UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACION DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN MAESTRÍA EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

EFECTO DE PROCESAMIENTOS CASEROS SOBRE ALGUNOS CONSTITUYENTES FUNCIONALES DE LA LINAZA (Linum usitatissimum L.)

Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por:

Zoitza Bethzabé Ostojich Cuevas

Como requisito parcial para optar al grado académico de:

Magíster en Ciencia de los Alimentos

Realizado con la asesoría de la Profesora Elba Sangronis

Abril, 2010

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iii

iv

DEDICATORIA

A mi papá, a mi abuelita Flor y a mi abuelo, quienes no pudieron acompañarme físicamente en la culminación de esta meta.

A mi mamá por estar siempre a mi lado y apoyarme a pesar de todo.

A la Prof. Elba porque sin su paciencia y ayuda no habría logrado culminar este trabajo.

A mis sobrinas Arantxa, Isabella y Sofía por llenar mi vida de cariño y esperanza.

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AGRADECIMIENTOS A Dios Todopoderoso y a la Santísima Virgen por darme vida y salud para lograr mis metas. A mi mamá por todo su amor, comprensión y tolerancia. A mis tíos y tías por apoyarnos siempre, y muy en especial a Antonio, Dexis, Douglas y Vilmary por acogerme en sus hogares y por todos sus consejos. A mis primos, en especial a Alfonso, Douglitas y Tamar por tener confianza en mi. A la Familia Riesco Flores por adoptarme como un miembro mas de su familia. A la Profesora Elba por toda su ayuda, paciencia y confianza. A las Profesoras Alexia y Marisa por sus oraciones, consejos y atenciones. A la Prof. Aleida por permitirme culminar esta etapa. A la Sra. Lithz por ayudarme y apoyarme en todo lo que necesitaba. A Gregoria, Olga y Yetzury por toda su ayuda. A mis amigos Ericka, Gabriela, José, Rosalyn y Victoria por todo lo que hemos compartido juntos. A Claudia, Cristina y Dennar por su apoyo permanente. A Eduardo, Jhoana, María Virginia, Rosaura y Yolmar por todas las alegrías y tristezas que hemos compartido juntos y por estar siempre pendientes. A Lidia y Neida por su amistad y toda su ayuda, espero que algún día podamos volver a compartir como antes.

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A la Lic. Ericka Scherer y a la Ing. Paula Guerra por toda su ayuda y colaboración. A la Dra. Lisette Álvarez y al Sr. Jorge Rosso por su apoyo constante. Al Laboratorio de Soporte Científico de las Empresas Polar y al Laboratorio de Desechos Tóxicos de la USB por la colaboración prestada durante la realización de los análisis. A la Biblioteca Virtual de Biotecnología para las Américas de la UNAM por toda la ayuda prestada durante el desarrollo del trabajo. A todos muchas gracias y Dios los bendiga!

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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACION DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN MAESTRÍA EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

EFECTO DE PROCESAMIENTOS CASEROS SOBRE ALGUNOS CONSTITUYENTES FUNCIONALES DE LA LINAZA (Linum usitatissimum L.) Por: Ostojich Cuevas Zoitza Bethzabé Carnet No.: 02-82886 Tutor: Prof. Elba Sangronis Abril 2010

RESUMEN En los últimos años se ha promovido el consumo de linaza (Linum usitatissimum L.) como alimento funcional debido a sus propiedades benéficas a la salud, atribuibles principalmente a su contenido de ácidos grasos omega-3, lignanos, y fibra dietaria. El objetivo principal de la presente investigación fue evaluar los efectos de los procesamientos caseros mas comunes aplicados a la linaza en Venezuela (remojo, cocción, tostado) sobre algunos de sus constituyentes. Para ello se caracterizaron 2 variedades de linaza, una canadiense y otra nacional cosechada en el estado Mérida. Se determinó su calidad microbiológica, análisis proximal y perfil de ácidos grasos, color, aw, concentración de HCN, polifenoles y capacidad antioxidante. Existen diferencias significativas entre la composición de las semillas, resaltando en ambas variedades su elevado contenido de grasa (40%), fibra dietaria (30%) y de ácido α-linolénico (60g/100g aceite). La linaza nacional contiene mayor contenido de polifenoles que la importada (1655 y 1435 mg/100g, respectivamente). La eficiencia antiradical de la linaza fue calificada como media y con un tiempo de reacción lento (TEC50>30 min). La concentración de HCN presente en la linaza es baja (40 mg/100g) y se remueve mayoritariamente durante el remojo de la semilla entera o molida. Los polifenoles y la capacidad antioxidante de la variedad importada resultaron significativamente afectados por el remojo en agua caliente, la cocción, y el tostado, mientras que en la variedad nacional no se observó un efecto significativo de los procesamientos sobre la eficiencia antiradical. Los extractos acuosos de linaza poseen pocas propiedades funcionales en comparación con la semilla completa. Se recomienda que el índice a considerar para evaluar la mejor forma de consumo de linaza sea el contenido de HCN equivalente. Se recomienda continuar la investigación sobre las semillas y los extractos para comprender mejor sus propiedades antiradicales. Palabras Claves: linaza, HCN, polifenoles, antioxidantes.

viii

ÍNDICE GENERAL Página ÍNDICE DE TABLAS

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

xiii

ÍNDICE DE ANEXOS

xiv

INTRODUCCIÓN

1

CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO

4

1.1. Linaza: descripción, morfología y cultivo.

4

1.2. Composición de la linaza.

8

1.2.1. Grasa: cantidad y calidad.

9

1.2.2. Proteínas: cantidad y calidad.

14

1.2.3. Fibra dietaria.

17

1.2.4. Carbohidratos.

18

1.2.5. Minerales y vitaminas.

18

1.2.6. Compuestos fitoquímicos.

19

1.2.6.1. Compuestos polifenólicos.

20

1.2.6.2. Lignanos.

22

1.2.7. Compuestos antinutricionales.

23

1.2.7.1. Glucósidos cianógenos

25

1.3. Principales usos de la linaza.

28

1.4. La linaza como alimento funcional.

32

1.5. La linaza en Venezuela.

34

1.6. Procesamientos caseros aplicados a la linaza.

35

1.7. Consideraciones generales sobre los análisis químicos aplicados a la linaza. CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Materiales. 2.1.1. Materia prima.

37 40 40 40

ix 2.1.2. Equipos y reactivos.

40

2.2. Procedimientos experimentales.

41

2.2.1. Muestreo de las semillas.

41

2.2.2. Análisis microbiológico.

41

2.2.2.1. Preparación de la muestra.

42

2.2.2.2. Coliformes totales y fecales

43

2.2.2.3. Mohos y levaduras.

43

2.2.2.4. Staphylococcus aureus

43

2.2.2.5. Microorganismos esporulados aerobios.

44

2.2.2.6. Recuento presuntivo de Bacillus cereus.

44

2.2.2.7. Microorganismos esporulados anaerobios.

45

2.2.2.8. Pruebas bioquímicas para C. perfringens.

45

2.2.2.8.1. Nitrato-motilidad.

45

2.2.2.8.2. Licuefacción de la gelatina/fermentación de lactosa.

45

2.2.3. Limpieza de la muestra.

46

2.2.4. Análisis proximal.

46

2.2.4.1. Humedad.

46

2.2.4.2. Grasa.

46

2.2.4.3. Proteínas.

46

2.2.4.4. Proteínas solubles.

47

2.2.4.5. Cenizas.

47

2.2.4.6. Minerales.

47

2.2.4.7. Fibra dietaria.

48

2.2.5. Propiedades físicas.

51

2.2.5.1. Actividad de agua (aw).

51

2.2.5.2. Color.

51

2.2.6. Análisis químicos.

52

2.2.6.1. Perfil de ácidos grasos.

52

2.2.6.2. Mucílago.

53

2.2.6.3. Polifenoles totales.

53

2.2.6.4. Capacidad antioxidante.

54

x 2.2.6.5. Ácido cianhídrico (HCN). 2.2.7. Procesamientos caseros aplicados a la linaza.

55 57

2.2.7.1. Tostado.

57

2.2.7.2. Cocción.

57

2.2.7.3. Remojo.

58

2.2.8. Diseño experimental aplicado a los procesamientos.

58

2.2.9. Análisis estadístico de los resultados.

59

2.2.9.1. Prueba t de dos muestras independientes.

59

2.2.9.2. ANOVA Multifactorial.

59

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

61

3.1. Análisis microbiológico.

61

3.2. Propiedades físicas de la linaza: aw y color instrumental.

64

3.3. Composición de la semilla.

66

3.4. Efectos de los procesamientos sobre la composición de la semilla.

79

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

92

4.1. Conclusiones

92

4.2. Recomendaciones

93

REFERENCIAS

95

ANEXOS

105

xi

ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1.1. Composición proximal de la linaza

9

Tabla 1.2. Composición porcentual de ácidos grasos de los aceites de linaza tradicional, linaza “Solin”, girasol y cártamo.

13

Tabla 1.3. Composición de aminoácidos de la linaza (var. Norman)

15

Tabla 1.4. Calidad de las proteínas de linaza.

16

Tabla 1.5. Contenido de minerales y vitaminas de la linaza canadiense (var. Norman).

19

Tabla 2.1. Longitudes de onda utilizadas en la determinación de minerales por ICP.

48

Tabla 2.2. Preparación de la curva patrón de cianuro de potasio (KCN).

56

Tabla 3.1. Resultado del análisis microbiológico para la materia prima criolla e importada.

61

Tabla 3.2. Actividad de agua de las semillas de linaza nacional e importada.

65

Tabla 3.3. Color instrumental de la linaza nacional e importada.

66

Tabla 3.4. Composición proximal de las semillas de linaza nacional e importada

67

Tabla 3.5. Fibra dietaria de las semillas de linaza importada y nacional.

69

Tabla 3.6. Contenido de minerales de la linaza importada y nacional

70

Tabla 3.7. Perfil de ácidos grasos de las semillas de linaza importada y nacional.

71

Tabla 3.8. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente y polifenoles en linaza importada y nacional.

74

Tabla 3.9. Capacidad Antioxidante en linaza importada y nacional.

76

Tabla 3.10. Contenido remanente de mucílago en linaza procesada de origen importado y nacional (g/100 g SS).

80

Tabla 3.11. Contenido de grasa en la torta de linaza remanente de la molienda y remojo (g/100 g SS).

80

xii Tabla 3.12. Contenido de proteínas solubles en los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza (mg/100 ml de extracto).

81

Tabla 3.13. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente en las semillas de linaza importada y nacional procesadas (mg /100 g SS).

83

Tabla 3.14. Contenido de ácido cianhídrico en los extractos de remojo/cocción de las semillas de linaza (mg/ L de extracto).

84

Tabla 3.15. Contenido de polifenoles en las semillas de linaza nacional e importada procesada (mg*/100g).

86

Tabla 3.16. Contenido de polifenoles en los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza (mg*/ L de extracto).

87

Tabla 3.17. Capacidad antioxidante de las semillas de linaza procesadas.

88

Tabla 3.18. Capacidad antioxidante de los extractos de remojo/cocción de las semillas de linaza.

91

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1.1. Variedades de flores de la planta de lino

4

Figura 1.2. Etapas en el crecimiento de la planta de lino.

5

Figura 1.3. Crecimiento de la planta de lino cultivada en el estado Mérida.

6

Figura 1.4. Cápsulas y Semillas de la planta de lino.

7

Figura 1.5. Factores que afectan la vida útil de un alimento en función de la actividad de agua.

11

Figura 1.6. Comparación del perfil de ácidos grasos de la linaza y otros aceites/grasas comerciales de origen vegetal.

12

Figura 1.7. Estructura de los ácidos fenólicos.

21

Figura 1.8. Estructura química de los lignanos de mamíferos, y de los principales lignanos vegetales contenidos en la linaza, y metabolismo del SDG.

23

Figura 1.9. Proceso de transformación del glucósido cianógeno linustatina en HCN.

26

Figura 1.10. Metabolismo normal del cianuro.

26

Figura 1.11. Planta de lino local y sus flores. Linaza cultivada en el Estado Mérida.

34

Figura 1.12. Reacción de König para la determinación de HCN.

38

Figura 1.13. Esquema de la reacción de reducción del radical DPPH•.

39

Figura 2.1. Esquema de muestreo de las semillas de linaza.

42

Figura 2.2. Escala de color Hunter L, a, b.

51

Figura 2.3. Procesamientos caseros aplicados a las semillas de linaza.

57

Figura 3.1. Colonias de microorganismos formadores de esporas en Agar Dextrosa Peptona de Caseína.

62

Figura 3.2. Cromatograma de ácidos grasos de la linaza importada.

72

Figura 3.3. Cromatograma de ácidos grasos de la linaza nacional

73

Figura 3.4. Comportamiento cinético del radical DPPH* para las semillas de linaza (a) Importada (b) Nacional, a diferentes concentraciones

79

xiv

ÍNDICE DE ANEXOS Página Anexo 1. Hoja de diseño experimental.

106

Anexo 2. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: Prueba t de dos muestras independientes.

107

Anexo 3. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: ANOVA multifactorial para mucílago y grasa en semillas procesadas.

122

Anexo 4. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de polifenoles en semillas procesadas.

123

Anexo 5. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de HCN en semillas procesadas.

125

Anexo 6. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de la Capacidad Antioxidante en semillas procesadas.

127

Anexo 7. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación del contenido de Polifenoles en los extractos de los procesamientos.

133

Anexo 8. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación del contenido de HCN en los extractos de los procesamientos.

