Módulo 1. Muestreo y examen microscópico de los alimentos Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su calidad y/o seguridad, los análisis microbiológicos proporcionan información muy valiosa, respecto a: la calidad de las materias primas, las condiciones sanitarias en que se procesó el alimento, y sobre la efectividad del proceso, específicamente de los métodos de conservación. Como químicos sabemos que antes de proceder a un análisis es indispensable: • tener claro el objetivo de un análisis, • identificar los analitos adecuados y las técnicas para determinarlos, y • planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de las muestras.

Parte A. PLANES DE MUESTREO Y CRITERIO MICROBIOLÓGICO ICMSF es la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de los Alimentos (en inglés, International Comssion on Microbiological Specification for Food) y forma parte de la Organización Mundial para la Salud (OMS). Está constituida por representantes de la mayoría de los países en el mundo. ICMSF surgió por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos estableciendo límites microbiológicos, métodos de análisis y de muestreo. Existen diversos métodos de muestreo, pero el de ICMSF está siendo adoptado rápidamente por la industria de alimentos relacionada con el comercio internacional. La calidad de los alimentos Según Adams y Moss (2000), la calidad de los alimentos depende de 3 factores: • Seguridad. Un alimento no debe contener ciertos niveles de microorganismos patógenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando éste se consuma. • Aceptabilidad. Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales que lo conviertan en organolépticamente inaceptable en poco tiempo. • Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no mostrar variaciones de lote a lote, tanto desde el punto de vista de seguridad como de aceptabilidad. Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y suponer que la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue tomado. La validez de esta extrapolación dependerá de la representatividad de las muestras y de la exactitud y precisión del análisis. De ahí la importancia de establecer un plan de muestreo adecuado. 1

Es necesario entonces contar con un criterio microbiológico para determinar si un alimento es de buena o de mala calidad, evaluando la seguridad del alimento, el seguimiento de buenas prácticas de manufactura, la vida de anaquel y la utilidad o adecuabilidad de un alimento o ingrediente para cierto propósito (Smoot y Pierson, 1997). Según la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de Alimentos (ICMSF, 2002), deben incluirse los siguientes factores en un criterio microbiológico: • Una descripción del alimento al que aplica el criterio, ya que al diferir en origen, composición y procesamiento, cada alimento representa diferentes problemas de descomposición y de seguridad. • Una descripción de los microorganismos o toxinas capaces de causar problemas. • Detalles de los métodos analíticos para detectar o cuantificar esos microorganismos o toxinas. • El número y tamaño de muestra que debe ser tomado de un lote de alimento. • Los límites microbiológicos apropiados, de acuerdo con el alimento y el microorganismo a analizar.

PLANES DE MUESTREO (ICMSF, 2002) Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un criterio de decisión. Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el carácter de una población. La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen la muestra. Un plan de muestreo está descrito por 2 valores: n, que es el número de unidades a analizar y c, que es el número máximo de unidades defectuosas aceptables. Mediante el uso de una curva de operación característica (para un par determinado de valores n y c) se puede determinar qué tan discriminante es un plan de muestreo. En esta curva se grafica la probabilidad de aceptación de un lote contra la calidad real del lote (porcentaje de unidades defectuosas). Un plan de muestreo es más estricto mientras mayor sea el número de unidades analizadas (n) y menor el número máximo de unidades defectuosas a aceptar (c). El riesgo del productor describe la probabilidad de que un lote aceptable sea falsamente rechazado (1 - Pa); mientras que el riesgo del consumidor describe la probabilidad de que un lote malo sea aceptado falsamente (Pa).

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Un lote rechazado deberá regresarse al productor, ser reprocesado, destruido o prohibido para el consumo humano. Para asegurar que la condición de la muestra tomada sea lo más similar a la del lote del que se sustrajo, ésta deberá ser representativa. Para lograr lo anterior se sugiere realizar un muestreo al azar o un muestreo estratificado, en el caso que se esperen diferencias en la calidad del lote. Se consideran los siguientes principios fundamentales: • n se refiere al número de unidades que se sustraen de manera separada e independiente. • La sustracción de un número grande de unidades pequeñas provee mayor protección que la del mismo peso total de muestra en menos unidades. • La muestra real consiste de aquéllas unidades que se examinan. • Lo relevante no es la sustracción de una fracción del lote, sino el tamaño de la muestra tomada al azar y los criterios de aceptación y de rechazo. • Cuando no es posible tomar una muestra al azar de todo un cargamento, sino sólo de una sección accesible, se le llama a esta sección el marco y los resultados y conclusiones aplicarán solamente a éste. • Al aumentar el riesgo debe aumentar el número y el tamaño de las unidades, para minimizar la probabilidad de aceptar un lote que debería ser rechazado. • A menor uniformidad, será necesario sustraer un mayor número de muestras. • Los análisis microbiológicos son laboriosos y lentos y los alimentos son perecederos. Por estas razones existen presiones políticas o administrativas para reducir el muestreo. Esto traerá como consecuencia el aumento en la probabilidad de error. • El tamaño de la muestra es crítico en situaciones de análisis de presencia o ausencia. MÉTODOS DE MUESTREO Existen diferentes tipos de datos: En el caso de los de atributos, las decisiones se basan en la presencia o ausencia de algún microorganismo o en el resultado positivo o negativo de una prueba. En los de medida la variable es continua, como una concentración o un número. Los de medida pueden ser convertidos en los del tipo atributo estableciendo un valor límite. Planes de 2 clases (Figura 1). Son aquéllos en los que la muestra se divide en dos clases, después de analizar las unidades: ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran aceptables. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se consideran defectuosas.

