Biología Molecular

Lic. Marcelo F. Goyanes

Estructura del ADN Breve reseña histórica Hasta casi la mitad del siglo XX una de las preguntas que mantenía ocupados a los investigadores en el campo de la Biología Molecular y Celular era ¿Qué molécula posee la información genética? La mirada apuntaba principalmente a dos macromoléculas: las Proteínas y el ADN. La molécula de ADN, por ese entonces, parecía demasiado simple para “encargarse” de tamaña tarea, ya que estaba constituida por solo cuatro componentes. El mismo Levene en la década del ´20 había aseverado que, como las muestras de ADN estudiadas poseían proporciones casi iguales de las cuatro Bases nitrogenadas, el ADN debía comportarse como un tetranucleótido, en el cual los ramilletes de a cuatro nucleótidos se repetían a lo largo de la molécula de manera más que monótona. Una molécula tan monótona y repetitiva no se acercaba en lo más mínimo a la idea de una verdadera portadora de la información genética. Fue hasta la década del ´50 que gracias a las experiencias y trabajos de Alfred D. Hershey y su colega Martha Chase se pudo comprobar, a través de estudios realizados con virus Bacterianos, que la información genética era portada por la molécula de ADN. El broche de oro lo constituye el trabajo realizado por James Watson y Francis Crick quienes realizan el modelo del ADN que concordaba perfectamente con los hechos conocidos y ayudaría a explicar el papel biológico de esta molécula. No nos olvidemos que los dos jóvenes investigadores contaban ya con una suma de información más que relevante e imprescindible para el armado del modelo. Entre los datos más importantes con los que contaban podemos rescatar:
Se sabía que la molécula de ADN era muy grande, larga y delgada. Compuesta por nucleótidos que contenían las bases nitrogenadas Adenina, Timina, Citosina y Guanina.
Linus Pauling (1950) había demostrado que las cadenas de aminoácidos que componen las proteínas están dispuestas a menudo en forma de una hélice y se mantienen con esa conformación gracias a las uniones puente de Hidrógeno que se forman entre los aminoácidos de los distintos giros de la hélice. Pauling había sugerido que la estructura del ADN podía ser semejante a la hélice que presentaban las proteínas.
Los patrones de las fotografías del ADN, obtenidas hasta este momento, reflejaban los giros de una hélice de grandes dimensiones.
Erwin Chargaff analizó el ADN y confirmó que las cantidades de las Bases Púricas eran iguales a las de las Bases Pirimídicas. En síntesis, las cantidades de Adenina eran iguales a las de Timina y, las de Citosina se correspondían a las de Guanina. Con todos estos datos, Watson y Crick intentaron construir el modelo de ADN. Para llevar la gran cantidad de información genética el modelo debía considerar dos aspectos fundamentales: ser heterogéneo y variado. Armaron así el modelo en hojalata y alambre y, como quien arma un rompecabezas, encajaron cada pieza en su lugar.

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A medida que armaban el modelo, se dieron cuenta que los nucleótidos que conformaban la molécula de ADN podían encajarse en cualquier orden. Dado que la molécula de ADN posee miles de nucleótidos de largo, la variabilidad y la heterogeneidad estaban aseguradas, puesto que la combinación de las bases se volvía incalculable. Otra de las conclusiones a las que arribaron fue que la cadena poseía una dirección, ya que cada grupo fosfato está unido a un azúcar en la posición 5´ (el quinto carbono en el anillo de azúcar) y al otro azúcar en la posición 3´ (el tercer carbono en el anillo del azúcar). Así la cadena tiene un extremo 5´ y otro 3´. Lo interesante del trabajo fue el armado de la cadena complementaria. Las Adeninas únicamente podían aparearse con las Timinas y las Guaninas con las Citosinas. Pero, para que esto ocurra, la dirección de las cadenas debía ser inversa. Es así como el extremo 5´ se aparea con el 3´, vale decir que ambas cadenas son Antiparalelas. Los estudios de Watson y Crick determinaron que la conformación tridimensional del ADN consiste en dos cadenas enrolladas de tal manera que se constituye una doble Hélice. Las Bases Nitrogenadas están agrupadas unas sobre otras constituyendo lo que se conoce como Ordenamiento de Apilamiento. Si la cadena gira conformando una hélice, debe de existir un eje de rotación. El mismo está conformado por las desoxirribosas que están unidas entre sí por una molécula de Fosfato constituyendo entonces un enlace 3´- 5´ fosfodiester. Este eje azúcar - fosfato se encuentra en la parte externa de la molécula, mientras que las Bases Nitrogenadas quedan dispuestas hacia el lado interno de la misma. La doble hélice exige que cada una de las Bases Nitrogenadas de una cadena se aparee en forma complementaria con la base de la otra cadena. Este apareamiento tiene lugar mediante las uniones Puente de Hidrógeno que se forman entre las mismas. Entre las Bases Adenina y Timina se forman dos uniones Puente de Hidrógeno, mientras que entre la Guanina y la Citosina se establecen tres uniones de la misma naturaleza. No esta demás aclarar que la unión entre las Bases Citosina y Guanina será, en consecuencia, más fuerte que la que se establece entre la Adenina y la Timina.

