Medicina [Buenos Aires]

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Sobre la historia de la penicilina La segunda línea Los Premios Nobel son el máximo reconocimiento que un científico, un literato, un pacifista, o un economista puede pretender. Premian logros alcanzados en la física, la química, la medicina o la fisiología, la literatura, la paz y las ciencias económicas. Se otorgan cada año desde 1901, excepto el de Economía creado en 1968. El de la Paz comenzó dividido, el de Física se dividió en 1902, el de Literatura en 1904 y el de Química en 1912. El de Medicina o Fisiología se otorgó sólo a una persona hasta 1906. En 1906 se otorgó a dos, Camilo Golgi y Santiago Ramón y Cajal1. Se reparten los honores y el dinero del premio Nobel, pero nunca son más de tres personas (o instituciones en el premio de la Paz) los premiados. ¿Es que con sólo tres personas se representa el máximo reconocimiento a los méritos en la ciencia o la literatura? La analogía con los tres actores de las tragedias griegas, pero con tres protagonistas, o con las tres medallas de las olimpíadas modernas, éstas sí con protagonista, deuteragonista y tritagonista, tal vez brote de la cultura clásica de los miembros del Comité Nobel, se deba a creencias en los números mágicos, o a una razón prosaica: si se menudean y distribuyen las coronas suecas a más de tres personas la suma no cambiaría para nada la vida del premiado y perderían valor el premio y los honores. Lo cierto es que siempre quedan sin el premio un cuarto, un quinto o más pretendientes, tal vez tan meritorios. Sus colaboradores, amigos y más a menudo sus compatriotas -el patriotismo es esencial- proceden a considerarlos héroes relegados, ganadores morales. Si se piensa un poco, ambos bandos tienen razón. Por un lado, todo tiene un límite. Por el otro, es improbable que sólo una persona, o tres, hayan sido determinantes totales del éxito de los trabajos premiados. Más de una vez fue decisiva la participación de algún colaborador, sea este profesional, técnico, o aun algún familiar. Patricia Fara, en su libro Pandora's Breeches socava el concepto heroico en la ciencia y resalta que los logros de grandes científicos y pensadores no dependen sólo de ellos, son una obra de conjunto, de muchas habilidades, de muchas personas, de muchas mujeres, de un medio adecuado2. Los protagonistas no son héroes, pero tienen singulares cualidades. Detrás de los famosos y premiados, detrás de los actores

conocidos de cualquier drama histórico, quedan actores olvidados, personas de la segunda línea, para nada menores, porque sin ellas los protagonistas tal vez no hubieran alcanzado ni la fama ni la gloria ni las coronas suecas. En otras palabras, de Tony Rothman esta vez: "Pero si la historia de la ciencia tiene alguna relevancia, seguramente es recordarnos que la ciencia es una empresa colectiva y engendrar en nosotros la humilde conciencia que el panorama de la ciencia sería muy diferente si la mayoría no reconocida nunca hubiera existido"3. Esta nota se limitará a un ejemplo: tres personas premiadas con el Nobel y una olvidada. Esta última recordada por Eric Lax en The mold in Dr. Florey's coat. The story of the penicillin miracle4. Lax enfoca su relato en cuatro personajes. Uno muy conocido: Alexander Fleming, escocés, (1881-1955); dos pocos conocidos: Ernst Boris Chain, alemán refugiado en Inglaterra (1906-1979) y Howard Walter Florey, australiano afincado en Inglaterra (1898-1968), los tres galardonados con el Premio Nobel de Medicina o Fisiología del año 1945. El premio, en partes iguales, lo obtuvieron "for the discovery of penicillin and its curative effect in various infectious diseases"5. La penicilina comenzó el mayor cambio de la medicina en el siglo XX. El cuarto personaje es un desconocido, Norman George Heatley (1911-2004), y, lo que ahora nos interesa, Lax destaca su participación en el logro. El libro de Lax, publicado en el 2004, refiere de nuevo y con ecuanimidad la historia, agrega noticias íntimas, impublicables en vida de los actores, y el testimonio de Heatley, resultado de sus conversaciones y el acceso a sus diarios. Lax caracteriza a Fleming como "el escocés callado"(o taciturno), a Florey como el "áspero genio colonial" y a Chain como el "temperamental continental" (europeo), y al tercer miembro del equipo inicial de Florey, Heatley, el que no recibió el premio, como el "maestro de los micro-métodos" (The micro master). De Alexander Fleming poco diremos; es casi el único conocido y endiosado de los tres premiados. En nuestro país, como en otros, calles, avenidas, clínicas, institutos, hospitales, colegios, y hasta una imprenta, llevan su nombre. A su personalidad, suficientemente excepcional, el periodismo y la propaganda le han fabricado mitos que periódicamente se repiten y adornan6. Para muestras algunos botones, por ejemplo: un mito repetido en un éxito editorial local7. O atolondradas contribuciones vernáculas al mito, por ejemplo: "Alexander Fleming, que trabajaba en un hospital público y gratuito en Londres, descubrió la penicilina"8. O este otro: "A diferencia del médico escocés que llevó adelante sus investigaciones en un modesto laboratorio, Florey contaba con un laboratorio bien equipado y con un aceitado equipo de investigadores"9. Por supuesto que son o medias verdades o fantasías. El lector interesado puede recurrir, para clarificarse, a la documentada biografía de Fleming escrita por Gwyn MacFarlane10 (traducida al castellano), a la biografía de Florey escrita por el mismo MacFarlane11, a la de Chain escrita por Ronald W. Clark12, o, para empezar, al libro de Lax. Pero, quien desee conocer cómo la penicilina llegó a la terapéutica, nada mejor que el capítulo Penicillin: Historical introduction en Antibiotics, obra escrita por Florey y sus colaboradores13. El trabajo de Fleming sobre el descubrimiento de la penicilina se publicó en 1929. Desde entonces hasta

1940 sólo se utilizó el caldo de cultivo del Penicillium notatum como antiséptico local con buenos pero no resonantes resultados. Los intentos de extraer la sustancia activa se abandonaron por ser ésta muy lábil. No se hicieron experimentos en animales para determinar su eficacia en infecciones sistémicas, "esto es, su poder quimioterapéutico no se había revelado"13a. Aquí interviene, a fines de 1939, el "aceitado equipo" de la Sir William Dunn School of Pathology de Oxford, y el trabajo sobre la penicilina "es tomado vigorosamente por Chain, Florey y Heatley"13b. Chain, se ocuparía de las propiedades químicas y bioquímicas, Heatley, al comienzo asistente de Chain, de la producción, de cómo cultivar la mayor cantidad posible de P. notatum que produzca la mayor cantidad del principio activo y, finalmente, de separarlo del caldo de cultivo y purificarlo, Florey se ocuparía de los aspectos biológicos y farmacológicos y de la ardua tarea de conseguir fondos. Entre septiembre de 1939 y mayo de 1940 trabajaron para obtener esa cantidad de penicilina. Finalmente Heatley consigue un "extracto de penicilina" suficiente para estudiar su toxicidad y realizar la prueba terapéutica. El 25 de mayo de 1940 llega la prueba terapéutica: inyectan dos ratones con una cepa de estreptococo hemolítico y les administran cinco dosis del extracto de penicilina a distintos tiempos después de la infección; otros dos ratones se infectan y reciben sólo una dosis de penicilina una hora después de infectados. Cuatro ratones sirven de controles, se infectan y no reciben penicilina. De los ratones que reciben cinco dosis de penicilina uno muere 16 días después, el otro vive indefinidamente; los que reciben sólo una dosis de penicilina mueren dos y seis días después. Todos los controles mueren dentro de las 16 ½ horas después de la inyección de estreptococos. Total de ratones: ocho. Cuando, después del experimento, Florey, Chain y Heatley se reunieron, se dice que Florey dijo: It looks quite promising. Con otra persona mostró más entusiasmo, le dijo: It looks like a miracle11a. The experiment, imperfect as it was, sufficed to give grounds for the hope that penicillin would have some systemic chemotherapeutic properties so that is was clear that further investigation should be carried out with as great speed as possible. N.G. Heatley devoted his attention to the production of penicillin while the collaboration of others workers secured a wider examination of the other problems involved. […]13c. El párrafo enumera una lista de colaboradores y termina con esta frase: The work was much accelerated by the most intimate collaboration of all concerned and the success attained was undoubtly due to the combined efforts of the members of the group. Heatley se concentró en la producción de penicilina y consiguió: 1) Cultivar una gran cantidad de hongos que produjeran más rápido mayor cantidad de penicilina, suficiente para que Chain estudiara sus características químicas y Florey probara sus propiedades biológicas. Primero en Oxford, en escala reducida (y el recipiente más eficiente para el cultivo resultó el orinal chato de los hospitales). Luego se trasladó a EE.UU. para colaborar en la producción en escala industrial. 2) Un método para medir la actividad de esa penicilina, el método del cilindro y

