VIII Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica – Octubre de 2006

Jorge Tolivia Fernández Ana Navarro Incio Eva Martínez Pinilla Cristina Ordoñez Camblor Cristina Pérez Carbajales Departamento de Morfología y Biología Celular Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, España

Correspondencia: Dr. Jorge Tolivia Fernández Facultad de Medicina Departamento de Morfología y Biología Celular c/ Julián Clavería s/n, 33006 Oviedo, España Telf:+34 85 103 061 Fax:+34 85 103 618 E-mail: [email protected]

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Método simple y rápido para el análisis morfométrico de secciones de nervios. El estudio histopatológico de los nervios es frecuentemente complementado con análisis morfométricos, los cuales pueden realizarse manualmente o mediante sistemas computerizados. La utilización de sistemas manuales o semiautomáticos resulta tediosa y consume una gran cantidad de tiempo. La mayoría de los métodos automáticos tienen problemas para discriminar los distintos tipos de fibras de la sección lo cual solo se resuelve parcialmente utilizando grandes aumentos y realizando un muestreo aleatorio de la muestra. Por otro lado estos métodos utilizan programas comerciales de alto costo. En este trabajo proponemos un sistema automático capaz de trabajar de forma fiable a bajos aumentos utilizando programas de libre o semilibre difusión. Se utilizaron nervios ciáticos procedentes de ratones salvajes y Knock-out para la apolipoproteína D. Las muestras fueron rutinariamente procesadas para microscópica electrónica de transmisión, obteniéndose secciones semifinas de 0,5 micras que fueron posteriormente fotografiadas y digitalizadas con un microscopio NIKON-eclipse E400. Las imágenes obtenidas fueron procesadas y analizadas mediante los programas Adobe Photoshop e Image Tool. El resultado final es la obtención de imágenes completas de la sección a un aumento de 40X donde se recoge la distribución colorimétrica de prácticamente todas las fibras (98%), distribuidas en función de los diferentes parámetros analizados (área, perímetro, diámetros, etc.). Así mismo, quedan recogidos dichos valores para su análisis estadístico. El tiempo estimado para el análisis de una sección es aproximadamente de 5 minutos. En conclusión, mediante el protocolo planteado se puede realizar un estudio detallado y totalmente automatizado de las características morfo y densitométricas de un nervio, sin la necesidad de utilizar programas comerciales ni equipamientos complejos. También se puede destacar nuevamente en que la mayor ventaja del método consiste en su sencillez y rapidez de aplicación, lo cual permite su uso de forma rutinaria en cualquier estudio anatomopatológico o experimental planteado. Palabras clave: morfometría; análisis de imagen; nervios; MET

mediante estrategias como el uso de tabletas digitalizadoras y posterior análisis computarizado) (Nehrer-Tairych y col., 2000), y automáticas (discriminación, selección y análisis final mediante el uso directo de programas de análisis de imagen) (Auer, 1994). La utilización de los dos primeros sistemas indicados resulta tediosa, aburrida y pesada, teniendo en cuenta el gran número de fibras a dibujar y/o medir por cada sección. La mayoría de los métodos automáticos tienen serios problemas para discriminar claramente todas las fibras de la sección y

INTRODUCCIÓN El estudio histopatológico de los nervios periféricos es a menudo complementado con análisis morfométricos. Esto se puede realizar manualmente o mediante sistemas computarizados de análisis de imagen, capaces de automatizar el proceso. En relación con esto podemos considerar tres tipos de estrategias: manuales (mediciones directas sobre la sección mediante escalas) (Romero y col, 2000), semiautomáticas (recopilación digital de perfiles

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dicho problema se acentúa en el caso de las fibras cuyas vainas mielínicas entren en contacto. Dicho problema solo se resuelve, parcialmente, utilizando grandes aumentos y realizando un muestreo aleatorio de la muestra, con lo cual solo se muestrea un número pequeño de las fibras en cada sección.

numérica y gráfica con los datos obtenidos del análisis, estableciendo el investigador los intervalos mas adecuados para su estudio y el tipo de factor a representar. La imagen gráfica obtenida nos da una imagen altamente informativa de la distribución de las fibras en la sección (Fig 4) según el parámetro y las franjas escogidas. Mediante una macro diseñada en Adobe se realiza el montaje de las dos hemisecciones analizadas, reconstruyendose la sección del nervio analizada (Fig 5). Finalmente y sobre las secciones originales (Fig 1) se puede realizar un análisis densitométrico global del contenido de mielina de la sección mediante el método previamente descrito por nuestro grupo (Tolivia y col., 2006).

En la presente comunicación exponemos un método automático que permite la discriminación, aislamiento y estudio morfométrico de la sección del nervio en su totalidad, con un gasto temporal mínimo por sección y una resolución que abarca también a las fibras que aparecen en íntimo contacto. MATERIAL Y MÉTODOS

DISCUSIÓN Se utilizaron nervios ciáticos normales y experimentales de ratones salvajes y “knock out” para Apo D. Las muestras fueron fijadas rutinariamente para microscopia electrónica, postfijadas en tetróxido de osmio e incluidas en resina acrílica tipo Araldita. Se obtuvieron secciones de 0,5 µm de grosor, teñidas con el primer paso del método polícromo de Tolivia y col (1994), fotografiadas en un microscopio Nikon Eclipse E400 mediante una cámara Nikon DN100 y archivadas en formato TIF. Posteriormente las imágenes fueron procesadas mediante los programas Adobe Photoshop CS e Image Tool 3.0, recogiendose los datos obtenidos en una hoja de cálculo (Microsoft Excel) para su posterior análisis estadístico.