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Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo o una para determinar una cuenta microbiana o la concentración de una toxina. m es un valor crítico arriba del cual la unidad analizada se considera defectuosa. Planes de 3 clases (Figura 2). Son aquéllos en los que la muestra se divide en tres clases, después unidades: ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m aceptables. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M marginalmente aceptables. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M defectuosas.

de analizar las se consideran se consideran se consideran

En ambos casos la probabilidad de aceptación dependerá de los valores n y c seleccionados. Las ventajas del uso de los planes de tres clases son: • De acuerdo con la experiencia práctica, aún observando buenas prácticas de manufactura, algunas unidades pueden resultar en el rango marginalmente aceptable, sin causar problemas, y se pueden aceptar. • Se afectan menos por cambios en la distribución de microorganismos dentro de un lote, debidos a causas desconocidas. • Permiten advertir aumentos en los riesgos, si existe una tendencia de aumento en el número de unidades marginalmente aceptables.

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PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES n = número de unidades a analizar c = número máximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar m = Cantidad que distingue aceptables de defectuosas

m

Aceptables

Defectuosas

Figura 1 Planes de muestreo de dos clases.

PLANES DE 3 CLASES Resultados cuantitativos Concentraciones

m

Aceptables

M

Marginalmente

Defectuosas

aceptables

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Figura 2 Planes de muestreo de 3 clases. En la Figura 3 se presenta un diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la selección del tipo de plan de muestreo.

Medición del microorganismo por: Pruebas de presencia o ausencia concentración ↓ Plan de dos clases ↓ Es posible aceptar la presencia de este microorganismo en el alimento? ↓ ↓ NO SI c=0 c≥0 ↓ ↓ Seleccionar Seleccionar n nyc

Pruebas

de

↓ Plan de tres clases ↓ Seleccionar n y c

Figura 3 Selección del tipo de plan de muestreo. Curvas de operación Una curva de operación (Figura 4) es la que se obtiene al graficar la probabilidad de aceptación, con valores entre 0 y 1 y el porcentaje real de unidades defectuosas del lote (considerando que se hubieran analizado cada una de las unidades del lote). Se presenta en la Figura 4 la curva de operación para el plan de muestreo n = 5 c = 0; o sea que para considerar que la calidad del lote es buena analizarse 5 unidades del lote y no se acepta ninguna unidad defectuosa. Entonces cuando el lote no contiene ninguna unidad defectuosa la probabilidad de aceptación es de 95% y cuando contiene 45% de unidades defectuosas, con el plan establecido, la probabilidad de rechazo sería de 95%. El efecto de n y c en la rigurosidad del plan de muestreo En la Figura 5 se presentan las curvas de operación para diversos valores de n y c. Se presentan 4 figuras con curvas para diferentes valores de n (5, 10,15 y 20) y en cada figura se presentan curvas de operación para diferentes valores de c. Como se puede observar, la Pa disminuye cuando n aumenta y cuando el valor c disminuye.

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Es posible entonces, modificando los valores de n y c, diseñar planes de muestreo tan estrictos como se requiera.

Figura 4 Curva de operación característica para el plan de muestreo n=5, c=0. (ICMSF, 2002).

