BLOQUE ANALÍTICO

Paloma Yáñez-Sedeño Orive • Sensores y biosensores en el análisis químico (2h) -Transductores ópticos y electroquímicos - Materiales de (bio)-reconocimiento (enzimas, ADN, aptámeros, bacteriófagos) -Técnicas de inmovilización. • Estrategias de modificación (2h) - Preparación de superficies nanoestructuradas: empleo de nanopartículas, quantum-dots, nanotubos de carbono y grafeno. • Monitorización de analitos traza en muestras ambientales y alimentos (2h) - Control de microorganismos. - Análisis multiplex. - Aplicaciones clínicas: diseño de POCs. - Detección de biomarcadores de enfermedades.

Sensores químicos SENSOR

MUESTRA

Medida directa Respuesta continua y reversible Sin preparación de muestra

elemento de reconocimiento selectividad

-ÓPTICOS -ELECTROQUÍMICOS biológico: BIOSENSOR

SENSORES ÓPTICOS

Empleo de “optodos” u “optrodos” Medida de señales de absorción o de luminiscencia Uso de fibra óptica y LEDs

FOCs

SENSORES ÓPTICOS Componentes básicos de un sensor de fibra óptica:

M E

F: selectores de longitud de onda; D: detector fotónico E: capa fluorescente indicadora sensible al oxígeno M: medida de oxígeno disuelto por desactivación de la fluorescencia del indicador inmovilizado.

SENSOR DE HUMEDAD

HR, % 0

100

Complejo de Ru sensible a la humedad

Espectros de luminiscencia (100%, sumergido en agua)

Bedoya et al., Sens. Actuators, B 113 (2006) 573

SENSORES ÓPTICOS INCONVENIENTES La luz ambiental produce altos niveles de ruido Es necesario amplificar la señal El intervalo dinámico lineal suele ser corto La miniaturización reduce la magnitud de la señal VENTAJAS No se requiere electrodo de referencia Monitorización remota con fibras de elevada longitud Transmisión simultánea de varios tipos de información

SENSORES ELECTROQUÍMICOS Empleo de electrodos Medida de señales amperométricas, voltamperométricas o potenciométricas Uso de modificadores, nanomateriales

RE

RE

AE

WE

eS

A-

P

amperométricos, voltamperométricos

WE

ISE

A- A- AK+ K+

potenciométricos

SENSORES ELECTROQUÍMICOS

+

VALINOMICINA

+

SENSORES ELECTROQUÍMICOS

Polímeros de impresión molecular (MIPs)

CARACTERÍSTICAS GENERALES

ALTA SELECTIVIDAD SENSIBILIDAD ADECUADA TIEMPO DE RESPUESTA RELATIVAMENTE BAJO MINIATURIZACIÓN, PORTABILIDAD PRODUCCIÓN EN MASA

BIOSENSOR

Biorreceptores Biorreceptor señal Señal Detector

Transductor

CLASIFICACIÓN BIORRECEPTORES

INMOVILIZACIÓN

Enzimas

química -enlace covalente (entrecruzamiento) Anticuerpos física -adsorción -atrapamiento -confinamiento ADN

CÉLULAS

FAGOS

CLASIFICACIÓN

Electroquímicos -amperometría -potenciometría

Espectroscopía de impedancia electroquímica (IES)

Ópticos -absorción UV-vis -luminiscencia (ECL)

Resonancia de plasmón superficial (SPR) Transductor

Piezoeléctrico Termométrico

Biosensor electroquímico para la determinación de glucosa en sangre

CÉLULA ELECTROQUÍMICA PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

Pista conductora de plata Electrodo de Trabajo (grafito)

PVC Contacto eléctrico

Electrodo de referencia Ag/AgCl) Capa dieléctrica Pista Conductora de grafito

REACCIÓN ENZIMÁTICA

P S

Ered

O2 2e

Eox

H 2 O2

Características de un medidor de glucosa típico

Electrodo de referencia Ag/AgCl y electrodo de carbono con glucosa oxidasa y ferroceno como mediador Deposición de muestra sobre una tira de plástico Detección 2-25 mM en una gota de sangre Resultado en 30 segundos Duración 6 meses