134

Anexo 9. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de la Capacidad Antioxidante en los extractos de los procesamientos.

136

INTRODUCCIÓN La semilla de lino, mejor conocida como linaza, es una oleaginosa de origen mediterráneo, considerada hasta hace poco como una “oleaginosa industrial” ya que a partir de ella se producen aceites no comestibles destinados a otras aplicaciones industriales diferentes a la alimenticia. Sin embargo, recientes estudios y descubrimientos sobre su amplio valor nutritivo han despertado el interés del consumidor y de la industria de alimentos (Primo-Yúfera 1998; Morris y Vaisey-Genser 2003), debido principalmente a su elevado contenido de grasa, fibra, y proteínas, así como por la calidad de su aceite, rico en ácidos grasos omega 3. Su considerable contenido de fitoestrógenos como los lignanos, también ha contribuido a captar la atención de los consumidores, pues sus efectos beneficiosos sobre la regulación hormonal humana han sido ampliamente reconocidos, y su influencia en la prevención de enfermedades como el cáncer y la diabetes se encuentra actualmente en estudio (Hutchins y Slavin 2003; Saarinen et al. 2003; Thompson 2003). Además de sus constituyentes principales, la linaza también contiene otros compuestos como los polifenoles, que le confieren capacidad antioxidante, y de los que no existen mayores estudios pues estos han sido relegados a sus compuestos mayoritarios (Daun et al. 2003).

La linaza ha sido poco estudiada en Venezuela, debido a que es una materia prima importada, costosa, y hasta hace poco, escasamente utilizada, relegada principalmente a la preparación de remedios caseros. Sin embargo, a partir de la publicación y divulgación de artículos en diferentes medios de comunicación, en los que se resaltan sus múltiples propiedades benéficas a la salud, tanto preventivas como curativas, así como sus atributos cosméticos y estéticos, el consumo de linaza se ha elevado considerablemente, e incluso se han comenzado a producir localmente, tanto a nivel artesanal como industrial, alimentos como panes, barras energéticas, cereales para desayuno y galletas con linaza como ingrediente. La información divulgada en el país sobre la linaza, proviene de investigaciones realizadas en otros países sobre variedades

2 canadienses y/o estadounidenses. Sin embargo, es ampliamente conocido en los países productores de linaza que su composición varía significativamente con el ambiente, suelo y condiciones de cultivo, por lo cual es importante conocer la composición de las variedades de linaza que se están importando, para así poder aprovechar al máximo sus propiedades funcionales y explotar su potencial como ingrediente en la industria de alimentos (Daun et al. 2003).

El cultivo de linaza es climáticamente viable en el país. En el estado Mérida existen pequeños cultivos de linaza con una producción actual aproximada de 150 kg de semillas/año. La poca demanda de la semilla en años anteriores provocó la disminución de su cultivo, pues la mayor parte de los agricultores decidió sustituirla por otros que fueran más rentables como la papa o el ajo. La escasa presencia de esta variedad en el mercado local ha sido la principal causa de la falta de estudios sobre sus constituyentes. Conocer su composición es primordial para acaparar el interés de los investigadores, fomentar su cultivo local y disminuir así la dependencia de la importación y su precio. Localmente, los pocos estudios realizados hasta ahora con linaza se orientan hacia su inclusión en el desarrollo de alimentos especiales como panes y galletas, dirigidas a la población de la tercera edad con el objetivo de aumentar su ingesta de fibra (Palacios et al. 2004). De allí se deriva la necesidad de obtener información adicional sobre la composición proximal de la linaza importada de Canadá que es consumida en el país, y conocer la composición de la linaza cultivada en el Edo. Mérida, lo cual puede aprovecharse para el incentivo y promoción de su cultivo local.

Algunas publicaciones han contemplado la posibilidad de que durante el procesamiento de la linaza se generen compuestos tóxicos atribuibles a su contenido de glucósidos cianógenos (Potter y Hotchkiss 1999; Daun et al. 2003). Se sabe que durante el procesamiento industrial de la linaza, las enzimas responsables de la formación de ácido cianhídrico (HCN), son inactivadas por las altas temperaturas y/o los solventes utilizados, pero en el caso de los procesamientos caseros se desconoce el comportamiento de estas enzimas y la posible toxicidad generada por el HCN.

3 La determinación de la calidad microbiológica de las semillas también es un factor importante a estudiar, considerando que en el país estas son procesadas y consumidas crudas, y que generalmente no se aplican procedimientos para inactivar los microorganismos patógenos que pudieran estar presentes como resultado de la cosecha y de la manipulación post-cosecha inadecuada de la semilla. Adicionalmente, conocer la flora microbiana asociada a las semillas permitiría elaborar recomendaciones bien fundamentadas sobre su cosecha, recolección, almacenamiento y manipulación.

En Venezuela los tratamientos previos al consumo de linaza son sencillos procesamientos caseros como molienda, tostado, cocción y remojo. Por esta razón, el objetivo general de la presente investigación fue evaluar los efectos de los procesamientos caseros mas comunes aplicados a la linaza (Linum usitatissimum L.) sobre algunos de sus constituyentes a los cuales se le atribuyen propiedades funcionales, previa caracterización química y microbiológica de dos variedades de semilla, importada y nacional. Objetivos específicos:

1. Analizar la calidad microbiológica de las semillas de linaza importada (de Canadá) y nacional (cultivada en Mérida).

2. Determinar la composición proximal de las semillas nacionales e importadas, y la composición del aceite extraído de ambos tipos de semillas.

3. Evaluar el efecto del tostado, molienda, cocción y remojo sobre el contenido de mucílago, grasa, glucósidos cianógenos, polifenoles y capacidad antioxidante de la semilla nacional e importada.

4. Cuantificar la concentración de glucósidos cianógenos, proteínas, polifenoles y la capacidad antioxidante de los extractos obtenidos durante el remojo o cocción de las semillas nacional e importada.

CAPÍTULO I MARCO TEORICO 1.1. Linaza: descripción, morfología y cultivo.

La semilla de lino, mejor conocida como linaza (Linum usitatissimum L.) es una oleaginosa de la familia Linaceae, originaria de la región mediterránea de Europa, siendo los Romanos quienes se encargaron de extender su cultivo a lo largo de todo su imperio y al resto de Europa y África, donde se utilizó con fines medicinales, y para fabricar las envolturas de lino empleadas durante las momificaciones en el Antiguo Egipto. En el siglo XVII, durante la colonización, la semilla fue trasladada a América y las primeras siembras de linaza en Canadá datan del año 1617 (Oplinger et al. 1992; Flax Council of Canada 2008). Morfológicamente, la planta de lino es pequeña, de tallo único y a partir de cuya base o parte media-superior (dependiendo de la variedad), se desprenden múltiples ramas que finalizan en inflorescencias y posteriormente en cápsulas dentro de las cuales se encuentra la linaza. El color de la flor también es dependiente de la variedad y puede ser blanca, violeta o azul (Fig. 1.1.).

Figura 1.1. Variedades de flores de la planta de lino. Fuente: Flax Council of Canada (2006).

La altura máxima de la planta de lino es 1 m, pero su raíz puede llegar a penetrar hasta 1,2 m. debajo del suelo. Crece favorablemente en suelos arcillosos o que tengan una buena retención de agua, climas fríos y/o frescos (temperaturas promedio menores a 35ºC), y precipitaciones

5 moderadas. El periodo vegetativo de la planta es de 45-60 días y botánicamente puede dividirse en 12 etapas (Fig. 1.2.), pero en términos generales se agrupa en 2, los primeros 1525 días que constituyen la fase de florecimiento y los últimos 30-40 días que dura la fase de maduración de la cápsula (Oplinger et al. 1992; Flax Council of Canada 2002b).

Figura 1.2. Etapas en el crecimiento de la planta de lino: 1 y 2, cotiledón y punto emergente; 3 y 4, primeras hojas verdaderas; 5 extensión del tallo e inicio del multiramado; 6 a 8, aparición de las ramas múltiples, capullos y florecimiento; 9 a 11, caída de las flores, comienzo de la maduración de la semilla; 12, semilla madura. Final a la derecha: corte transversal de la cápsula con semillas en su interior. Fuente: Turner (1996).

6 En la Fig. 1.3. se presenta, en forma resumida, el crecimiento de la planta de lino cultivada en el edo. Mérida, el cual se inicia con la salida del cotiledón, la aparición de los primeros pares de las denominadas hojas verdaderas e inicio de la forma espiral de las hojas superiores (Fig. 1.3a.), posteriormente ocurre el crecimiento y multiramado del tallo (Fig. 1.3b.), florecimiento, que en esta especie es de color violeta (Fig. 1.3c.), y finalmente, la aparición de las cápsulas que contienen en su interior las semillas, en el extremo superior de los tallos (Fig. 1.3d.). La maduración de las cápsulas viene acompañada del deshojado parcial o total del tallo (Fig. 1.3e.).

a

b c d Figura 1.3. Crecimiento de la planta de lino cultivada en el estado Mérida.

e

Las cápsulas generalmente contienen en su interior entre 6 y 10 semillas (Fig. 1.4a.). Durante el periodo de maduración, las cápsulas y las semillas pasan de color verde claro a marrón (Fig. 1.4b. y 1.4c.). Las semillas son planas, ovales y puntiagudas en uno de sus extremos (Fig. 1.4d.). Se componen de una cubierta o cáscara formada por cinco capas, dos cotiledones achatados y amplios, un hipocótilo corto y una radícula; el cotiledón constituye aproximadamente el 55% del peso total de la semilla y, la cubierta y el endospermo el 36%. Las semillas de lino miden alrededor de 2,5 mm de ancho, 4-6 mm de largo y 1,5 mm de espesor, con un peso de aproximadamente 7 ± 1 mg, su aspecto es liso y brillante, y su color, según la especie, varía desde el amarillo y dorado, hasta el marrón rojizo (Fig. 1.4e., 1.4f., y 1.4g.). El color de la semilla está determinado por la cantidad de pigmentos concentrados en la capa externa. Existen al menos 22 variedades certificadas de linaza, clasificadas de acuerdo al

7 color de la flor, de la semilla y de su contenido de grasa. Sin embargo, las más estudiadas han sido las variedades “NorMan” y “NorLin” (Canadienses, de color pardo-rojizo), las variedades “Foster” y “Dakota Gold” (Estadounidenses, de color dorado), y la variedad “Omega” (Estadounidense, de color amarillo). En términos generales, las variedades de linaza pueden agruparse en 3 clases: las semillas ricas en grasa, las destinadas a la producción de fibra (que no poseen la misma cantidad ni la misma calidad de aceite que las antes mencionadas), y las denominadas “Solin”, que son variedades híbridas con bajo contenido de ácidos grasos poliinsaturados (Oplinger et al. 1992; Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Morris 2007; Flax Council of Canada 2002b, 2008).

Figura 1.4. Cápsulas y Semillas de la planta de lino. Arriba: a) Vista del interior de las cápsulas maduras. b) Cápsulas con semillas de linaza en su etapa de maduración; c) Cápsula madura; d) Vista ampliada de la semilla de linaza canadiense. Abajo: e) Semillas de variedad Solin. f) Semillas de color dorado. g) Semillas de variedad pardo-rojiza.

La cosecha de linaza se realiza cuando las semillas han alcanzado la madurez suficiente, lo cual se evidencia por el cambio de color de la cápsula. En este punto la humedad de la semilla es de aproximadamente 12%. La cosecha es difícil debido al pequeño tamaño de la semilla y a la fragilidad de la cápsula que las contiene. La linaza verde no puede utilizarse para alimentación (ni animal ni humana), pues contiene una gran cantidad de glucósidos cianógenos, que durante la digestión se hidrolizan en ácido prúsico, mejor conocido como

8 ácido cianhídrico (HCN), cuyo efecto tóxico se discutirá mas adelante. En países productores de linaza, como Canadá y Estados Unidos, la cosecha se realiza mecánicamente, con la ventaja de que las semillas son separadas automáticamente de la cápsula por una serie de cilindros concéntricos con diferentes aperturas y velocidades, evitando así la manipulación excesiva de las semillas que conlleva a su contaminación. Una vez recolectadas, las semillas son tamizadas repetidas veces (con aperturas entre 1/16” y 3/16”), para obtener lotes uniformes de semillas con menos de 0,01% de impurezas (ramas, hojas, restos de cápsulas, etc.), y luego son enfriadas con ayuda de un secador neumático, para evitar que liberen el calor absorbido en el campo dentro de los silos de almacenamiento, lo cual, junto a una humedad relativa igual o superior al 70% favorecería el crecimiento de mohos. Luego de su recolección, las semillas de lino mantienen una alta tasa de respiración hasta por 6 semanas antes de pasar a estado latente (Oplinger et al. 1992; Flax Council of Canada 2002b).

Según la Dirección de Estadística de la Organización para la Alimentación y Agricultura de las Naciones Unidas (FAO), los principales países productores de linaza en el año 2007 (últimos datos disponibles), fueron Canadá (633.500 Toneladas Métricas), China (480 mil TM), India (168 mil TM), Estados Unidos (149 mil TM), y Etiopía (108 mil TM). En Latinoamérica, Argentina, Brasil y México tienen una producción pequeña comparada a los países antes mencionados, siendo apenas de 34 mil TM, 14.700 TM y 7.200 TM, respectivamente (FAO-Statistics 2007). 1.2. Composición de la linaza.