la placa, usado luego millones de veces. 3) Un ingenioso método de contracorriente para extraer la inestable penicilina del caldo del cultivo sin perderla en los pasos intermedios. El procedimiento estaba basado en hechos conocidos desde 1932: si una solución acidificada con penicilina se mezcla y sacude con éter, la penicilina pasa al éter, pero no si la solución tiene pH neutro. La contribución de Heatley, a su juicio risible, aunque admitía que le había costado un duro esfuerzo mental, fue sacudir el extracto etéreo con agua mantenida en pH neutro con un buffer o álcali, de esa manera la penicilina pasaba a la fase acuosa14. 4) Demostrar su estabilidad en los tejidos y líquidos del organismo: el hígado y la sangre de rata no la destruían. Florey pensó que si Alemania invadía Gran Bretaña y se producía el desastre, debían destruir registros y aparatos; a Heatley se le ocurrió preservar la cepa de Penicilliun notatun productor de la penicilina, frotando esporas del hongo, indetectables y durmientes, en el forro de sus ropas. De allí el título de The mold in Dr. Florey's coat. Las esporas se frotaron en las ropas de Florey, Chain, Heatley y otras dos personas, si alguno escapaba podía reanudar el trabajo11b, 4a. Chain, hijo de un químico industrial, quería patentar los descubrimientos. Florey, indeciso, y ante la insistencia de Chain, recurrió al consejo de E. Mellamby, Secretario, y de Sir Henry Dale, Presidente, del Medical Research Council, quienes lo persuadieron de que no era ético patentar un descubrimiento médico. Florey, probablemente de acuerdo con ellos, no insistió, no lo hizo11c. Y el Reino Unido debió pagar regalías por muchos años para fabricar una droga descubierta, aislada, investigada y desarrollada allí. Heatley, hijo de un veterinario, desde niño mostró una habilidad manual fuera de lo común, como la de su padre. Estudió en Cambridge, fue ayudante de Frederick Gowland Hopkins y se convirtió en un experto en cualquier micro-método: químico, bioquímico, físico, etc. Recomendado por Chain fue reclutado por Florey cuando estaba a punto de instalar un laboratorio comercial; Heatley comenzó como asistente de Chain, pero no pueden concebirse dos personalidades más distintas y opuestas. Ocurrió lo que era de esperar, pasó a depender directamente de Florey. Heatley era: "El más versátil ingenioso y habilidoso mecánico en cualquier escala, grande o minúscula. A su formación en biología y bioquímica podía añadirles sus habilidades técnicas en óptica, trabajo con vidrio o metal, plomería, carpintería y toda labor en electricidad necesaria en esos días pre-electrónicos. Sobre todo podía improvisar, usar los más improbables pedazos de equipos de laboratorio o domésticos para hacer un trabajo con la mínima pérdida posible de tiempo" 11d. "Modesto en exceso, cortés, bueno, considerado, constante en buscar la manera de ayudar a colegas y amigos [y a becarios inexpertos, desorientados, y cortos de genio]. Era un jugador de equipo más que un líder"15. La publicidad y la fama atraparon a Fleming. A los tres premiados se les concedió el rango de caballeros. Florey quiso compartir las coronas suecas con sus colaboradores, E. P. Abraham le aconsejó no hacerlo, divididas no serían muchas para nadie. En agradecimiento Florey compró, a cada uno, un juego de copas de vino de cristal sueco de color azul. Heatley nunca las usó; en ellas no se puede apreciar el color del vino,

dijo, y cuando se rompió una copa, no le importó4b. Florey fue luego Presidente de la Royal Society, Provost del Queen's College de Oxford, se convirtió en Lord Florey, Baron of Adelaide and Marston, y recibió la Orden del Mérito, la más alta distinción civil del Reino Unido. Después de la penicilina, Heatley colaboró en el comienzo del estudio que condujo a las cefalosporinas. El trabajo lo continuaron E. P. Abraham y Guy Newton quienes descubrieron, purificaron y establecieron la estructura de la cefalosporina C, la primera de la familia. Esta vez el compuesto y la estructura del anillo básico se patentaron y los cuantiosos beneficios se dedicaron a la investigación en la universidad y el Lincoln College16. E.P. Abraham le ofreció a Heatley participar en los beneficios, Heatley le respondió que el sueldo de la Universidad bastaba para su familia4c. A Heatley no lo alcanzó la publicidad ni la fama ni la fortuna. La Royal Society no lo incorporó cuando fue propuesto. Su apocamiento y el rumor que sólo era un par de manos de Florey no lo favorecieron. Los honores llegaron tarde; finalmente llegaron. En 1978, cuando se retiró, Heatley recibió la Orden del Imperio Británico (OBE) y, en 1990, la Universidad de Oxford le confirió el grado honorario de Doctor en Medicina, el primero conferido en los 800 años de historia de la universidad4d. La interpretación más breve y acertada de esta historia es la de Henry Harris, sucesor de Florey en la Sir William Dunn School of Pathology: To sum it all up: without Fleming, no Chain or Florey; without Chain, no Florey; without Florey, no Heatley; without Heatley, no penicillin. 17. Juan Antonio Barcat E-mail: [email protected] 1. Nobel Foundation. En: http://nobelprize.org/; consultado 27-1-06. 2. Fara P. Pandora's Breeches. Women, Science and Power in the Enlightment. London: Pimlico, 2004. Epi-logue, p 232-6. Comentario en Medicina (Buenos Aires) 2005; 65: 89-90. 3. Rothman T. Lost in Einstein's Shadow. Einstein gets the glory, but others were paving the way. Am Sci 2006; 94: 112. 4. Lax E. The mold in Dr. Florey's coat. The story of the penicillin miracle. New York: Henry Holt, 2004. a)p126; b)260-1; c)p 260; d)p 261. 5. Nobel Foundation. En: http://nobelprize.org/medicine/laureates/1945/index.html; consultado el 18-2-06. 6. Barcat JA. Churchill, Fleming y la penicilina. Medicina (Buenos Aires) 1994; 54: 1756. 7. Paenza A. Matemática... ¿Estás ahí? Sexta Edición. Buenos Aires: Siglo XXI, 2006. p 96-7). 8. Capanna P. El precio del saber. Página/12. 3-05-2003. 9. Marconi A. Informe penicilina. Página/12. 13-5-2003. 10. MacFarlane G. Alexander Fleming. The man and the Myth. Cambridge (MA): Harvard UP, 1984. Versión en español: Fleming. Barcelona: Salvat, 1988. 11. MacFarlane G. Howard Florey. The making of a great scientist. Oxford: Oxford UP, 1979. a) p 315; b) p 321-2; c) p 336; d) p 302-3. 12. Clark RW. The life of Ernst Chain. Penicillin and Beyond. New York: St. Martin's Press, 1985. 13. Florey HW. Chain E, Heatley NG, Jennings MA, Sanders AG, Abraham EP, Florey ME. Antibiotics, II. Chapter 15: Penicillin: Historical Introduction. p 632-71. a) p 637; b) p

635; b) p 638-9. 14. Anón. Making Penicillin Possible: Norman Heatley Remembers. (An interview with Norman Heatley). En: Science Watch, Nov/Dec. 1995. http://www.sciencewatch. com/interviews/norman_heatly.htm; consultado el 18-4-06. 15. Anón. Norman Heatley - A remarkable man. Fusion. A newsletter of the Sir William Dunn School of Pathology. 2004; 1: 6-9 (Issue 3. Trinity 2004). En: http://www.path. ox.ac.uk/news.htm; consultado el 16-4-06. 16. University of Oxford. Annual Review 2000/2001. En: http:// www.ox.ac.uk/publicaffairs/pubs/annualreview/ar01/11.shtml; consultado el 16-4-06. 17. Harris H. Howard Florey and the development of penicillin. Notes Rec R Soc Lond. 1999; 53: 243-52.

