Introducción

Metodologías para la determinación estructural de fármacos y el estudio de fenómenos de reconocimiento molecular

• 1986: Primera estructura de un péptido obtenida en disolución con datos de NMR por Wütrich. • El número de estructuras crece exponencialmente cada año e incluye ya fragmentos de DNA y RNA • Limitación: Tamaño de la molécula o marcaje • Ventaja: en disolución y con información dinámica

Programa de doctorado en Química Médica

Estructura 3D de biomoléculas Estructura de péptidos Javier Pérez Castells USP-CEU

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Escala de tiempos

Detalles sobre la preparación de la muestra •

• Disolvente: D2O ó H2O/D2O 9:1. Simulación de membranas… Eliminación de agua… • Concentración (1-15 mM). La relación señal ruido aumenta con √ del nº de veces que se promedia la señal. Es fundamental para lograr ver lo NOEs a larga distancia. • Problemas de agregación, anchura de la señal con distinta concentración… • pH: a 3 la velocidad de intercambio NH ND es mínima y se hace muy rápida a pH = 6-7 • Cuidado con la estabilidad durante el registro de los espectros (varias horas o días)

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• • •

Es importante tener una idea de la relación entre la escala de tiempos en que se producen los intercambios químicos y el cambio en los parámetros de NMR Dentro de un péptido puede haber intercambios lentos y rápidos. Los lentos darán dos sets de señales diferentes. Un ejemplo típico es la isomería cis-trans del enlace peptídico cuyo giro se hace lento en algunos aa como la Prolina y afecta a los aa inmediatamente precedentes en la secuencia. En ocasiones también se ensanchan las señales de cadenas laterales de aa aromáticos porque se dificulta el giro del anillo

Al-Pro-Ala

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Asignación de señales en proteínas

Registro de espectros

Péptidos naturales

•El proceso ya está casi totalmente automatizado, con excepción de la asignación de las señales que sigue teniendo que hacerse semimanualmente. Necesitamos espectros 2D. •El pico a -0.8 ppm es casi seguro un metilo. ¿pero es una valina, leucina o isoleucina? •Imaginemos que sabemos que es valine. ¿cual de las valinas? •Si sabemos que es Val30. ¿cual de los dos metilos?

1D: COSY TOCSY NOESY

Distintos tm y pH

(hasta 15 kD) Péptidos marcados

Secuencia de la lisozima: KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAA KFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCN DGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVS DGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL

3D-NMR HSQC HSQC-TOCSY

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Los sistemas de spin

Acoplamientos a 3-enlaces Acoplamientos a 2-enlaces

• •

Un sistema de spines es un set de 1H conectados (bien directamente o de forma “relayed”) mediante acoplamientos escalares. Generalmente el acoplamiento es detectable hasta 3 o 4 enlaces pues mas allá tiene valores inferiores a 1 Hz y no se ven en el espectro.

H

Acoplamiento geminal J ~ -12 to -15 Hz

H

C H


Solo los aromáticos cortan en el carbono ipso independizando el ciclo.

H CH3

C

H

Acoplamiento vecinal J ~ 2-14 Hz


La mayoría de los resíduos tiene un solo sistema de spin


Nunca se extiende a más de un aa.

H

Hc

“relayed”

H

CO2

-

Ha

Hb

Un sistema de spines

El COSY muestra los picos de cruce de núcleos con acoplamiento vecinal y geminal (dos o tres enlaces)

H

No!

C

C N

C

N

C

H

O

H

O

Glu 7

H

H

El TOCSY incluye los acoplamientos “relayed”. USP-CEU

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Ala USP-CEU

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H

Acoplamientos a 3-enlaces Acoplamientos a 2-enlaces

TOCSY

C

H

H

C

C

C

C

H

• Es muy útil en análisis de péptidos porque cada aa es un sistema de spin independiente con un patrón conocido. • Se basa en una secuencia de bloqueo de spin (en el plano transversal) que se logra con un tren de pulsos (MLEV-17 etc) que coloca al sistema en condiciones de mezcla isotrópica (todos los spines experimentan el mismo campo efectivo). • Entonces se cumple la condición de Hartmann-Hahn y la magnetización se trasfiere entre núcleos acoplados. • En definitiva, pueden aparecer señales de cruce entre todos los spines del sistema y además salen en fase, con lo que es muy ventajoso respecto al COSY. • La aparición y la intensidad de las señales depende del tiempo de mezcla que escojamos.