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Figura N° 1: Estructura de una porción de la molécula de ADN. Cada nucleótido consiste en un Grupo Fosfato, un azúcar (desoxirribosa) y una Base Nitrogenada Púrica o Pirimídica. El eje de cada cadena esta constituido por la secuencia repetida de azúcar – fosfato. Cada grupo Fosfato está unido al carbono 5´ de la desoxirribosa y al carbono 3´ del siguiente nucleótido. Las dos cadenas se mantienen unidas por medio uniones Puente de Hidrógeno, que se establecen entre las bases complementarias (A-T y C-G). Se forman tres uniones P. de H. entre las bases C y G, mientras que entre la A y T se establecen solo dos. Las cadenas son antiparalelas, la dirección desde el extremo 5´a 3´de una es opuesta al de la otra.

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Topología de ADN Las cadenas de ADN pueden enrollarse una sobre otra de dos formas: en sentido horario o en sentido antihorario. Es decir que si las cadenas giran a favor del movimiento de las agujas del reloj diremos que lo hacen en sentido horario, de lo contrario el sentido que adquiere el giro será denominado antihorario. Esto determina que existan dos variantes de AND, el que se enrolla en sentido horario se denomina Right Handed ADN y el que lo hace en forma contraria se denomina Left Handed ADN o ADN Z. Right Handed ADN: Esta variante de ADN a su vez puede subdividiese en dos tipos de organización: el “ADN A” y el “ADN B”. 1. ADN A:
Las bases Nitrogenadas forman, al unirse con el eje azúcar – fosfato, un ángulo de 20°.
Por cada vuelta de la hélice, encontraremos 11 pb (pares de bases).
Es menos frecuente que el ADN B. 2. ADN B:
Las bases nitrogenadas forman un ángulo de 90° con el eje azúcar fosfato.
Por cada vuelta de la Hélice encontraremos 10 pb.
Es el tipo de ADN más frecuentemente encontrado. Left Handed ADN o ADN Z: Este tipo de ADN, como indicábamos arriba, gira en sentido antihorario. Esta disposición en el giro hace que el ADN adquiera forma de ZIG ZAG, de ahí su nombre. Por cada vuelta de hélice hay 12 pb. El ADN Z se encuentra acompañado de la unión de grupos metilo (-CH3) y juega un rol importante en la regulación de la expresión génica. Generalmente las zonas metiladas del ADN no se transcriben, es así como la distinta disposición del ADN Z en el genoma de una célula intervendrá en forma activa en la diferenciación de la misma.

Superenrollamiento: La mayoría de los esquemas que podemos llegar a visualizar del ADN lo muestran como una molécula lineal y con una estructura de doble hélice. En realidad la conformación que adquiere en el espacio dista de ello, ya que el mismo posee una estructura cerrada, constituyendo bucles. Esta estructura la adopta ya que le son agregadas fuerzas adicionales que lo mantienen empaquetado. Si además del giro que presenta (horario u antihorario) le agregamos otro giro alrededor de su eje, obtendremos una idea más acertada de su verdadera conformación. Este giro adicional, con el que se encuentra dispuesto en el espacio, se lo denomina Superenrollamiento. Ahora bien, si a algo que ya posee un giro le agregamos otro, este puede o no coincidir en su dirección con el anterior. Es así como nos veremos ante la presencia de dos tipos de Superenrollamiento: el Positivo y el Negativo.