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5.4.2. SECUNDARIOS Metabolitos secundarios microbianos. Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes y más importantes de interés industrial. Los más conocidos y más ampliamente estudiados son los antibióticos y en la imagen inferior puede verse la cinética del proceso de obtención de la penicilina. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del metabolismo secundario son: 1. Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos. 2. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción. 3. La formación de metabolitos secundarios es extremadamente dependiente de las condiciones de crecimiento, especialmente de la composición del medio. Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario. 4. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras estrechamente relacionadas. Por ejemplo, se ha visto que una sola cepa de una especia del Streptomyces produce 32 antibióticos distintos pero relacionados, del tipo antraciclina. 5. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como están al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan espectacular.

Los metabolitos secundarios son moléculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento, cuyas características son: (i) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la

especie, pero cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en cultivo puro los metabolitos secundarios no desempeñan esa misión.

(ii) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados químicamente entre sí. Por ejemplo, una única cepa de una especie del género Streptomyces

produce

32

antraciclinas

diferentes.

(iii) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos.

(iv) La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea (degeneración de la raza), por lo que son muy importantes las técnicas de conservación de estos microorganismos.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación, los más importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se incluyen, además de los antibióticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (ácido lisérgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.

Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibióticos, de los que se han descubierto más de 5000, cifra que aumenta a razón de una media aproximada de 300 por año, aunque la mayoría carecen de utilidad pues son tóxicos para los organismos vivos. Aproximadamente el 75% de los antibióticos conocidos son producidos por actinomicetos. Algunas especies son excepcionales productores de antibióticos, por ejemplo Streptomyces gryseus produce al menos 40 antibióticos diferentes. El metabolismo secundario se da en fases Trofofase e idiofase.. La trofofase es la fase de crecimiento logaritmico (el prefijo trofos, significa "crecimiento" )

donde

normalmente no se producen los metabolitos secundarios, mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que las condiciones se alteren

adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del producto sea excelente.

Aunque es una simplificación pensar sólo en dos fases, esta simplificación nos permite comprender mejor la fermentación industrial de los metabolitos secundarios. Es decir, si nosotros queremos producir un metabolito secundario primero debemos asegurar las condiciones apropiadas durante la trofofase para un buen crecimiento y después, debemos alterar esas condiciones en el momento adecuado para asegurar una excelente producción del metabolito secundario.

Este retraso en la formación de metabolitos secundarios es uno de los principales mecanismos mediante el cual los microorganismos productores de antibióticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logarítmica de crecimiento son sensibles a su propio antibiótico, para posteriormente, durante la idiofase, volverse resistentes al antibiótico que están produciendo En el metabolismo secundario, la producción en cuestión puede no derivarse del sustrato primario del crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó a partir del sustrato primario del crecimiento. Por tanto, el metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las células, durante el metabolismo primario. Una característica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas en la producción del metabolito secundario están regulados separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores específicos de la producción de metabolitos secundarios. Por ejemplo, se ha identificado un inductor específico de la producción de estreptomicina, un compuesto denominado Factor A. EFECTO DE LOS PRECURSORES O INDUCTORES EN LOS METABOLITOS

SECUNDARIOS Los factores que ponen en marcha la producción de metabolitos secundarios al final de la trofofase no se conocen; únicamente se sabe que este mecanismo

se dispara normalmente cuando algún nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el nutriente responsable es una fuente de Carbono, en otras, sin embargo es el Nitrógeno o el Fósforo. La explicación puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores de los enzimas encargados de la síntesis de los metabolitos secundarios. Otra explicación puede ser que al faltar la fuente de Carbono cesa la represión por catabolito, sintetizándose a partir de este momento los enzimas necesarios para la biosíntesis de estos metabolitos secundarios. Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo secundario al final de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos cambios muy fuertes en la composición enzimática de las células, apareciendo los enzimas que están específicamente relacionados con la formación de metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia de sistemas de regulación que juegan un papel importante en la síntesis de determinados productos industriales. Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones ambientales que se llevan a cabo durante el screening secundario de una forma sistemática, incluyen la adición de centenares de aditivos en los medios de cultivo que puedan actuar como posibles precursores del producto que estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un precursor que incrementa de forma notable la producción de este metabolito secundario. El precursor puede incluso dirigir la síntesis de un determinado producto de entre varios que se producían anteriormente; es lo que se conoce como biosíntesis dirigida. Como ejemplos de precursores están el ácido fenilacético en el caso de la producción de bencil penicilina; determinados aminoácidos específicos en la producción de actinomicinas y tirociclinas; ácidos benzoicos sustituidos en la formación de novobiocinas. En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna actividad. Esto es debido a que su síntesis por el microorganismo no es el

factor limitante de la producción del metabolito secundario. En estos casos, la adición de aditivos ha revelado efectos dramáticos, tanto estimuladores como inhibidores en la producción del metabolito secundario por parte de una molécula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interacción de estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo productor. Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que los mecanismos reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable en la producción de los metabolitos secundarios. INDUCCION ENZIMATICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS A lo largo de los estudios sobre el papel que el triptófano juega como estimulador de la biosíntesis de alcaloides por Claviceps (Cornezuelo del centeno) se puso de manifiesto que la inducción enzimática juega un papel importante

en

la

producción

de

metabolitos

secundarios.

Si bien el triptófano es un precursor en la biosíntesis de estos alcaloides, no es un factor limitante; ya que su efecto estimulador se debe en gran parte a la inducción de la síntesis de los enzimas que dan lugar a la síntesis de los alcaloides. Existen tres razones que han llevado a esta conclusión: (i) Los análogos del triptófano, que no se incorporan a la molécula del alcaloide, es decir, que no son precursores, estimulan la producción de los alcaloides.

(ii) El triptófano se debe añadir durante la trofofase ya que si se añade durante la idiofase tiene poco efecto. (iii) El triptófano añadido es absorbido por la célula durante la fase de crecimiento y alcanza su mayor concentración intracelular justo antes de la síntesis de los alcaloides.

Otro efecto de inducción similar es el de la metionina en la biosíntesis de cefalosporina por Cephalosporium acremonium. A pesar de que la metionina provee azufre al antibiótico, la estimulación de la formación de cefalosporina C

se debe a un efecto de inducción. Se llegó a esta conclusión ya que la metionina debe añadirse durante la trofofase; además, la metionina puede ser reemplazada por su análogo norleucina que no tiene azufre en su molécula, por lo que su efecto no puede ser debido al hecho de aportar azufre.

La inducción también juega un papel muy importante en determinar la relación entre los componentes de la mezcla que se produce en una fermentación. Por ejemplo, en la fermentación para la producción de estreptomicina se produce estreptomicina y manósido estreptomicina. La conversión de manósido estreptomicina en estreptomicina se cataliza mediante el enzima -Dmanosidasa que es inducido por manano. V. REGULACION POR RETROALIMENTACION EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La regulación por retroalimentación también parece jugar un papel fundamental en el metabolismo secundario. Por ejemplo, el cloranfenicol al igual que la cicloheximida, penicilina y otros antibióticos limitan su propia producción actuando por retroalimentación generalmente sobre el primer enzima de la ramificación

que

conduce

a

la

síntesis

de

este

metabolito.

Otro caso de regulación por retroalimentación sucede cuando la ruta metabólica ramificada, mediante la cual se sintetiza el metabolito secundario, conduce a su vez a la síntesis de un metabolito primario, como es el caso de la lisina y la penicilina en Penicillium chrysogenum. En un primer momento se encontró que la L-lisina disminuía la producción de penicilina, pero no se sabía porqué; hasta que se descubrió que el -aminoadipato es un intermediario en la biosíntesis de los dos, lisina y penicilina. La disminución en la formación de penicilina por lisina está causada por la inhibición por retroalimentación de la homocitrato sintasa, que es el primer enzima en la biosíntesis de lisina.