La linaza es rica en grasa, fibra dietética y proteínas, sin embargo, su composición proximal varía apreciablemente según la variedad, el clima (temperatura y pluviosidad), y tipo de suelo donde crece. Por ejemplo, se conoce que los climas fríos tienden a disminuir el contenido de proteína y aumentar el de grasa, los climas con noches frías mejoran la calidad de la grasa, las variedades doradas poseen menos fibra soluble que las variedades marrón-rojizas, pero mayor contenido de lignanos, y los suelos nitrogenados y arcillosos proporcionan semillas con mayor contenido de proteínas, al contrario de los suelos arenosos. Análogamente, el contenido y variedad de minerales presentes en la semilla es proporcional a la riqueza mineral del suelo

9 donde se cultive (Oomah 2001; Flax Council of Canada 2002b; Daun et al. 2003; Morris 2007).

Los rangos de la composición proximal de la linaza que se presentan en la Tabla 1.1., fueron obtenidos a partir de reportes de diversas variedades de linaza cultivadas en Estados Unidos y Canadá. La amplitud de los rangos demuestra la variación existente en la composición según la variedad y las condiciones de cultivo; por esta razón, cuando se reportan dichos datos suelen especificarse la variedad, o zona y mes de cultivo de la semilla, además del método de análisis utilizado.

Tabla 1.1. Composición proximal de la linaza g/100g de semilla Humedad

6-9

Grasa

34-53

Proteína

19-36

Fibra dietética

10-28

Cenizas

3-5

Carbohidratos totales

1-6

Energía (Kcal/100 g)

450

Fuente: Oomah (2001); Flax Council of Canada (2002b); Daun et al. (2003); Morris (2007). 1.2.1. Grasa: cantidad y calidad.

La linaza es ampliamente valorada por su elevado contenido de grasa, y la mayoría de sus efectos beneficiosos a la salud se atribuyen a la calidad de su aceite y a su elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados (mas del 70%), en su mayoría ácido α-linolénico (ALA). El ALA es un ácido graso esencial (AGE) para la alimentación humana, junto con el ácido linoleico. Los AGE son necesarios, entre otras cosas, para la estructura de la membrana celular, ya que contribuyen a su permeabilidad y fluidez. Adicionalmente, el ALA es precursor de los ácidos grasos de cadena larga: eicosapentanoico (EPA) y docosahexanoico (DHA),

10 C20:5 y C22:6, respectivamente, necesarios para el correcto desarrollo del sistema nervioso central y la visión, y coadyuvantes en la prevención de enfermedades coronarias y cardiacas. El DHA es de gran importancia para el organismo, pues forma parte de los fosfolípidos de las membranas celulares y de la estructura cerebral (Oomah y Mazza 1998; Morris 2007).

Aproximadamente el 40-60% del contenido de aceite de la linaza es ALA, lo cual la hace la fuente vegetal mas rica en este tipo de ácidos omega 3, seguida del aceite de canola (11%) y el de soya (8%). Media cucharadita de aceite de linaza aporta aproximadamente 1,3 g de ALA, lo cual cubre completamente el consumo diario recomendado para las mujeres por el U.S. Institute of Medicine (1,1g ALA/día), y está muy cercano a lo recomendado para hombres (1,6g ALA/día). Sin embargo, el alto contenido de ALA limita la vida útil de la linaza, particularmente de la semilla molida, ya que los tres dobles enlaces de su cadena son muy propensos a la peroxidación lipídica, y los compuestos volátiles secundarios de esta reacción le imparten a la semilla un olor y sabor a pintura (Belitz y Grosch 1997; Flax Council of Canada 1999; Morris y Vaisey-Genser 2003; Morris 2007). . En las condiciones en que usualmente se almacena la linaza, los acíl-lípidos insaturados que contiene (oleico, linoleico y ALA), no son estables. La cinética de las reacciones de oxidación lipídica frecuentemente tiene una fase lag o periodo de inducción, en el que la rancidez no es detectada y por tanto se mantiene la calidad del alimento, hasta que se alcanza la fase exponencial en la cual la oxidación y por tanto la aparición de los “off-flavors” ocurre rápidamente. Como es bien conocido, la longitud de la fase lag depende además de la composición de los ácidos grasos presentes, de las condiciones en las que se almacena el alimento (presencia de O2, luz, temperatura) y de su actividad de agua (aw). La velocidad de la autooxidación lipídica se incrementa tanto en los alimentos secos (aw < 0,1) como en aquellos con aw > 0,5 (Fig. 1.5.). El efecto del aw sobre algunos procesos importantes en la vida útil de los alimentos también se aprecia en la Fig. 1.5. La disminución del aw frena primeramente el crecimiento de bacterias, levaduras y mohos, posteriormente las reacciones enzimáticas y por último el pardeamiento no enzimático (Belitz y Grosch 1997; Damodaran et al. 2008).

11

Figura 1.5. Factores que afectan la vida útil de un alimento en función de la actividad de agua según Labuza et al. (1971). Fuente: Belitz y Grosch (1997).

Algunos estudios afirman que la semilla molida es estable hasta por 4 meses, siempre y cuando sea almacenada a temperaturas inferiores a los 25ºC y en empaques trilaminados que la resguarden de la luz y el oxígeno, mientras que otros autores afirman que bajo las mismas condiciones de almacenamiento, la semilla molida puede mantenerse hasta por 11 meses sin disminución significativa de su contenido de ALA, aún cuando la cantidad de ácidos grasos libres aumenta en comparación con la muestra fresca. La semilla entera ha demostrado ser mas estable (hasta 9½ meses), a la oxidación lipídica almacenada a estas mismas condiciones (temperaturas < 25ºC, en empaques trilaminados a resguardo de la luz y el oxígeno) (Flax Council of Canada 1999; Morris y Vaisey-Genser 2003; Morris 2007).

En la Fig. 1.6. se muestran, a modo comparativo, los perfiles de ácidos grasos de varios aceites y grasas comestibles en contraste con el aceite de linaza canadiense. Se evidencia la riqueza del aceite de linaza en ALA, mientras que en otros aceites y grasas el contenido de dicho ácido graso no es mayor al 10% (Belitz y Grosch 1997; Morris y Vaisey-Genser 2003).

12

0% Linaza

20% 9

Girasol Canola Maiz

40%

18

12

60%

80%

16

57

16

71

7

1

61 13

Oliva

15

Soya

15

Palma M. de Cacao Mantequilla

% Saturada

100%

21

29

11

57

1

75 23

9 54

51

8 39

62

10 34

68

% Monoinsaturada

1

28

% Linoleico

3 31

% α-linolénico

Figura 1.6. Comparación del perfil de ácidos grasos de la linaza y otros aceites/grasas comerciales de origen vegetal. Fuente: Belitz y Grosch (1997);Vaisey-Genser y Morris (1997).

El

aceite de linaza es considerado no comestible en muchos países y no posee la

denominación GRAS (Generally recomendad as safe), debido a su rápida oxidación y polimerización por la gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados que posee. Por esta razón, en 1993 se inició el desarrollo de las variedades “Solin”, un trabajo conjunto entre la Universidad de Wisconsin (Estados Unidos), el United Grain Growers Ltd. (Canadá), y el Commonwealth Scientific & Industrial Research Organization (Australia). Las semillas de estas variedades híbridas Solin son de color amarillo claro, y poseen mas de 50% de grasa, pero menos de 5% de ácido α-linolénico (ALA), lo cual lo hace más estable al calor y la luz, y por ende es apto para la cocción y la fritura siempre y cuando la temperatura del aceite se mantenga por debajo de los 150ºC (Morris y Vaisey-Genser 2003; Flax Council of Canada 2008).

En la Tabla 1.2., se presenta la composición de ácidos grasos del aceite de las variedades Solin con la del aceite tradicional de linaza y los aceites de girasol y cártamo. Al comparar estos perfiles, se observa que el aceite de linaza tradicional posee un alto contenido de ALA, mientras que los aceites de Solin, girasol y cártamo son ricos en ácido linoleico a expensas de

13 un poco o nulo contenido de α-linolénico. Actualmente existen 3 variedades certificadas Solin, comúnmente llamadas “Linola™” y diferenciadas entre si por códigos seguidos del nombre (Oplinger et al. 1992; Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Flax Council of Canada 1999, 2002b).

Tabla 1.2. Composición (g de ácido/100g de aceite) de ácidos grasos de los aceites de linaza tradicional, linaza “Solin”, girasol y cártamo. Ácido graso Palmítico (C16:0)

Variedad de Linaza Tradicional “Solin” 5 6

Girasol

Cártamo

8

8

Esteárico (C18:0)

3

3

5

3

Oleico (C18:1 ω-9)

17-19

17

16

13

Linoleico (C18:2 ω-6)

14-16

72

71

75

α-linolénico (C18:3 ω-3)

55-59

2-3

-

1

Fuente: Oomah y Mazza (1998); Potter y Hotchkiss (1999); Daun et al. (2003).

Además de los ácidos grasos, los acilgliceroles figuran como componentes mayoritarios en la fracción lipídica de la linaza. Por el contrario, los ésteres esteroles, glicolípidos y fosfolípidos no suman mas del 5% de los lípidos totales, y han sido poco estudiados ya que el interés de los investigadores se ha centrado en los ácidos grasos. La concentración y calidad del aceite de linaza dependen de las características de las semillas que dieron origen a la cosecha, aún cuando la temperatura ambiente, las condiciones del suelo y la presencia de plagas también influyen. El 75% de la grasa de la semilla se encuentra en el cotiledón; el resto se encuentra distribuido entre el germen (3%) y la cáscara (22%) (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Morris 2007).

El aceite de linaza tiene múltiples usos y de ello depende su procesamiento. Para consumo humano se recomienda en aplicaciones “frías” como aderezos, salsas, vinagretas, y para enriquecer bebidas caseras como merengadas y batidos de fruta. También se comercializa en forma de cápsulas como suplemento dietético. En ambos casos, el aceite se extrae en frío con

14 temperaturas controladas inferiores a los 35ºC en todas las etapas (limpieza, trituración y prensado), para posteriormente ser encapsulado y/o envasado en contenedores ámbar o laminados que eviten la foto-oxidación, y previa inyección de nitrógeno para remover el oxígeno presente en el espacio de cabeza del envase. Estos aceites y suplementos deben almacenarse en ambientes frescos para evitar la auto-oxidación y refrigerarse una vez abiertos. Cuando el aceite no va a ser utilizado para consumo, la extracción se realiza con solventes (Morris y Vaisey-Genser 2003). 1.2.2. Proteínas: cantidad y calidad.

Las proteínas de la linaza son en su mayoría globulinas del tipo 11-12S (58-66%), mientras que las albúminas (2S) están contenidas en menor proporción (20-42%). Las globulinas son poco solubles y de mayor peso molecular, contrario a las albúminas de menor peso molecular y mayor solubilidad, y en consiguiente las proteínas de linaza son más lipofílicas que las de soya; por lo tanto, la actividad emulsificante de las proteínas de linaza es mayor que la de las proteínas de soya. La linaza, al igual que otras oleaginosas, no contiene gluten y por lo tanto puede ser ingerida por consumidores con sensibilidad a esta proteína. En comparación con otras oleaginosas, la linaza contiene elevados niveles de nitrógeno no proteico, por lo cual muchos autores consideran importante utilizar el término “proteína verdadera” (N x 4,9) y diferenciarlo del término “proteína cruda” (N x 6,25) al momento de interpretar los datos de proteínas (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003).

El perfil de aminoácidos de la linaza (Tabla 1.3.) es similar al de la proteína de soya, a la cual pudiera sustituir como ingrediente en ciertos alimentos gracias a su funcionalidad y a la ventaja de tener menores efectos alérgenos y aterógenos, este último debido a que tiene un menor radio lisina:arginina que la soya. La fracción de aminoácidos de la linaza contiene niveles relativamente altos de ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y arginina. Nutricionalmente hablando, los aminoácidos limitantes de la proteína de linaza son la lisina y metionina, aunque en este sentido existen muchas divergencias, ya que algunos autores incluyen también como limitantes a la isoleucina, la tirosina y la treonina, excluyendo a la metionina. Sin embargo, diversos estudios coinciden en que el perfil de aminoácidos de la

15 linaza muestra cierta variación en algunos de sus componentes (arginina, ácido glutámico, metionina, serina, tirosina, y ácido aspártico), con respecto a la variedad y ambiente donde se cultiva (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Wanasundara y Shahidi 2003).

Tabla 1.3. Composición de aminoácidos de la linaza (var. Norman) Aminoácido

g/100 g de proteína

g/100 g de semilla

Alanina

4,4

1,047

Arginina

9,3

2,033

Acido aspártico

9,2

1,924

Cisteína

1,1

0,408

Acido Glutámico

19,6

4,104

Glicina

5,8

1,244

Histidina*

2,2

0,442

Isoleucina*

4,0

0,921

Leucina*

5,8

1,299

Lisina*

4,0

0,806

Metionina*

1,5

0,415

Fenilalanina*

4,6

1,017

Prolina

3,5

0,813

Serina

4,5

1,054

Treonina*

3,6

0,813

Triptófano*

1,8

0,330

Tirosina

2,3

0,578

Valina

4,6

1,153

* Aminoácidos esenciales. Fuente: FAO (1970); Vaisey-Genser y Morris (1997).

Los estudios sobre la fracción proteica de la linaza y su valor nutricional son escasos y dispersos. En la Tabla 1.4. se presentan los rangos de los valores reportados encontrados. Se aprecia gran variabilidad entre los resultados del PER (Relación de Eficiencia Proteica, por sus siglas en inglés), atribuidas principalmente a las diversas condiciones y técnicas de análisis

16 empleados en la determinación, aún cuando es posible que la variedad de semilla utilizada sea también un factor de variación considerable (FAO 1970; Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998).