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Superenrollamiento Positivo: Se presenta cuando el ADN se enrolla en el espacio en sentido horario, al igual que la doble hélice, quedando apretado. Este tipo de Superenrollamiento se produce en vivo sólo en condiciones especiales. Un caso típico que genera Superenrollamiento Positivo esta dado por enzimas que rompen el ADN, lo giran y luego vuelven a unirlo. Si el giro que realizan va a favor del sentido horario el número de pb por vuelta aumentará, quedando la doble hélice apretada. Estas enzimas se denominan Topoisomerasas (serán descriptas en el capítulo referido a la autoduplicación del ADN). Un caso extremo de Superenrollamiento estaría dado en el pasaje de ADN del tipo B al ADN del tipo Z. En este último caso, el ADN gira en sentido horario sobrepasando el sentido horario de la hélice original. Otro de los casos en los cuales el Superenrollamiento Positivo se hace evidente, y que veremos más adelante, lo confiere el aumento de tensión originada por delante de la horquilla de replicación durante el proceso de autoduplicación del ADN.
Superenrollamiento Negativo: En este caso, el ADN gira en sentido antihorario. De esta forma, la tensión del ADN baja y la cantidad de pb por vuelta de la hélice se hace menor. Es sumamente importante ya que, disminuyendo la tensión de la doble hélice, se hace factible la separación de las dos cadenas.

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Replicación del ADN Una de las características más notables del ADN es su capacidad de replicarse. Vale decir que el ADN es capaz de formar copias de sí mismo. El proceso de autoduplicación del ADN se lleva a cabo en el período S del ciclo celular. Esta etapa es un paso previo obligado para realizar la división celular en la etapa M de mencionado ciclo. Los genes deben poseer tres funciones principales, como portadores del material hereditario:
Deben ser capaces, por medio de una replicación fiel, de transmitir la información genética de generación en generación.

Figura N° 2: Ciclo Celular


Deben contener la información necesaria para sintetizar todas las proteínas fundamentales para permitir el normal desarrollo de la célula.
Deben aceptar cambios ocasionales como forma de evolución, es decir, deber aceptar la capacidad de mutar. La replicación permite que el ADN sea capaz de cumplir con las funciones anteriormente mencionadas. La réplica del material hereditario es un producto directo de este proceso; la información para la síntesis de las proteínas está asegurada por medio de la replicación y los errores en la replicación posibilitan y generan cambios que pueden llevar a la evolución. La replicación del ADN es Semiconservativa, puesto que las dos cadenas del ADN sirven de patrón para la síntesis de las nuevas cadenas. Cada doble hélice hija, producto del proceso de autoduplicación, tendrá una cadena recién sintetizada (nueva) y otra cadena que, con anterioridad, formaba parte de la molécula parental.

Figura N° 3: Replicación Semiconservativa del ADN. Obsérvese en la figura que las cadenas del ADN parental se conservan y pasan a formar parte de las cadenas hijas. En el esquema, las cadenas nuevas se visualizan en negrita.

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La replicación se llevará a cabo en el núcleo de la célula eucariota, e intervendrán una dotación de enzimas que se encargarán de abrir la doble hélice, incorporar los nucleótidos y disminuir la tensión que se genere por delante de ella. Enzimología de la Replicación: Con el fin de esclarecer el proceso de replicación, describiremos primero todas las enzimas que intervienen y luego desarrollaremos el proceso en su conjunto.
ADN polimerasa: Es la principal enzima de este proceso. Ella es capaz de sintetizar nuevas cadenas de ADN , a partir de una hebra patrón y las unidades estructurales correspondientes (desoxirribonucleótidos). Los desoxirribonucleótidos, para ser incorporados por esta, deben estar trifosfatados. Es decir que se necesitarán dATPs, dGTPs, dTTPs y dCTPs, para poder sintetizar las nuevas cadenas de ADN. Otra de las características principales de esta enzima, es que polimerizará los nucleótidos en la dirección 5´a 3´. Como consecuencia de esto, la dirección en la cual leera la cadena patrón de ADN será de 3´a 5´ . Un rasgo a tener en cuenta es que la ADN polimerasa NO puede iniciar su síntesis sin la existrencia de un cebador de ARN. No solamente polimeriza los nucleótidos, sino que se ha comprobado que es capaz de corregir los posibles errores que se cometan durante la autoduplicación.
Helicasas: Son las enzimas encargadas de separar las dos hebras del ADN. Estas enzimas son responsables de la ruptura de las uniones puente de Hidrógeno que se establecen entre las bases de las dos cadenas del ADN. Para poder separar las dos hebras del ADN se necesitará energía, que es obtenida de la hidrólisis del ATP. Por cada dos pares de bases que separan, se gastan dos moléculas de ATP.
Proteínas estabilizadoras de la cadena: Una vez que las cadenas del ADN son separadas, la estabilidad de las mismas disminuye considerablemente. El ADN tiende a reasociarse y, son estas proteínas quienes impiden que el ADN vuelva a su conformación inicial. Su presencia es fundamental para mantener las cadenas estiradas.
Topoisomerasas: Al producirse la duplicación, el ADN adquiere cierto grado de superenrollamiento. Imaginemos que la molécula de ADN es como una bandita elástica, a la cual le conferimos vueltas alrededor de su eje longitudinal. Si ahora tomamos uno de sus extremos y separamos cada una de sus partes veremos que, por delante de donde se produce la separación, la bandita adquirirá una mayor tensión, plegándose sobre sí misma. Lo mismo ocurre con la molécula de ADN, si la Helicasa separa las cadenas delante de donde se está produciendo la replicación aumentará, en forma más que considerable, la tensión de la molécula. Para evitar esto, las topoisomerasas cortan la doble hélice, rotan el ADN y vuelven a unirlo, evitando así que aumente la tensión por delante de la horquilla de replicación. En consecuencia, encontraremos a las Topoisomerasas por delante del lugar donde se está produciendo la duplicación.
ARN polimerasa o Primasa: Esta enzima es la que sintetiza el cebador, un primordio de ARN necesario para que la ADN polimerasa pueda iniciar la síntesis de las

