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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
METODO HPLC PARA LA CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSAMINA EN QUITINA DE RESIDUOS DE CAMARÓN
TESIS PARA OBTENER EL TITULO DE
INGENIERO BIOTECNOLOGO
PRESENTA KARINA EDITH DELGADO ROSAS
CD. OBREGÓN, SONORA
OCTUBRE
Octubre 2005
DEDICATORIAS A dios por darme la vida y otorgarme la fuerza para seguir adelante. A mi mama por apoyarme siempre y confiar en mi, le doy las gracias por que siempre ha luchado para sacarnos adelante sin ella no hubiera logrado esta meta importante en mi vida te quiero. A mi hermanita por que siempre he contado con su amistad y apoyo para hacer las cosas y te agradezco la paciencia que me has tenido. A mi tía Silvia por el cariño que siempre me ha brindado y porque ha sido como mi segunda mama. A mis padrinos por la confianza y cariño que siempre me han demostrado. A Santiago por brindarme su cariño y amor durante estos años y apoyarme en todo momento gracias flaco.
i
AGRADECIMIENTOS A mis asesores: Dr. Jaime López y Dra. Dalia Sánchez por el apoyo y confianza que me brindaron para realizar este trabajo. A mis revisores: M.C Roberto García y M.C Jorge Cabrera. A mis amigos con los que siempre conté en todo momento, Raúl mi hermanito te agradezco el apoyo q siempre me has brindado, Lilian por hacerme reír en los momentos tristes, al pollo por ser un muy buen amigo, Bedoy por que siempre he contado con su apoyo, Mario te aprecio monito, Shagy, Fernando, Henry, Pancho, Helga, Marcia, Arely, Mario, Jesús, Daniel, Carlita a todos ellos por ser parte importante de mi vida. A mis compañeros de tesis Raúl, Lilian, Oliviert, Alfredo, Patricia, Berenice y Teresa por que siempre me brindaron su apoyo y motivación par a seguir adelante.
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INDICE LISTA DE TABLAS …………………………………………………………………... v LISTA DE FIGURAS …………………………………………………………………
vi
RESUMEN…………………………………………………………………………...... vii INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………..
1
OBJETIVOS…………………………………………………………………………… 3 JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………
5
HIPÓTESIS……………………………………………………………………………. 7 I.- REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 1.1 Obtención de quitina a partir de fermentación láctica...……………………...
8
1.1.1 Características fisicoquímicas de la cabeza de camarón……........
8
1.1.2 Fermentación láctica………………………………………………........
10
1.2 Quitina como fuente de glucosamina…………………………………………
13
1.2.1 Quitina…………………………………………………………………….
13
1.2.1.1 Propiedades fisicoquímicas………………………………...
13
1.2.1.2 Fuentes y usos…… ………………………………………….
14
1.2.1.3 Procesos de purificación de quitina…………………...........
15
1.2.2 Glucosamina……………………………………………………………..
18
1.2.2.1 Propiedades fisicoquímicas………………………….……...
18
1.2.2.2
Fuentes y usos……………………………………………….
19
1.3 Cromatografía……………………………..……………………………….........
20
1.3.1 Conceptos sobre cromatografía……………………………….……….
20
1.3.2 Instrumentación…………………………………………………………..
21
1.3.2.1 Detectores……………………...………………………………..
21
1.3.2.2 Columnas………………………..………………………………
21
1.3.3 Validación del método…………………………………………………...
22
1.3.4 Reactivos de derivatización………………………………………..……
24
1.4 Antecedentes bibliográficos de los métodos para la determinación de glucosamina…………………………………………………………………………… 26 1.4.1 Tratamientos de preparación de la muestra…………………………
26
iii
1.4.2 Derivatización…………………………………………………………..
27
II. MATERIALES Y METODOS 2.1 Patrones y reactivos químicos………………………………………………….
30
2.2 Obtención de quitina……………………………………………………………..
31
2.2.1 Condiciones de la fermentación………………………………………..
31
2.2.2 Purificación de quitina……………………………………………………
32
2.3 Preparación de la muestra……………………………………………………..
33
2.3.1 Hidrólisis de la muestra…………………………………………………
33
2.3.2 Derivatización……………………………………………………………
33
2.4 Equipo y condiciones HPLC…………………………………………………….
34
lll. RESULTADOS Y DISCUSION 3.1 Ensayos preliminares…………………………………………………………….
36
3.2 Preparación de la muestra………………………………………………………
37
3.3 Condiciones cromatográficas…………………………………………………..
37
3.4 Identificación de glucosamina………………………………………………….
39
3.5 Validación del método…………………………………………………………..
40
3.5.1 Linealidad…………………………………………………………………
40
3.5.2 Precisión………………………………………………………………….
44
3.5.3 Recuperación…………………………………………………………….
44
3.6 Análisis de la muestra……………………………………………………………
45
3.6.1 Humedad y cenizas……………………………………………………..
45
3.6.2 Contenido de glucosamina………………………………………………
46
CONCLUSIÓN………………………………………………………………………..
47
BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………….
48
iv
LISTA DE TABLAS Tabla
Título
Pagina
1
Composición química del camarón............................................
10
2
Tratamiento de preparación de la muestra……………….…......
28
3
Condiciones cromatográficas para el análisis de glucosamina propuesta por diferentes autores………………………………….
29
4
Programa de la bomba……………………………………………..
35
5
Condiciones cromatográficas establecida para el análisis……..
39
6
Datos de calibración de glucosamina……..……………………...
43
7
Valores de precisión del método………………………………….
44
8
Valores de recuperación del método……………………………..
45
9
Contenido de humedad y cenizas de quitina…………………….
45
v
LISTA DE FIGURAS Figura
Título
Pagina
1
Partes del camarón....................................................................
2
2
Estructura de la quitina..............................................................
7
3
Estructura de la glucosamina....................................................
12
4
HPLC cromatogramas de glucosamina en hidrolizados de quitina. (A) Detector UV (264 nm); (B) Detector de fluorescencia (λex 270 nm, λem 316 nm)…………………………
5
Cromatograma de la muestra con el espectro de absorción de la glucosamina………………………………...………………..
6 7
38 41
Comparación entre cromatogramas (A) Blanco, (B) Patrón, (C) Muestra ………………………………………………………...
42
Recta patrón de glucosamina…………………………………….
43
vi
RESUMEN El presente trabajo describe el desarrollo de un método HPLC para el análisis de glucosamina en quitina obtenida a partir de la fermentación de desechos de camarón. La quitina se hidroliza con ácido clorhídrico; y la glucosamina obtenida es derivatizada con 9-fluorenil metil cloroformato (FMOC). La separación se llevo a cabo en una columna SGE Hypersil ODS C18
250
mm x 4.6 mm, 5 μm y
detección de ultravioleta a 264 nm; la fase móvil es un gradiente de tres soluciones: fase A (30mM fosfato de amonio pH 6.5 en 15:85 metanol-agua), fase B (15:85 metanol-agua) y fase C (90:10 acetonitrilo-agua) a una velocidad de flujo de1.20 ml/min, con una temperatura de la columna de 38 ºC. Con las condiciones cromatográficas establecidas se ha validado el método a través de parámetros como precisión (2.58), linealidad (0.9995) y recuperación (89.05).