Tabla 1.4. Calidad de las proteínas de linaza. Valor biológico (BV)

61,6 – 77,4

Digestibilidad

72,9 – 91,6

PER

0,79 – 1,76

Utilización proteica neta (NPU)

45 - 60

Índice de aminoácidos esenciales

69

Fuente: FAO (1970); Oomah y Mazza (1998).

El estudio de las proteínas de linaza se ha visto relativamente desplazado por otros de sus constituyentes como los lignanos y la grasa, pues a pesar de ser rica en proteínas, las investigaciones sugieren que sus beneficios están mas asociados a su perfil de ácidos grasos y de fibra. Adicionalmente, la completa extracción de las proteínas de linaza para su identificación, aislamiento y caracterización ha constituido un reto para los científicos debido a que la viscosidad propia de las proteínas se ve incrementada por la presencia de mucílago en la corteza de la semilla, lo cual también ha implicado un reto para la producción industrial de aislados y concentrados de proteínas de linaza; Sin embargo, a nivel experimental se han obtenido aislados proteicos de linaza con aproximadamente 86% de proteínas, y concentrados con aprox. 65% de proteínas, pero con bajas propiedades estabilizantes y gelificantes (VaiseyGenser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Oomah 2001; Daun et al. 2003; Wanasundara y Shahidi 2003).

Como en otras oleaginosas, existe una correlación negativa entre el contenido de grasa y de proteína de las semillas, es decir, a mayor contenido de proteínas menor contenido de grasa. Se ha observado que al incrementar la utilización de fertilizantes nitrogenados y fosforados durante la cosecha, se obtienen mayores niveles de proteínas en la semilla (Oomah y Mazza 1998).

17

1.2.3. Fibra dietaria.

El concepto de fibra dietaria total abarca aquellos polisacáridos, y los no polisacáridos como la inulina, que forman la estructura de la pared celular de las plantas, exceptuando el almidón, que no son digeridos por las enzimas del tracto gastrointestinal humano, pero si están sujetas a cierta degradación en el intestino grueso por fermentación bacteriana como la lignina, celulosas y hemicelulosas, β-glucanos, pectinas, gomas, mucílago, oligofructosa y almidón resistente (Higdon y Lupton 2005).

La semilla de lino contiene aproximadamente el 28% de su peso seco de fibra dietaria total, siendo una excelente fuente de ambos tipos de fibra, soluble e insoluble. La proporción de fibra soluble:insoluble reportada en diversos estudios es variable y va desde 20:80 a 40:60, dependiendo del método de extracción y análisis utilizado (Batthy 1993; Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

La información que existe sobre la variación del contenido de fibra dependiendo del tipo de semilla y sus condiciones de cultivo es limitada, ya que la determinación de fibra total es costosa, larga y tediosa por lo que no resulta práctico analizar un número grande de muestras. En consecuencia, generalmente se utiliza la cantidad de mucílago como un estimado de la cantidad de fibra soluble que contiene la semilla, ya que el procedimiento de extracción de mucílago es más sencillo y económico. El mucílago (goma hidrocoloidal), es el principal polisacárido soluble presente en la linaza, constituye aproximadamente el 7-10% del peso de la semilla y se encuentra formando parte de la estructura externa de la cáscara. Esta compuesto principalmente por ramnosa y xilosa en un ratio aproximado de 0,5-1,5. Recientemente se ha venido estudiando su uso como ingrediente en la industria de alimentos por sus propiedades estabilizantes y espesantes. La fibra insoluble presente en la linaza (principalmente lignina y celulosa), ha sido poco estudiada en comparación con la fibra soluble, debido a que a esta última se le atribuyen mayores beneficios y propiedades funcionales (Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Higdon y Lupton 2005).

18

1.2.4. Carbohidratos.

La linaza contiene pocas cantidades (1-2%) de carbohidratos digeribles como azúcares simples y almidones. Al igual que sucede con otros componentes minoritarios de la semilla, se requieren estudios adicionales para conocer los compuestos que integran este grupo (Daun et al. 2003). 1.2.5. Minerales y vitaminas.

La linaza es fuente de magnesio, potasio y fósforo (Tabla 1.5.). Una cucharada de linaza aporta igual cantidad de magnesio que un cambur o una taza de leche descremada. Su aporte de potasio es análogo al de un cambur, un huevo cocido o al de una rebanada de pan, y el de fósforo es un poco mayor al de una sardina enlatada. Por el contrario, la linaza es baja en sodio, cobre, hierro y zinc (Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

Entre las vitaminas, la E es la que está en mayor cantidad en la linaza, mayoritariamente como γ-tocoferol (9-40 mg/100g de semilla). El contenido máximo de α-tocoferol es de apenas 1,2 mg/100g de semilla. Aproximadamente el 26% del contenido total de tocoferoles están contenidos en la cáscara de la semilla. La linaza también contiene aproximadamente 12mg/100g de tocotrienoles, compuestos que han probado ser mas eficientes en la reducción de la oxidación lipídica que el α-tocoferol, y pequeñas cantidades de carotenos (1,8 mg/ kg de semilla ≈ 100 equivalentes de retinol / kg de semilla) (Daun et al. 2003).

Los estudios indican que la linaza tiene bajo contenido de vitamina C, al igual que de complejo vitamínico B (Tabla 1.5.). Se piensa que las condiciones climáticas del lugar de cultivo tienen gran influencia sobre el contenido de vitaminas; sin embargo, se hacen necesarios estudios adicionales, empleando un método de determinación adecuado, ya que se han reportado variaciones significativas entre estudios, dependiendo del método analítico utilizado (Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

19

Tabla 1.5. Contenido de minerales y vitaminas de la linaza canadiense (var. Norman).

Potasio

mg/100 g de semilla 550-1060

Fósforo

440-760

Zinc

3,8-9,4

Magnesio

320-410

Manganeso

1,3-4,3

Calcio

200-440

Cobre

0,8-1,7

Azufre

230-250

Aluminio

0,2-1,0

Sodio

20-60

Selenio

≈0,06

Mineral

Vitaminas

mg/100g de semilla

Mineral Hierro

Vitaminas

mg/100g de semilla 3,6-16,4

mg/100g de semilla

Vitamina C

0,5 – 1,3

Piridoxina (Vit. B6)

0,4 – 10,0

Tiamina (Vit. B1)

0,1 – 0,6

Cianocobalamina (Vit. B12)

0,0 – 0,5

Riboflavina (Vit. B2)

0,1 – 0,3

Niacina (Vit. B3)

1,4 – 5,5

Acido Fólico

Ácido Pantoténico 0,6 – 7,0 Biotina (Vit. B5) Fuente: Vaisey-Genser y Morris (1997); Daun et al. (2003).

µg/ 100g de semilla 112 6

1.2.6. Compuestos fitoquímicos.

Son aquellos compuestos químicos de origen vegetal que pudieran tener influencia positiva sobre la salud pero que no son nutrientes esenciales. Entre los compuestos fitoquímicos conocidos se encuentran los carotenoides, ácidos fenólicos, flavonoides, isotiocianatos, fitoestrógenos como los lignanos y las isoflavonas, fitoesteroles, y resveratrol; algunos autores incluyen también en este grupo de compuestos a la fibra. De los compuestos antes mencionados se sabe, hasta ahora, que la linaza contiene ácidos fenólicos y lignanos, siendo estos últimos los más estudiados (Daun et al. 2003; Johnsson 2004; Frankel y German 2006).

20 En la última década ha aumentado considerablemente la atención en los compuestos fitoquímicos debido, entre otras cosas, a su potencial efecto protector e inhibidor de los daños ocasionados por la oxidación biológica o efecto de los radicales libres sobre el organismo, que ocasionan daños a lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, dando inicio a enfermedades degenerativas. La biodisponibilidad, absorción y metabolismo de estos compuestos durante la digestión, su mecanismo (in vivo) de protección e intervención contra las enfermedades son objeto de estudios actualmente, ya que el mecanismo de acción aún no está totalmente claro a pesar de los numerosos estudios realizados hasta ahora (Frankel y German 2006). La falta de consenso en los resultados se debe principalmente a 2 causas, en primer lugar se ha observado que los diferentes métodos analíticos utilizados influyen notablemente en los resultados, por lo cual se hace necesario mejorar y estandarizar los métodos actualmente utilizados. En segundo lugar, la evidencia sugiere que la cantidad de estos compuestos que es absorbida en el organismo así como su biodisponibilidad varían considerablemente con la matriz del alimento fuente y las mezclas complejas de compuestos polifenólicos que posee (Vaisey-Genser y Morris 1997; Frankel y German 2006). 1.2.6.1. Compuestos polifenólicos.

Los polifenoles son compuestos estructuralmente relacionados, con propiedades antioxidantes que muestran un gran efecto atrapador de radicales. En la naturaleza, dichos compuestos desempeñan funciones de defensa y protección de las plantas durante el cultivo contra los ataques depredadores de animales herbívoros, insectos, hongos y hierbas parasitarias. Los polifenoles se encuentran asociados a la fibra en las paredes celulares de las plantas, contribuyen con el color, sabor amargo y sensación astringente característica de algunas oleaginosas, y poseen una actividad antioxidante importante, gracias a su capacidad de donar átomos de hidrógeno. Los compuestos fenólicos vegetales abarcan los ácidos fenólicos de 7 a 9 átomos de carbono, tales como los ácidos gálico y p-cumárico, los flavanos o flavonoides de 15 átomos de carbono, y las ligninas, entre otros. Como característica común, los compuestos polifenólicos poseen un grupo hidroxilo en posiciones orto y para, que los hace susceptibles a participar en reacciones tipo redox, las cuales les permiten actuar como agentes reductores, donadores de hidrógeno y agentes atrapadores de oxígeno. Diversos estudios han reportado que la actividad antioxidante se encuentra relacionada con cierta ubicación de los grupos

21 hidroxilo en el anillo, que lo hacen más reactivo ante la acción de radicales libres; En consiguiente, puede decirse que la actividad antioxidante es dependiente del número y la posición de grupos hidroxilos, así como de su conjugación. Los ácidos fenólicos como el cafeico, clorogénico, ferúlico, sinápico y p-cumárico tienen mayor poder antioxidante que los derivados del ácido benzoico como los ácidos p-hidroxibenzoico, vainilico y siríngico (FAO 1995; Velioglu et al. 1998; Kähkönen et al. 1999; Rimac et al. 2005; Salta et al. 2005).

La linaza contiene de 8 a 10 g/kg de harina de polifenoles totales. Los principales ácidos fenólicos encontrados en la linaza desgrasada son el trans-ferúlico (46% del total de ácidos fenólicos), trans-sinapico (36%), p-cumárico (7,5%) y trans-cafeico (6,5%), en rangos que van desde los 7,9 hasta los 10,3 mg/g de linaza desgrasada; También contiene aproximadamente 2,8 mg de ácido gálico /g de linaza desgrasada. La estructura básica de estos ácidos se muestra en la Fig. 1.7. Se ha encontrado que las estaciones en las que se realiza el cultivo tienen mayor efecto sobre la variación del contenido de estos ácidos que la variedad de semilla. A los ácidos fenólicos se le atribuyen, entre otras funciones bioactivas, propiedades antioxidantes, antimicrobianas y anticancerosas (Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Johnson 2004).

Figura 1.7. Estructura de los ácidos fenólicos. 4-O-β-d-glucopiranosil-p-acido cumárico (si R = OH), y 4-O-β-d-glucopiranosil ácido ferúlico (si R = OCH3). Fuente: Higdon y Lampe (2005).

Son pocos los estudios sobre los flavonoides contenidos en la linaza; sin embargo, se ha encontrado que los principales son las flavonas C- y O-glicosidos, en un rango que varía entre 31 y 87 mg/100g de semillas. Los flavonoides reportan efectos antibacteriales, antivirales,

22 anti-inflamatorios, antialérgicos y vasodilatadores, además de antioxidantes, al inhibir la peroxidación lipídica (Oomah y Mazza 1998; Johnson 2004). 1.2.6.2. Lignanos.

Son compuestos fenólicos secundarios presentes en las plantas, cuya estructura básica es un 2,3-dibenzilbutano. Son considerados fitoestrógenos ya que al ser consumidos cumplen una actividad similar a las de los estrógenos en los humanos. Aún cuando no se conoce completamente su función, las propiedades antifúngicas e insecticidas de los lignanos vegetales (también conocidos como “precursores de lignanos”) indican que podrían ayudar a la protección de la planta, así como también se le atribuyen efectos reguladores en su crecimiento (Johnsson 2004).

Los lignanos vegetales conocidos son el secoisolariciresinol diglucosido (SDG), el matairesinol (MAT), el pinoresinol y el lariciresinol. El contenido de lignanos de las plantas varía con las condiciones climáticas y el lugar de cultivo, la madurez de la semilla y las condiciones de almacenamiento. Una vez ingerido el alimento, los lignanos vegetales son transformados por las bacterias intestinales durante la digestión, en los lignanos de mamíferos, enterodiol (ED) y enterolactona (EL) (Fig. 1.8c. y 1.8d.), para luego ser absorbidos por el intestino (se cree que en el colon), y transportados al hígado para ser secretados por la bilis; estos últimos poseen propiedades antimitóticas (inhiben la mitosis celular), reguladoras y antioxidantes, a las que se le atribuyen, entre otros, efectos anticancerosos. La linaza es el alimento de origen vegetal con mayor contenido de lignanos conocido hasta ahora (1 cda. aporta 85,5 mg de lignanos), siendo los principales el SDG (Fig. 1.8a.), en cantidades entre 13,6-23,1 mg/g de linaza desgrasada y en menor cantidad el MAT (Fig. 1.8e.). El contenido de lignanos en la linaza es dependiente de la variedad, lugar del cultivo y época del año. Los lignanos no están asociados a la fracción lipídica de los alimentos, en consecuencia, el aceite de linaza no contiene lignanos, a menos que haya sido enriquecido (Oomah y Mazza 1998; Meagher y Beecher 2000; Morris y Vaisey-Genser 2003; Johnsson 2004; Higdon y Lampe 2005).