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nuevas cadenas. El cebador es una pequeña porción de ARN de 10 a 12 ribonucleótidos de largo que se mantendrá unido a la cadena de ADN molde hasta que sea removido. Mecanismo de la Replicación: Ya dijimos que la duplicación se llevará a cabo durante el período S del ciclo celular y que es un proceso fundamental para que la célula pueda dividirse. El ADN actuará como patrón, ya que la ADN polimerasa agregará los nucleótidos de las nuevas cadenas por complementariedad de bases. El lugar donde transcurre la replicación se denomina Horquilla de Replicación, esta estructura tiene forma de “Y”, y es la zona donde se sintetiza el ADN para formar las dos moléculas hijas (Ver figuras Nº 4 y 5). Las horquillas de replicación se originan en una estructura denominada Burbuja de Replicación, una región en la que las cadenas de la hélice de ADN se separan una de otra, actuando como patrón para la síntesis de las nuevas cadenas de ADN. Las zonas donde se producen las Burbujas de replicación no son aleatorias, se ha demostrado que existen secuencias de bases que indican los lugares precisos donde la replicación ha de comenzar. Cada Burbuja de Replicación posee dos Horquillas de Replicación, una de las cuales se desplaza hacia la derecha y otra hacia la izquierda. Este proceso necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen. Para esto, las Helicasas se unirán a la cadena de ADN e hidrolizarán las uniones Puente de Hidrógeno que las mantienen unidas. La consecuente apertura de la doble hélice hace que las cadenas simples adquieran inestabilidad, esta es compensada por la unión de las proteínas estabilizadoras de la cadena simple. La ADN polimerasa no es capaz de iniciar la síntesis a partir de los desoxirribonucleótidos libres, por lo tanto necesitará que la Primasa sintetice en forma previa el Primer o Cebador. Una vez incorporado el Cebador, la ADN polimerasa incorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrón. Una vez que la Horquilla avance, la tensión por delante de la misma aumentará, para evitar esto las Topoisomerasas cortarán la doble hélice, la rotarán y volverán a unirla. Debido a la orientación antiparalela del ADN, una de las cadenas de la horquilla de replicación quedará en sentido 3´a 5´, por lo cual la ADN polimerasa podrá trabajar en forma continua (recordemos que esta enzima Figura N° 4: Horquilla de replicación. Síntesis de la leía en dirección 3´a 5´y cadena continua y de la discontinua. polimerizaba en dirección 5´a 3´). En cambio, la otra cadena de la Horquilla, quedará orientada en la dirección inversa (5´a 3´), por lo cual en cada Horquilla de Replicación deberán actuar al menos dos ADN polimerasas. Una de ellas podrá actuar en forma contínua, puesto que, a medida que se abra la doble hélice se encontrará con el extremo 3´ de la cadena patrón,

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pudiendo así incorporar el nucleótido correspondiente. En cambio, la otra ADN polimerasa se encontrará, cuando la apertura de la doble hélice avance, con el extremo 5’ de la cadena patrón, por lo cual será necesario incorporar otro cebador de ARN para poder continuar la síntesis. En resumen: cuando la cadena patrón presente la dirección 3´a 5´, la síntesis se realizará en forma Continua. Por el contrario, cuando la cadena patrón . presente la dirección 5´a 3´, la síntesis se realizará en forma Discontinua.

