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Virología y Micología Veterinaria Trabajo Práctico No. 4 ELECTROFORESIS La electroforesis es una técnica utilizada para separar grandes moléculas por tamaño a través de la aplicación de un campo eléctrico y el uso de una matriz separadora a manera de tamiz. Las moléculas que más frecuentemente se estudian con esta técnica son ADN, ARN y proteínas. La matriz separadora que funciona como tamiz para separar este tipo de moléculas en función a su tamaño son agarosa y acrilamida. Esta matriz separadora posee una consistencia tipo gel y es por ello que normalmente se denominan de esta forma, gel de agarosa y gel de acrilamida o gel de poliacrilamida. Las moléculas a ser separadas (contenidas en la suspensión o muestra) se depositan en pequeños pozos o bolsillos que se hacen en uno de los extremos del gel; las moléculas son forzadas a pasar a través del gel cuando se aplica corriente eléctrica. Este procedimiento con el cual se hacen pasar las moléculas a través del gel se denomina comúnmente corrida electroforética. Las moléculas más grandes tienden a entrelazarse y retardarse en el gel; las moléculas más pequeñas pasan a través del gel más rápido y se movilizan más lejos del pozo donde inicialmente fueron colocadas. Las moléculas de igual tamaño y carga migran a la misma distancia desde el pozo y forman una sola banda electroforética. Los ácidos nucléicos, ADN y ARN, son moléculas cargadas negativamente debido a los grupos fosfatos que se encuentran en los puntos de unión entre un nucleótido y otro. Es por ello que, los ácidos nucleicos migran hacia el polo positivo. A diferencia de los ácidos nucléicos, las proteínas pueden estar cargadas positivamente, negativamente o no poseer carga. Para conferirle una carga negativa uniforme las proteínas pueden ser cubiertas con un detergente antes de la corrida electroforética, como SDS: Sulfato duodecilsulfato de sodio. Igualmente, las muestras que contienen proteínas pueden ser calentadas para eliminar cualquier estructura secundaria que podría hacer que dos moléculas del mismo tamaño migren diferente.

En nuestro caso, se realizará una corrida electroforética en gel de poliacrilamida para visualizar el genoma de un virus tipo ARN de doble cadena, extraído a partir de heces; y una corrida electroforética en gel de agarosa para el análisis de los amplicones obtenidos en la PCR.

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Migración de moléculas a través del gel La distancia que un fragmento de ADN o ARN recorre es inversamente proporcional a su longitud. Al transcurrir cierto tiempo de corrida, los fragmentos de tamaño similar se acumulan formando bandas en el gel, figura 1. Las corridas electroforéticas en gel de agarosa normalmente se llevan a cabo en una cámara horizontal; mientras que las corridas en gel de poliacrilamida se realizan en cámaras verticales. Se debe tener presente que la gravedad no tiene nada que ver con la separación de las moléculas, sino el campo eléctrico que se genera.

Distancia de migración (cm)

Distancia de Migración (cm) Figura No. 1. Grafica de migración de las moleculas de acuerdo a su tamaño.

Electroforesis en gel de poliacrilamida Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bisacrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametil-etiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. En presencia de radicales libres, los cuales son generados

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dada la reducción del persulfato de amonio por el TEMED, la polimerización de los monómeros de acrilamida conlleva a la formación de cadenas lineales de poliacrilamida. La presencia de bisacrilamida hace posible una reacción de copolimerización que genera una especie de red tridimensional. De esta manera, las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros de acrilamida. Rango de separación de ADN o ARN doble cadena en gel de poliacrilamida Concentración de archilamida (%) 3,5

Tamaño aproximado de las moléculas (pb) 1000-2000

5,0

80-500

8,0

60-400

12,0

40-200

15,0

25-150

20,0

6-100

Preparación del gel de poliacrilamida El gel de poliacrilamida se logra al incorporar la mezcla de los reactivos en una delgada cámara obtenida por ensamblaje de dos vidrios y colocación de dos separadores. Los separadores determinarán el grosor del gel, así los más utilizados son los minigeles de poliacrilamida que poseen entre 0,75mm y 1mm de grosor. Una vez que polimeriza y se obtiene el gel, este debe ensamblase en la cámara vertical para realizar la corrida electroforética, figura 2. Mini gel de poliacrilamida 7%: Reactivo

Cantidad

H2O

3,1 ml

Acrilamida-bisacrilamida 30%

1,4 ml

1,5M Tris (pH 8,8)

1,5 ml

TEMED

0,005ml (5ul)

Persulfato de amonio (10%)

0,05ml (50ul)

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Pozos Electrodo negativo (-)

Muestra

Dirección de la migración

Electrodo positivo (+)

Figura 2. Diagrama de electroforesis en gel de poliacrilamida.