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Figura 5 Efecto de los valores n y c en la rigurosidad del plan de muestreo (ICMSF, 2002). SELECCIÓN DEL PLAN DE MUESTREO Para seleccionar un plan de muestreo adecuado es necesario considerar: 1. La seriedad del tipo de riesgo según el microorganismo a analizar. 2. Las condiciones a las que se expondrá el lote del alimento. Tipo de riesgo. El plan de muestreo deberá ser más estricto mientras mayor sea el riesgo que implique el tipo de microorganismo a analizar. Los factores a considerar en el tipo de riesgo son: • Médicos y epidemiológicos, que incluyen la severidad clínica de la enfermedad producida, su frecuencia, duración, la infectividad del microorganismo, la posibilidad de ocurrencia del estado portador y la extensión potencial. • Etiológicos, como la asociación inherente con riesgos severos, como ocurre en el caso de Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Entamoeba histolytica, Taenia solium y Taenia saginata, que sobreviven y se multiplican en el hombre, dañan su salud, amenazan su vida y presentan dosis infectivas pequeñas, o como Clostridium botulinum, que produce una toxina fatal. 8

• Factores clínicos. Se deberán tomar en cuenta las altas tasas de mortalidad ocasionadas por enfermedades como la disentería y el botulismo, las secuelas severas de la acción de Streptococcus beta-hemolítico, la convalescencia larga de enfermedades como la fiebre tifoidea, la paratifoidea, la brucelosis y la vulnerabilidad de niños, ancianos y enfermos. • Factores epidemiológicos. La propensidad de ciertos tipos de microorganismos patógenos de encontrarse distribuidos ampliamente en el reino animal, las costumbres locales, los estándares de higiene, la asociación entre ciertos tipos de patógenos con ciertos alimentos, las costumbres dietéticas y de la preparación de los alimentos. Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de microorganismos de acuerdo al tipo de riesgo que representan en: Sin riesgo a la salud. Se incluye aquí a los grupos microbianos responsables de la descomposición de alimentos, que disminuyen su aceptabilidad, su vida de anaquel, pero que como grupo de microorganismos no se considera que causen daño a la salud. Riesgo indirecto. Se considera a los microorganismos indicadores, como los microorganismos mesófilos aerobios, los coliformes totales y fecales, los enterococos y Staphylococcus aureus, que indican (de manera indirecta) la posible presencia de microorganismos patógenos. Riesgo moderado de extensión moderada. Son microorganismos ubicuos en la naturaleza y la enfermedad que producen está relacionada con números grandes del patógeno. Riesgo moderado de extensión amplia. Incluye microorganismos que presentan riesgos epidemiológicos severos. Son diseminados por alimentos específicos, pero pueden introducirse al alimento por contaminación ambiental o cruzada. La enfermedad resulta de inóculos relativamente pequeños. Riesgo severo. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan riesgos severos a la salud. En la Tabla 1 se presenta una clasificación de microorganismos y parásitos de acuerdo con los criterios anteriores. Se debe mencionar que ésta no es una clasificación rígida, ya que se debe tomar en cuenta que lo que para un adulto normal representa un riesgo moderado, para un adulto, un bebé o un enfermo puede ser un riesgo severo. Efecto de las condiciones a las que se expondrá el alimento. Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento, existen condiciones que pueden provocar:

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• Aumento del riesgo. Éste puede ocurrir por recontaminación después del procesamiento, uso de tal manera que permita la multiplicación de microorganismos, cuando la cocción no ocurre inmediatamente antes del consumo. • El riesgo no se modifica. • Disminución del riesgo. Por ejemplo, cuando se sabe que se aplicará al alimento un procesamiento térmico. Combinando estos dos aspectos, el ICMSF propone que se consideren 15 casos, así como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 2). Determinación de los valores m y M. El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y obtenible con buenas prácticas de manufactura. Puede tener un valor de cero o de ausencia de cierto microorganismo, o el nivel de detectabilidad de una prueba, o un valor numérico. El valor M es un nivel de contaminación riesgoso, provocado por malas prácticas higiénicas. Microorganismos de descomposición: serán los niveles de microorganismos que producen una descomposición detectable (olor o sabor) o una vida de anaquel inaceptablemente corta. Indicadores de sanidad: niveles que indican una condición de sanidad inaceptable. Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles de microorganismos (o concentración de toxinas) que producen enfermedades. Tabla 1 Agrupación de microorganismos y de parásitos de acuerdo al tipo de severidad del riesgo (Smoot y Pierson, 1997). Tipo de riesgo Riesgo severo

Organismo Clostridium botulinum tipos A, B, E y F Shigella dysenteriae Salmonella typhi serotipos paratyphi A y B Escherichia coli enterohemorrágica virus de la hepatitis A y E Brucella abortus, Brucella suis Vibrio cholerae 01 Vibrio vulnificus Taenia solium

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Riesgo moderado de potencialmente amplia

extensión Listeria monocytogenes Salmonella spp. Shigella spp. otras cepas enterovirulentas de E. coli Streptococcus pyogenes Rotavirus Virus del grupo Norwalk Entamoeba histolytica Diphyllobotrium latum Ascaris lumbricoides Criptosporidium parvum Riesgo moderado de extensión limitada Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Vibrio cholerae no 01 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Giardia lamblia Taenia saginata

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Tabla 2 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las diferentes combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso.