Otro camino mediante el cual actúa la regulación por retroalimentación en la formación de metabolitos secundarios implica la inhibición y la represión de las fosfatasas por fosfato. Muchas fermentaciones se inhiben por ortofosfato

(H3PO4) a concentraciones (>10 mM) que no son inhibidoras para el crecimiento. En algunos casos se explica ya que los intermediarios de la ruta metabólica del producto que nos interesa están fosforilados, aunque el producto final no lo esté. Las fosfatasas actuarían en estos intermediarios.

Un ejemplo lo tenemos en la biosíntesis de estreptomicina donde actúan varias fosfatasas en la formación de estreptidina y en el último paso, desfosforilación de la estreptomicina fosfato, donde el enzima que cataliza esta reacción también está inhibida por el fosfato inorgánico. VI. REGULACION CATABOLICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La represión catabólica fue observada en la industria de antibióticos mucho antes de que se conociera y se entendiera el significado general de este fenómeno. Durante el desarrollo de la producción de penicilina se observó que la glucosa, que era una magnífica fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo, era un sustrato muy malo para la producción de penicilina; sin embargo, se observó que la lactosa, que soporta un crecimiento muy pobre, es un buen sustrato para la producción de penicilina. Por lo tanto, el medio clásico de

Jarvis

y

Johnson

lleva

una

mezcla

de

glucosa

y

lactosa.

Los mecanismos moleculares de la regulación catabólica se esclarecieron en la década de los 70. Hoy sabemos que la regulación catabólica está mediada por el nivel intracelular de un nucleótido especial, el monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), cuyo nivel intracelular es inverso a la concentración de glucosa en el medio de cultivo. Mientras existe glucosa en el medio de cultivo el nivel intracelular de AMPc es sumamente reducido, debido a que la glucosa inhibe la actividad adenilciclasa, enzima que interviene en la síntesis de AMPc. Cuando la glucosa del medio se agota, la concentración intracelular de AMPc aumenta rápidamente. El AMPc sintetizado forma un complejo con una proteína existente en la célula, denominada "proteína receptora de AMPc". Este complejo de proteína receptora y AMPc actúa sobre el gen promotor al objeto de inducir la síntesis de los enzimas necesarios para la utilización de otras

fuentes de carbono distintas a la glucosa. La glucosa inhibe gran cantidad de metabolitos secundarios. La represión catabólica también juega un papel importante en la determinación de la concentración relativa de cada uno de los antibióticos de una misma familia química que se producen en una fermentación. Este es el caso de la producción de estreptomicina por Streptomyces gryseus. Como ya hemos dicho, el manano es el inductor de la manosidasa que convierte la manósido estreptomicina en estreptomicina; sin embargo, este enzima no se sintetiza si hay glucosa (>0,5%) en el medio debido a la represión catabólica. Sólo cuando la glucosa ha desaparecido se produce el enzima que es inducido por manano. En este caso la represión catabólica juega un papel fundamental en el porcentaje de manósido estreptomicina producido en esta fermentación. VII. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La producción de clortetraciclina se reduce en gran cantidad cuando existe fosfato inorgánico en el medio. En las fermentaciones para la producción de clortetraciclina, la idiofase comienza cuando se agota el fosfato en el medio. Puesto que en la biosíntesis de clortetraciclina donde intervienen 72 intermediarios, ninguno de ellos fosforilado, este efecto del fosfato no se debe a la regulación por retroalimentación de fosfatasas. Sin embargo, es posible que esta regulación esté mediada por la carga energética ya que el contenido en ATP de dos cepas de Streptomyces aureofaciens, una poco productora (200 µg/mL) y la otra muy productora (2000 µg/mL) de clortetraciclina, difieren en que la cepa menos productora tiene de 2 a 4 veces más ATP que la más productora. En ambas cepas la concentración de ATP aumenta en la trofofase y disminuye en la idiofase, durante la producción de clortetraciclina. VIII.

INCREMENTO

DE

LA

PRODUCCION

DE

METABOLITOS

SECUNDARIOS La mayoría de los controles descritos en este capítulo se eliminan mediante manipulación ambiental o mediante la obtención de mutantes mal regulados.

1.- Manipulación ambiental Catabolito: eliminación de la glucosa del medio. Inducción: adición de manano al medio. Carga energética: disminución de fosfato en el medio. Precursores: adición de precursores al medio. 2.- Selección de mutantes mal regulados A. Revertientes La estrategia consiste primeramente en seleccionar las mejores cepas productoras del antibiótico. Estas cepas se someten a mutación con un agente mutágeno (UV, luz ultravioleta o NTG, nitrosoguanidina). De los mutantes obtenidos se seleccionan aquellos que no sean productores del antibiótico (se seleccionan aquellas cepas que poseen una proteína inactiva). Estos mutantes se vuelven a someter a mutación y se seleccionan aquellas cepas que sean de nuevo productoras del antibiótico (se obtienen mutantes dobles desregulados en un gen en el que actúa esa proteína inactiva). B. Resistencia a análogos La estrategia es la misma que la descrita con los metabolitos primarios. C. Mutasíntesis Se realiza mediante la mutación en el gen que codifica para un precursor del antibiótico natural, con lo que se consigue la síntesis de una molécula de antibiótico incompleta. Cuando se añade al medio el precursor que no puede sintetizar el microorganismo, éste reanuda la producción del antibiótico natural. De esta manera se pueden obtener nuevos antibióticos simplemente añadiendo precursores

con

estructuras

ligeramente

diferentes.http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema08MI.html http://www.biologia.edu.ar/microind/formacion%20de%20productos.htm

http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html

TEMA 12: TIPOS DE FERMENTADORES Dr. Pedro F. Mateos González

I. INTRODUCCION El objetivo de la biotecnología es obtener productos metabólicos útiles a partir de materiales biológicos. La biotecnología comprende dos fases distintas: la fermentación y la recuperación de los productos. Para el cultivo de microorganismos en condiciones óptimas, así como para la producción, por parte de los microorganismos, de los metabolitos o los enzimas deseados, deben ser desarrollados procedimientos de fermentación como son el desarrollo de cepas mediante manipulación genética y/o la regulación del metabolismo mediante la optimización del medio de cultivo así como el control adecuado de los factores físico-químicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales (02, Tª, pH, etc.). La recuperación del producto o "procesamiento posterior" (del inglés downstream processing) conlleva la extracción y purificación de los productos biológicos. La recuperación en los procesos bioquímicos difiere de la recuperación química, principalmente, en que los materiales biológicos son frecuentemente mucho más lábiles. Por lo tanto, la producción de productos metabólicos útiles a partir de microorganismos conlleva una íntima relación entre la Ciencia y la Tecnología. por un lado se deben desarrollar los microorganismos de interés industrial y por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan crecer en gran cantidad bajo aquellas condiciones que originen el mejor rendimiento posible del producto. A simple vista uno puede pensar que aquellas condiciones que se han encontrado ser las más efectivas a pequeña escala deberían ser igual de efectivas a larga escala y que para conseguir este objetivo únicamente es necesario usar un recipiente mayor con el correspondiente incremento de

volumen del medio. Nada más lejos de la realidad. Por ejemplo, se puede conseguir un buen crecimiento de un microorganismo aerobio en un matraz de 200 mL mediante agitación en un incubador usando un rotor de 300 w. Si nosotros simplemente ampliamos este sistema, un único fermentador de 10.000 litros requeriría un agitador con un motor de 15 megawatios. Dicho motor debería ser tan grande como una casa y el calor generado durante la agitación herviría a los microorganismos. En líneas generales, un proceso típico de fermentación comienza con la formulación y esterilización del medio de cultivo así como la esterilización del equipamiento. Las células se crecen primero en un cultivo de mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente en un matraz (200 a 1.000 mL) y de ahí en un prefermentador (10 a 100 L) para finalmente inocular el fermentador de producción (1.000 a 100.000 L). Una vez que la fermentación se ha completado, las células se separan del cultivo líquido. Si el producto es intracelular, se rompen las células, se eliminan los restos celulares y se recupera el producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica a partir del sobrenadante libre de células. Hasta ahora hemos visto el desarrollo de las cepas así como el diseño de los medios de cultivo. A continuación vamos a desarrollar los aspectos tecnológicos de las fermentaciones.