23

(d) Enterolactona (EL)

(a) Secoisolaricirresinol diglucosido

Oxidación (Tracto GI)

Hidrólisis (Tracto GastroIntestinal)

Dehidroxilación, demetilación (Tracto GI)

(c)

(b)

(ED)

(e) Figura 1.8. Estructura química de los lignanos de mamíferos, y de los principales lignanos vegetales contenidos en la linaza, y metabolismo del SDG. a) 2,3-bis[(4-hidroxi-.)metil]-1,4butano-diglucosido (SDG). b) 2,3-bis[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-1,4-Butanediol (SECO). c) 2,3-bis[(3-hidroxifenil)metil]-1,4-Butanediol (ED). d) trans-dihidro-3,4-bis[(3-hidroxifenil) metil]-2(3H)-Furanona (EL). e) Dihidro-3R,4R-bis[(4-hidroxi-3-metoxifenil) metil]-2(3H)furanona (MAT). Fuente: Higdon y Lampe (2005); Hu et al. (2007)

1.2.7. Compuestos antinutricionales.

Este término abarca aquellos compuestos que interfieren en la absorción o en el metabolismo de los nutrientes, como por ejemplo los fitatos y los oxalatos, presentes en la soya y las

24 espinacas, respectivamente, y que son responsables de atrapar minerales como el calcio, hierro, magnesio y zinc, formando complejos insolubles que reducen su absorción en el intestino. Otros compuestos antinutricionales comúnmente estudiados son los inhibidores de proteasas, como los

inhibidores de tripsina, presentes en la soya y otros granos, y los

inhibidores de amilasas presentes en leguminosas como las caraotas (P. vulgaris) y cereales. Entre los compuestos antinutricionales que han sido identificados en la linaza se encuentran los glucósidos cianógenos, la linatina (inhibe el metabolismo de la vitamina B6), y en ciertos casos, subproductos de la oxidación lipídica. No se han detectado inhibidores de amilasa, pero si pequeñas cantidades de inhibidores de tripsina (20-30 unidades AIT/g de semillas), mucho menos que la soya y la canola (FAO 1995; Daun et al. 2003), mientras que en la sémola de linaza la actividad inhibidora de tripsina (AIT) es de 42-51 unidades AIT/g de sémola (Oomah y Mazza 1998).

La linatina es un compuesto polar localizado en el cotiledón de la linaza que se hidroliza en el intestino y reacciona con la piridoxina formando un compuesto estable e inhibiendo su absorción. Estudios realizados con una ingesta de 45 g de linaza/día por 5 semanas concluyeron que la linatina se encuentra en muy baja concentración (aproximadamente 10 ppm), por lo que no ocasiona inhibición significativa en la absorción de micronutrientes en humanos. En animales, el efecto de la linatina si es considerable debido a que el tamaño de ración es mucho mayor; sin embargo es fácilmente contrarrestable con la adición de suplementos vitamínicos (Daun et al. 2003).

Igualmente, los subproductos de la oxidación de los lípidos de la linaza han demostrado tener influencia desfavorable sobre los niveles de vitamina E y causar estrés oxidativo en los tejidos corporales, solo si se ingieren grandes cantidades de linaza (40% de la ingesta calórica diaria ≈ 110g de semillas), y por periodos de tiempo prolongados (mas de un mes). De los compuestos antinutricionales, los glucósidos cianógenos son los que han sido mayormente estudiados y que se encuentran en mayor cantidad (Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

25 1.2.7.1. Glucósidos cianógenos.

Son químicos nocivos producidos por ciertas plantas como medio de defensa de los depredadores, y que pueden transformarse, por hidrólisis ácida o por acción enzimática, en ácido cianhídrico (HCN), compuesto tóxico para humanos y animales. Su concentración en las plantas depende, entre otros factores, de la composición del suelo donde se realiza el cultivo, específicamente de su contenido en hierro y nitrógeno, del pH y la aridez del clima. Entre otros alimentos que poseen glucósidos cianógenos se encuentran las almendras, yuca, sorgo, albaricoque, durazno, cereza y ciruelas. Los diglucósidos linustatina (R=CH3) y neolinustatina (R=C2H5), son los principales glucósidos cianógenos que contiene la semilla de lino, seguidos del monoglucósido linamarina que se encuentra en menor concentración, e inclusive en ciertos cultivares no ha sido detectado. La linaza también contiene las 2 β -glucosidasas encargadas de hidrolizar a los glucósidos cianógenos. La cantidad de glucósidos cianógenos presentes en la semilla disminuye considerablemente con su madurez; mientras la semilla verde contiene aproximadamente 5% (en base seca), la semilla madura contiene alrededor del 0,1% (en base seca), razón por la cual se recomienda que las semillas destinadas al consumo humano y animal estén completamente maduras (Kobaisy et al. 1996; Fokunang et al. 2001; Daun et al. 2003).

El daño a la estructura de la semilla da inicio a la degradación de los cianógenos, al permitir que las enzimas tengan acceso al sustrato cianogénico y reaccionen. El metabolismo de los glucósidos cianógenos comienza cuando la enzima β-bis-Glucosidasa, también llamada linustatinasa, hidroliza la linustatina y la neolinustatina, transformándolas en el glucósido monocianogéno linamarina (Ec. 1, Fig. 1.9.), que posteriormente es hidrolizada por la βmonoglucosidasa o linamarasa para formar las denominadas “agliconas” o compuestos cetocianhídricos (Ec. 2, Fig. 1.9.). Finalmente, se produce HCN (Ec. 3, Fig. 1.9.) cuando la αHidroxinitril liasa descompone la acetocianohidrina (Bhatty 1993; Fokunang et al. 2001; Daun et al. 2003).

26

… (Ec. 1)

… (Ec. 2)

… (Ec. 3)

Figura 1.9. Proceso de transformación del glucósido cianógeno linustatina en HCN. Fuente: Bhatty (1993).

Posteriormente, el HCN es convertido en tiocianato por la enzima Rhodanasa (Fig. 1.10.), o se combina con la cisteína para formarβ -cianoalanina. En condiciones normales, la mayor parte del tiocianato es excretado a través de la orina y sólo una pequeña parte se acumula en el organismo. El efecto tóxico del cianuro se produce después de la inhibición de la enzima citocromoxidasa, cuya ausencia altera la utilización celular del oxígeno, ocasionando una hipoxia citotóxica, disfunción y muerte celular (Fokunang et al. 2001).

S2O2 CN

2-

SO3

2-

-

SCN Tiosulfato sulfur-transferrasa (Rhodanasa)

-

Excreción (Orina)

-

HCO2 -

Pool de CN

Incorporación a las células

Figura 1.10. Metabolismo normal del cianuro. Fuente: Fokunang et al. (2001).

27 La dosis mínima letal de HCN se estima entre 0,5 y 3,5 mg/kg de peso corporal; sin embargo, la magnitud del efecto del HCN sobre el metabolismo no solo depende de la cantidad de glucósidos ingeridos y de la frecuencia de consumo, sino también de la salud y estado nutricional del consumidor, en especial, si existe deficiencia de proteínas en la dieta. Las personas sanas y con un régimen de alimentación balanceada son capaces de detoxificar y eliminar del organismo estos compuestos potencialmente peligrosos. Un adulto saludable puede llegar a detoxificar entre 30 y 100 mg/día de cianuro, sin embargo cuando se combina el consumo de glucósidos con uno o mas de los aspectos nutricionales previamente mencionados, la habilidad del organismo de eliminar el cianuro se ve considerablemente comprometida. Por ejemplo, las personas con deficiencia de yodo que ingieren frecuentemente alimentos con glucósidos cianógenos, tienden a mantener niveles elevados de tiocianato en sangre lo cual eventualmente desencadena en intoxicación por HCN y/o en deficiencias crónicas de yodo ya que el tiocianato inhibe el metabolismo de este elemento. Entre los síntomas característicos de la intoxicación con HCN se encuentran la asfixia, halitosis, nauseas y/o vómitos, mareo y aumento del ritmo cardíaco; en casos de intoxicación aguda puede haber parálisis muscular, confusión mental, paro respiratorio y muerte (Fokunang et al. 2001; Daun et al. 2003).

La presencia de glucósidos cianógenos ciertamente es la mayor limitación para el consumo de linaza, aun cuando diversos estudios coinciden en que se necesitarían ingerir cantidades superiores a 1 kg/día para ocasionar una intoxicación aguda (Daun et al. 2003). Bhatty (1993), determinó que la cantidad de glucósidos liberados de la semilla entera no es suficiente para resultar tóxica, sin embargo, en esta investigación no se estudió la semilla molida, sino entera, y por lo tanto recomienda, ante la ausencia de otras investigaciones, evitar la ingestión de cantidades mayores a 50 g de semillas enteras/día (≈ 4 cdas. grandes), en especial por personas que padezcan insuficiencia renal o hepática, cuya capacidad de detoxificacion es limitada. En enero del 2009, la Food and Drug Adminisration (FDA) consideró que habían suficientes estudios clínicos y toxicológicos para asignar el status GRAS a la linaza tanto entera como molida. Este estatus le proporciona a la linaza la seguridad que algunas compañías requerían para incluirla en sus formulaciones. Aún se encuentran en estudio para asignar status GRAS el

28 aceite, los lignanos y los suplementos de fibra dietaria de linaza. (Flax Council of Canada 2009).

Se sospecha que el calor leve y la molienda exacerban la acción enzimática, razón por la cual se aconseja realizar infusiones en frío para evitar que la enzima actúe, no calentarlas sino hervirlas por 10 minutos como mínimo para inactivar la enzima, o comer las semillas enteras, pero de esta forma se limita el aprovechamiento de los constituyentes que están contenidos en el interior de la semilla. En animales se han producido intoxicaciones cuando se utilizan tortas de linaza (residuo de la extracción del aceite) que no han sido sometidas previamente a tratamientos de calor que destruyan las enzimas o a extracciones con disolventes adecuados (la máxima extracción se obtiene mediante 3 etapas con mezclas metanol-amonio-agua/hexano). Por otro lado, durante el proceso de extracción del aceite de linaza también puede haber producción de HCN por lo que las semillas deben tratarse previamente para inhibir la acción enzimática (Bhatty 1993; Oomah y Mazza 1998; Fokunang et al. 2001; Flax Council of Canada 2009). 1.3. Principales usos de la linaza.

La planta de lino se ha cultivado desde la antigüedad para la extracción de las fibras y aceite. De las fibras del tallo se obtiene un hilo con el cual se fabrican telas. Su cultivo para este fin, adquirió gran relevancia dentro del imperio Egipcio ya que las telas de lino se utilizaban para vestir a los faraones, y también durante el proceso de momificación. En el año 1753 se comenzó la producción industrial de fibra de lino. Durante la revolución industrial tuvo múltiples usos y por ende mucha demanda, pero posteriormente, el descubrimiento de las fibras sintéticas y el predomino del cultivo del algodón (comienzos del siglo XIX), relegó la producción de la fibra de lino y el cultivo de la planta a un segundo término. El proceso de obtención de telas puede realizarse industrial o manualmente, en el último caso, se permite que la planta cortada quede expuesta a las condiciones ambientales para que la fermentación natural la descomponga y permita separar la fibra vegetal de otras partes no deseadas para elaborar un hilo natural que se utiliza en la fabricación de una tela similar al algodón, pero más fuerte, más lisa al tacto e igual de fresca y absorbente. El tallo y las semillas pueden ser

29 utilizados en la fabricación de pulpa papelera (Vaisey-Genser y Morris 1997; Flax Council of Canada 2005).

El aceite de linaza se utiliza fundamentalmente en la industria de pinturas, tintas y barnices por sus propiedades como agente de secado rápido; además, los polímeros formados durante las reacciones de oxidación del aceite de linaza le confieren a la madera, hierro y otras superficies, protección contra los factores ambientales. Por otra parte, el aceite de linaza es el componente principal en la fabricación del linóleo, un producto impermeable, altamente resistente y de baja necesidad de mantenimiento utilizado para cubrir suelos, y también es utilizado como agente antidesgarrante en la fabricación del concreto, pues evita que los cambios climáticos, especialmente el frío del invierno, cause grietas en las estructuras hechas de este material (Vaisey-Genser y Morris 1997; McKinnon 2008).

El mucílago de linaza tiene usos cosméticos ya que posee propiedades demulcentes (suavizantes y protectoras de la piel irritada), y emolientes (suavizan la piel, formando una capa sobre ella que impide la evaporación del agua), que son aprovechadas en preparaciones con harina de las semillas, para ser usadas en el tratamiento de afecciones de la piel, como eccemas, hinchazón, quemaduras, etc. También se utiliza el extracto de mucílago para productos del cabello pues posee efecto fijador, alisante, y fortalecedor. Adicionalmente, el mucílago de linaza posee propiedades estabilizantes y emulsificantes por lo cual puede ser utilizado como aditivo en la industria de alimentos en lugar de otras gomas como la arábiga y la xanthan, y como sustituto del huevo en la elaboración de diversos productos horneados y fritos como ponques y panquecas. Las proteínas de linaza también poseen buenas propiedades emulsionantes, espesantes y espumantes que pueden ser aprovechadas en la fabricación de helados, derivados cárnicos y salsas; igualmente, han demostrado tener efectos antifúngicos en alimentos con pH neutro o alcalino, lo cual pudiera promover su uso como aditivo alimentario (Oomah 2001; Daun et al. 2003; Morris 2007; Xu et al. 2008).