Grado de riesgo Sin riesgo directo, vida de anaquel, descomposición Riesgo a la salud Bajo, indirecto (indicadores) Moderado, directo, extensión limitada Moderado, directo, extensión amplia Severo, directo

Condiciones en las que se espera que el alimento sea manejado y consumido después del muestreo Condiciones que Condiciones que Condiciones que reducen el riesgo no modifican el incrementan el riesgo riesgo Vida de anaquel Sin cambio Vida de anaquel aumenta disminuye Caso 1 Caso 2 Caso 3 3 clases 3 clases 3 clases n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 Riesgo disminuye Riesgo no cambia Riesgo aumenta Caso 4 Caso 5 Caso 6 3 clases 3 clases 3 clases n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 Caso 7 Caso 8 Caso 9 3 clases 3 clases 3 clases n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 n = 10, c = 1 Caso 10 Caso 11 Caso 12 2 clases 2 clases 2 clases n = 5, c = 0 n = 10, c = 0 n = 20, c = 0 Caso 13 Caso 14 Caso 15 2 clases 2 clases 2 clases n = 15, c = 0 n = 30, c = 0 n = 60, c = 0

Referencias Adams M.R., Moss, M.O. (2000). Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry, Gran Bretaña. Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (2001). Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C. ICMSF (2002) Microorganisms in Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety Kluwer Academic/Plenum Publishers. E.U.

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Smoot L.M., Pierson M.D. (1997) Indicator microorganisms and microbiological criteria. En: Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (Eds) Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C. 66-80.

Parte B.

EXAMEN MICROSCÓPICO DEL ALIMENTO

Cuando se tiene un alimento alterado por microorganismos ó en descomposición y cuando se sospecha que un alimento está involucrado en una ETA, es importante hacer un examen microscópico directo del alimento o de una de las primeras diluciones; la microbiota que se encuentra en una tinción de Gram de dicha preparación puede orientar al analista sobre el problema, aún cuando los microorganismos pueden no estar viables. Por ejemplo la presencia de gran cantidad de cocos Grampositivos puede implicar la presencia de toxina estafilocóccica, aún si los cultivos resultan negativos, ya que el calentamiento puede destruir a la bacteria pero no a la toxina. Si se encuentran cantidades importantes de bacilos Grampositivos esporulados, conviene considerar el manejo que ha tenido el alimento (refrigeración, tratamiento térmico, condiciones aeróbicas o anaeróbicas) y relacionarlas con los posibles contaminantes. La presencia de bacilos Gramnegativos se debe relacionar con los síntomas y periodos de incubación, para buscar alguno de los géneros posiblemente implicados: Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio, ó Campylobacter. A continuación se describe el método para el examen microscópico de alimentos en general: Equipo Microscopio óptico

Material y muestras Alimento homogenizado o dilución 10-1. Portaobjetos previamente marcados Asa microbiológica

Reactivos Colorantes de Gram Metanol Xilol (xileno ó dimetil-bencenos) PRECAUCIÓN: Flamable, evitar exposición en embarazo

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Procedimiento 0. En esta práctica NO SE UTILIZA MECHERO por el xilol, que es muy volátil y flamable. Aplique las muestras con pipeta Pasteur. 1. Hacer preparaciones fijas, secar al aire y fijar con metanol durante 1 a 2 minutos, escurrir, enjuagar y secar al aire. 2. Desengrasar las muestras de alimentos (que lo requieran), sumergiendo en xilol por 2 minutos; escurrir, lavar en metanol para eliminar el exceso de xilol, ya que es insoluble en agua, escurrir y secar. PRECAUCIÓN: El xileno es muy flamable y es tóxico. NO USAR MECHEROS CUANDO SE USA XILOL. EVITAR LA INHALACIÓN. EMPLEAR LENTES DE PROTECCIÓN. EVITAR LA EXPOSICIÓN EN EL EMBARAZO. 3. Teñir las preparaciones con el método de Gram 4. Examinar al microscopio, con 1000x y aceite de inmersión. Se deben examinar al menos 10 campos de cada preparación, buscando los tipos predominantes de microorganismos, en particular costridia, cocos Grampositivos y bacilos Gramnegativos. Para el examen microscópico de huevo congelado y en polvo, así como de leche bronca, el método se aplica de manera cuantitativa, aplicando una cantidad conocida de muestra en una superficie definida.

Referencias CFSAN. 2006. Bacteriological Analytical Manual (online). USFDA. Disponible a través de Internet en: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-2.html International Labour Organisation. (ILO). 2002. International Chemical Safety Cards (ICSC). P-xylene. International Occupational Safety and Health Information Centre. Disponible a través de Internet en: http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/i csc0086.htm

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