MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo de Estudio Experimental. Este tipo de estudio tiene como característica primordial el poder manipular y controlar las variables, siendo en este caso la fuerza iónica y el pH. Se llevó a cabo en las instalaciones del Laboratorio de Bioquímica de Proteínas del Departamento de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad de Sonora.

Muestra Se utilizaron muestras de suero humano, provenientes de tres mujeres sanas con un promedio de edad de 25 años. Se descartó el suero proveniente de mujeres en periodo menstrual o con una semana de culminación del mismo.

Sesgo Experimental Se

descartaron

las

muestras

hemolizadas,

con

agregación

y/o

desnaturalización proteica. Se realizaron de forma sistemática y como se indica en cada una de las técnicas.

Producción de Anticuerpos Contra Ferritina Para generar los anticuerpos contra ferritina sérica, se utilizaron conejos de laboratorio (Oryctolagus cuniculus) machos de la misma camada, de tres meses de edad, con una masa aproximada de 2,5 kg. Los conejos fueron inmunizados con 100 μg de antígeno (ferritina de bazo de caballo) en adyuvante de Freud completo para la primera inmunización e incompleto para las subsecuentes. La inmunización fue realizada por vía intramuscular, en distintos lugares del dorso animal, siguiendo el método propuesto en “Guide for the care and use of laboratory animals” de la Oficina de Bienestar para Animales de Laboratorio. Se 13

llevaron a cabo retos semanales, tomándose muestras de sangre para el monitoreo del título de anticuerpos. Al terminar el proceso, la sangre de los conejos fue obtenida por punción cardiaca, colectada en tubos de ensayo sin anticoagulante; se reposó durante 30 min a temperatura ambiente, posterior a la retracción del coágulo, las muestras fueron centrifugadas 5 min a 3,000 rpm a una temperatura de 4 °C y el suero fue separado en alícuotas y almacenado a – 20 °C para su posterior procesamiento (Worwood y col., 1981; Kazakbaeva y col., 1986).

Aislamiento de Inmunoglobulinas Anti-Ferritina Sérica Las inmunoglobulinas anti-ferritina se aislaron a partir del suero inmune de conejo mediante cromatografía de afinidad en una matriz acoplada a Proteína A. Se aplicó 1.0 mL de suero de conejo (44 mg de proteína por mL en promedio), a una velocidad de flujo de 0.20 mL/min en un volumen de cama de 3.14

cm3.

Las

proteínas

no

adsorbidas

a

la

matriz

y

las

unidas

inespecíficamente se eliminaron lavando la columna con la solución de lavado compuesta de amortiguador de fosfatos (PB) 20 mM, pH 7.6, y para las unidas específicamente se usó una solución de elución conteniendo glicina 20 mM, pH de 2.6 (inmediatamente fue neutralizada con Trizma base 0.1 M, pH 8). El aislamiento

de

las

inmunoglobulinas

séricas

totales

fue

monitoreado

espectrofotométricamente a 280 nm (Vázquez y col., 2001).

Concentración y Diálisis de las Fracciones de Lavado y Elución de la Cromatografía de Proteína A Las fracciones de lavado y elución fueron concentradas utilizando centricones® (Sigma Amicon Ultra-4) con un límite de exclusión de 10 kDa; se centrifugaron a 4,000 rpm en un promedio de seis intervalos de 20 min cada uno a temperatura ambiente. En iguales condiciones se dializó la fracción de elución contra PB 20 mM, pH 7.2. 14