BIOSENSORES

ALÉRGENOS

TESTOSTERONA GLUTAMATO

CREATININA GLUTEN

HOMOCISTEÍNA

DISRUPTORES ENDOCRINOS

FRUCTOSA

CAMPOS DE APLICACIÓN

CLÍNICO

AGROALIMENTARIO

MEDIOAMBIENTAL DEFENSA MILITAR

CAMPOS DE APLICACIÓN

SECTOR CLÍNICO •

Biosensores Enzimáticos

Analito

Aplicación

GLUCOSA

DIABETES

Urea y Creatinina Colesterol Acetilcolina Lactato

Función renal Ateromas Neurotransmisión Esfuerzo muscular

CAMPOS DE APLICACIÓN

SECTOR AGROALIMENTARIO •

Control de calidad

Analito Glucosa, fructosa, otros H de C Hipoxantina Inosina Inosina-5`monofosfato

Producto Alimentos y bebidas

Frescura carne y pescado

•

Control de procesos

Analito Lactato Glucosa Penicilina Aminoácidos Sacarosa Etanol

Producto Vino y yogurt Medios de fermentación y maduración Proteínas Jarabes y confituras Bebidas

CAMPOS DE APLICACIÓN

SECTOR MEDIOAMBIENTAL

•

Detección de sustancias tóxicas Analito

Biosensor

pesticidas organofosforados y carbamatos fenoles (microorganismos)

acetilcolinesterasa tirosinasa y otros

CAMPOS DE APLICACIÓN

DEFENSA MILITAR

•

OBJETIVO:

desarrollo de dispositivos de alarma para armamento químico

•

Detección de explosivos y agentes de guerra química Analito

Biosensor

TNT agentes neurotóxicos

peroxidasa (HRP) organofosfato hidrolasa (OPH)

BIOSENSORES ÓPTICOS

SISTEMA NAD+/NADH sustrato + NAD+

EDH

productos + NADH

oxidación

NADH NAD+

BIOSENSORES ÓPTICOS Configuraciones:

A+B SIN mediador

C

EtOH + NAD+

ADH

A+B M+C

CON mediador

AcOH + NADH

M C

glucosa + O2

GOx

H2O2 + lum

H2O2 lum

*

BIOSENSORES ÓPTICOS EJEMPLO DE APLICACIÓN DE UN FOB:

Determinación de herbicidas (diuron) fibra óptica

hν

Chlorella vulgaris PSII (sol-gel)

guía

hν

diuron

tapa

(anti –PSII) entrada muestra

salida muestra No se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.

soporte

algas

Excitación λ 469 nm

Emisión de fluorescencia λ 682 nm Fibra óptica

Fluorescencia

Células de algas atrapadas en un sol-gel transparente

zona de fluorescencia

DISEÑO DE LA FASE SENSORA

INMOVILIZACIÓN A

B

Enlace covalente: A) a una superficie activada y B) a una membrana

A

A

B

Adsorción física: A) sin y B) con entrecruzamiento

B

Atrapamiento: A) en polímero y B) en material electródico

Confinamiento

INMOVILIZACIÓN B

A

estabilidad unión proteínas mediante grupos:

Enlace covalente: A) a una superficie activada y B) a una membrana

OH

OH

-SH Cisteína -OH Serina

-COOH Aspartato Glutamato

-Nimidazol Histidina

unión al soporte mediante grupos:

OH OH

COOH COOH

-NH2 Lisina -OH-Ph Tirosina

-CONH2

poliacrilamida

-COOH

carboximetilcelulosa

-NH2

poliestireno, nylon

-OH

agarosa, sephadex

-Si(OH)3

vidrio poroso

COOH COOH

carbono activación

carbono activado

INMOVILIZACIÓN

acetato de polivinilo

HS-CH2-CH2-COOH (MPA) chitosan

INMOVILIZACIÓN B

A

simplicidad interacciones electrostáticas, hidrofóbicas, puentes de H, van der Waals materiales adsorbentes:

Adsorción física: A) sin y B) con entrecruzamiento

oro, carbono, vidrio, PVC, celulosa estabilidad limitada

CHO

NH2-ENZIMA +

( CH 2) 3

NH2-ENZIMA

CHO

N - Enzima CH ( C H 2) 3 CH N - Enzima

GA entrecruzamiento RETICULADO: BSA

INMOVILIZACIÓN A

B inclusión de la biomolécula en red tridimensional materiales:

Atrapamiento: A) en polímero y B) en material electródico

polímero, gel, matriz porosa, Nafion, silicatos, electrodos compósitos, partículas metálicas pérdida bioactividad difícil acceso a la biomolécula

INMOVILIZACIÓN Electrodos “screen-printed”

Electrodos compósitos Grafito Grafito + Enzima agitación + Enzima + Teflon presión

Pastilla

“tinta” de carbono con la enzima

POLÍMEROS CONDUCTORES

• CONDUCTORES • DE INTERCAMBIO IÓNICO • REDOX

Polímeros conductores electrónicos

TIOFENO PIRROL

ANILINA

POLIPIRROL

POLÍMEROS CONDUCTORES DETERMINACIÓN DE COLESTEROL

EJEMPLO DE APLICACIÓN: pirrol (Py)

polipirrol (pPy)

E = +0.8V

ChOx

colesterol oxidasa

ChEt

colesterol esterasa

-eChOx ChEt

-eChOx ChEt

electrodo ecolestenona + H2O2 colesterol O2 colesterol éster

E = 0.5 V

INMOVILIZACIÓN Formación de estructuras sol-gel TMOS hidrólisis ó condensación

policondensación

Formación de gel

Gel + Evaporación de disolvente

Gel seco +

EJEMPLO: PREPARACIÓN DE UN MICROBIOSENSOR DE L-GLUTAMATO WE RE AuE

PDA, 10 mM PBS 0.1 M, pH 7.4 CV, 0.2-0.8 V, n=6, 10 mV/s

-0.9 → -1.2 V 10 – 40 s

Pt µE

p(PDA)-Pt µE L-GLU (gel) / p(PDA)-Pt µE

HCl dil.

TMOS

Tris 50 mM, pH 7.

sol hidrólisis

glicerol, NaCl + L-GLU, 1 U

PDA, fenilendiamina pPDA, poli(fenilendiamina) L-GLU, L-glutamato oxidasa

capilar

FUNCIONAMIENTO DEL MICROBIOSENSOR L-GLU(gel)/p(PDA)-µPtE

Eap= 600 mV

FUNCIONAMIENTO DEL MICROBIOSENSOR L-GLU(gel)/p(PDA)-µPtE Determinación de L-glutamato en el cerebro de ratas anestesiadas

L-glutamato + H2O 2-oxoglutarato L-glutamato + NH3 oxidasa

O2

H2O2

presión arterial (BP) fenilefrina

INMOVILIZACIÓN

la biomolécula queda entre el electrodo y una membrana porosa materiales: Confinamiento

membrana de diálisis, colágeno, liposoma pérdida bioactividad difícil acceso a la biomolécula menos interferencias

INMOVILIZACIÓN Membranas de diálisis

De celulosa: celulosa modificada (cuprofán, cupramonio-rayón) celulosa sintética (hemofán, SMC) celulosa sustituida (acetato, diacetato y triacetato de celulosa). Sintéticas: poliacrilonitrilo (AN69, PAN, SPAN) polisulfona; poliamida; polimetilmetacrilato (PMMA) policarbonato; etilenvinilalcohol (EVAL)

biomolécula aislada por membrana semipermeable

Liposoma

INMOVILIZACIÓN COMPARACIÓN DE MÉTODOS Características

Preparación

Adsorción

Enlace covalente

Atrapamiento

Empleo de membranas

Simple

Difícil

Difícil

Simple

Bajo

Alto

Moderado

Alto

Variable

Fuerte

Débil

Fuerte

Si

No

Si

No

Amplia

Selectiva

Amplia

Muy amplio

Problemas de funcionamiento

Alto

Bajo

Alto

Alto

Efectos matriz

Si

Si

Si

No

Grandes barreras de difusión

No

No

Si

Si

Coste Fuerza de unión Pérdidas de biomolécula Aplicabilidad

ENZIMA TIROSINASA

His His

His

O Cu

His

Cu O

His

His

o-quinona 1/2

O2

Tyrred o-difenol e-

H2O

Tyrox

derivado fenólico

ESTABILIDAD DE VARIOS BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS DE TIROSINASA

TIEMPO DE VIDA ÚTIL Tyr-grafito

8 horas

Tyr-MPA-AuE

5 días

Tyr-nAu-GCE Tyr-nAu-grafito-Teflon

18 días 39 días

TRANSFERENCIA ELECTRÓNICA DIRECTA (DET)

