INTERNACIONAL PRODE SA DE CV EVALUACION HISTOPATOLOGICA DEL APARATO RESPIRATORIO EN POLLOS DE ENGORDA TRATADOS CON UN PRODUCTO A BASE DE ACEITES ESENCIALES DESPUÉS DE UN DESAFIO CON Mycoplasma gallisepticum Y/O VIRUS DE LA INFLUENZA AVIAR (H9N2). Elie K Barbour et al Departamento de ciencias Animales Facultad de Ciencias de la alimentación y Agricultura Departamento de Agricultura, Universidad Americana de Beirut y Universidad Saint Joseph Beirut Libano Resumen: El objetivo del trabajo fue evaluar el impacto de un producto a base de aceites esenciales de mentol y eucalipto (MENTOFIN ®) en la protección del aparato respiratorio de pollos desafiados con Mycoplasma gallisepticum y/o virus de la gripe aviar. Introducción: Mycoplasma gallisepticum(MG) es el agente causante de la enfermedad crónica respiratoria en pollos (1), es una enfermedad muy común alrededor del mundo: Aunque las manifestaciones clínicas son de lento desarrollo cuando se combina el MG con otros patógenos respiratorios pueden causar aerosaculitis graves (1). Además de la reducción del consumo de alimento y de reducción en la producción de huevos, el MG tiene gran importancia económica por las lesiones que ocasiona en el tracto respiratorio causando altas morbilidades y mortalidades, condenación de las canales y degradación de las mismas. Por eso los esfuerzos en limitar las perdidas derivadas por infecciones de MG son de vital importancia en la industria avícola. El virus de la gripe o influenza aviar es una de las mas devastadoras enfermedades virales en las aves y tiene una distribución mundial. Casos frecuentes del virus H9N2 de la gripe aviar con alta mortalidad se observan comúnmente en granjas de pollos de engorda en la región del medio oriente (3). Infecciones mixtas con otros patógenos respiratorios en particular MG son el resultado de una elevada mortalidad asociada a las graves perdidas económicas. El control de este virus debe ser de una importancia vital por las perdidas y además por la diseminación (pandemias). Los aceites esenciales de eucalipto y mentol presentes en Mentofin® han demostrado ser eficaces frente a complejos respiratorios: Barbour y colaboradores en 2005 demostraron que la administración de Mentofin después de la vacunación con NDV, IBV y IBDV en pollos infectados con MG y IF (H9N2) mejoran la respuesta inmune y mejoran su rendimiento. En consecuencia la administración de Mentofin podría tener un efecto similar en los signos y lesiones de pollos infectados con MG y/o IFV - H9N2. Aunque se han realizado varios experimentos para estudiar la interacción en MG y otros patógenos respiratorios (6,7), no hay muchos estudios de desafío sobre las interacciones entre MG y/0 H9N2. Por eso la importancia de este estudio para evaluar y comprender a nivel celular el impacto del Mentofin sobre la protección de las vías respiratorias en pollos desafiados. El trabajo histopatológico para la comprensión de los

INTERNACIONAL PRODE SA DE CV cambios microscópicos a nivel celular de la traquea incluyendo la observación de de ciliación traqueal, hipertrofia de la mucosa, degeneración del las células Globet, acumulación de moco e infiltración heterofilica. Material y métodos: Aves: Setenta pollos de engorda de un día de edad fuero agrupados en 7 grupos (10 aves por grupo): Los 7 grupos fueron alojados en salas de aislamiento que tenían lámparas infrarrojas, bebederos y comederos. Todas las aves fueron alimentadas con el mismo tipo de alimento. Preparación de cepas de desafío: Aislamiento de MG: Un hisopo traqueal de un ave proveniente de una parvada infectada con MG fue cultivada en caldo Frey a 37 grados por 4 días y subcultivada en agar frey por 4 días mas. Una colonia sospechosa con característica morfológica de huevo frito fue probada contra anticuerpos específicos de pollo (SPAFOS, Connecticut, EEUU). Un conjugado anticuerpos IgG caprino anti pollo (cadena pesada + cadena ligera) marcados con fluoresceína