Una de las consecuencias de la síntesis Discontinua es que quedarán pequeños fragmentos de ADN, de unos 100 a 200 pb, intercalados con los cebadores. A estas porciones de ADN se los denomina Fragmentos de Okazaki, en honor al científico que los describió por primera vez. En el caso de la cadena conductora (la que se polimeriza en forma continua) es necesario la presencia de un solo Cebador, en cambio, en la cadena retardada (la que se polimeriza en forma discontinua) se necesita más de un Primer. Luego de terminada la síntesis de ambas cadenas, los Cebadores son removidos por una enzima y la ADN polimerasa agrega los nucleótidos faltantes. La enzima denominada Ligasa, se encarga de unir ambos extremos del ADN.

Figura N° 5: Proceso de Replicación del ADN. Obsérvese la Horquilla de Replicación en la cual se encuentran actuando las dos ADN polimerasas. La cadena con dirección 3´a 5´ se replica en forma continua y la de dirección opuesta lo hace en forma discontinua. La Primasa sintetiza el Cebador. La Topoisomerasa actúa en forma adelantada a la Horquilla de Replicación, disminuyendo el superenrollamiento positivo.

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Energética de la Replicación: Ya hemos mencionado que las unidades estructurales utilizadas en este proceso son los desoxirribonucleótidos. También se dijo que los mismos debían encontrarse trifosfatados para poder ser utilizados por la ADN polimerasa. Es así como se utilizarán Desoxiadenina trifosfato (dATP), Desoxiguanina trifosfato (dGTP), Desoxicitosina trifosfato (dCTP) y Desoxitimina trifosfato (dTTP). Antes de incorporar el nucleótido a la cadena patrón, la ADN polimerasa escinde dos de los tres grupos fosfato de los mismos, quedando así monofosfatados y liberándose por cada uno un PPi. Esta ruptura de los enlaces de alta energía que mantenía unidos a los P libera energía, que es utilizada para impulsar las reacciones catalizadas por la ADN polimerasa. Replicación en Células Procariotas y Eucariotas: La gran mayoría de la información con la que contamos, en materia de la replicación del ADN, se obtuvo a partir de investigaciones realizadas en organismos Procariotas. Sin embargo, no hay diferencias sustanciales entre ambos procesos. La principal diferencia radica en que las células Procariotas replican el ADN en forma desnuda, puesto que en las células Eucariotas el ADN se encuentra es estado de Cromatina. Esta Cromatina esta básicamente formada por ADN y proteínas básicas denominadas Histonas. Como veremos más adelante, las Histonas se unen al ADN y ayudan al empaquetamiento del mismo. Las proteínas nucleares frenan el accionar de la ADN polimerasa, por lo tanto, la velocidad de replicación en las células Eucariotas es diez veces menor que en las células Procariotas. Basándose en esto, también es posible explicar la diferencia entre la longitud de los Fragmentos de Okazaki. En las células Procariotas, los segmentos de Okazaki poseen una longitud de 1000 a 2000 pb en cambio, en las células Eucariotas, los Fragmentos adquieren longitudes de apenas 100 a 200 pb. Una de las explicaciones posibles es la disposición de las histonas a lo largo de la molécula de ADN, esta longitud de 200 pb coincide con los tramos de ADN que quedan desprovistos de mencionadas proteínas. Figura N° 6: Replicación del ADN. La figura muestra el proceso por el cual se inicia la burbuja de replicación. A) La replicación se inicia en una secuencia de 300 pb, que indican el origen de la misma. B) La doble hélice se abre, conformando la burbuja de Replicación, la Primasa sintetiza el Cebador. C) Una vez sintetizado el cebador, la ADN polimerasa comienza a sintetizar la nueva cadena de ADN. D) Se originan dos Horquillas de replicación completas, una de las cuales se desplaza hacia la izquierda con la cadena continua en la parte superior y la retrasada en la parte inferior, y la otra hacia la derecha, con la cadena continua en la parte inferior y la cadena retrasada en la parte superior.