Los métodos utilizados hasta el momento actual para realizar estudios morfométricos de las secciones de nervios periféricos presentan diferentes inconvenientes. Los métodos mas manuales son muy tediosos y laboriosos haciendo prácticamente imposible un seguimiento lógico y libre de errores, causados mayoritariamente por la fatiga en el observador (Auer 1994), de nervios largos y con un gran número de fibras. Cuando se realizan estudios automáticos o semiautomáticos sobre muestras aleatorias de una sección los errores cometidos pueden ser elevados sobre todo dependiendo del número de muestras no existiendo un claro acuerdo en este punto (Mayhew y Sharma, 1984; Torch y col., 1989). No existen actualmente métodos automáticos o semiautomáticos altamente fiables, y que además no usen programas comerciales caros y complejos, para el estudio morfométrico de las secciones de nervios (UrsoBaiarda y Grobbelaar, 2006). El método desarrollado por nuestro grupo permite el estudio global de secciones completas, incluso en los nervios del presente estudio constituidos por varios miles de fibras en cada sección y con diámetros muy pequeños, pudiendo obtener en pocos minutos (no mas de 10 por sección) todos los datos morfométricos que el programa usado permita calcular. Así mismo se basa en el uso de programas fácilmente adquiribles (Adobe Photoshop viene con diversos digitalizadores, escáneres, cámaras etc., e Image Tool es de libre difusión.).

RESULTADOS Mediante el tratamiento con el programa Adobe Photoshop obtenemos dos imágenes en grises de la sección original obtenida con el objetivo de 40x (Fig 1). Para la obtención de las imágenes en grises se diseñó una macro que básicamente realiza los siguientes pasos: aumento del tamaño de imagen, modificación de contraste, selección del canal rojo y división de la imagen en dos mitades para facilitar su posterior análisis (Fig 2). Las imágenes en grises son cargadas posteriormente en el programa Image Tool donde se realizarán las medidas pertinentes (área, perímetro, factor circular etc.). Estas medidas son ordenadas numéricamente según un etiquetado realizado por el programa directamente sobre los perfiles de las fibras analizadas (Fig 3). Las medidas obtenidas son pasadas a una hoja de calculo para su posterior análisis estadístico. El programa Image Tool nos permite también realizar una distribución

Conclusión: Podemos concluir que el método que hemos desarrollado permite el muestreo rápido y muy fiable de las secciones de nervios periféricos, con un margen mínimo de pérdida de fibras (estimamos -2-

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http://conganat.cs.urjc.es Análisis de Imagen 4. Nehrer-Tairych GV, Rab M, Kamolz L, Deutinger M, Stohr HG, Frey M. The influence of the donor nerve on the function and morphology of a mimic muscle after cross innervation: an experimental study in rabbits. Br J Plast Surg. 2000; 53(8):669-75. 5. Romero E, Cuisenaire O, Denef JF, Delbeke J, Macq B, Veraart C. Automatic morphometry of nerve histological sections. J Neurosci Methods. 2000; 97(2):111-22. 6. Tolivia J, Navarro A, Tolivia D. Differential staining of nerve cells and fibres for sections of paraffin-embedded material in mammalian central nervous system. Histochemistry. 1994; 102(2):101-4. 7. Torch S, Stoebner P, Usson Y, D'Aubigny GD, Saxod R. There is no simple adequate sampling scheme for estimating the myelinated fibre size distribution in human peripheral nerve: a statistical ultrastructural study. J Neurosci Methods. 1989;27(2):149-64. 8. Urso-Baiarda F, Grobbelaar AO. Practical nerve morphometry. J Neurosci Methods. 2006; 30 [en prensa] 9. Tolivia J, Navarro A, del Valle E, Perez C, Ordoñez C, Martinez E. Application of Photoshop and Scion Image analysis to quantification of signals in histochemistry, immunocytochemistry and hybridocytochemistry. Anal Quant Cytol Histol. 2006 Feb;28(1):43-53

menos del 3-5% en nuestras secciones de nervios) y que solo afecta a algunas fibras de ínfimo tamaño con lo cual en nervios de mayor diámetro (por ejemplo en humanos) se puede aproximar a un 100% de efectividad. Así mismo se trata de un método fácil, aplicable de forma rutinaria y con un mínimo gasto de tiempo y dinero en cualquier servicio de Anatomía Patológica. REFERENCIAS 1. Auer RN. Automated nerve fibre size and myelin sheath measurement using microcomputer-based digital image analysis: theory, method and results. J Neurosci Methods. 1994;51(2):229-38. 2. Mayhew TM, Sharma AK. Sampling schemes for estimating nerve fibre size. I. Methods for nerve trunks of mixed fascicularity. J Anat. 1984;139:45-58. 3. Mezin P, Tenaud C, Bosson JL, Stoebner P. Morphometric analysis of the peripheral nerve: advantages of the semi-automated interactive method. J Neurosci Methods. 1994; 51(2):163-9.

ICONOGRAFÍA

Figura 1.- Sección semifina de nervio ciático de ratón. 40x

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Figura 2.- Hemisección de la figura 1 procesada en Adobe Photoshop para su posterior análisis morfométrico. Se observa la nitidez de los perfiles fibrilares lo cual garantiza su correcto análisis.

Figura 3.- Imagen parcial del etiquetado numérico que el programa Image Tool realiza de forma automática y que permite conocer exactamente a que fibras de la imagen corresponden las medidas obtenidas. -4-

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Figura 4.- Distribución de las fibras de la figura 2 en función del área de las mismas, realizada de modo automático por el programa Image Tool. Cada color corresponde a un rango de área determinado.

Figura 5.- Montaje final, realizado mediante una macro en Adobe Photoshop, donde se recoge la distribución de todas las fibras de la sección en función del área estimada.

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