II. DISEÑO Y FUNCIONAMIENTO DEL FERMENTADOR El estudio detallado del diseño de un fermentador cae fuera del objetivo de esta asignatura que se concentra en los principios biológicos de la biotecnología. Sin embargo, como la tecnología de los procesos fermentativos es una amalgama de técnicas biológicas e ingeniería química, se hace necesario proporcionar un breve resumen de los tipos de fermentadores disponibles y de sus principales características. A continuación paso a describir una lista de 13 puntos considerados como los criterios más importantes para el diseño de un fermentador: 1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, así como para las operaciones de más larga duración.

2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos. 3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible. 4.- Debe tener un sistema para el control del pH. 5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas. 8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas. 9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de procesos. 10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras. 11.- La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas. 12.- deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados satisfactorios. 13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador. El mantenimiento de un ambiente aséptico y unas condiciones aeróbicas son, probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formación de espuma.

III. TIPOS DE FERMENTACIONES

1.- Fermentación discontinua Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios).

2.- Fermentación alimentada (fed-batch) En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los sustratos se añaden al principio de la fermentación. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada que se utiliza en la producción de sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los sustratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y continuan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción.

3.- Fermentación continua En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.

El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar costes e incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de fermentación más adecuado para cada paso en particular. Si bien los procesos de fermentación continua no se utilizan de forma general en la industria, debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de células en fermentación discontinua, el coste de producción de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior al de cultivo discontinuo. De este modo se han instalado plantas de producción para la producción continua de proteína de origen unicelular a partir de nalcanos, compuestos C1 y almidones. Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos han resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones: a.- Muchos métodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas. b.- Mantener las condiciones estériles a escala industrial a lo largo de un largo período de tiempo es difícil. c.- La composición de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una producción máxima. La composición de las soluciones de nutrientes industriales son variables (líquido de maceración del maiz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiología de la célula y disminuir la productividad. d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo continuo más deprisa que las cepas de producción por lo que el rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos células las que sintetizan el producto de interés.

4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo

clásico y además el producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse. Existen tres métodos de inmovilizar las células: a.- Asociación física mediante resinas de intercambio iónico. La unión se puede romper fácilmente. b.- Unión covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil celulosa. Unión fuerte aunque inactivación. c.- Atrapamiento mediante colágeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida, poliestireno. Es el método más utilizado en inmovilización de células; para ello se mezclan las células con el polisacárido líquido y posteriormente se deja enfriar para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en una columna.

IV. FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES

1.- Oxígeno 2.- Temperatura 3.- pH

1.- Oxígeno Uno de los factores más críticos en la operación de fermentación a gran escala es el suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxígeno es el sustrato

gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso. La ley de Henry describe la solubilidad del oxígeno en soluciones de nutrientes en relación a la presión parcial del oxígeno en la fase gaseosa: P0 C = -----H En esta ecuación C es la concentración de O2 de la solución de nutrientes a saturación, P0 es la presión parcial del gas en la fase gaseosa y H es la constante de Henry que es específica para cada tipo de gas. A medida que aumenta la concentración de O2 en la fase gaseosa, aumenta la proporción de O2 en la solución de nutrientes. En consecuencia, la presión más alta de O2 se consigue durante la aireación con oxígeno puro. Comparado con el valor obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se disuelven 43 mg O2/L cuando se utiliza oxígeno puro. Otra característica es que a medida que aumenta la temperatura desciende la solubilidad del oxígeno. Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias parcialmente independientes: a.- La resistencia dentro de la película de gas a la interfase. b.- La penetración de la interfase entre la burbuja de gas y el líquido. c.- Transferencia desde la interfase al líquido. d.- Movimientos dentro de la solución de nutrientes. e.- Transferencia a la superficie de la célula. En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos unicelulares como

bacterias o levaduras, el factor más importante que controla la velocidad de transferencia es la resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el líquido. Las células microbianas próximas a la burbuja de gas pueden absorber directamente el O2 a través de la interfase aumentando la transferencia del gas a estas células. En los aglomerados de células o en las bolitas de micelio, la transferencia de gas dentro del aglomerado puede ser un factor limitante. Por último indicar la concentración crítica de oxígeno que es el término utilizado para expresar el valor de la velocidad específica de absorción de oxígeno que permite la respiración sin impedimentos. Esta concentración crítica de oxígeno suele tener unos valores concretos para cada microorganismo oscilando de forma general entre el 5% y el 25% de los valores de saturación de oxígeno en los cultivos.

2.- Temperatura La temperatura es otro de los parámetros esenciales para el éxito de una fermentación. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos. A fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La velocidad de producción de calor debida a la agitación y a la actividad metabólica de los microorganismos no se ve compensada por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación, por lo que se debe recurrir a sistemas de refrigeración. Dentro de éstos, los más utilizados en las fermentaciones industriales son las camisas de agua.

3.- pH La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

V. AGITACION Y MEZCLADO La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gaslíquido. 1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos. 2.- La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan. 3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para la eliminación del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso. Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases: 1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes. 2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración de nutrientes, en el fermentador. 3.- Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos. 4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles. Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el daño celular.

Los diferentes tipos de agitación que se utilizan en las fermentaciones se incluyen dentro de las siguientes clases: 1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecánico de agitación. 2.- Columnas de burbujas, la agitación se realiza mediante la introducción de aire a sobrepresión. 3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o externo. La mezcla y circulación de los fluidos son el resultado de las corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad dentro de las diferentes partes del fermentador. De estos tres tipos el más utilizado es el primero ya que es más flexible en las condiciones de operación, es más fácil de conseguir comercialmente, provee una eficiente transferencia de gases a las células y es el tipo con el que se tiene más experiencia.

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Required Report - public distribution Date: 7/14/2008 GAIN Report Number: AR8028 AR8028

Argentina Biotechnology Annual Report 2008 Approved by: David Mergen U.S. Embassy Prepared by: Andrea Yankelevich Report Highlights: Argentina continues to be the second largest producer of biotech crops (after the United States), with an area of 19.8 million hectares estimated for the 2007/08 crop season. Pioneer's stacked corn variety HX+LL+RR received approval from the Argentine Secretariat of Agriculture, Livestock, Fisheries and Food on May 28. This approval clears the way for the first triple stacked trait product to be used by Argentine farmers.

Includes PSD Changes: No Includes Trade Matrix: No Annual Report Buenos Aires [AR1] [AR]

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Executive Summary ............................................................................................. 3 Biotechnology Trade and Production ........................................................................ 3 Soybeans ........................................................................................................ 3 Corn............................................................................................................... 4 Cotton............................................................................................................ 4 Oilseed - Rape ................................................................................................. 5 Cloned Cows: Cutting edge technology ................................................................. 5 Biotechnology Policy............................................................................................. 5 Biosafety Regulatory System............................................................................... 5 Traceability...................................................................................................... 6 Labeling .......................................................................................................... 6 Stacked events................................................................................................. 7 Coexistence..................................................................................................... 7 Intellectual Property Rights – Royalties ................................................................. 8 Biosafety Law .................................................................................................. 8 International Negotiation Fora ................................................................................ 9 Cartagena Biosafety Protocol .............................................................................. 9 Codex Alimentarius and Other Agreements............................................................ 9 Ongoing Issues at National Level ......................................................................... 9 Marketing Issues ............................................................................................... 10 Public Perception – Consumer’s Attitude.............................................................. 10 Appendix A: Biotech Crops Approved in Argentina.................................................... 11 Appendix B: Resolution 39 ................................................................................. 13 Appendix C: Commercial Release Approval Procedure for Biotech Events in Argentina..... 15 Appendix D: Field Test Approval Procedure For Biotech Events In Argentina .................. 16