La linaza es muy utilizada en la alimentación animal, principalmente la torta remanente de la extracción del aceite, pues es una excelente fuente de proteínas (aproximadamente 35%), de

30 ahí que la harina de linaza se emplea para fabricar alimentos y “snacks” para perros, gatos y caballos. Sin embargo en las últimas décadas, mas que las proteínas, ha sido la calidad de los lípidos que contiene la linaza lo que ha incentivado su uso en la alimentación animal, pues se ha observado que al incrementarse el consumo de ácido α-linolénico (ALA), el perfil de ácidos grasos de la carne, leche y huevos se modifica aumentando el porcentaje de ácidos omega 3 que aportan. La leche enriquecida con aceite de linaza aporta aproximadamente 90mg de ALA por vaso (250 ml); esta leche presenta la desventaja de ser mas susceptible a la oxidación por lo cual requiere un manejo y condiciones de procesamiento especiales Al adicionar aceite de linaza al alimento tradicional del ganado vacuno, diversos estudios observaron que solo una pequeña parte del ALA suplementado a los animales era incorporado a la leche, ya que durante la digestión, este se transforma en ácidos grasos saturados, concluyendo que para obtener un incremento hasta del 20% de omega 3 en la leche era necesario proteger física o químicamente al ALA para que no se hidrolice en el rumen del animal. Al fabricar mantequilla con leche enriquecida en ALA se observan cambios importantes en su suavidad y untabilidad a temperatura ambiente, respecto a una mantequilla control (Vaisey-Genser y Morris 1997; Primo Yùfera 1998; Flax Council of Canada 2002a).

En Canadá se ha suplementado el alimento para gallinas ponedoras con 10-20% de linaza, lo cual ha modificado, entre otras cosas, la composición de ácidos grasos de la yema de huevo, al aumentar considerablemente su contenido de ácidos omega-3, desde 0,4% hasta un 9,0%, sin afectar perceptiblemente su color o sabor. Otros beneficios observados al incluir linaza en la alimentación de aves han sido incremento en el peso del animal, disminución de la grasa de la carcasa y los órganos, y un incremento en los niveles de ácidos omega-3 en los tejidos. La suplementación con linaza debe complementarse con vitamina E para evitar la oxidación de ácidos grasos, ya que esto ocasiona que los productos tengan un leve sabor a pescado y sean mas propensos a la oxidación (Oplinger et al. 1992; Vaisey-Genser y Morris 1997; Flax Council of Canada 2003, 2004).

Existen pocos estudios sobre la suplementación de alimentos para pescados y ganado porcino con linaza. Hasta ahora se sabe que en el caso de los pescados esta dieta no afecta su crecimiento, y que el contenido de omega-3 de su carne aumenta a expensas de los omega-6,

31 principalmente del ácido araquidónico (de Souza et al. 2008). A las semillas utilizadas para este fin se les debe extraer primero la fibra soluble, ya que se ha observado que los pescados no la toleran. La adición máxima de linaza a la alimentación del ganado porcino es del 5% pues se ha observado que niveles superiores afectan desfavorablemente el sabor de productos como la tocineta y chuleta (Vaisey-Genser y Morris 1997; Flax Council of Canada 2003).

Las propiedades medicinales de la linaza eran bien conocidas en la antigua China, en donde la utilizaban con diferentes fines en su medicina tradicional. Actualmente, la linaza sigue siendo utilizada mundialmente en la preparación de medicinas caseras para tratar inflamaciones, estreñimiento y mala digestión, entre otros. En países como Canadá y Estados Unidos, se comercializan desde hace varios años diversos productos nutracéuticos a base de linaza para tratar y/o prevenir diversas afecciones, como por ejemplo, extractos purificados de lignanos, que son utilizados por el consumidor para el tratamiento y/o prevención de enfermedades como la diabetes, lupus, hipertensión y desordenes hormonales, incluyendo los relacionados con la menopausia. También se comercializan cápsulas de aceite de linaza que afirman tener múltiples beneficios contra enfermedades cardiovasculares y trastornos hormonales; sin embargo, el aceite de linaza no posee lignanos por lo cual tampoco posee sus propiedades fitoestrógenas (Flax Council of Canada 2002a; Crosby 2005). Muchos de estos productos ya pueden adquirirse localmente.

A partir de los años 70 se profundizaron los estudios sobre la composición de la linaza, conociéndose sus propiedades benéficas a la salud, con efectos tanto preventivos como curativos. Ello ha incentivado en países productores como Estados Unidos y Canadá, el consumo de linaza como parte de la dieta diaria, y por ende su uso y/o el de sus subproductos como ingrediente en una variedad de alimentos disponibles al consumidor como por ejemplo harinas, panes, galletas, pastas, tortas, donas, bebidas y barras energéticas, snacks, cereales para desayuno y toppings entre otros. En Latinoamérica, México es el país que mas reseña el uso de linaza en la fabricación industrial de alimentos como cereales, panes y barras energéticas, resaltando su contenido de fibra. Hasta un 40% de sustitución con linaza entera o molida ha sido utilizada exitosamente en la fabricación de productos horneados. Su adición modifica el perfil de textura de estos alimentos proporcionando suavidad (debido a la grasa

32 que aporta), y crujencia (aportado por la cáscara); adicionalmente, la contribución de aceite de la semilla permite disminuir la cantidad de grasa añadida (Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Flax Council of Canada 2005). 1.4. La linaza como alimento funcional.

Los alimentos funcionales son aquellos que contienen componentes que poseen actividad biológica capaz de promover la salud. Cuando se demuestra que un alimento afecta beneficiosamente y de manera relevante alguna función corporal, mas allá de sus propiedades nutricionales básicas, éste se considera un “alimento funcional”. Estos alimentos están relacionados con mejoras significativas en la salud y bienestar físico en general, y/o con la reducción del riego de enfermedades crónicas (Erbas y Tetik 2005; Salta et al. 2005).

A la linaza se le atribuyen actualmente múltiples beneficios a la salud, con efectos tanto preventivos como curativos, entre los cuales destacan: 

Su alto contenido de fibra y ácidos grasos insaturados ayuda a prevenir enfermedades cardiovasculares y la arteriosclerosis, ya que disminuye los niveles de colesterol LDL y triglicéridos en sangre (Bhatty 1993; Oomah y Mazza 1998).



La fibra soluble de la linaza también es coadyuvante, en asociación con las proteínas, en la reducción de la incidencia de diabetes y en el tratamiento de la obesidad, ya que retrasa la digestión y absorción de los carbohidratos, lo cual favorece la respuesta glicémica del organismo beneficiando la regulación de los niveles de azúcar en sangre. Sin embargo se sabe que el consumo excesivo de semillas inhibe también la absorción de otros nutrientes y de medicamentos debido a la formación de una barrera mucilaginosa sobre el intestino (Bhatty 1993; Oomah y Mazza 1998; Fitzpatrick 2008).



Su contenido de tocoferoles, además del efecto antioxidante, favorece la excreción de sodio, lo cual contribuye a disminuir la presión sanguínea; adicionalmente, ayuda a mantener el selenio en estado reducido, contribuyendo a su acción antioxidante, y disminuye la formación de nitrosaminas, responsables de la aparición de cáncer de estómago (Oomah y Mazza 1998; Morris 2007).

33 

Mejora el estreñimiento gracias a sus propiedades laxantes al ser consumidas enteras o en infusiones frías. Este beneficio es atribuido a los mucílagos, que además poseen efecto protector sobre el intestino, evitando las irritaciones que otros laxantes suelen producir. También se le atribuyen efectos preventivos del cáncer de colon y recto (Batthy 1993; Flax Council of Canada 2005).



Efecto anti inflamatorio, reparador y protector del aparato digestivo y del sistema urinario, por lo que se utilizan para combatir las irritaciones estomacales, diverticulitis y la cistitis. Asimismo, estas propiedades también pueden aprovecharse para el tratamiento de ciertos trastornos ginecológicos como la endometriosis, en el tratamiento de cataratas, inflamación de garganta, alivio de dolores musculares, etc. (Oomah y Mazza 1998).



La administración diaria de aceite de linaza o de linaza molida (15g), disminuye la inflamación de los riñones y mejora la función renal en pacientes con lupus eritematoso (Morris 2007).



Ayuda a prevenir la aparición de cáncer de mama, próstata y tumores en la piel, e interviene en la regulación de los niveles de las hormonas sexuales en plasma, principalmente de los estrógenos, gracias a su contenido de fitoestrógenos de lignano a los cuales se le atribuyen propiedades antioxidantes, antiestrogénicas y antitumorales (Flax Council of Canada 2002a; Daun et al. 2003; Crosby 2005).



Sus propiedades mucolíticas ayudan a eliminar las secreciones bronquiales remanentes de resfriados y otras enfermedades respiratorias (Oplinger et al. 1992).



El aceite de linaza posee propiedades antimaláricas, antiparásitos y antitumorales, debidas a la toxicidad de los productos secundarios de la peroxidación de los ácidos grasos insaturados, que son capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos y de células malignas. También se ha relacionado con el alivio de ciertas condiciones neurológicas como el entumecimiento y la visión borrosa, así como con potenciales efectos antitrombogénicos y antiarrítmicos (Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998).



Los flavonoides y los polifenoles pudieran tener efecto antioxidante y protector en el tracto gastrointestinal antes de ser absorbidos. Esta hipótesis está fundamentada en el hecho de que en algunos estudios se ha encontrado mayor concentración de compuestos fenólicos en el estomago y el intestino que en la sangre. Los polifenoles pudieran disminuir la susceptibilidad de oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), que es

34 ocasionada por el estrés oxidativo de las grasas y azucares postprandiales oxidadas. Proteger las LDL de la oxidación tiene un efecto preventivo y atenuante de la ateroesclerosis (Frankel y German 2006). 

Se cree que el ácido fítico colabora con los efectos hipocolesterolémicos e hipolipidémicos de los componentes mayoritarios de la linaza, así como en la reducción del riesgo de cáncer de mama y colon. Aun cuando este ácido es considerado en algunos casos como un compuesto antinutricional, se ha demostrado que se encuentra en muy bajas concentraciones para ocasionar una inhibición significativa de nutrientes. El contenido de ácido fítico de la linaza varía entre 23-33 g/kg de semillas (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003).

1.5. La linaza en Venezuela.

La semilla de lino consumida en Venezuela es importada desde Canadá, ya que los cultivos locales, aunque viables, son escasos, al punto de no existir información oficial sobre producción de linaza en el país (FAO 2007). En el estado Mérida existen pequeños cultivos de linaza, con una producción anual que no llega a cubrir las necesidades locales. La linaza criolla, a diferencia de la rojiza canadiense, es de variedad dorada (Fig. 1.11.). El color de la flor de la planta de lino criolla, que también pudiera contribuir a la futura identificación taxonómica de la variedad local, es violeta (Fig. 1.11.).

Figura 1.11. Planta de lino local y sus flores. Linaza cultivada en el Estado Mérida.

35 1.6. Procesamientos caseros aplicados a la linaza.

En Venezuela, la linaza es comúnmente utilizada y consumida a nivel casero o artesanal, principalmente en forma de infusiones frías o calientes, adicionada a los cereales de desayuno o jugos de fruta, y tostada para hacer barras tipo turrón. Recientemente ha sido incluida a nivel industrial por empresas como la Kellogg’s y Panes Bimbo en la fabricación de cereales de desayuno, barras dietéticas y panes.

Entre los procesamientos mas comunes aplicados en el país a la linaza están el remojo, la cocción, la molienda y el tostado. Las condiciones particulares de tiempo y temperatura recomendadas en cada caso varían según la fuente (Anónimo 2007).

Existen recomendaciones variadas y opiniones encontradas sobre la forma de consumir la linaza, en particular sobre si deben consumirse enteras o molidas. La mayoría de las recomendaciones están orientadas hacia el consumo de las semillas enteras para aprovechar al máximo su contenido de fibra, pero dejando de lado el resto de sus componentes. La cáscara de la linaza resiste la acción de las enzimas digestivas, por lo cual las semillas pasan a través del tracto gastrointestinal sin ser digeridas. En este caso, si se desean aprovechar los nutrientes que se encuentran en el interior de la semilla, esta debe ser completamente masticada antes de su deglución (Morris 2007).

La molturación o molienda de la semilla es otra operación que se recomienda para que el organismo aproveche los constituyentes contenidos en el interior de la semilla. Sin embargo, la molienda tiene sus detractores que se basan en el hecho de que esto promueve la oxidación de las grasas poliinsaturadas, y además permite que las enzimas y el sustrato cianógeno entren en contacto, formándose el HCN. Diversos estudios de estabilidad aseguran que desde el punto de vista de los ácidos grasos, la linaza molida se mantiene fresca a temperatura ambiente (≈ 23ºC) hasta por 4 meses, gracias a la acción sinérgica de los lignanos y el tocoferol presentes en la semilla. Sin embargo, y ante la ausencia de estudios de estabilidad donde se considere la formación de HCN, la recomendación general es moler las semillas, si se desea

36 aprovechar mas que la fibra, al momento en que se van a consumir, y no guardar semilla molida para ser consumida luego (Morris 2007).