fue usado. La reacción de anticuerpos sospechosos fue observada en un microscopio Fluorescente Leica para confirmar la identidad de MG. La colonia purificada y clonada fue cultivada en caldo Frey por 4 días a 37 grados, pellets de MG obtenidos por centrifugación del caldo de cultivo a 15,557x g durante 15 minutos, Los pellets de MG se reconstituyeron en 30 ml de solución salina estéril y se determinó el titulo por HA en contra de una suspensión de glóbulos rojos de pollo al 0.1%. La reconstitución de MG se hizo diluyendo para alcanzar 2 unidades de HA/0.5 ml de solución salina para ajustar para el desafío. Aislamiento de H9N2: La cepa de H9N2 fue aislada de un brote severo de influenza aviar en pollos en el verano de 2004, el componente H9 fue identificado en la Universidad americana de Beirut, mientras que el subtipo completo fue completado en el laboratorio central veterinario de Weybridge, Inglaterra. Un informe emitido por la Dra. Ruth Manvel en Weybridge confirmo el subtipo como H9N2. El H9N2 se mantuvo a -80 ° C en nuestro laboratorio con un rango de 1:1 de fluido alantoideo: caldo triptosa fosfato. La mezcla fue diluida en solución salina estéril para resultar en 2 unidades HA/0.5 ml, un ajuste de stock viral para el desafío. Desafío y tratamiento: Los 7 grupos de pollos fueron criados durante una semana. A la semana de edad los siguientes desafíos fueron hechos como se muestra en el Tabla 1. Mentofin fue diluido V/V 0.025 ml / 100 ml de agua de bebida. Cada ave tratada inició recibiendo el Mentofin diluido vía intraesofágica dos veces al día (mañana y tarde) en un volumen de 1 ml/ ave/ hora. El tratamiento fue de 6 días comenzando el día del desafío. Tabla 1: Desafíos realizados intraesofágico en los pollos a la semana de edad. Grupo Desafíos* Tratamiento Mentofin 1 Ninguno Ninguno 2 MG Ninguno 3 MG Si+

INTERNACIONAL PRODE SA DE CV 4 H9N2 Ninguno 5 H9N2 Si+ 6 MG/H9N2 Ninguno 7 MG/H9N2 Si+ *El MG y H9N2 fueron dados en volumen de 0.5 ml intratraqueal. El MG y H9N2 Fue dado como 2 Unidades de HA/o,5ml/ ave. + Mentofin se administró en el día del desafío; la administración fue esofágica dos veces por día (mañana y tarde) en un volumen de 1 ml/ave/hora por seis días. La dilución es la recomendada por el fabricante. Histopatología: todas las aves se sacrificaron usando CO2 a los seis días después del desafío. Se tomó una sección de 1 cm de las traqueas de las aves sacrificadas y estas fueron fijadas en una solución buferada de formalina al 10%. Se procesaron las traqueas para obtener cortes de 4 micras y se tiñeron con H&E. Se procedió a realizar las observaciones de los cortes para deciliación, hipertrofia de mucosa, degeneración de las células globet, acumulación de moco e infiltración heterofilica a partir de 4 cortes traqueales por ave. La observación fue hecha al microscopio a un aumento de 400x. Una puntuación o score de 1 se asignó a cada uno de los siguientes cambios en el tejido deciliación, hipertrofia de mucosa, degeneración de las células globet, acumulación de moco y infiltración heterofilica; mientras que un escore de 0 fue dado para las ausencias de lesiones traqueales. El promedio de los scores de 10 aves por grupo se utilizaron para los histogramas. Conteos de heterofilia acumulativos de 12 campos de 4 cortes traqueales por ave fue registrado y el conteo promedio de 10 aves se uso para los histogramas. Imágenes microscópicas magnificadas 400 x fueron tomadas para comparar los cambios en tejidos de diferentes grupos de los pollos de engorda. Análisis Estadístico: La media de los escores de observaciones histopatológicas de traqueas se analizaron por una prueba de ANOVA y posteriormente por una prueba de Duncan. Resultados: La histopatología d las secciones de traquea de los animales tratados con Mentofin presentaron una reducción significativa de las lesiones microscópicas en comparación con las secciones obtenidas de los grupos no tratados con Mentofin (P