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INTRODUCCIÒN
La quitina es el polisacárido más abundante en la naturaleza que contiene aminoazúcares, y está asociado con proteínas y minerales. En la actualidad este biopolímero se obtiene industrialmente aislándolo de desperdicios generados en el procesamiento de crustáceos, tales como caparazones de camarón y jaiba (Pinelli et al., 1998). Los aminoazúcares contribuyen una cantidad significativa de entre 5 y 12% de N orgánico al suelo, siendo los más importantes glucosamina, galactosamina, ácido murámico, y manosamina, aunque existe una variedad de otros aminoazúcares. Las células fúngicas contienen en sus paredes grandes cantidades de glucosamina y son la fuente principal de este componente en el suelo, aunque el exoesqueleto de los invertebrados y las paredes de células bacterianas también están constituidos de glucosamina.
Introducción
Existe una gran variedad de métodos para la determinación de los amino azúcares después de la hidrólisis de la materia orgánica, como lo son cromatografía de gases la cual es muy sensible y tiene una alta especificidad, pero el procedimiento de la derivatización de los productos de la hidrólisis implica la producción de componentes volátiles; con la cromatografía de líquidos (HPLC) también necesita pasos de derivatización para determinar los amino azúcares, sin embargo, esto se puede realizar hoy automáticamente por el sistema de HPLC como derivatización de la pre-columna (Joergensen, 2004). Los reactivos utilizados en la derivatización pre-columna incluyen fenilisotiocianato (PITC), Orto-ftalaldehido (OPA), 1-dimethylaminophthalene-5-sulphonyl (dansyl) y 9- fluorenil- metil cloroformato (Fmoc-Cl) (Haynes, 1991). Recientemente, químicos orgánicos han establecido formas de utilizar la quitina. Una de las aplicaciones más importantes es el uso de la quitina para inmovilizar enzimas. Además, estos polímeros pueden servir como acarreadores no absorbibles de ingredientes altamente concentrados (colorantes, saborizantes y nutrientes), cuya descarga puede ser controlada por la lisozima (Luvian et al., 1993).
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OBJETIVO
Analizar la pureza de la quitina de residuos de camarón a partir de la cuantificación de glucosamina, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
OBJETIVO ESPECIFICO
Determinar el grado de pureza de quitina extraída, mediante cenizas, glucosamina y humedad. Evaluar la calidad de quitina obtenida, comparándola con comercial.
una quitina
Objetivo Estandarización de la metodología HPLC utilizando derivatización con FMOC-Cl (9-Fluorenylmethyl cloroformato) y detección por ultravioleta. Determinar la calidad de la quitina en relación al contenido de glucosamina cuantificada
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JUSTIFICACIÓN
En toda industria moderna rentable destinada a la producción de alimentos se producen cantidades de residuos orgánicos, que de no ser utilizados en la generación de otros productos para el consumo humano o animal, representan un problema operacional y en ocasiones legal para la industria y una fuente de contaminación ambiental. Este problema es uno de los más críticos para la industria de la pesca a nivel mundial, debido a las grandes cantidades de residuos orgánicos que se generan y se descartan en el mar o en tierra (vertederos). Actualmente, estos residuos orgánicos representan un 60% de la materia total resultante del procesado de pescadería para el consumo humano.
Justificación
Debido a la preocupación que genera la disposición de estos residuos como posibles contaminantes del medio ambiente (agua, suelos y aire) y la incapacidad de costear un sistema de manejo de desperdicios efectivo, se crea el interés en evaluar
nuevas
tecnologías
alternas
para
su
disposición
que
sean
económicamente factibles. El procesar el residuo de camarón no solo resuelve un problema ambiental, sino que también ayuda a obtener productos tales como lo la quitina la cual tiene un alto valor comercial esto dependiendo de su grado de pureza y de sus propiedades. El grado de pureza que se obtenga en la quitina va a depender de el tratamiento que se le de a la misma. Por ello, en este trabajo se propone un método HPLC para cuantificar la glucosamina presente en la quitina obtenida y así determinar su calidad. Por lo anterior, en esta investigación se pretende desarrollar una alternativa para conocer la pureza de la quitina obtenida del fermentado de la cabeza de camarón; de esta manera se aprovecharán los desechos de la industria camaronícola.
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HIPOTESIS
La calidad de la quitina puede ser evaluada en función del contenido de glucosamina.
I.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 Obtención de quitina a partir de fermentación láctica.
1.1.1
Características fisicoquímicas de la cabeza del camarón
El camarón es un crustáceo decápodo, macruro de tamaño y color variable. Su cuerpo es algo encorvado y esta dividido en 2 partes cefalotórax y abdomen. El cefalotórax, es una combinación de cabeza y tronco en una sola unidad, el cual esta cubierto por un caparazón que contiene a la cabeza, los órganos vitales del animal, tres pares de patas prensoras y dos caminadoras. El abdomen se divide en seis segmentos. El último de ellos termina en una punta fina llamada telsón y por debajo esta la cola que le sirve para nadar (Capiña, 1995). La figura 1 representa al camarón con cada una de sus partes, se observa que alrededor del 50% del camarón esta constituido por el cefalotórax y corresponde a
Revisión Bibliográfica la fracción no comestible y el cual es considerado como un desecho en la industria de la camaronicultura (Desrosier,1992). Esto da idea de los volúmenes de desechos de camarón que se producen en México (Cañipa, 1995).
Fuente: Soluap, 1998
Figura 1. Partes del camarón
El camarón es excepcionalmente nutritivo. Es un alimento con alto contenido de proteínas y bajo en grasas, en la tabla 1 se presenta la composición química de la porción comestible del camarón.
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Revisión Bibliográfica
Tabla 1. Composición química del camarón Composición
Parte comestible
Agua (g)
78.2
Proteína (g)
18.1
Grasa (g)
0.8
Carbohidratos (g)
1.5
Niacina (mg)
3.20
Calcio (mg)
63.00
Fósforo (mg)
166.00
Hierro (mg)
1.60
Tiamina (mg)
0.02
Calorías cal
91.00
Fuente: Charley, 1995
La riqueza del cefalotórax de camarón en lo que respecta a sus componentes; quitina, proteína y pigmentos, lo convierten en una fuente susceptible de ser procesada para obtener subproductos útiles en la industria alimentaría, cosmética y farmacéutica (Cañipa, 1995). La basura o residuo de camarón contiene 26.5 % de materia seca de la cual el 74 % es material orgánico (principalmente proteínas y quitina del tejido fino), y el resto, 26 % corresponde a los minerales (Gildberg, 2001).