Sox Sred

Sox Sred

Ered

O2

Eox

H2O2

Ered

Mox

Biosensor de primera generación

2e

Eox

Sox Sred

ne

Biosensor de segunda generación

ne

Biosensor de tercera generación

Mred

Ered Eox

EJEMPLO: DET de Cyt c sobre L-cys/AuE

Cyt cc Cyt HemoFe Fe(II) Hemo (II)

H2O2

½ H 2O2

L-Cys ePBS pH 7.0

CV, 0.4 – 0.0 V vs Ag/AgCl

Cyt c

Cyt cc Cyt HemoFe Fe(II) Hemo (III)

H2O

H 2O

MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS (SAMs)

2.88 Å

4.97 Å

4.97 Å

30º

Conjuntos de moléculas ordenadas Alcanotioles de cadena larga adsorbidos en una superficie sólida (AuE). Modificadores superficiales Mejora interacción biomolécula - electrodo

MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS (SAMs) PREPARACIÓN

R-S-H + Aun0 → R-S-Au+.Aun-10 + ½H2

AUTOENSAMBLAJE Sencillez Flexibilidad sintética Reproducibilidad Homogeneidad Estabilidad Ordenamiento estructural

MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS (SAMs) EJEMPLO DE APLICACIÓN:

DETERMINACIÓN DE LACTULOSA

2TTF+ 2e

PQQH2 2TTF

5-CETO-D-FRUCTOSA

PQQ FRUCTOSA

mediador redox

LACTULOSA

β-galactosidasa fructosa deshidrogenasa tetratiafulvaleno

TIEMPO DE VIDA ÚTIL: 81 DÍAS LOD: 9.6 µM

ácido mercaptopropiónico

Biosensor bienzimático TTF-β-Gal-FDH-MPA-AuE DETERMINACIÓN DE LACTULOSA EN LECHE índice analítico para diferenciar leche UHT y leche esterilizada Adición de 500 µL de leche a la célula electroquímica (conteniendo 10.0 mL de regulador fosfato 0.05 M, pH 4.5):

0.02 µA 50 s Leche pasteurizada Leche UHT (sin lactulosa) (100-510) mg L-1 lactulosa

Leche esterilizada (600-2000) mg L-1 lactulose

El blanco es la señal de la leche pasteurizada

BIOSENSORES DE AFINIDAD DOS TIPOS:

INMUNOSENSORES

GENOSENSORES

CONTROL TERMODINÁMICO

INTERACCIONES ESPECÍFICAS

ÁREAS DE INTERÉS

ANÁLISIS BIOMÉDICO Y FARMACÉUTICO

ANÁLISIS DE ALIMENTOS

medicamentos drogas hormonas marcadores de enfermedades alérgenos microorganismos...

ANÁLISIS MEDIOAMBIENTAL

ANÁLISIS FORENSE

pesticidas residuos industriales

CONTROL DE DOPAJE

INMUNOSENSORES INTERACCIONES ANTÍGENO - ANTICUERPO

Complejo antígeno-anticuerpo NO DETECCIÓN DIRECTA

constantes ~ 105 - 1012

TÉCNICAS DE INMUNOENSAYO

INMUNOENSAYO ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

Por lo general: marcaje de antígenos o anticuerpos

El marcador hace posible la detección

antígeno

marcador

anticuerpo

INMUNOSENSORES Inmunoensayo con marcadores

fosfatasa alcalina AP

ARILFOSFATO OH1-naftilfosfato fenilfosfato p-nitrofenilfosfato

DERIVADO FENÓLICO 1-naftol fenol p-nitrofenol -e

debe optimizarse el arilfosfato para cada superficie electródica

QUINONA

TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN Uniones de afinidad: A) avidina o estreptavidina B) proteína A

biotina

anticuerpo biotinilado

Estreptavidina Biotina

estreptavidina

MAGNETOINMUNOSENSORES

Micropartículas magnéticas funcionalizadas - Elevada área activa - Inmovilización de altas concentraciones de biomoléculas - Manipulables con la ayuda de un imán - Disminución de efectos matriz - Separación etapas de preparación del conjugado y de detección - Facilitan la optimización de las condiciones experimentales.

VARIEDAD DE GRUPOS FUNCIONALES Y SITIOS ENLAZANTES

** versatilidad ** uniones covalentes o de afinidad

CALIBRADOS COMPETITIVO P

++

S

Electrodo

Electrodo +

+

S 25 20 15 10 5

anticuerpo

antígeno

marcador

0

10

20

Conc.