El remojo de las semillas enteras en agua por varias horas es quizás la práctica más común. La finalidad de este proceso es extraer el mucílago o fibra soluble que se encuentra recubriendo la semilla. Con el remojo, esta capa mucilaginosa se hidrata y se separa de la corteza de la semilla. Sin embargo, si no hay agitación, la separación del mucílago es solo parcial y la mayor parte de la fibra soluble quedará hidratada pero adherida a la semilla. El remojo puede realizarse con agua fría o caliente, siendo este ultimo más efectivo si lo que se desea es extraer el mucílago. El tiempo de remojo puede variar desde 30 min hasta 12 h.

La cocción de la semilla por varios minutos, previo remojo o no, para realizar infusiones, tiene por finalidad aumentar la extracción de fibra de la semilla. Adicionalmente, el calor prolongado puede producir cierto daño en la estructura de la semilla, ocasionando que parte de los compuestos, como por ejemplo las proteínas solubles, pasen al agua de cocción. Este procesamiento es recomendado para inactivar las enzimas responsables de la producción de HCN y disminuir el riesgo de intoxicación en personas con ciertas patologías que no tienen la capacidad de detoxificación del HCN de una persona sana, o cuando se ingiere linaza varias veces al día. El tiempo de cocción recomendado varía desde 2 hasta 10 min.

Para prolongar el tiempo de vida útil de la semilla y mejorar sus propiedades organolépticas se recomienda el tostado de la semilla a temperaturas superiores a los 180ºC por varios minutos. Durante el proceso de tostado de linaza se generan compuestos aromáticos que le confieren a la semilla sabor y olor similar al de nueces o almendras tostadas, además de una textura crocante más agradable al paladar de ciertos consumidores. También ocurren reacciones de Maillard que pudieran aumentar su actividad antioxidante. Posterior al tostado, la semilla puede consumirse entera o molida (Morris 2007). Esta práctica es por el contrario la menos utilizada en el país a nivel casero, ya que a nivel industrial es la más usada.

37 1.7. Consideraciones generales sobre los análisis químicos aplicados a la linaza.

La fibra dietaria total se determina de acuerdo al método AOAC 985.29 (1997), también conocido como Método de Prosky, que combina procedimientos enzimáticos y gravimétricos. Las muestras son inicialmente gelatinizadas con α-amilasa termoestable y posteriormente digeridas enzimáticamente con proteasa y amiloglucosidasa, con la finalidad de remover las proteínas y el almidón, respectivamente. Etapas sucesivas de filtración, lavados con etanol (C2H6) y acetona, precipitación de la fibra soluble por adición de C2H6, determinación de proteínas y de cenizas, completan esta metodología.

Para la cuantificación de los polifenoles totales extraíbles se utilizó el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu (Sánchez-Moreno et al. 1998, 1999; Singleton et al. 1999), empleando el reactivo del mismo nombre, que es capaz de reaccionar con las sustancias fenólicas y no fenólicas reductoras presentes en un medio con pH básico, formando cromógenos de color azul (Bray y Thorpe 1954).

Para la determinación de ácido cianhídrico (HCN) se utilizó el método propuesto por Bradbury et al. (1994) en el cual la determinación se realiza en tres etapas: (1) Extracción de los compuestos cianógenos de la muestra utilizando un medio ácido para inactivar a la enzima linamarasa, (2) La hidrólisis de los glucósidos cianógenos a cianohidrinas por hidrólisis ácida, y luego a cianuro por adición de un álcali y, (3) La cuantificación del cianuro, basado en la reacción de König en la cual el ion CN- es oxidado por la adición de Cloramina-T (Ec.1, Fig.1.12.), luego reacciona con la piridina para producir un compuesto intermediario (Ec.2, Fig.1.12.), que posteriormente se hidroliza a un dialdehído conjugado denominado aldehído glutacónico (Ec.3, Fig.1.12.); este dialdehido, al acoplarse a un grupo metileno activo (Ec.4, Fig.1.12.), que aporta el ácido barbitúrico, forma el complejo coloreado rosa que es detectado por el espectrofotómetro a una longitud de onda de 583 nm (Lambert et al. 1975; Bradbury et al. 1994).

38

→

CN ¯ +

CN

+

... (Ec. 1)

Cloramina-T

... (Ec. 2) Piridina

… (Ec. 3)

Complejo … (Ec. 4) Coloreado

Figura 1.12. Reacción de König para la determinación de HCN. Fuente: Lambert et al. (1975).

Para la determinación de la capacidad antioxidante de la linaza se utilizó el método del DPPH, que mide la capacidad de secuestro de los radicales libres (Sánchez-Moreno et al. 1998); este método se basa en la generación de radicales libres a partir de una solución metanólica de 2,2difenil-1-picrilhidrazil, mejor conocida como DPPH, que en forma de radical absorbe a una longitud de onda de 515 nm. La absorbancia decrece como consecuencia de la reducción por la presencia de un agente oxidante o de especies radicales, es decir, disminuye a medida que los radicales libres del reactivo son atrapados (Fig.1.13.). Los antioxidantes interfieren con el proceso de oxidación al reaccionar con los radicales libres, al quelar los metales catalizadores y/o al atrapar oxígeno. Los compuestos que son capaces de disminuir rápidamente la absorbancia del DPPH al donar átomos de hidrógeno son considerados como buenos antioxidantes. Mientras más átomos de hidrógeno estén disponibles en el medio de reacción, más radicales libres son reducidos, por lo que la tonalidad del medio cambia gradualmente desde un violeta intenso a un color amarillo traslúcido (Sánchez-Moreno et al. 1999a; Espín et al. 2000; Ozcelik et al. 2003).

39

Figura 13. Esquema de la reacción de reducción del radical DPPH·. Fuente: Espín et al. (2000)

CAPÍTULO II MATERIALES Y METODOS

2.1. Materiales.

2.1.1. Materia prima.

La linaza importada de Canadá fue adquirida en el comercio local. Para ello se seleccionaron semillas empacadas y distribuidas por “Empacadora Pico Bolívar, C.A.” en Ejido edo., Mérida. Lote: DM010904. El empaque de origen eran bolsas de plástico transparentes, termoselladas, conteniendo 450 gramos de peso neto en cada una.

La linaza nacional fue adquirida directamente de su productor. Se trabajó con 2 cosechas de esta linaza, ya que debido al resultado obtenido en los análisis preliminares realizados a la primera cosecha, se decidió descartar su utilización dentro del diseño experimental. El cultivo se realizó en el sector “El Morro” de la ciudad de Mérida (Edo. Mérida). Normalmente la cosecha se realiza durante los meses de abril y mayo, y posteriormente son empacadas artesanalmente en bolsas de lona con capacidad máxima de 15 kg.

2.1.2. Equipos y reactivos.

Los análisis microbiológicos y fisicoquímicos se llevaron a cabo en los laboratorios de Microbiología de Alimentos, Análisis de Alimentos, y Desarrollo de Productos de la Universidad Simón Bolívar sede Sartenejas, Caracas. El perfil de ácidos grasos se realizó en el Laboratorio de Biotecnología (Laboratorio de Soporte Científico) de Cervecería Polar, Centro Tecnológico Polar, Caracas. La determinación de minerales se realizó en el Laboratorio de

41 Desechos Tóxicos de la Universidad Simón Bolívar. Los reactivos utilizados serán descritos en cada una de las metodologías correspondientes. 2.2. Procedimientos experimentales.

2.2.1. Muestreo de las semillas.

Se siguió la norma Venezolana para el muestreo de cereales, leguminosas, oleaginosas y productos derivados (COVENIN 1982). El tamaño inicial del sublote para ambos tipos de semilla fue de aproximadamente 12 kg, y el de la muestra final fue de 3 kg. Se conservó una muestra testigo de 1 kg. para cada tipo de semilla. El procedimiento de muestreo se realizó en condiciones asépticas como requerimiento para su posterior análisis microbiológico. Las muestras se almacenaron en recipientes de plástico, con cierre hermético, previamente esterilizados (COVENIN 1982, 1989a), y de color oscuro para evitar posibles cambios en la composición de los ácidos grasos de la semilla a consecuencia de la luz. Las submuestras se almacenaron en refrigeración hasta su análisis (Oomah y Mazza 1998; Flax Council of Canada 1999). En la Fig. 2.1. se presenta un esquema simplificado del proceso de muestreo de las semillas. 2.2.2. Análisis microbiológico.

Para la selección de los análisis microbiológicos a realizar se tomaron en consideración las características intrínsecas de la linaza, sus condiciones de transporte, almacenamiento y manipulación, y la ausencia de estudios previos y/o antecedentes microbiológicos (Adams y Moss 2000). De acuerdo a lo anterior, se determinaron coliformes totales, mohos y levaduras, Staphylococcus aureus, y microorganismos productores de esporas de los géneros Bacillus (aerobios) y Clostridium (anaerobios). Todos los análisis se realizaron por triplicado. Para la expresión de los resultados se utilizaron las reglas para el contaje de colonias de la American Public Health Association (APHA 1992), y las Normas COVENIN 1292-89 y 1644-93 (COVENIN 1989b, 1993a).

42

Linaza Importada

Linaza Nacional

26 Bolsas de 450 g

Saco de 12 kg

↓ De cada bolsa se tomaron

↓ Se tomaron semillas de

aproximadamente 160 g

Muestras primarias

diferentes partes del saco

↓

↓

Muestra total: 3 kg

Muestra total: 3 kg

Muestras de laboratorio

↓

↓ Análisis Microbiológico ↓ Remoción de impurezas

↓

↓ Metodología Experimental

Figura 2.1. Esquema de muestreo de las semillas de linaza.

2.2.2.1. Preparación de la muestra. 

Para las determinaciones de coliformes totales, mohos y levaduras, y Staphylococcus aureus se pesaron 11 g de cada variedad de semillas en bolsas de polietileno tipo ziplock y se adicionaron 99 ml de solución de agua peptonada al 0,1% (HiMedia). Para su homogeneización se empleó el stomacher (LAB-BLENDER 400) por 30 seg. Esta mezcla se consideró como la dilución 10-1, a partir de la cual se prepararon las diluciones posteriores correspondientes a cada análisis, utilizando también solución de agua peptonada al 0,1%.



Para la determinación de esporas aerobias y anaerobias, se siguió el procedimiento indicado en la Norma COVENIN 2499 (1988), que establece una cocción de la dilución madre de muestra (Dilución 10-1 preparada como se indicó anteriormente), a 94ºC por 15

43 min, con la finalidad de eliminar posibles células vegetativas. Se disminuyó la cantidad de muestra pesada que indica la norma (50g), hasta 11g por razones operacionales debidas a la naturaleza mucilaginosa de la linaza. Se pesó una muestra adicional que se utilizó para conocer y controlar la temperatura de la dilución durante el proceso de cocción, el cual se realizó en un baño térmico. Posteriormente se continuó con la metodología específica de acuerdo a cada género a estudiar. 2.2.2.2. Coliformes totales y fecales.

Se utilizó la técnica de determinación del numero mas probable (NMP) (COVENIN 1996) con baterías de 3 tubos por cada dilución (10-1, 10-2, 10-3). Para los coliformes totales se utilizaron los caldos Lauril Sulfato (Hi-Media) y Bilis Verde Brillante (Merck). Para los coliformes fecales se empleó el Caldo EC (Merck). Los tubos se incubaron a 35ºC (totales) y a 44,5ºC (fecales) por 24-48 h. La aparición de gas en el tubo de Durham indicó la presencia de los microorganismos investigados. 2.2.2.3. Mohos y levaduras.

Se empleó Agar Papa Dextrosa o PDA (Merck), previa adición de ácido tartárico (14ml/lt), y utilizando la técnica de siembra en profundidad para las diluciones 10-1 y 10-2. El periodo de incubación fue de 5 días a 28ºC (Merck 1994). 2.2.2.4. Staphylococcus aureus.

Se utilizó agar Baird Parker BP (BBL™), adicionado de solución de yema de huevo al 40% y telurito de potasio al 3,5%, con siembra en superficie o por agotamiento con las diluciones 10-1 y 10-2. El periodo de incubación fue de 24-48 h, a 35ºC. Las colonias negras, redondas, brillantes, rodeadas de un halo claro se consideraron colonias presuntivas. Para confirmarlas se tomaron dichas colonias presuntivas y se inocularon por separado en caldo cerebro corazón (Merck) a 35ºC por 24 h para su enriquecimiento. Posteriormente se tomó 0,1 ml de este caldo y se colocó en tubos que contienen 0,3 ml de solución plasma de conejo (Merck) con la finalidad de determinar la capacidad coagulasa positiva característica del S. aureus; los tubos

44 se incubaron a 35ºC por 4-6 h, o hasta por un máximo de 24 h. La observación de coágulos se consideró como confirmación de la presencia de S. aureus (COVENIN 1989b; Merck 1994; Adams y Moss 2000). 2.2.2.5. Microorganismos esporulados aerobios.

Se utilizó Agar Dextrosa Peptona de Caseína (Merck), el cual contiene indicador púrpura de bromocresol que permite observar fácilmente las colonias que tienen la propiedad de metabolizar la dextrosa, provocando que el medio cambie a color amarillo. Aun cuando la técnica de siembra recomendada para esta metodología es la de agotamiento, se utilizó la técnica de siembra en profundidad en placas, ya que la consistencia mucilaginosa de la linaza dificultaba la aplicación de la siembra en superficie. El periodo de incubación fue de 24-72 h a 35ºC. Se sembraron las diluciones 10-1, 10-2 y 10 -3. Se consideraron colonias típicas aquellas con borde liso, 2-3 mm de diámetro, centro opaco, y rodeadas por un halo amarillo (Merck 1994). A dichas colonias se les realizó un frotis para su observación en el microscopio, además de tinción Gram para observar sus características morfológicas. 2.2.2.6. Recuento presuntivo de Bacillus cereus.