1.1.2
Fermentación láctica
La fermentación inhibe el deterioro dentro del pescado mediante el incremento d el nivel de acidez. Durante la fermentación, el uso de sal inhibe la acción del deterioro bacteriano y permite que las enzimas del pescado o las bacterias beneficiosas productoras de ácido descompongan la carne. La fermentación puede definirse como la acción controlada de microorganismos benéficos sobre
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Revisión Bibliográfica los alimentos para alterar su sabor o textura y para prolongar su vida de anaquel (Rao et. al., 2000)
Las fermentaciones lácticas son aquellas en donde el ácido es producido in situ por bacterias lácticas a partir de una fuente de carbohidratos, y los microorganismos responsables pueden pertenecer a la microflora natural o ser cultivos iniciadores (Frazier, 1993).
El ensilaje de residuos de pescadería, puede designarse como “pescado líquido” o “concentrado de proteínas”, y se produce mediante fermentación anaeróbica o acidificación directa. Por ensilaje de acidificación directa, se entiende el producto resultante de la mezcla de residuos pesqueros con ácidos orgánicos e inorgánicos que reducen el pH lo suficiente como para prevenir el deterioro del residuo (León, 2003)
El ensilaje biológico implica el uso de microorganismos para generar ácido in situ, mientras que, el ensilaje químico usa ensilaje
mineral químico
o ácido orgánico. El
de pescado para la bioconversión del desecho se ha estudiado
extensamente para aumentar la productividad de la industria de mariscos (Cira e.t al., 2002).
Condiciones para la fermentación láctica La eficiencia de la fermentación que utiliza bacterias ácido lácticas depende de factores tales como la cantidad de inóculo, la glucosa, pH inicial y el pH durante la fermentación, la cantidad y el tipo del ácido utilizado y del tiempo de fermentación (Rao, et. al., 2000).
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Revisión Bibliográfica La mayor influencia en el crecimiento de bacterias lácticas y la velocidad con la cual decrece el pH de la fermentación son debido a: o Fuente de carbohidratos. En pescados y crustáceos frescos es muy baja la cantidad de carbohidratos libres, por lo tanto es necesario agregar alguna otra fuente de carbono para la buena producción de ácido en la fermentación. o Factores orgánicos de crecimiento. Las vitaminas, aminoácidos y otros factores orgánicos de crecimiento son requeridos para el crecimiento de las bacterias lácticas, estos factores son disponibles en cantidades adecuadas a partir de los músculos del pescado y crustáceos. o Condiciones anaerobias. La pronta exclusión del oxígeno durante las etapas iniciales de la fermentación es un factor importante en la reducción del crecimiento de las bacterias Gram negativas, las cuales son contaminantes antes de que se establezcan las condiciones acidificantes (Armenta, 1998) o Temperatura. La temperatura puede ser considerada como un factor que influye en la composición de la población microbiana y del sabor final de las fermentaciones naturales. Las temperaturas altas promueven el rápido crecimiento de microorganismos indeseables. o Concentración de sal. La sal tiene una doble función en la fermentación, disminuyendo el agua libre, y ayudando a las bacterias lácticas en la competencia con bacterias contaminantes y peligrosas. o Concentración de ácidos orgánicos y valor de pH. El crecimiento de las bacterias lácticas es necesariamente acompañado por la producción de
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Revisión Bibliográfica ácido láctico y, en algunas circunstancias, de ácido acético, en consecuencia se disminuye el valor de pH en el medio. Bacterias lácticas En el proceso de ensilado biológico, es común utilizar inóculos de bacterias productoras de ácido láctico tipo homofermentativos de los géneros Lactobacillus, Pediococcus o Streptoccoccus y fuentes de carbohidratos como la melaza de caña para acelerar el proceso fermentativo. Además, una fermentación apropiada se genera a una temperatura óptima a la cuál los microorganismos proliferan y alcanzan poblaciones de 108 u.f.c. /g después de 4 a 8 días. Durante este proceso ocurre un cambio rápido en la composición bacteriológica, generando una dominancia de bacterias productoras de ácido láctico y la inhibición de microorganismos indeseables causantes de efectos negativos de deterioro en el ensilaje. El crecimiento y densidad de la población bacteriana del ensilaje varía según el tipo de materia prima presente (León, 2003).
1.2 Quitina como fuente de glucosamina
1.2.1 Quitina
1.2.1.1 Propiedades fisicoquímicas La quitina es un polisacárido formado por unidades de 2-acetamido-2desoxiglucosa, con uniones beta 1-4, su nombre químico es poli (1,4)-N-acetil-Dglucosamina, ver figura 2. Pertenece a una familia de productos derivados de los complejos naturales de quitina-proteína.
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Revisión Bibliográfica La quitina puede ser biodegradada por efecto de las glicosidasas, especialmente de la lisozima. Además presenta muy baja capacidad antigénica, por lo que se ha propuesto su uso en aplicaciones biomédicas y farmacéuticas (Romero et. al., 1995).
Fuente: www.fao.org/docrep/ field/003/ab492s/AB492S02.htm
Figura 2. Estructura de la quitina
La quitina es un sólido de color blanco translúcido prácticamente insoluble en agua, ácidos diluidos, álcalis concentrados o diluidos, y solventes orgánicos; además, los ácidos inorgánicos concentrados la degradan. La quitina sufre degradación a altas temperaturas, no puede resistir temperaturas mayores de 100120 ° C (Fernández, 2002; Cañipa, 1995).
1.2.1.2 Fuentes y usos La quitina es sintetizada por algunos organismos unicelulares como las diatomeas y los protozoarios. La proporción de quitina con respecto al peso seco total del 14
Revisión Bibliográfica cuerpo, es más alta en los crustáceos que en otros animales, lo cual hace que sea la principal fuente para la obtención del polímero (Romero et. al., 1998). Estos polímeros han encontrado variada aplicación en industrias como la textil, la alimentaría y fundamentalmente la farmacéutica (Fernández, 2002). La quitina es un polímero de origen natural que posee actividad como acelerador de la cicatrización y reconstructor. Su efecto farmacológico, unido a su carácter biocompatible y atóxico, han propiciado su introducción con éxito en diferentes formas farmacéuticas (Suárez et. al., 1999) La quitina como sus derivados tiene una serie de propiedades que los hacen muy atractivos por su gran variedad de aplicaciones, en alimentos, nutrición, cosmética, hasta
la
biomedicina,
agricultura
y
medio
ambiente.
Sus
propiedades
antibacteriales y antivirales están muy indicadas para las aplicaciones de la medicina biológica, en la cura de heridas, suturas y como ayuda en las operaciones de cataratas y tratamiento de las enfermedades periódicas. La quitina es totalmente biodegradable y por sus aplicaciones antihongos está muy recomendado
para
la
agricultura
y
el
medio
ambiente.
http://evven.5u.com/text/sobre_chitin_y_quitosan.htm.