H

C C

H

H

H

C N

C

H

O


Un aa con dos sistemas
Hay que recurrir al NOESY

Phe

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Sistemas de spin

Zonas del espectro H Alanina

H C HO N C C H H

Glicina

N H

H

O

C

C

H

Diagonal COSY peaks TOCSY peaks

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Sistemas de spin

Sistemas de spin

H CH3 - C - CH3

OH Leucina

H C HO N C C H H

H C HO N C C H H

Valina

N H

CH3 O C C H

Ser, Cys, Asp, Asn Phe, Tyr, His, Trp

Los aa aromáticos Tienen 2 sistemas de spin

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HN

β

γ

δ

ε

NH2

Hα Hε

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• Elegimos un residuo cuyas señales estén bien resueltas en el TOCSY y después buscar en el NOESY correlaciones a protones en otros sistemas de spines.

Hδ α

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Asignacion de sistemas de spin secuencial

Sistemas de spin

CO

Lisina

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Hβ

Hγ

• Estas son generalmente correlaciones dNN, dαN, y dβN. También correlaciones dβδ para establecer la identidad de los residuos aromáticos, Asn, Arg, Gln, etc… Hγ Hδ Hβ

• Después de encontrar esos, volvemos al TOCSY para identificar a que residuo corresponden las correlaciones que vimos en el NOESY. Esos protones van a estar en residuos i ± 1. A lo mejor ya podemos situarlos en la cadena. • Hacemos esto hasta que se nos acaban los residuos (i.e., hasta que llegamos a una punta de la cadena peptídica), o hasta que tenemos mucho solapamiento. Podemos tener muchos puntos de partida y direcciones, el método se ‘valida’ a si mismo.

Hε Hα

• Estos métodos fueron propuestos por Wüthrich. Además, dado que regiones de USP-CEU

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estructura secundaria definidas dan patrones de NOE regulares, podemos acelerar buscando dichos patrones sobretodo si sospechamos que tenemos esas estructuras USP-CEU secundarias (CD por ejemplo)

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NOESY – Ejemplo de conexión entre dos sistemas de spin

El NOESY

Ejemplo, si en el TOCSY hemos identificado los sistemas de Val, Asn, Gly y Cys, con el NOESY los ordenamos en la secuencia que es Cys-Val-Asn.

• Conceptualmente más simple. Muy util en péptidos por ser muy sensible. • La intensidad del NOE depende del Τc y en péptidos pequeños puede ser en torno a cero. (ROESY) • También depende del tiempo de mezcla…. • Aparición de la difusión de spin • El concepto de seudoátomo (Q)

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Intensidad de los NOES

N H

O

Cα H

C

dNN NOEs intensos para hélices < 3.6 Å para α-helice

Cβ H N H

Cα H

Ahora tenemos casi todos los NOE entre el residuo i e i + 1 y i - 1. Solo nos queda buscar correlaciones NOE de distancia media (i + 2, 3, y 4) y de larga (> i + 5).

dβN C

• La cantidad y tipo de NOEs de larga distancia dependerá de la estructura secundaria/terciaria del péptido.

N H

O

• Estos NOEs son agrupados en tablas y hay que integrarlos. Se les asigna un valor dependiendo del volumen del pico usando una referencia interna de intensidad, como ser un NOE entre 1Hs del CH2 de una Phe).

dαN NOEs intensos para lámina β < 2.7 Å para lámina β

NOE

Distancia

Débil Medio Fuerte

3.0 - 5.0 Å 2.0 - 4.0 Å 2.0 - 2.5 Å USP-CEU

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NOES a larga distancia

Estructura secundaria y su relación con la intensidad de los NOEs H Cβ

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NOES a larga distancia

Gly

NOES: problemas

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Hay veces en que vemos ciertos NOE pero no otros que ‘tendrían’ que verse.

Gly

• Los NOE no solo dependen de la distancia entre dos protones, sino de la dinámica entre ellos (grado de movimiento de uno con respecto al otro). Esto va a ser importante en péptidos pequeños, porque en estos casos tenemos mucha movilidad en las cadenas laterales y en el esqueleto peptídico.