Buffer de electroforesis o de corrida La migración electroforética de ADN o ARN es afectada por la composición y fuerza iónica de la solución tampón o buffer de electroforesis. En ausencia de iones la conductividad eléctrica es mínima y el ADN o ARN migraría muy lentamente, si es que llegara a migrar. En caso contrario, si la fuerza iónica del buffer es muy elevada, la conductividad eléctrica sería muy eficiente pero traería como consecuencia un aumento de temperatura lo cual pudiera ocasionar la desnaturalización del ADN o ARN y el gel podría fundirse. Es por ello que, se debe utilizar una concentración adecuada de este buffer para lograr una electroforesis óptima. Durante la práctica, la corrida electroforética en gel de poliacrilamida se llevará a cabo en presencia de una solución tampón constituida por Tris-base 0,025M y Glicina 0,192M (Tris-glicina), conocida como buffer de electroforesis o de corrida. Buffer de carga. Antes de depositar las muestras en los pozos, éstas deben mezclarse con una solución denominada buffer de carga. Este buffer de carga tiene tres propósitos: 1. Incrementar la densidad de la muestra, permitiendo que la muestra de ADN se mantenga en el fondo del pozo.

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2. Incorpora color a la muestra, lo cual simplifica el proceso de carga de la muestra en el pozo. 3. Contiene un colorante (azul de bromofenol) que en el campo eléctrico se moviliza hacia el ánodo a una tasa predecible El buffer de carga se utiliza tanto para la carga de muestras en gel de poliacrilamida como para la carga de muestras en gel de agarosa.

Visualización de bandas electroforéticas. El procedimiento descrito a continuación se refiere a una tinción a base de nitrato de plata, sin embargo, existen diferentes métodos por los cuales puede teñirse un gel de poliacrilamida. Una vez finalizada la corrida electroforética, el gel debe desensamblarse de los vidrios y lavarse en agua destilado durante 30min. -

Seguidamente el gel es sumergido en una solución 12mM de nitrato de plata durante 30min.

-

Se elimina la solución de nitrato de plata y se hacen tres lavados rápidos con agua destilada.

-

Las bandas electroforéticas en el gel teñido son visualizadas al agregar la solución reveladora compuesta por 0,76% formaldehído y 0,75M NaOH. Esta reacción es detenida sustituyendo la solución de revelado por una solución de ácido acético al 5%. Las mismas se observan de color marrón oscuro o de color negro.

Electroforesis en gel de agarosa La agarosa es un polímero que se obtiene de algas marinas y la misma es hoy en día un producto comercial presentado a manera de un polvo de color blanco. La preparación de un gel de agarosa es muy similar a la preparación de gelatina, una vez que el polvo es disuelto por calentamiento en una solución tampón específica se vierte en una cámara o dispositivo de forma cuadrada o rectangular a la cual se le coloca un peine para que una vez que solidificado el gel los pozos queden hechos, figura 3.

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Figura No. 3. Preparación del gel de agarosa. Una vez solidificada la agarosa, el gel debe colocarse dentro de la cámara horizontal para realizar la corrida electroforética, figura 4.

Buffer de electroforesis o de corrida El buffer de electroforesis o de corrida posee las mismas propiedades descritas para el buffer de corrida en gel de poliacrilamida. Pueden variar y la elección de este depende de la preferencia que se tenga por alguno de ellos. Las soluciones tampón pueden ser Tri-acetato y EDTA (TAE;pH8,0), Tris-borato (TBE) o Tris-fosfato (TPE) a una concentración de 50mM (pH7,7 – 7,8). Todos funcionan muy bien para la realización de las corridas electroforéticas. En nuestro caso utilizaremos TBE, del cual se tiene preparada una solución stock 5X: 54gr de Tris base 27,5gr de ácido bórico 20ml de 0,5M EDTA (pH8,0) A partir de esta solución stock se preparará la solución de trabajo a una concentración de 1X. Buffer de carga Posee las mismas propiedades y composición descritas para el buffer de carga en gel de poliacrilamida.

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Vista de lado

Pozo para cargado de la muestra

Cámara de elctroforesis

Campo eléctrico Dirección de la migración

Electrodo negativo (-)

A

Electrodo positivo (+)

B Figura No. 4. Diagrama de una electroforesis en gel de agarosa. A, vista lateral de la cámara de electroforesis con ubicación del gel y dirección de la corrida. B, cargado de la muestra en los pozos. Visualización de bandas electroforéticas. Por lo general los geles de agarosa son teñidos son reactivos que tiene la propiedad de emitir fluorescencia cuando son expuestos a luz UV. La tinción más utilizada ha sido la de Bromuro de etidio, este colorante se intercala entre las bases nitrogenadas del ácido nucleico permitiendo que los fragmentos de ADN o ARN puedan ser localizados en el gel una vez que se expone a la luz UV. Dada la interacción del bromuro de etidio con el ADN, esta sustancia se constituye en un poderoso mutágeno que también puede interactuar con el ADN de nuestras células así como lo hace con el ADN en el gel. Es por ello que es obligatorio el uso de guantes. Hoy en día se dispone se otros reactivos de marca registrada como SYBR gold o SYBR safe que poseen una afinidad muy elevada por el ADN por lo que se requiere de muy baja concentración de este

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reactivo para la tinción de un gel. Se considera un colorante ultrasensible que emite gran fluorescencia una vez que se ha unido al ADN y la fluorescencia emitida es 1000 veces mayor a la obtenida con bromuro de etidio; es por ello que