1.2.1.3 Procesos de purificación de quitina Despigmentación Los pigmentos carotenoides que se encuentran en el cefalotórax de camarón presentan estructuras muy parecidas entre sí, y globalmente se conocen como astaxantinas. Para extraer el pigmento, el principal obstáculo lo constituye la unión con las proteínas. En estado natural, hay una mutua interacción entre proteínas y
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Revisión Bibliográfica carotenos que aumenta la estabilidad de los últimos. Si esta unión se debilita o se rompe, entonces la estabilidad de los carotenos decrece (Cañipa, 1995) Varios autores han probado diferentes sistemas de extracción, tales como acetona, éter de petróleo, aceite se soya, mezclas de éter de petróleo-acetonaagua y acetona ciclohexano (Cañipa, 1995). Cira et. al., (2001) ha utilizado una mezcla de solventes constituido por cloroformo, metanol y agua (1:2:4) a 25 ºC, para la extracción de pigmentos de los desechos del camarón.
Desproteinización
Química
La extracción química de proteínas del cefalotórax de camarón implica un tratamiento con NaOH y calor. Las proteínas se pueden recuperar del filtrado proveniente de dicho proceso, si son centrifugadas, ajustadas a pH de 4.5 con HCl, centrifugadas por segunda vez, y secadas en un horno con vacío a 50 °C durante 8 horas. La recuperación de proteínas de los desechos de camarón requieren sólo que se neutralice el medio, lo cual a la vez facilita la formación de sales en la proteína recuperada (Cañipa, 1995). En el proceso químico, los esqueletos de crustáceo se tratan generalmente con la solución (1-10%) de NaOH a temperaturas elevadas (65-100 °C) en donde se disuelve la proteína presente. Algunos autores mencionan también el uso de una gran variedad de agentes para este paso tales como NaOH, el Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Na2SO3, NaHSO3, CaHSO3, Na3PO4 y Na2S
(Goycoolea et. al.,
2000).
16
Revisión Bibliográfica Los tratamientos alcalinos más utilizado por diferentes autores son realizados con Na2CO3 a concentraciones arriba a 0.1 M, a 100 °C durante 4 horas (Goycoolea et al, 2000). Lizardi
Enzimática
(1998),
utilizó un extracto enzimático de páncreas de porcino para
desproteinizar la cáscara de camarón logrando remover el 82 % de la proteína presente. El uso de enzimas proteolíticas es sencilla y económica, además es una alternativa a métodos químicos empleados actualmente en la preparación de quitina. Podría ser especialmente útil para la conservación del estado natural de este polímero. También es importante
el hecho de que el líquido de
desprotenización puede ser utilizado para la recuperación de la proteína para su uso en alimentación o suplemento animal, y con bajo nivel de minerales (Gagne et. al., 1993). Gagne et. al., (1993), utilizaron 2 tipos de enzimas proteolíticas para la obtención de quitina a partir del desecho del camarón, estas fueron papaina y quimotripsina, encontrando que ambas enzimas son eficientes para separación de la proteína presente. Desmineralización Las sales minerales, principalmente fosfatos y carbonatos de calcio son el segundo componente más abundante del cefalotórax, estas sustancias se encuentran asociadas a la quitina y a las proteínas, dándole al animal la rigidez que lo caracteriza.
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Revisión Bibliográfica La materia mineral puede ser removida con solventes tales como ácido acético y el ácido clorhídrico especialmente al carbonato de calcio y otras sales presentes (Pinelli, 1998).
La desmineralización con ácido sulfuroso es económicamente atractiva sólo en operaciones comerciales muy grandes, pues su principal ventaja la constituye un sistema de recirculación muy costoso. Para operaciones comerciales de pequeña y mediana escala se utiliza HCl (Pinelli, 1998). Decoloración El color es una propiedad de la materia que tiene una gran importancia en cuanto a la aceptación o rechazo de un producto por parte de los consumidores, esto se debe a que el color es el primer contacto que tiene el consumidor con los productos y posteriormente los juzga por sus otras características (Badui, 1990). El hipoclorito de sodio es una sustancia blanqueadora que decolora o blanquea un sustrato por acción química. Esta acción puede ser por procesos de oxidación o reducción, que hacen que las sustancias de color en el sustrato sean más solubles y se eliminen más fácilmente durante su proceso (Kirk y Othmer, 1998).
1.2.2 Glucosamina
1.2.2.1
Propiedades fisicoquímicas
La D-glucosamina (2-amino-2-desoxi-D-glucosa) es una molécula de glucosa modificada por reemplazo de un grupo OH por un grupo NH3 que se encuentra en el segunda átomo de carbono, es un aminoazúcar ampliamente difundido (figura 3).
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Revisión Bibliográfica
Fuente: Wilcox, 2003.
Figura 3. Estructura de la glucosamina
Es una molécula pequeña, su peso molecular es de 215.63 y es muy hidrosoluble, por lo que es absorbida con facilidad por las células intestinales por medio de transporte activo. Su solubilidad es de 0.1 g/ml en agua y tiene un color claro.
1.2.2.2 Fuentes y usos La D-glucosamina se encuentra en muchos polisacáridos de los tejidos de los vertebrados y es también componente principal de la quitina, polisacárido estructural presente en el exoesqueleto de los insectos y de los crustáceos (Lehninger, 1995). La glucosamina, es un componente natural de las glicoproteínas encontradas en tejidos finos conectivos y membranas de la mucosa gastrointestinales. Además tiene potencial terapéutico para el tratamiento de una variedad de enfermedad, incluyendo artritis,
enfermedades
inflamatorias del intestino, y de daño
inflamatorio general (Zhu et. al., 2005).
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Revisión Bibliográfica Es uno de los mayores bloqueadores de la síntesis natural del cuerpo, de los lubricantes críticos y de los amortiguadores necesarios para restaurar y mantener saludables las coyunturas o articulaciones (http://www.riovel.com/glucosam.htm).
1.3 Cromatografía
1.3.1 Conceptos sobre cromatografía La cromatografía es una técnica de separación de los constituyentes de una mezcla. Se ha convertido en un método analítico de primer orden para identificar y cuantificar los compuestos de una fase líquida o gaseosa homogénea. El principio básico se fundamenta en los equilibrios de distribución de los compuestos presentes entre dos fases no miscibles de la que una, llamada estacionaria, está inmovilizada en una columna o fijada sobre un soporte y la otra, llamada móvil, se desplaza al contacto de la primera. La elusión (proceso en el cual, se separan los solutos a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil) a velocidades diferentes de los compuestos presentes por la fase móvil conduce a su separación. De todos los métodos analíticos e instrumentales, la cromatografía es el que tiene el mayor campo de aplicabilidad y por ello, ocupa una posición dominante (Rouessac y Rouessac, 2003).