15

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Los NOEs a larga distancia definen la estructura terciaria

• Lo mas importante a tener en cuenta siempre es que no ver un NOE no significa que dos protones estén a mas de 5 Å. Gln

• A su vez, un NOE puede surgir de un promedio de confórmeros del péptido. Podemos ver algo como NOE medio (1.8 a 3.3 Å), cuando en realidad es una mezcla de NOE fuerte (1.8 a 2.7 Å) y ausencia de correlación:

Si se observan estos NOEs es que las dos Gly-Gly se doblan para situarse cerca del carbono a de la Gln

Aparente:

Real:

dij < 3 Å USP-CEU

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Generación de una estructura 3D

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CYANA: Cómo funciona

• Ahora tenemos tablas de NOEs con distintas intensidades (integrados), constantes de acoplamiento 3J, y desplazamientos químicos. • Una opción es acudir directamente al modelado molecular, con sus diferentes posibilidades: Generalmente primero se usa un programa que asigne automáticamente de nuevo y genere varias estructuras 3D (CYANA, X-PLOR con un MD rápido) y luego se refina el resultado con un programa de modelado (AMBER…)

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dij > 6 Å

dij ~ 3 Å

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• Asigna los picos automáticamente teniendo los desplazamientos químicos. • Nos devuelve ficheros donde se compara la asignación del programa y la nuestra. • Realiza 7 ciclos de cálculo. • En el primero calcula los noes basándose en la coherencia del desplazamiento químico y en el “network anchoring”, que es la compatibilidad de cada restricción con las demás. • Calcula 100 confórmeros basados en la dinámica de los ángulos de torsión. • Los ciclos de cálculo 2-7 repite la asignación añadiendo a los dos términos anteriores uno que compara el NOE con las 20 mejores estructuras calculadas en el ciclo 1, y vuelve a calcular 100 confórmeros • Hace un ciclo final desde el 7 en el que divide las restricciones con varias asignaciones y hace asignaciones estereoespecíficas si es posible. USP-CEU

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Cómo construye la estructura Cómo asigna los NOEs • Con una MD simulada. Utiliza ángulos de torsión como restricciones y no coordenadas espaciales y hace un annealing muy rápido. El cálculo tiene 5 fases: – Minimización inicial (100 pasos, sin H) – Calentamiento a 10000K – Enfriamiento lento calculando los ángulos hasta casi 0K – Incorporación de los H – Minimización final de 1000 pasos • Calcula un número de estructuras y les da un valor de Target function a cada una. Esta función es un criterio de calidad. Si la estructura cumpliera con todas las restricciones NOE y no hubiera superposiciones sería 0. • Se queda con las mejores estructuras (las de menor target function)

• Acepta las asignaciones con un 20% o más de probabilidad, la cual se calcula con la fórmula siguiente: • Ptot= Pdespl q.xPestructuraxPnetwork anchoring • Pdespl= desviación del alineamiento con los desplazamientos químicos (tolerancia) • Pestructura= distancia entre núcleos no sea superior al límite calculado por el ciclo anterior • Pnetwork anchoring= polinomio que compara con NOEs compatibles

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Criterios de éxito

Cómo construye la estructura •Importante:

• Una representación del annealing

•>90% de los desplazamientos q. Asignados (excepto móviles) Conformeros ‘calientes’

•RMSD rmin

ENOE = KNOE * ( rmin - rcalc )2

si

rcalc < rmin

φmin

φmax

Jmin

Jmax USP-CEU

• Es moverse por una función multidimensional que se podría imaginar como la figura siguiente con más dimensiones.

E (Kcal/mol)

rmax

rmin

Rcalc, φcalc, o Jcalc

30

ψ φ 31

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Presentación de resultados •Las estructuras que obtenemos por estos métodos que no muestren violaciones grandes de las restricciones que incluimos se dicen ser consistentes con los datos de RMN. Se presentan como un set de estructuras de baja energía superpuestas en las regiones mas rígidas: • Se pueden luego hacer figuras sólo con los átomos pesados del esqueleto peptidico. Se pueden hacer estudios de flexibilidad, dinámica, cargas, accesibilidad al disolvente…

N-termini

Determinacion de la estructura tridimensional de la toxina CgNa de la anemona Condylactis gigantea Secuencia del péptido Nuevo péptido de 5043 Da de MW Cuenta con 47 aa Aislado de una anémona marina (de las vesículas venenosas de sus tentáculos) Las toxinas de anémona se clasifican: Tipo 1 y 2: de 46-49 aa con tres puentes SS Tipo 3: 27-31 aa Actividad biológica. Bloquean (tipo 1) los canales de Na+ pudiendo ser estimulantes cardiacos Son poco tóxicas en mamíferos (más en crustáceos)

C-termini

Potencial electrostático

20 confórmeros

USP-CEU Accesibilidad disolvente 33

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34

Creación de una estructura por homología Secuenciación:

Existen varios homólogos cuyas estructuras han sido determinadas por RMN:

Se hizo por método de Edman en los primeros 38 aa Se hicieron varias digestiones con enzimas tipo tripsina y quimiotripsina y los fragmentos se determinaron por EM y por análisis secuencial El final se determino por EM

1ahl_.pdb with P(N)=1e-11 1atx_.pdb with P(N)=1e-10 1apf_.pdb with P(N)=5e-10 1sh1_.pdb with P(N)=5e-09 1shi_.pdb with P(N)=5e-09

GVHypCRCDSDGPSVHGNTLSGTVWVGSCASGWHKCNDEYNIAYECCKE

2sh1_.pdb with P(N)=5e-09

Presentan 3 o 4 láminas β y un loop poco estructurado. Esto nos ha permitido ver que: Peculiariedades

Lo que más se conserva son las CYSS con idénticos puentes SS en todos ellos.

