugieren la acción de varios genes con efectos aditivos. Miklas et al. (1998) evaluaron, en condiciones de campo, la herencia de la resistencia a la pudrición carbonosa en frijol en una población endogámica recombinante derivada de la cruza entre XAN 176 (resistente) y Dorado (susceptible). La heredabilidad en sentido estricto fue intermedia, con valores de 0.53 a 0.57, y se encontró una distribución de frecuencias de reacción al hongo cercana a la normal, con la ausencia de clases discretas de segregación, lo que indicó la presencia de resistencia de tipo cuantitativo. El análisis con ADN polimórfico amplificado al azar señaló la presencia de tres a cinco loci de caracteres cuantitativos (LCC) que explicaron de 12 a 19% de la variación fenotípica observada. Los modelos de regresión múltiple de los LCC explicaron más de 28% de la variación fenotípica observada entre líneas endogámicas recombinantes. Los cinco LCC encontrados en el progenitor resistente mostraron efectos aditivos. Estos resultados no son prometedores en cuanto a la utilización de marcadores moleculares para la selección de genotipos resistentes a M. phaseolina en generaciones segregantes, dados los bajos valores de variación fenotípica explicada. Ésta a su vez parece estar fuertemente influida por las condiciones variables de la presión de selección del patógeno prevalecientes en condiciones de campo. La variación en resultados, en cuanto a la determinación de la base genética de la herencia de la resistencia, puede depender de la naturaleza genética de cada hospedante y de las condiciones de evaluación del material segregante. Lodha y Solanki (1993) determinaron la presencia de efectos epistáticos en genotipos resistentes de Cyamopsis tetragonoloba L., además de la presencia de efectos de dominancia y aditividad. Sinhamahapatra y Das (1992) observaron que en ajonjolí (Sesamum indicum L.) el componente de dominancia tiene una función importante en el control de la resistencia a la pudrición carbonosa (aptitud combinatoria específica).

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charcoal rot resistance, since the inheritability was low (less than 38%). Tenkouano et al. (1993) related the resistance to charcoal rot in sorghum to absence of plant senescence under drought stress. They found that both characteristics have the same basis of inheritance and are dominant; moreover, both characteristics are influenced by dominant and recessive epistatic interactions between two loci. No problems were reported since they carried out a Mendelian analysis of their data. Nevertheless previous works suggested the presence of polygenic resistance in both characteristics and heterogenuos genotypes did not segregate on discrete classes, due to reaction ranks to the disease in resistant plants did not overlap with those of susceptible germplasm. De and Kaiser (1991) performed a genetic analysis of resistance to M. phaseolina in jute (Corchorus sativus L.) and they found the predominance of additive effects and the dominance of resistance, related to high general and specific combinatorial abilities. Further works should include optimum environmental conditions for an homogenous selection pressure level to the fungus and favorable climate condition for its appropriate development, to perform proper assessments of bean germplasm reactions to M. phaseolina and obtain useful information to be applied in breeding programs.

CONCLUSIONS The inheritance of resistance to M. phaseolina in bean is determined by two pairs of dominant genes with complementary effects (double recessive epistasis) and it is possible that minor genes influence the resistance to the pathogen. –End of the English version–

pppvPPP Lodha y Solanki (1993) encontraron que el ambiente tiene una función importante en la expresión de la resistencia a la pudrición carbonosa, debido a que la heredabilidad de la misma fue baja (menor a 38%). Tenkouano et al. (1993) relacionaron la resistencia a la pudrición carbonosa del sorgo con la falta de senescencia de la planta en condiciones de déficit hídrico. Encontraron que ambas características se heredan de igual forma y de manera dominante, además de la presencia de interacciones epistáticas dominantes y recesivas entre dos loci. Dichos autores no encontraron problemas en el análisis mendeliano de la información; no obstante los informes previos de la existencia de resistencia poligénica a ambas características evaluadas y a que los genotipos heterogéneos no segregaron en clases discretas, debido a que el rango de reacciones a la enfermedad en plantas

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AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 6, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2001

resistentes no se traslapó con el de las susceptibles. De y Kaiser (1991) efectuaron un análisis genético de la resistencia a M. phaseolina en yute (Corchorus sativus L.), mostrando la predominancia de efectos aditivos y resistencia heredada en forma dominante, así como altas aptitudes combinatorias general y específica. En trabajos futuros es conveniente probar las condiciones ambientales óptimas de presión de selección homogénea del hongo y del clima favorable para su adecuado desarrollo, a fin de obtener estimaciones correctas de la reacción del germoplasma de frijol a M. phaseolina, de manera que la información obtenida sea aplicable en programas de mejoramiento genético.

CONCLUSIONES La herencia de la resistencia a M. phaseolina en frijol está determinada por dos pares de genes dominantes con efectos complementarios (epistasis doble recesiva), y existe la posibilidad de que genes con efectos menores influyan también en la resistencia al patógeno. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de México (Proyecto 3230P-B9607). Los autores agradecen a R. Romero-Córdova, G. Esquivel-Esquivel, R. Rosales-Serna y A. Gutiérrez-Larrazábal por su apoyo técnico. N. Mayek-Pérez agradece al CONACYT la beca otorgada para realizar estudios doctorales en el Colegio de Postgraduados.

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