60

CALIBRADOS SANDWICH P

+ Electrodo

+ Electrodo

S P

Electrodo

+

+

S

S 25 20 15 10 5

0

anticuerpo

antígeno

10

marcador

20

60

Conc.

INMUNOSENSORES EJEMPLO DE APLICACIÓN

Determinación de la antitoxina del cólera

(HQ) (Q)

(HQ)

toxina del cólera

electrodo

II Anticuerpo marcado con HRP

(pPy-derivado)

I Anticuerpo (antitoxina del cólera)

INMUNOSENSORES EJEMPLO DE APLICACIÓN

Determinación de neumolisina

MAGNETOINMUNOSENSORES CORTISOL

lavado

lavado

anti-cortisol

protein A -MBs

AP-cortisol

cortisol

MAGNETOINMUNOSENSORES CORTISOL 1-NPP

Ar-OH Ar=O

i

imán

IMÁN E

AP

Hormona polipeptídica generada en el tejido adiposo blanco Hipotálamo Ingesta de alimentos

Regula la ingesta de alimentos promoviendo anorexia

LEPTINA LEPTINA

Peso corporal

Tejido adiposo

su consumo en la leche materna proteje de la obesidad en la edad adulta

MAGNETOINMUNOSENSOR PARA LA DETERMINACIÓN DE LEPTINA

I. Ojeda et al., Analyst, 138 (2013) 4284

MAGNETOINMUNOSENSOR PARA LA DETERMINACIÓN DE LEPTINA

25 i, µA leptina, pg/mL

5 µA

20

100 50 25 10 5 1

15 10 5 0

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1

1e+2

1e+3 1e+4 1e+5 Leptin, pg/mLpg/mL leptina,

0.0

0.25 E, V 0.5

0.75

MAGNETOINMUNOSENSOR PARA LA DETERMINACIÓN DE LEPTINA

Determinación de leptina en suero humano y leche infantil

Leptina, ng/mL

Leptina encontrada, ng/mL

Recuperación, %

Suero humano

leptina

Leche infantil

Determinación de leptina en leche materna

Leptina encontrada, ng/mL

2.6 2.6 0.1 0.1 1.9 0.2

KIT ELISA, ng/mL

2.9 2.9 0.5 0.5 1.9 0.4

I. Ojeda et al., Analyst, 138 (2013) 4284

“screen-printed”

DESECHABLES

*Diseño flexible *Varios materiales *Reproducibilidad

BIOSENSORES DE ADN

Dos tipos:

DE AFINIDAD

- detección de pequeñas moléculas afines a los ácidos nucleicos - se intercalan en las cadenas de ADN - se monitoriza la señal electroquímica de la guanina - Ejemplos: PAHs, micotoxinas, PCBs

DE HIBRIDACIÓN

- detección de cadenas complementarias - se inmoviliza un oligonucleótido específico (cadena simple: ssADN) - se monitoriza la hibridación - suelen emplearse indicadores

BIOSENSORES DE HIBRIDACIÓN DE ADN

Autoensamblaje de monocapas de sondas funcionalizadas con tioles sobre electrodos de Au

ADN objetivo

ADN sonda MCH AuE MCH: 6-mercapto-1-hexanol

BIOSENSORES DE HIBRIDACIÓN DE ADN Inmovilización del oligonucleótido sonda de cadena simple sobre el electrodo

HIBRIDACIÓN

Apareamiento de bases de Watson-Crick (G-C y A-T) guanina-citosina


Requisitos: - Alta especificidad - Alta sensibilidad

adenina-timina

Secuencia complementaria

BIOSENSORES DE HIBRIDACIÓN DE ADN DETECCIÓN BASADA EN UN INDICADOR

DPV de ferrocenilnaftaleno diimida sobre electrodo modificado con dT20 antes (a) y después (b) de la hibridación con dA20

– HS → Au

Sensor de ADN

NANOESTRUCTURA DE ORO

SH

SH ss-DNA "sonda"

S

S

S

ADN de captura tiolado

ADN diana

RuHex

RuHex

RuHex

i, nA

ADN marcado con liposomas

S

S

S

RuHex

E, mV

W-C. Liao, J.A. Ho, Anal. Chem., 81 (2009) 2470