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Executive Summary Argentina continues to be the second largest producer of biotech crops (after the United States) in the number of hectares planted, with an area of 19.8 million hectares estimated for the 2007/08 crop season (soybeans, corn and cotton), an increase of 8 percent over the past crop season. Almost all soybean area planted is biotech, with 74% and 90% of corn and cotton area also biotech. No other Latin American country has embraced biotech crops as wholeheartedly as Argentina. Introduction of biotech soybeans in the late 1990s sparked a rapid expansion of soybean production, which now surpasses 17 million hectares. Argentina is now entering in a new stage of biotech development after approving the use and commercialization of stacked events. Argentina continues to be an important ally of the United States in international issues involving biotechnology and co-complainant with the United States in the World Trade Organization challenge to the European Union moratorium on biotech crop applications. While the disagreement between Monsanto and the Government of Argentina (GOA) on a royalty collection system for Roundup Ready (RR) soybeans is still pending, the Government of Argentina (which created a new Ministry of Science and Technology) has placed a priority on stimulating biotech research and innovation. The current Argentine Seed Law allows producers to successively use seeds on their own farms. Farmers cannot sell these seeds. This law is interpreted to mean that farmers only have to pay royalties on the original purchase of biotech seeds, but not when they replant seeds that have been selected and saved. But according to official numbers, 20 perc ent of the total area planted with soybeans in Argentina is sown with seeds purchased from authorized dealers; 30 percent with seeds saved by farmers for their own use, and the remaining 50 percent with seeds selected and sold illegally. The National Seed Institute (INASE), in charge of overseeing seed production and sales and guaranteeing the transparency of the sector, was closed down in 2000 and reopened by the Secretariat of Agriculture in 2003. Since then, INASE officials have been assigned to draft a revamped seed law which contains a modification to the chapter dedicated to “self use”. This draft was approved by the former Secretary of Agriculture last November, and has been passed to the National Congress for discussion. The Office of Biotechnology, created in 2004, is the key biotechnology agency within Secretariat of Agriculture (SAGPyA) that coordinates all biotech activities and information. Biotechnology Trade and Production Argentina is the world's second largest producer of biotech crops after the United States, with twelve biotech crop varieties approved for production and commercialization: one for soybeans (Monsanto 40-3-2), two for cotton (Monsanto 531 and 1445) and now nine for corn (Ciba-Geigy 176, AgrEvo T 25, Monsanto 810, NK 603, Novartis Bt 11, Syngenta GA 21, Dow/Pioneer TC 1507, Monsanto NK603 x 810 and Pioneer 1507 x NK603). (Please See Attachment A) Soybeans Released in 1996, glyphosate tolerant (Roundup Ready) soybeans were the first biotech crop introduced into Argentine agriculture. Since its release, this technology has been adopted at a very high rate, with almost all of the 17 million hectares of soybeans planted for the

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current season being biotech. The new technology facilitated the incorporation of double crop soybeans (following wheat) in many areas where only one crop was planted before the availability of the biotech varieties. The Argentine soybean economy is geared almost entirely towards exports. Only two percent of harvested soybeans reach the domestic market, whereas 30 percent is exported as grain and 68 percent is processed by the oilseed industry within Argentina. Ninety-three percent of soybean oil and ninety-nine percent of by-products (meals) are exported. Corn On August 31, 2007 Argentina approved the first stacked gene, Monsanto’s NK603x810. This approval marks the first time stacked traits have been approved in the country. In February 2007, the government simplified the approval process for stacked events, allowing applications for a transgenic crop combining two already approved events without a full analysis of the new crop. The seeds are modified to produce a substance toxic to corn borer parasites and for glyphosate resistance, widely used as a herbicide to control weeds. On May 28, 2008 Pioneer received approval from the Argentine Secretariat of Agriculture, Livestock, Fisheries and Food for the company's stacked corn trait product containing the insect protection trait (Herculex I technology), resistance to the Amonium Glufosinate (Liberty Link technology) and to Glifosate (Round Up Ready Technology). This approval clears the way for the first triple stacked trait product to be used by Argentine farmers. This is also the first stacked trait product of Pioneer approved in Argentina. The stacked trait approval was issued after a product safety scientific review conducted by the Argentina regulatory bodies of CONABIA and SENASA. Biotech varieties of lepidoptera tolerant and ammonium-glyphosate tolerant corn were commercially released for the first time in 1998. The adoption of these varieties has also been significant. Biotech corn adoption represents 74% of total corn planted area. In the 2007/2008 crop season the area planted with stacked events accounted for 2 percent of the total area (approx 82,000 hectares). The rest of the biotech corn planted corresponded to Bt corn estimated in 2.51 million hectares, representing approx 63 percent of the total planted corn in the country, and gliphosate tolerant 390,000 hectares or 9 per cent of the total corn. Cotton Biotech cotton adoption represents 90 percent of total cotton planted area. In the 2007/08 crop season, 43% of that cotton (124,000HAS) was plated with the glyphosate resistant event and the remaining 57% (162,000HAS) were planted with the Bt event. Although seed containing the combination of Bt and RR technologies may be approved in the near future, some sources speculate that it may not be marketed due to concerns by seed companies about collecting fees and controlling illegal multiplication. Research done by the National Institute of Agricultural Technology (INTA) found that in the leading cotton-growing regions of Argentina, biotech cotton required almost 64 percent fewer applications of insecticide when compared to its conventional counterpart. This research showed that the average cotton grower had a $65 per hectare advantage (approximately $26

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per acre) using biotech cotton versus conventional cotton. Similar economic advantages have been found in the United States from the use of biotech cotton. INTA is also conducting research of colored cotton varieties. The release in the market is expected in a few more years and will be focused on niche markets for small and medium producers. Oilseed - Rape The National Seed Institue (INASE) has forbidden thru Resolution 305/07 the import of biotech rapeseed and established the requirement for a certificate stating the absence of biotech seeds in rapeseed shipments. Cloned Cows: Cutting edge technology Argentina was the first country in Latin America to develop two generations of cloned cows, capable of producing Human Growth Hormone. In March 2006, CONABIA and SENASA (National Service of Agricultural And Food Health and Quality) approved the first step in the process to authorize the production of the human growth hormone from milk. The next step that needs to be completed is the approval by the Secretary of Public Health. The cloned calves, Pampa Mansa II, Pampa Mansa III and Pampero, developed by the Biosidus Company, carry a gene that produces human growth hormone in milk. The milk produced by just one cow can meet the demand of the entire country. It is estimated that 1,000 Argentine children currently require such hormone therapy. In 2007, Biosidus Company developed another line of cloned calves, this time to produce insulin. After several years of research and 4 million dollars investment, “Patagonia” was the first calve born. In this case, the insulin produced by 25 cows like Patagonia will meet the annual demand of the entire country at a lower cost (30% less than the currently used insulin). The intention is to produce enough insulin to be able to export in the near future. Biotechnology Policy Biosafety Regulatory System Argentine biosafety regulatory system is based on the evaluation of the product and not of the process through whic h it was obtained. The evaluation takes place on a case-by-case basis, taking into consideration the process only in those cases where the environment, the agricultural production or the health of humans or animals could be at risk. The key office within SAGPyA that centralizes all biotech activities and information is the Office of Biotechnology, created in 2004. This office coordinates three technical areas: Biosafety Issues (the head is a member of CONABIA), Policy Analysis and Formulation and Regulatory Design. The approval process for commercialization of biotech seeds involves different agencies within SAGPyA:

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-National Advisory Committee on Agricultural Biotechnology (CONABIA) Role: Evaluate impact in the agricultural ecosystem. Ensures compliance with Resolution 39. (Please See Appendix B) and also with Resolution 60, that regulates stacked genes. CONABIA is a multidisciplinary and inter-institutional organization with advisory duties. Its main responsibility is to assess, from a technical and scientific perspective, the potential environmental impact of the introduction of biotech crops in Argentine agriculture. CONABIA reviews and advises the Secretariat on issues related to trials and/or the release into the environment of biotech crops and other products that may be derived from or contain biotech crops. -National Service of Agricultural And Food Health and Quality (SENASA) Role: Evaluate the biosafety of food products derived from biotech crops for human and animal consumption. -National Direction of Agricultural Food Markets (DNMA) Role: Evaluate commercial impact on export markets by preparing a technical report in order to avoid a negative impact on Argentine exports. DNMA mainly analyzes the status of the event under study in the destination markets in terms of whether the product has been approved or not and, as a result, whether the addition of this event to Argentina’s export supply might represent a potential barrier to the access to these markets. -National Seed Institute (INASE) Role: Establish requirements for registration in the National Registry of Cultivars. Upon completion of all of the steps mentioned above, CONABIA's Office of Technical Coordination compiles all pertinent information and prepares a final report to the Secretary of Agriculture, Livestock, Fisheries and Food for final decision. (Attachments C & D) CONABIA is a multi-sectorial organization made up by representatives from the public sector, academia and private sector organizations related to agricultural biotechnology. CONABIA members perform their duties as individuals and not as representatives of the sector they represent, and they are active participants in the international debate of biosafety and its related regulatory processes. CONABIA has reviewed over 500 permits since its creation, developing new capacities as the sector required. CONABIA is an advisory agency that operates pursuant to a resolution by the Argentine Secretary of Agriculture. In absence of a law governing its reviews, there are limits in its ability penalize those who do not comply with stipulated procedures. Traceability There is no official system in place. At this stage, only private companies (authorized labs) have the capability to perform the required tests. For example, the National Institute of Agricultural Technology (INTA) does analysis on a private basis. Labeling There is no specific regulation in Argentina in reference to labeling biotech products. The current regulatory system is based on the characteristics and identified risks of the product and not in the production process of that product. There is no regulation governing the use of labels such as “BIOTECH FREE” or “NON-GMO”.