Presenta una HYP en 3er lugar. El último aa en la secuencia es Glu pero se ve que es Gln a la vista del espectro USP-CEU

1atx presenta una identidad del 60%. Con estos 5 homólogos se obtuvo un modelo. 35

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Fases del estudio

Creación de una librería para un aa no habitual, la HYP

O O QD

N HA

HG

Adquisición Espectros TOCSY NOESY (2 tiempos m, H2O y en D2O) 1D

CARA XEASY

CYANA

•Tomamos un pdb de una proteina conteniendo HYP

AMBER

HO

QB

•Cargamos el pbd en molmol y visualizamos la estructura (1) 1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

Asignación secuencia

Estructura 3D

Depósito

•Definimos todos los enlaces del residuo con calc bond

Programas de visualización de espectros

•Creamos los seudoátomos (aquí QB y QD)

• Permiten asignar los picos y grabar las asignaciones en un lenguaje que comprendan los programas de cálculo automático y modelado posteriores. • Necesitan una librería de residuos, la secuencia y los espectros. • Generan archivos que indican el desplazamiento químico de cada átomo o seudoátomo, y otro con las asignaciones de los picos, que incluye la integral de estos y por tanto la intensidad de los NOEs USP-CEU

•Borramos toda la proteina excepto la HYP y los atomos anteriores y posteriores necesarios para la definición de los ángulos

•Salvamos la HYP como .lib •Modificamos la nomenclatura (ej: HB1 = HB3 y HB2 = HB2), teniendo en cuenta la estereoquímica •Pegar las coordenadas DYANA en la lib 37

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40

2ª Fase. Asignación de la secuencia

•NOESY (250ms)

Gln 47

•Huella dactilar

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Ejemplo de asignación

Programa automático de cálculo. CYANA •El programa se alimenta de los macro que hemos creado, los archivos peaks y prot, la secuencia y los datos sobre ssbonds. Ejecuta el calculo con una macro: calc.cya peaks

:= CgNaN.peaks

# NOESY peak lists

prot

:= CgNaN.prot

# chemical shift list

constraints := ssbonds.upl

# additional (non-NOE) constraints

tolerance

# chemical shift tolerances

:= 0.025,0.020

calibration :=

# NOE calibration parameters

structures

:= 100,20

# number of initial, final structures

steps

:= 10000

# number of torsion angle dynamics steps

Peak 11 from CgNaN.peaks (2.65, 2.84 ppm; 2.46 A): 2 out of 9 assignments used, quality = 1.00: * HB2 ASP 36 + HB3 ASP 36 OK 99 1.8=100 HB2 TYR 42 + HB3 TYR 42 OK 84 1.8=100 HB2 TYR 42 - QB TYR 38 far 0 HB2 TRP 23 - HB3 TYR 42 far 0 HB2 ASP 36 - QB TYR 38 far 0 HB2 ASP 36 - HB2 CYSS 44 far 0 Violated in 0 structures by 0.00 A.

99 100 100

1.8-1.8

84 100 100

1.8-1.8

78 64 88 81

4.8-5.4 5.0-5.3 8.0-9.0 8.6-9.8

0 0 0 0

-

# ----- NOE assignment and structure calculation -----

noeassign peaks=$peaks prot=$prot autoaco

# ----- summary -----

system "cyanatable

USP-CEU

> Table"

41

USP-CEU

42

USP-CEU

44

Criterios de éxito

Resumen del cálculo •El resumen del cálculo se halla en Table

•Importante:

Directory

: jjba17:/home/jesus/jpercas/cyana-0

Cycle

:

1

2

3

4

5

6

7

•>90% de los desplazamientos q. Asignados (excepto móviles)

Peaks: selected

:

2351

2351

2351

2351

2351

2351

2351

assigned

:

1669

1649

1586

1582

1552

1528

1532

unassigned

:

682

702

765

769

799

823

819

•RMSD