El HPLC es una técnica cromatográfica de reparto o posición en la que la muestra se fracciona entre una fase móvil que es líquida y una fase estacionaria y es la técnica más utilizada de todos los tipos de cromatografía de elusión, conociéndose como tal al desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente (Bermejo, 1991).
20
Revisión Bibliográfica 1.3.2 Instrumentación
1.3.2.1
Detectores
El papel del detector es indicar los momentos de aparición de los componentes, y proporcionar indicación cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deberá reunir una serie de características como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad, amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presión y la temperatura (Hernández, 2002). Características de los detectores: -
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una señal eléctrica medible.
-
Linealidad. Rango de masa o concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviación arbitraria.
-
Rango dinámico lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
- Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la evaluación de la cantidad mínima detectable y el límite inferior del rango lineal. -
Límite de detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal que sea el triple del nivel de ruido.
La separación efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. Un cromatograma es una imagen que se traduce visualmente en una pantalla o en un papel, en función del tiempo, y de un parámetro que depende de la concentración instantánea del soluto a la salida de la columna. Este gráfico se obtiene gracias a un detector situado a la salida de la columna (Rouessac y Rouessac, 2003).
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Revisión Bibliográfica 1.3.2.2 Columnas En las columnas cromatográficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que permiten su separación (Loro, 2001). El material de las columnas cromatográficas suele ser de acero inoxidable cuya longitud varía de 5 a 30 cm, y un diámetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas aumenta al disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria (Harris, 2001).
Skoog, et. al., (2001), reportan los típicos rellenos de las partículas porosas para cromatografía de líquidos los cuales están formados por micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 μm, con la menor dispersión posible con respecto a un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio iónico, aunque, sílice es el material de relleno más común en cromatografía de líquidos.
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna con otra más corta, la precolumna, que retiene por adsorción las impurezas (Harris, 2001).
1.3.3 Validación del método Validar el método significa el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. Para iniciar la validación es necesario previamente:
Tener perfectamente caracterizado el analito.
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Revisión Bibliográfica
Trabajar con una composición definida, puesto que cambios en la composición incluso a niveles de excipientes afectarán probablemente al procedimiento analítico.
Trabajar suficientemente con el método de análisis como para que nuestro conocimiento acerca de éste, nos ofrezca garantías de que la validación puede ser satisfactoria.
Las características de fiabilidad son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de validación y comprenden varios criterios. Selectividad: Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultáneamente o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra. Linealidad: Se define como la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Rango: Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior para las cuales se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método. Precisión: es la capacidad de un método para proporcionar resultados próximos entre sí. Se puede a tres niveles: repetibilidad: evalúa la precisión del método (precisión intraensayo); precisión intermedio: evalúa la precisión frente a variaciones de analista, equipo y día; reproducibilidad: evalúa la precisión entre laboratorio.
23
Revisión Bibliográfica Repetibilidad del sistema instrumental: Este parámetro estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento, y se determina analizando repetidamente una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces. Repetibilidad del método: Se efectúa con una serie de alícuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación de la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista. Puede realizarse con un mínimo de 6 muestras a la concentración nominal o un mínimo de 3 muestras a tres niveles de concentración cubriendo el intervalo especificado (un total de 9 muestras).
Exactitud:
expresa
la
proximidad
entre
el
valor
que
es
aceptado
convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia y el valor experimental encontrado. Límite de cuantificación: Se define como la cantidad mínima de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precisión. Límite de detección: Se define como la mínima cantidad de un analito en una muestra que puede ser detectado aunque no necesariamente cuantificado con precisión y exactitud.
1.3.4 Reactivos de derivatización para compuestos amino La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Debería ocurrir cuantitativamente para generar productos sencillos para cada aminoácido, y el reactivo no debería interferir. Es probable que la derivatización genere productos que son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la alta selectividad de separación de los sistemas cromatográficos implica que raramente haya problemas.
24
Revisión Bibliográfica La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de detección más alta (Burriel, 2003). Orto–ftalaldehído (OPA) El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina en la postcolumna de derivatización y suministró un significante incremento en la sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto fluorescente. La separación en fase reversa seguida de detección fluorescente constituye un método de detección rápido, sensible y selectivo para todos los aminoácidos con grupos amino primario. Fenilisotiocianato (PITC) El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado para la secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisis de aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente más usado para precolumnas de derivatización, seguido de cromatografía en fase reversa, en análisis de aminoácidos, siendo empleado para mezclas de aminoácidos de una gran variedad de fuentes. Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl) El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todavía usado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis de aminoácidos.
25
Revisión Bibliográfica El FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperatura ambiente para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varían en función del pH y de la proporción de reactivo y aminoácido.
1.4 Antecedentes bibliográficos de los métodos para la determinación de glucosamina Existen diferentes métodos para la determinación de glucosamina, pero cada uno posee dificultades. El problema más común es la sensibilidad, debido a que la glucosamina no es cromofóra (Thrall, 2004). Algunos de los métodos utilizados para la determinación de este compuesto, son cromatografía de gases el cual tiene una alta especificidad y es muy sensible (Joergensen, 2004), otro método utilizado para este tipo de análisis es el de colorimetría. El método más extensamente usado para la determinación de glucosamina es principalmente HPLC fase reversa, con una precolumna de derivatización, la cual tiene la ventaja de tiempos cortos de análisis, instrucciones de uso relativamente sencillas y un bajo costo (Sánchez – Machado et. al., 2003).
1.4.1 Tratamientos de preparación de la muestra La determinación de glucosamina se basa en varias etapas una de ellas es la de la preparación de la muestra, otra etapa involucra el análisis cromatográfico. En la tabla 2 se presenta el manejo sugerido de las muestras por diferentes autores en investigaciones previas.
26
Revisión Bibliográfica 1.4.2 Derivatización La derivatización de la glucosamina es una de las alternativas para realizar su análisis. Dependiendo de las características de la muestra y los reactivos de derivatizacion utilizados, las condiciones cromatográficas serán distintas, por lo que en la tabla 3 se hace referencia a otros trabajos para determinar las condiciones ideales para el análisis.
27
Revisión Bibliográfica Tabla 2. Tratamientos de preparación de la muestra
AUTOR
PROCEDIMIENTO La muestra fue tratada con NaOH 0.2N por 6 horas a 20 °C y a 100 °C por
Ekblad y Nasholm otras 17.5 horas y lavadas 4 veces con agua destilada, después fueron (1996)
hidrolizadas con HCl 6N a 100 °C por 7 horas.
500 mg de muestra fueron colocados en tubos de 20 ml y mezclados con Joergensen, et.al.,
10 ml de HCl 6 M transferidos a un evaporador y calentados por 6 horas a
(2004)
105 °C. El hidrolizado es filtrado y se toman alícuotas de 0.5 ml y son evaporados a 40 °C, Después es redisuelta con 0.5 ml de agua y evaporado nuevamente. Finalmente el residuo es nuevamente redisuelto con 1 ml de agua y centrifugado a 5000 g. El sobrenadante es transferido a viales para el analisis HPLC.