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The policy of the SAGPyA on labelling in international fora is that it should be based on the type of food product derived from a specific biotech seed taking into account that: Any food product obtained through biotechnology and substantially equivalent to a conventional food product, should not be subject to any specific mandatory label. Any food product obtained through biotechnology and substantially different from a conventional food product for any specific characteristic may be labelled according to its characteristics as food product, not according to aspects concerning the environment or production process. Differential labelling is not justified, as there is no evidence that demonstrates that food products produced through biotechnology may represent any risk for the consumers’ health. In the case of agricultural products, as the majority of them are commodities; the identification process would be complicated and expensive. The increased production costs as a result of labelling would end up being paid by the consumers, without assuring that this would represent better information or increased food security. Stacked events In 2007, under Resolution 60 which complements resolution 39, Argentina approved a different treatment for stacked genes. Approval is based in a case by case evaluation under which the applicant needs to submit a letter simultaneously to SAGPyA (Office of Biotechnolgy) and to SENASA requesting authorization for commercialization of the specific stacked event. The evaluation is based on possible effects when the individual events affect related metabolic patterns. Also, in order to evaluate the possible effects of the stacked event in the ecosystem, as well as the food biosafety evaluation, CONABIA and/or SENASA will determine whether they request additional information from the applicant. Coexistence The Argentine Seed Association (ASA), created in 1999 the Insect Resistance Management Program in Bt. The objective of the program is to promote a responsible use of technology in order to delay any potential resistance development and immediately detect any change in the susceptibility of insect populations by putting in place a refuge system. To carry out this goal, the program is based on three pillars: Research: Scientists from INTA (National Institute of Agricultural Technology) conduct permanent studies to improve the understanding of pest biology and to monitor the sensitivity to the Bt protein. The goal is to continuously improve tools used to evaluate recommendations regarding resistance management provided to farmers and used to detect any possible change in the susceptibility of the insect population. Communication: Farmers, as users of the technology, have a key role in its preservation; therefore their knowledge is fundamental to achieve a responsible and successful management of Bt corn varieties.

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Evaluation of a proper use of technology: The periodic evaluation of farmers adoption of refuges allows an assessment of the success of the program and to improve the tools to adjust communication. CONABIA approved this system and periodically receives reports submitted by the Argentine Seed Association (ASA). Intellectual Property Rights – Royalties Argentina is a major producer and exporter of agricultural biotechnology products, yet it does not have an adequate and effective system in place to protect the intellectual property rights of new plant varieties or plant-related technology. Penalties for unauthorized use of protected seed varieties are negligible. Judicial enforcement procedures in Argentina likewise are ineffective as a mechanism to prevent the unauthorized, commercial use of protected varieties. Argentine Intellectual Property (IP) laws are based on UPOV-78, which provides strong protection for the right of farmers to save and replant seeds, and exempts them from providing explanations on how selected seeds were used. The lack of effective enforcement options for plant variety rights, combined with the absence of patent protection for a significant range of biotech inventions, renders Argentina’s intellectual property system inadequate from the perspective of the biotechnology industry. Monsanto, grower organizations, and commodity exporters have not reached agreement on a solution to the continued high level of saved and illegally traded RR soybeans. In January 2004, Monsanto announced that it would cease investments in and sales of RR soybeans in Argentina. The central issue, according to Monsanto, was its inability to fully collect RRtechnology-related royalties from Argentine growers. Monsanto applied for and was denied a patent on RR soybeans, a decision it appealed unsuccessfully with the Argentine Supreme Court. Argentine law currently allows farmers to save seed from one harvest and to use it the following year if a royalty is paid to the original seed breeder. However, it is illegal to sell, trade, or pass saved seed from one producer to another. In May 2004, Argentina’s National Seed Institute implemented Resolution 44/2004, requiring that each sack of seed be labeled with quantity, unit price, total sales price, and seed species, type or variety. Due to continued illegal seed sales, Monsanto initiated legal actions in European Countries in 2005 against unlicensed shipments of soybeans, soybean meal, and other soy products containing the RR gene. The Argentine Government developed a new seed law with the goal of ensuring that providers of technology are adequately compensated, although details of the law have not been made public. Contacts report that the initial proposal has already reached the National Congress, but due to the ongoing dispute between the government and the rural sector, the Congress has not started its consideration of the law. Biosafety Law Argentina does not have a biosafety law in place. Initial discussions on developing a biosaftey law took place in 2001, but due to the institutional and economic crisis that broke out in December 2001, the draft was never discussed in Congress and there is no evidence that it will be in the near future.

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International Negotiation Fora Cartagena Biosafety Protocol In the international biotechnology negotiation arena, the Cartagena Biosafety Protocol (CBP) is probably the most significant issue. Argentina signed the Biosafety Protocol in May 2000 in Nairobi, Kenya, but has not yet signed its ratification. Argentina is currently undergoing a consultation process, analyzing and debating with all the involved sectors the position the country will take in this respect. Codex Alimentarius and Other Agreements Argentina is actively working to reach consensus on biotech labelling and traceability, and actively participating to avoid potential trade disruptions and unnecessary cost increases. Other important international negotiation areas are the creation of an ad-hoc group on agricultural biotechnology within the framework of the MERCOSUR. Ongoing Issues at National Level Creation of a Biotechnology office within SAGPyA with the objective of centralizing all the information and activities. The GOA has Developed a 15 year Strategic Plan The plan proposes to diversify the application of biotechnology, both in the number of tools and in productive activities. It advocates creating an appropriate environment (in political, legal and public acceptance issues) for the creation and development of biotechnology-based companies, and also to improve the consolidation of the existing ones. It proposes to assist increasing agricultural production, while preserving and improving the quality of life of the present and future generations. One of the strengths of the plan resides on its flexibility: the accomplishment of the plan has been based on the implementation of a scheme that is built almost simultaneously along its execution, including the revision of objectives, goals and main actions. Another strength of the plan is the collective bias of its elaboration: stakeholders of the agricultural and livestock activity took part in different discussions, and they contributed with relevant elements that promoted both the quality and the general acceptance of the document. For several agricultural biotechnology strategic concerns, a regional treatment has been anticipated with the purpose of preserving the regional integration, with attention to local issues, where the relationship with neighbor countries is defined in terms of technological cooperation and commercial exchange or competition. Biotech Promotion Law This law (N. 26.270) was implemented to promote biotech initiatives, to stimulate, through fiscal benefits, research, development and investment in products, services or biotech processes.