Aislamiento de Ferritina Sérica por Cromatografía de Afinidad con Anticuerpos Policlonales para Ferritina Una vez obtenidas las inmunoglobulinas séricas del conejo inmunizado contra ferritina de bazo de caballo, se acoplaron a 1.0 g de una matriz de agarosa activada con divinilsulfona (Kem-En-Tec., Copenhagen, Denmark). El gel activado se lavó con agua deionizada, se resuspendió en una solución de carbonato de sodio 0.3 M (pH 8.6), se incubó por espacio de 14 h con 16 mg de la fracción de elución de la cromatografía de afinidad a Proteína A, y finalmente la matriz activa unida a los anticuerpos de conejo se incubó con una solución de glicina 0.2 M (pH 8) por espacio de 5 h, para bloquear el exceso de grupos reactivos (Hermanson y col., 1992). La matriz se empacó en un sistema de baja presión a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min en una columna para cromatografía de 1 x 4 cm, posteriormente se equilibró con 5 volúmenes de solución de PB 20 mM, pH 7.2 (Hermanson y col., 1992). Se aplicaron a la fase estacionaria, un promedio de 65 a 75 mg de proteína contenidas en 1 mL de suero humano, a una velocidad de flujo de 0.20 mL/min, en un volumen de cama de 2.9 cm 3. Las proteínas no absorbidas y las unidas inespecíficamente se eliminaron en la fracción de lavado con PB 20 mM, pH 7.2. Para eluir la ferritina, se utilizó glicina 20 mM, pH 2.6 (las fracciones fueron neutralizadas inmediatamente con Trizma base 0.1 M, pH 8 ). Las corridas cromatográficas se monitorearon espectrofotométricamente a 280 nm.

Evaluación de la Pureza del Aislamiento de Ferritina Sérica Evaluación de la Pureza Mediante Electroforesis en Condiciones Nativas Con la intención de evaluar el nivel de pureza de la fracción de elución de la cromatografía de afinidad, se realizaron ensayos de electroforesis nativa en geles de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés) al 8%, bajo las siguientes condiciones electroforéticas: inicialmente, 80 volts por 30 min, y 15

posteriormente 110 volts durante aproximadamente 2 h, a temperatura ambiente. Una vez culminada la corrida electroforética se tiñeron las proteínas con azul de Coomassie por espacio de 12 h, posteriormente los geles fueron desteñidos con solución a base de metanol 50% y ácido acético 6%, y finalmente incubados con solución para su preservación (metanol 5%, ácido acético 7% y 2% de glicerol).

Evaluación de la Pureza Mediante Electroforesis en Condiciones Desnaturalizantes y Reductoras (SDS) Para llevar a cabo la evaluación de la pureza de la fracción de elución, se realizó una electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE). Se separaron electroforéticamente las fracciones de lavado y elusión, tanto de cromatografía de proteína A, como de la cromatografía de afinidad anti IgG (anti ferritina), a 110 volts por 2.5 h. Una vez culminada la electroforesis se tiñeron los geles con azul de Coomassie, se destiñeron y preservaron bajo el procedimiento arriba descrito (Laemmli, 1970).

Cuantificación de Ferritina Sérica Para la determinación cuantitativa de ferritina sérica se utilizó el Kit comercial tipo ELISA (“Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" que significa Ensayo Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas) No. Cat. 1810, de Alpha Diagnostic Internacional®. El procedimiento se describe a continuación: se colocaron 10 µL de suero en el pozo de una microplaca, posteriormente se adicionaron 100 µL de anticuerpo monoclonal anti-ferritina conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), se mezclaron e incubaron por 30 min a temperatura ambiente. Trascurrido este tiempo, la placa se lavó cinco veces con 300 µL del tampón de lavado (PBS-Tween 20), se añadieron 100 µL de tetrametilbencidina (TMB), se mezcló y posteriormente se incubó por 15 min a temperatura ambiente. 16

Finalmente se adicionaron 50 µL H2SO4 (solución finalizadora de la reacción). La reacción enzimática (colorimétrica) es directamente proporcional a la concentración de ferritina sérica presente. La cuantificación de ferritina sérica fue monitoreada mediante un lector de microplacas de ELISA a 450 nm. La curva de calibración fue construida siguiendo el procedimiento anterior, con standars, de una concentración de 0 ng/mL a 800 ng/mL.

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