Wu, et.al .,
La muestra fue hidrolizada con HCl 6N a 110 °C. El hidrolizado fue
(2004)
neutralizado con acetato de sodio.
Cheng, et.al .,
La muestra fue hidrolizada por 12 horas a 100 °C con HCl pH 1.0. Después
(2003)
de la hidrólisis la muestra fue evaporada para remover el ácido clorhídrico.
Du y Anumula
La muestra fue hidrolizada con 0.5 ml de ácido trifluoroacético al 20% y 1.6
(1999)
ml de polipropileno en viales a 100 °C por 6-7 horas
Zhu, et. al .,
La muestra fue hidrolizada con ácido clorhídrico 8 M a una temperatura de
(2005)
110 ºC por 4 horas.
28
C18 de 250 x 5 mm (I.D)
Columna
Phenomenex Luna C18, 4.6 Isocratico ACN/H2O/H3PO4 x 150 mm (10/90/0.1)
http://www.nsf.org /business/ina/ glucosamine.asp? program=INA
Fase móvil pH ( 5.3): Citrato de sodio0.05M Acetato de Sodio 0.05M metanol y tetrahidrofuran (90:8.5:0.75:0.75)
C18 de 125mm x 4 mm C18 ODC de 4 mm x 2 mm.
Fase Movil: acetonitrilo-agua-acido acetico-trietilamina (4.5:95.5:0.1:0.05)
Consiste en: metanol-buffer 40-50% 50-68% 68-90% Flujo 1 ml / min.
Fase Móvil
Joergensen, et.al (2004)
Ali Aghazadeh-Habashi, Saeed C18 de 10 cm × 4.6 mm (I.D) Sattari, Franco Pasutto nad Fakhreddin Jamali
Ekblad y Nasholm (1996)
Referencia
del
OPA
Fenilisotiocianato (PITC)
UV a 240 nm
1-naphthyl isothiocyanato
FMOC-Cl
derivatización
Reactivo
Longitud de onda 445 nm Excitación 340 nm
Excitación 260nm Emisión 330nm
método
Validación
Tabla 3. Condiciones cromatográficas para el análisis de glucosamina propuestas por diversos autores
Revisión Bibliográfica
29
II. MATERIAL Y METODOS
2.1 Patrones y reactivos químicos Todas las soluciones fueron preparadas con agua ultra pura purificada con un sistema Nano pure Diamon (Barnstead Internacional, Bodoque Iowa). FMOC (9fluorenil metil cloroformato) (Sigma, St. Louis, MO, USA) se disolvió en acetonitrilo (EMD Chemicals Inc. Darmstadt, Germany, Grado HPLC); el buffer de boratos fue preparado con ácido bórico y agua ajustando el pH a 8.5 con hidróxido de sodio 1 M (Productos Químicos Monterrey, Nuevo León, México). El reactivo para eliminar el FMOC sin reaccionar (Cleavage) se preparó utilizando hidróxido de sodio 0.85 M con hidroxilamina 0.5 M y 2 – metiltioetanol (SigmaAldrich, St. Louis, USA); también la solución para ajustar el pH de la reacción (Quench) se preparó con ácido acético glacial y acetonitrilo (Productos Químicos Monterrey, NL, México).
Material y Métodos Los reactivos fosfato de amonio, metanol y acetonitrilo utilizados para la composición de la fase móvil fueron proporcionados por EMD Chemicals Inc.
2.2 Obtención de quitina
2.2.1 Condiciones de la fermentación Como inóculo se utilizó un producto probiótico de células inmovilizadas (Lactobacillus sp.). Éste fue activado al colocarlo en un recipiente con azúcar 3.75% (p/v) y agua 5% (v/v) durante 5 días a 37 °C A los residuos de camarón descongelado (500 g) y previamente molidos se les adicionó de 6.6% de azúcar (p/p), y posteriormente se inoculó con el probiótico previamente activado 50% (v/p), el pH fue ajustado por debajo de 6.5 con ácido cítrico al 10% esto para evitar la descomposición de la muestra. Las muestras fueron incubadas durante 24 horas a una temperatura de 30 °C; el pH y la acidez total titulable (ATT) se monitorearon cada 3 horas hasta obtener un pH por debajo de 4.5 y una acidez titulable de 3.5%. Centrifugación Después de realizar la fermentación, el ensilaje obtenido fue centrifugado a 5000 rpm a 8 °C durante 15 minutos, esto para separar las fases: sobrenadantepigmento, licor y residuo, los dos primeros fueron separados por decantación y se guardaron para las investigaciones de extracción de pigmentos y extracción de proteínas. El residuo sólido fue recolectado y secado a 60 ºC por 6 horas para posteriormente realizar su purificación.
31
Material y Métodos
2.2.2 Purificación de quitina Despigmentación La extracción de los pigmentos, se realiza mediante la siguiente mezcla de solventes
éter
de
petróleo:acetona:agua,
en
una
relación
15:75:10,
respectivamente. Esta mezcla de solventes se añade a la muestra, en relación 1:10 p/v, en un vaso de precipitados de 500 ml cubiertos con papel aluminio, se homogeniza por medio de un multiagitador magnético y se mantiene en agitación por 3 horas, transcurrido el tiempo la mezcla se filtra en un tamiz No. 100, y se lava con acetona. El residuo despigmentado fue secado a vació a 60 ºC por 6 horas y almacenado. Desproteinización Inicialmente se toman 10 g de muestra previamente despigmentada y se mezclan con 160 ml de buffer de carbonatos pH 9.5, por otro lado en un matraz se agregan 1.5 g de enzima proteasa TAKABATE y 20 ml de buffer pH 9.5. Ambos matraces se ponen a baño María con agitación a 60 °C, y cuando ambas soluciones alcancen la temperatura se le añade la solución enzimática a cada muestra. El tiempo de reacción es de 3 horas, manteniendo constante la temperatura y la agitación. Desmineralización Consistió en tratar la muestra previamente desproteinizada con HCl 1N en relación (1:20, muestra/ácido)
por 3 horas a temperatura ambiente con agitación
constante, después de transcurridas las 3 horas la muestra se vierte en un tamiz No. 100 y se lava con agua, posteriormente se secó por 6 horas a 60 ºC.
32
Material y Métodos Decoloración La quitina purificada es decolorada utilizando una solución de hipoclorito de sodio, con 0.5% de cloro en una relación (1:20, muestra/solución); la mezcla se mantiene en agitación por 20 minutos, transcurrido el tiempo la quitina se lava en un tamiz N.100 con agua destilada y se seca a 60 ºC por 6 horas.