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Marketing Issues Public Perception – Consumer’s Attitude Most Argentine scientists and farmers are optimistic and enthusiastic about the prospects of using biotechnology to improve yields and nutritional value of crops while decreasing the input of chemical pesticides. As yet, Argentine consumers do not see biotech products as a benefit to themselves but they can see these products as economically productive to farmers and multinationals and are hesitant about supporting the technology. As Argentina has been a leader in the adoption of biotechnology, there is a need for dialogue and communication among scientists, farmers, private companies, consumers, government, and regulatory organisms. Under the UNEP-GEF project (United Nations Environment Program – Global Environment Facility), SAGPyA performed and released a survey among producers and consumers that provided the following results: Producers: (survey conducted a the two most important local farming shows) 90% of the consulted producers reported that, (although some showed confusion and hesitation), they knew, worked with or at least heard about biotech, 75% stated that consumption of biotech foods DO NOT present any risks to the human health, 12% expressed that they know the Argentine regulatory system, and half of them considered that it is safe, 57% stated that if the GOA were to decide to segregate, they would still use biotech seeds, 82% stated that biotechnology is a tool that solves problems that no other technology has been able to solve, and 49% stated that biotechnology does not present a serious ethical problem. Consumers (survey conducted in various supermarkets): 80% are informed mainly thru TV, 55% thru radio and 50% thru newspapers, 13% DO NOT read the label of a product before purchasing it, 60% have confidence in what they consume, 64% of the consulted consumers stated that, albeit reporting some confusion and hesitation, they heard about biotech foods, 43% agreed with the use of biotechnology in agriculture 40% stated that consumption of biotech products poses some risks to human health 94% of all consulted (both producers and consumers) stated that the government should provide more information regarding the benefits and risks of biotech products.

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Appendix A: Biotech Crops Approved in Argentina

Crop

Trait Category

Event

Applicant

Soybean

Glypohosate Herbicide Tolerant

"40-3-2"

Nidera S. A.

Maize

Maize

Cotton

Maize

Cotton

Maize

Maize

Maize

Resistant to Lepidoptera

Glufosinate Amonium Tolerant

Resistant to Lepidoptera

Resistant to Lepidoptera

Glypohosate Herbicide Tolerant

Resistant to Lepidoptera

Glypohosate Herbicide Tolerant

Resistant to Lepidoptera and Glufosinate Amonium Tolerant

(25-3-96) SAPyA N° 19

"176"

*

Ciba-Geigy

"T25"

AgrEvo S. A.

Monsanto Argentina S.A.I.C.

"MON 531"

Monsanto Argentina S.A.I.C.

"MON 810"

"MON 1445"

" Bt 11"

" NK 603 "

“TC 1507”

Resolution SAPyA N° 167

Monsanto Argentina S.A.I.C.

Novartis Agrosem S.A.

Monsanto Argentina S.A.I.C.

Dow AgroSciences S.A. and Pioneer Argentina S.A

(16-1-98). SAGPyA N° 372 (23-6-98) SAGPyA N°428 (16-7-98). SAGPyA N° 429 (16-7-98). SAGPyA N° 32 (25-4-01). SAGPyA N° 392 (27-7-01). SAGPyA N° 640 (13-7-04). SAGPyA N° 143

(15-03-05) SAGPyA N° 640 Maize

Glypohosate Herbicide Tolerant

"GA 21"

*

Syngenta Seeds S.A. (22-08-05)

Maize

Glypohosate Herbicide Tolerant and Resistant to Lepidoptera

NK603x810

Monsanto

SAGPyA Nº 78 (28/08/07)

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Maize

Glypohosate and Glufosinate Dow Agrosiences and Herbicides Tolerant and Resistant NK603x1507 Pioneer Argentina to Lepidoptera

SAGPyA Nº 434

(28/05/08)

• •

Production and Commercialization in compliance with Res. 178/07 INASE

Source: CONABIA

For a complete list of 2006 evaluations, please visit: http://www.sagpya.gov.ar/new/0-0/programas/conabia/liberaciones_ogm_2006.php

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Appendix B: Resolution 39 Specifies the conditions under which environmental releases of transgenic material should be conducted. Resolution 39 is part of the general regulatory system governing the existing agricultural regulations in Argentina related to Plant Protection (Decree-Law of Agricultural Production Health Defense. n° 6704/66 and its amendments), Seeds and Phytogenetic Creations (Seed and Phytogenetic creations law, nº 20.247/73 and its regulatory decree), and Animal Health (Law of Veterinarian Products, and Supervision of Creation and Commercialization. nº 13.636/49). The Secretariat of Agriculture (SAGPyA) is the authority that issues the licences for experimentation on and/or release into the environment of genetically modified plant organisms, relying on prior advice from CONABIA. - Licences are issued in the following cases: a) Laboratory-greenhouse trials; b) Field trials; and or c) Pre-commercial multiplication of GMOs - Fifteen (15) copies of the appropriate application must be submitted to CONABIA. The procedure begins in the National Seed Institute at the following address: Paseo Colon 922 3° floor - office 349. zip code 1063 - Capital Federal, Buenos Aires, telephone no.: 54-114349-2433/2420/2498. fax: 54-11-4349-2417. - Each copy of the application must be signed by a legally responsible person of the applicant organization, who will assume responsibility for the compliance with all of the conditions under which the pertinent authorization is granted. - Information included in the summary of the application shall be contained in all other sections of the application, as it is required. - The assertions in the additional information form must be accompanied by the supporting literature references. All information should be provided in the original language. - The form must be written in the Spanish language. - Supplementary information may include reports presented to the competent authorities of foreign countries, with the amendments and additions that may be relevant for the local conditions, as well as references to previous reports presented to CONABIA. - Upon evaluation of the application, CONABIA shall decide on the suitability of permitting the release of the GMO in question, and shall submit its decision for the approval of the Secretary of Agriculture, Livestock, Fisheries and Food. - At the end of the period for which the authorization was granted, the applicant shall submit to CONABIA a final report. - An authorized experiment will be deemed correctly concluded, upon compliance with the following conditions:

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-Correct risk management by the applicant, -Consistency between the conditions under which the authorization was granted and the conditions observed at the site of experimentation, and/or release by the inspectors appointed by the competent authority; and -Submission of the final report. -Any applicants who had already obtained authorizations for experimentation and/or release into the environment of GMOs, may request through a letter addressed to CONABIA, filed at the National Seed Institute, flexibility for the conditions under which the above mentioned permits are granted. Upon receiving approval of the flexibility status permit from the Secretary of Agriculture, Livestock, Fisheries and Food, further releases into the environment will only require the submission of the following information: the area sown, the date of sowing, the site of release, and the harvest date. CONABIA will only recommend that inspections be made at harvest and of the measures taken for the final disposition of the material. -Obtaining the flexibility status permit will not mean an authorization for seed commercialization. Seed commercialization is subject to the following terms and conditions: - Authorization to follow more flexible conditions for the the environment of GMO material.

granting of permits for release into

- Compliance with the requirements set forth by the National Seed Institute for registration of the material in the National Cultivar Registry and in the official certification regulations. - Compliance, if applicable, with the requirements set forth by SENASA regarding authorizations for the commercialization of agrochemical products. - A letter addressed to the Technical Coordination of CONABIA at Paseo Colón 982 - 2° floor office 220 - zip code 1063 - Federal Capital. Telephone no.: 54-11-4349-2222/2226, fax no.: 54-11-4349-2224, requesting the initiation of the procedure necessary to comply with the requirements under the jurisdiction of SENASA in connection with the use of transgenic material and its derived products for human and animal consumption. SENASA may request from the applicant any information it may deem necessary for the purposes of carrying out the pertinent evaluations. - Thereupon, CONABIA will request the technical review of the National Direction of Agricultural Food Markets regarding the convenience of commercialization of the GMO material. -Upon completion with all of the steps mentioned above, CONABIA's Technical Coordination will compile the pertinent information for the purposes of preparing a final report to the Secretary of Agriculture, Livestock, Fisheries and Food for its final decision.

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Appendix C: Commercial Release Approval Procedure for Biotech Events in Argentina Application

SENASA

CONABIA

Food Safety review

Environmental review

Decision proposal Flexibilization

DNMA Market analysis

Technical Report

Technical Report

CONABIA

SAGPyA

Project of Final Resolution by the Agriculture Direction of SAGPyA (Commercialization approval) INASE

Seed Registration Commercial Release

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Appendix D: Field Test Approval Procedure For Biotech Events In Argentina Application

CONABIA Preliminary review by Technical Coordination staff (data lacking) Request for additional Information review

(data complete) CONABIA Complete analysis and By full commission

Response by Applicant

Reccomendations

SAGPyA Official Resolution Notice to Applicant INASE Letter with conditions for the test Applicant conducts field tests Site inspections by INASE, SENASA and CONABIA Final Report to CONABIA

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