2.3 Preparación de la muestra
2.3.1 Hidrólisis de la muestra En esta etapa se incluye principalmente la hidrólisis química de la quitina para obtener glucosamina libre de acuerdo al método propuesto por Ekblad y Nasholm (1996) con algunas modificaciones. Posteriormente la glucosamina es derivatizada siguiendo el procedimiento de López-Cervantes et al (2005). Se depositan 100 mg de quitina seca en tubos con rosca y se tratan con 5 ml de HCl 6 N por 7 horas a una temperatura de 100 °C. La muestra hidrolizada es filtrada a vacío (papel Wathman No. 41) y se diluye a 100 ml en un matraz volumétrico. Previamente a la derivatización, 300 μl de la solución patrón o de muestra se pasan a un vial, y se llevan a sequedad en condiciones de vacío por 6 horas a 60 ºC.
2.3.2
Derivatización
Para llevar a cabo la derivatización el residuo seco se redisuelve en 300 μl de buffer de boratos a pH 8.5, posteriormente a la solución resultante se le agregan 300 μl del reactivo FMOC- Cl, y se agitan 90 segundos en el vortex, después de trascurrido el tiempo se añaden 180 μl del reactivo Cleavage, la solución se mezcla en el vortex y se deja reposar por 3.5 minutos, posteriormente se agregan 420 μl del reactivo Quench, se agita y se filtra utilizando una membrana millipore de 0.45 μm; después de esto la muestra esta lista para ser analizada por HPLC.
33
Material y Métodos
2.4 Equipo y condiciones HPLC Para el análisis se utilizó un cromatógrafo de líquidos equipado con un auto muestreador y un detector de fluorescencia controlado con un software (WinCrom), la temperatura de la columna se controla a 38 ºC con un calentador de columna, todo el equipo utilizado es proporcionado por GBC Instrumental, Australia. La separación se lleva a cabo con una columna de fase reversa 4.6 mm SGE Hypersil ODS C18, para el análisis cromatográfico se inyectan 5 μL de la muestra derivatizada. La fase móvil esta compuesta por una mezcla de 3 soluciones de distinta composición: Fase A: 30 mM fosfato de amonio (pH 6.5) disuelto en una mezcla de metanol–agua (15:85); fase B: metanol – Agua (15:85) y la fase C: acetonitriloagua (90:10). La glucosamina es separada con un gradiente de elusión el cual se muestra en la tabla 4.
34
Material y Métodos
Tabla 4. Programa de la bomba (flujo en gradiente)
La velocidad de flujo utilizada fue de 1.20 mL/min. La longitud de onda del detector de fluorescencia es de 264 nm excitación y 316 nm emisión.
35
III. RESULTADOS Y DISCUSION
La quitina es un polímero de la N-acetil-glucosamina. Por lo tanto, actualmente se dispone de diversos métodos para la cuantificación indirecta de quitina en bacterias, hongos, insectos y raíces. La hidrólisis de quitina puede ser enzimática o química, ácida o alcalina, y la subsiguiente medición de la glucosamina producida, se puede realizar por colorimetría, cromatografía de gas-líquidos o con HPLC. En este trabajo se presenta el desarrollo de un método HPLC para la cuantificación de glucosamina, el cual fue aplicado a muestras de quitina obtenidas por fermentación láctica de residuos de camarón. 3.1 Ensayos preliminares En los ensayos previos, tanto la glucosamina pura como la glucosamina obtenida de la hidrólisis de las muestras fueron convertidas en FMOC-derivados para producir un producto fluorescente. Los FMOC-derivados fueron detectados por ultravioleta y por fluorescencia. En fluorescencia las longitudes de onda seleccionadas
para
excitación
y
emisión
fueron
270
nm
y
316
nm,
respectivamente; mientras que para absorción UV la longitud correspondió a 264
Resultados y Discusión nm. En la figura 4 se muestran los cromatogramas para ambos tipos de detección. En el cromatograma del patrón la glucosamina se observa como tres picos con tiempos de retención de 18.240, 19.721 y 20.445 minutos. Este mismo perfil fue encontrado en los hidrolizados de quitina comercial y de quitina obtenida de la fermentación láctica de residuos de camarón. Además, la relación entre los tres picos no varía entre los diferentes tipos de muestras, manifestándose mayor interacción entre el segundo y triple picos. La cuantificación de la glucosamina en los hidrolizados de quitina se realizo por detección ultravioleta.
3.2 Preparación de la muestra Para determinar la cantidad óptima del hidrolizado de la muestra a utilizar en el análisis, se llevaron a cabo ensayos preparando hidrolizados con 100, 200 y 300 mg de muestra en 5 y 10 ml de HCl 6 N. Posteriormente los hidrolizados fueron filtrados al vacío con papel Whatmann No. 41, y diluidos a 100 ml con buffer de boratos (pH 8.5). Con estos ensayos se determinó que la cantidad óptima de muestra a utilizar correspondía a los hidrolizados preparados a partir de 100 mg de muestra en 5 ml de HCl 6 N y diluidas a 100 ml de buffer de boratos sonificados por 1 min. a temperatura ambiente.
3.3 Condiciones cromatográficas Diferentes columnas cromatográficas han sido utilizadas para el análisis de aminoazúcares como la glucosamina, en este estudio se seleccionó una columna 25 cm x 4.6 mm SGE Hypersil ODS C18 5μm. De acuerdo a las recomendaciones de López-Cervantes et al 2005, para la separación de FMOC-derivados fueron seleccionados como componentes de la fase móvil fase A: 30 mM fosfato de amonio, fase B: metanol – Agua (15:85) y fase C: acetonitrilo – Agua (90:10); y se llevaron ensayos variando la relación de los componentes en el gradiente de la bomba, velocidades de flujo de la fase móvil y temperaturas de la columna (resultados no mostrados). Estos ensayos permitieron optimizar las condiciones
37
Resultados y Discusión cromatográficas del método, lo cual permitió separar los tres picos que identifican a la glucosamina. En la tabla 5 se muestran las condiciones seleccionadas.
A
B
Figura 4. HPLC cromatogramas de glucosamina en hidrolizados de quitina. (A) Detector UV (264 nm); (B) Detector de fluorescencia (λex 270 nm, λem 316 nm)
38
Resultados y Discusión Tabla 5. Condiciones cromatográficas propuestas para la cuantificación de glucosamina Parámetro
Condiciones
Columna
25 cm x 4.6 mm SGE Hypersil ODS C18 5μm
Eluyente
Velocidad de flujo
Detección
Temperatura
Fase A: 30 mM fosfato de amonio pH 6.5 Fase B: metanol – Agua (15:85) Fase C: acetonitrilo – Agua (90:10)
1.2 mL/min
Ultravioleta Excitación: 264 nm Emisión: 316 nm
38ºC
3.4 Identificación de glucosamina En esta investigación la identificación de la glucosamina en la columna cromatográfica por sus tiempos de retención y por espectros de absorción UV. Para confirmar la identificación de glucosamina a través de los tres picos observados en el cromatograma, se determinó el espectro de absorción de cada uno de los picos detectados en las muestras del hidrolizado de quitina, y se compararon con los observados en la solución estándar de glucosamina. Encontrándose que la serie de picos corresponden a la glucosamina. La figura 5 muestra el cromatograma de una muestra con los espectros de absorción de cada pico, lo cual indica que corresponden al mismo compuesto. Otro método para la identificación de la glucosamina es la comparación de los cromatogramas de un blanco y del patrón con la muestra analizada, como se muestra en la figura 6.
39
Resultados y Discusión
3.5 Validación del método
3.5.1 Linealidad La curva de calibración fue determinada con 4 diferentes concentraciones de la muestra patrón de glucosamina que van desde 338 μg/ml hasta1354 μg/ml, las cuales fueron inyectadas por duplicado. La recta patrón para glucosamina se obtuvo graficando concentración contra el área del pico lo cual fue satisfactoria ya que
presentó un valor de r2 = 0.9995
y según la Asociación Española de
Farmacéuticos de la Industria, (2001), el valor recomendable para el coeficiente de correlación es ≥ 0.999 aunque en caso de impurezas se admite ≥ 0.990
40
1
2 3
2
Figura 5. Cromatograma de la muestra con el espectro de absorción de la glucosamina
1
3
Resultados y Discusión
41
Resultados y Discusión
A
B
C
Figura 6. Comparación entre cromatogramas (A) Blanco, (B) Patrón, (C) Muestra
42
Resultados y Discusión La representación gráfica de la recta de regresión en un sistema de coordenadas junto con los valores experimentales, permite visualizar la bondad del ajuste. La recta patrón es expresada matemáticamente como y = ax + b. Si la recta no pasa cerca del origen de coordenadas significa que el método a evaluar esta afectado por un error sistemático por defecto o por exceso en el intervalo estudiado. Si existen diferencias apreciables significa que la linealidad no es buena (figura 7). Tabla 6. Datos de calibración de glucosamina Tiempo de retención (min)
Cantidad (μg/ml)
Área
338.56
894342
677.12
1881307
1015.68
2786166
1354.24
3683757
18.240 19.721 20.445
Y = 2739x – 6883 R2 = 0.9995
4000000 3500000 3000000 Àrea
2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0
500
1000
1500
Concentracion (μg/ml)
Figura 7. Recta patrón de glucosamina
43
Resultados y Discusión 3.5.2
Precisión
La precisión es conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Esta variabilidad se puede deber a errores aleatorios. Este se llevó a cabo analizando una misma muestra cuatro veces, los valores se muestran en la tabla 7, en donde se observa la desviación estándar relativa RSD % la cual es de 2.58
Tabla 7. Valores de precisión del método Ensayos
Glucosamina mg/g materia seca
1
688,2
2
706,4
3
719,6
4
731,1
Promedio Desviación estándar RSD, %
711,32 18.42 2.58
3.5.3 Recuperación Para llevar a cabo la recuperación del método, se añaden sobre una o varias muestras cantidades conocidas de un analito patrón. Lo anterior se realizó adicionando glucosamina (605 mg/g matera seca), antes de la hidrólisis de la quitina y después se cuantifico el contenido total por HPLC. Los datos se muestran en la tabla 8 (4 ensayos de la misma muestra), donde se
observa que la
recuperación es de 89.05% la cual se considera aceptable debido al afecto que podría tener las condiciones de la hidrólisis y la derivatización sobre la glucosamina.
44
Resultados y Discusión Tabla 8. Valores de recuperación del método Ensayos
Glucosamina mg/g materia seca
1
86.3
2
87.0
3
90.6
4
92.3
Promedio Desviación estándar RSD, %
89.05 2.87 3.22
3.6 Análisis de la muestra
3.6.1 Humedad y cenizas
El muestreo se llevó acabo utilizando 11 muestras obtenidas de diferentes fermentaciones, realizando análisis por duplicado bajo las condiciones ya establecidas del método. En la tabla 9 se muestran los valores obtenidos de humedad y de cenizas tanto de la muestra proveniente del residuo de camarón y la de la quitina comercial. El contenido de cenizas y humedad son parámetros de calidad importantes para determinar la pureza de la quitina estos fueron comparados con los resultados de investigaciones previas, el contenido de humedad obtenido de la quitina del residuo de camarón es de 2.3 % el cual es similar al reportado por Shahidi et al, (1999), mientras que Cremades et al, (2001) reporta valores de cenizas de 1.09 % lo cual indica que el método para remover los minerales es eficaz encontrándose que tanto la quitina comercial como la obtenida de residuo de camarón son muy similares a las reportadas.
45
Resultados y Discusión Tabla 9. Contenido de humedad y cenizas en quitina Muestra
Quitina residuo de camarón Quitina Comercial
Humedad (%)
Cenizas (g) 100g materia
1
2.33
1.07
2
2.35
1.01
3
2.39
1.07
1
3.41
1.02
2
3.44
1.17
3
3.12
1.04
3.6.2 Contenido de glucosamina en la quitina La quitina obtenida de residuo de camarón y la quitina comercial presentan resultados muy similares en cuanto al contenido de glucosamina los cuales son de 89.91 % y 89.82 % respectivamente (Tabla 10). El contenido de glucosamina representa la calidad de la quitina así como otros parámetros ya mencionados. La pureza de la quitina obtenida a partir de los residuos de camarón es de 93.71%.(89.91% glucosamina, 1.5% cenizas, 2.3% humedad) esto se puede deber según Wu et al (2004) a diferentes factores tales como el tipo y concentración de ácido, la temperatura y el tiempo de hidrolizado de la quitina los cuales no hallan sido los óptimos para la recuperación de la glucosamina. Tabla 10. Contenido de glucosamina en quitina Quitina residuo de camarón 914.6 863.8 919.1 899.1
Quitina Comercial
Desviación estándar
30.7
78.7
RSD, %
3.41
8.76
Ensayos 1 2 3 Promedio
972.8 815.8 906.1 898.2
46
CONCLUSIÓN
En este trabajo se presentó un método HPLC sensible y reproducible para el análisis y cuantificación de glucosamina en quitina de la cabeza de camarón utilizando una derivatización con FMOC. La validación del método se considera satisfactoria debido a que se obtuvieron niveles de recuperación de un 89 % y una buena precisión del método con valores de coeficiente de correlación mayores de 0.999, lo cual implica un gran potencial para la investigación y análisis de rutina. De tal manera que al llevar a cabo el análisis del contenido de glucosamina en la quitina, se puede confirmar la pureza de la misma así como también
las
condiciones óptimas de la hidrólisis por lo tanto, el método debe ser aplicable para la determinación rutinaria de glucosamina y la pureza de la quitina en residuos de camarón
47
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