Se utilizó agar Yema de huevo Polimixina Rojo Fenol, y la siembra por agotamiento de las diluciones 10-1 y 10 -2 en dos fracciones de 0,3 y una de 0,4 ml, con un periodo de incubación de 24 h a 37ºC. Las colonias presuntivas de B. cereus en este agar son grandes, secas y rugosas, sobre un fondo nítido de color rosado intenso a púrpura, rodeadas por un halo de precipitado blanco y denso formado por la degradación de la lecitina del medio, característica de este microorganismo. La flora de acompañamiento que suele estar presente junto a este microorganismo, y que no es inhibida por la polimixina, produce el viraje del indicador de color rojo a amarillo. La presencia de B. cereus se confirmó posteriormente con una tinción Gram para observar sus características morfológicas, y con las siguientes pruebas bioquímicas: degradación anaeróbica de la D(+)glucosa (utilizando caldo VP modificado para B. cereus), licuefacción de la gelatina (gelatina nutritiva), reducción de nitratos a nitritos (caldo nitrato), hidrólisis del almidón (agar almidón), y peptonización del medio leche tornasol (COVENIN 1993a; Merck 1994).

45

2.2.2.7. Microorganismos esporulados anaerobios.

Se utilizaron los medios Reinforced Clostridial Agar RCA (BBL™) con polimixina B (0,02g/lt), para la enumeración del contenido total de microorganismos anaerobios y facultativos, y el agar Triptona Sulfito Neomicina TSN (Merck), especifico para la detección y enumeración de Clostridium perfringens. La siembra y cultivo de ambos medios se realizó en tubos planos o de Miller-Pricket y bajo condiciones anaerobias, para lo cual se utilizó una jarra de anaerobiosis tipo Gas-Pack. Para la siembra en agar RCA se utilizaron las diluciones 10-1 y 10-3 con incubación de 7 días a 35ºC. Se enumeraron las colonias con coloración crema o amarillo pálido. El agar TSN con las diluciones 10-1 y 10-2, fue incubado por 24-48 h a 35ºC, siendo las colonias presuntivas de C. perfringens de color negro. Posteriormente para confirmar o descartar su presencia, se realizaron pruebas bioquímicas, previa recuperación de las colonias presuntivas tomadas del agar TSN en caldo tioglicolato (Merck) por 24 h a 37ºC (COVENIN 1993b; Merck 1994). A las colonias obtenidas en ambos medios, se les realizó un frotis y tinción Gram. 2.2.2.8. Pruebas bioquímicas para C. perfringens.

2.2.2.8.1. Nitrato-motilidad.

Se utilizó agar del mismo nombre, con técnica de siembra por punción y fue incubado por 24 h a 35ºC. El cambio de color del medio a naranja o rojo se consideró indicador de la reducción de nitratos a nitritos (COVENIN 1993b; Adams y Moss 2000). 2.2.2.8.2. Licuefacción de la gelatina/fermentación de lactosa.

Se utilizó agar lactosa-gelatina y se incubó a 35ºC por 24-48 h. El cambio del medio a color amarillo se consideró indicador de la fermentación de la lactosa (COVENIN 1993b; Adams y Moss 2000).

46 2.2.3. Limpieza de la muestra.

Una vez concluido el análisis microbiológico se procedió a la limpieza manual de la muestra de linaza nacional la cual contenía gran cantidad de impurezas como ramas, hojas, restos de cápsulas y pequeñas piedras, para evitar posibles interferencias en los análisis fisicoquímicos. Las impurezas presentes se originan como resultado de la cosecha manual y el secado solar artesanal, a diferencia de la muestra importada, cuya cosecha y secado son mecánicos. La linaza canadiense no presentaba impurezas visibles por lo que se omitió este paso de limpieza. 2.2.4. Análisis proximal.

2.2.4.1. Humedad.

Se utilizó el método AOAC 925.40 (1990) para la determinación de humedad en oleaginosas y productos de oleaginosas, que consiste en secar 2g de muestra a peso constante a 95-100ºC a una presión ≤ 100 mmHg, para lo cual se utilizó una estufa de vacío NAPCO modelo 5B. 2.2.4.2. Grasa.

Se utilizó el método de extracción semicontinua en equipo Soxhlet (COVENIN 1981a), empleando hexano grado técnico como solvente, con un tiempo de extracción de 6 h. Una vez desgrasada la muestra en el extractor Soxhlet, se dejó a temperatura ambiente hasta la completa evaporación del solvente para su posterior análisis (Guerra et al. 2005). 2.2.4.3. Proteínas.

Se determinó el porcentaje de nitrógeno (N) por el método de Kjeldahl, según la norma venezolana COVENIN (1980) y el método oficial AOCS Ba 4e-93 (AOCS 1998a), empleando un aparato de digestión y destilación Macro-Kjeldahl marca Labconco. Se utilizó la linaza previamente desgrasada (ver 2.2.4.2.). Para convertir el porcentaje de nitrógeno (N) en porcentaje de proteínas se utilizó el factor 6,25xN (AOCS 1998a; Daun et al. 2003; Morris 2007).

47 2.2.4.4. Proteínas solubles.

Se utilizó el método de Biuret (Chang 1998; Guerra et al. 2005). En un tubo de ensayo se añadió 1 ml del agua de remojo de las semillas y 4 ml del reactivo de Biuret (se disolvieron 1,5 g de CuSO4.5H2O y 6 g de NaKC4H4O6.4H2O en 500 ml de agua, se mezclaron con 300 ml de NaOH al 10% y se enrasó a 1000 ml con agua destilada), se agitó con el vortex y se dejó en reposo por 30 min, para luego leer la absorbancia a 540 nm, contra un blanco de reactivo (4 ml del reactivo de Biuret, 1 ml de agua destilada). La curva patrón de proteínas se preparó a partir de una solución madre de albúmina de suero bovino (BSA) 10 mg/ml. La concentración de proteínas en la muestra se obtuvo por regresión lineal de la curva concentración vs absorbancia del patrón. 2.2.4.5. Cenizas.

Las cenizas, o fracción mineral, se obtuvieron mediante la incineración completa del material orgánico de la muestra a 500ºC (COVENIN 1981b). La muestra se carbonizó primero en planchas de calentamiento, por un periodo de aproximadamente 8h, incrementando gradualmente la temperatura. Se completó la incineración de la muestra utilizando un mechero Bunsen para completar la carbonización, finalizando el proceso en la mufla Memmert, donde permaneció toda la noche a la temperatura antes mencionada (Guerra et al. 2005). 2.2.4.6. Minerales.

A partir del residuo de la determinación de cenizas se preparó una solución ácida según la metodología propuesta por Guerra et al. (2005). Todo el material utilizado para la preparación de las soluciones fue previamente lavado y remojado en HNO3 al 5% (12 h). En la solución de cenizas se determinó el contenido de sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, cinc, hierro, cobre, manganeso, fósforo y selenio utilizando el método de emisión atómica con plasma acoplado inducido (ICP), en un equipo marca GBC modelo Integra XL 2001. Las condiciones de trabajo del equipo fueron: Flujo de argón: 0,5 lt/min; altura de la fuente: 6mm; plasma: 12,0 lt/min; gas auxiliar: 0,5 lt/min. Las longitudes de onda, variaron según el elemento a determinar, como se indica a continuación en la Tabla 2.1.

48

Tabla 2.1. Longitudes de onda utilizadas en la determinación de minerales por ICP. Elemento Longitud de Onda (nm) Elemento Longitud de Onda (nm) Ca

422, 7

Mn

260,6

Cr

267,7

Na

589,6

Cu

327,4

P

213,6

Fe

372,0

Se

196,0

K

766,5

Zn

213,9

Mg

285,2

2.2.4.7. Fibra dietaria.

Se determinó de acuerdo al método AOAC 985.29 (1997), utilizando el kit de fibra TDF-100A (Sigma). La muestra previamente desgrasada (ver 2.2.4.2.) y deshidratada en condiciones de vacío (70ºC, sobre la noche), se molturó y tamizó hasta un tamaño de partícula de 0,3-0,5 mm (35-50 msh ASTM), y se mantuvo en un desecador hasta su análisis. En cada crisol filtrante, previamente lavado y tarado, se pesaron 0,5g de de celite (Sigma) y se colocaron en la estufa a 130ºC hasta peso constante; este peso se denominó “W1” (peso del crisol + celite). Se utilizaron dos crisoles por muestra, uno para filtrar la fibra insoluble y otro para la fibra soluble. Por cuadriplicado se pesó 1 gramo de la muestra preparada en fiolas con tapa; adicionalmente, se identificaron otras dos fiolas vacías como blancos I y II (blancos de muestra). Se añadieron a todas las fiolas 50 ml de bufer fosfato 0,08M pH 6,0, y 100 µl de αamilasa termoestable; se agitaron suavemente, se taparon e incubaron en un baño de agua hirviendo (T ≈ 98ºC), por 15 min contados a partir del momento en que el contenido de las fiolas alcanzó esta temperatura, tomando la precaución de agitar suavemente cada 5 min. Transcurrido el tiempo, las fiolas se enfriaron a temperatura ambiente (T ≈ 25ºC). Se ajustó el pH de todas las fiolas a 7,5 ± 0,2 mediante la adición de NaOH 0,275N (≈ 10 ml), para luego añadir 100 µl de solución de Proteasa (50 mg/ml en bufer fosfato) recién preparada, a cada fiola; se taparon e incubaron en baño de agua a 60ºC, con agitación continua, por 30 min contados a partir de que el interior de las fiolas alcanzó dicha temperatura. Una vez que las fiolas alcanzaron de nuevo la temperatura ambiente se ajustó el pH de las soluciones hasta 4,0-

49 4,6 con HCl 0,325M (≈ 10 ml). A cada fiola se le añadieron 100 µl de amiloglucosidasa, se taparon e incubaron en baño de agua a 60ºC, con agitación continua, por 30 min, a partir de que el interior de las fiolas alcanzó dicha temperatura. Transcurrido el tiempo se comenzó con el proceso de separación de la fibra insoluble. Cuantitativamente se transfirió el contenido de las fiolas a sus respectivos crisoles (previamente mojados con etanol al 78% e identificados como fibra insoluble). Una vez finalizada la filtración se lavó el residuo con 2 porciones de 10 ml de agua destilada. Se separó el filtrado (incluyendo las aguas de lavado), y se le añadieron 4 volúmenes de etanol al 95%. Se dejó en reposo a temperatura ambiente durante la noche para permitir la completa precipitación de la fibra soluble. Se lavaron nuevamente los crisoles que contienen el residuo insoluble, pero esta vez con 2 porciones de 10ml de acetona (el filtrado de este lavado se desechó sin mezclarlo con el filtrado anterior). Los crisoles se secaron en estufa de convección (105ºC) durante la noche para ser pesados al día siguiente; este peso (crisol + celite + residuo insoluble), se denominó W2I. Transcurrido el tiempo para la formación del precipitado de fibra soluble, se transfirió cuantitativamente la suspensión a sus respectivos crisoles, esta vez identificados como fibra soluble, realizando el paso previo de redistribución de la capa de celite con etanol al 78% como en la filtración anterior. Se lavó el residuo con 3 porciones de 20 ml de etanol al 78%, luego con 2 porciones de etanol al 95%, y finalmente con 2 porciones de 10 ml de acetona. Los crisoles se secaron con el residuo soluble en estufa de convección (105ºC), durante la noche y al día siguiente se pesaron (crisol + celite + residuo soluble), obteniéndose W2S. El filtrado resultante de estos lavados se desechó. Se determinó el contenido de proteínas de los residuos del blanco I y dos de los crisoles de la muestra: uno de la fibra soluble y el otro de la insoluble. Se utilizó el método de Kjeldahl (equipo digestor marca Büchi), y el factor de conversión 6,25N para el cálculo del contenido proteico. Los residuos de los crisoles restantes (blanco II, y los otros dos crisoles de la muestra con residuo de la fibra soluble e insoluble), se incineraron en la mufla a 525ºC por un tiempo mínimo de 5 horas; el peso (crisol + celite + cenizas) fue registrado como W3I ó W3S según fuese el caso.

Para realizar los cálculos se utilizaron las siguientes ecuaciones: RS = W2 S − W1

;

RI = W2 I − W1

 Ec. 2.1

50 C S = W3 S − W1

C I = W3 I − W1

;

B = RBlanco − PBlanco − ABlanco  R − PS − C S − B  % FS =  S  × 100 PM  

;

 R − PI − C I − B  % FI =  I  × 100 PM  

% FDT = % FS + % FI

 Ec. 2.2

 Ec. 2.3

 Ec. 2.4  Ec. 2.5

Donde: RS = Peso del residuo de fibra soluble (mg); RI = Peso del residuo de fibra insoluble (mg) C = Peso de las cenizas de los residuos (mg). El subíndice S o I se refiere a si proviene del residuo de la fibra soluble o insoluble respectivamente. B = Corrección del blanco de muestra (mg). RBlanco = Peso promedio del residuo de los blancos I y II (mg). P = Cantidad promedio de proteínas contenidas en el residuo (mg). El subíndice S, I o Blanco se refiere al origen del residuo (de la fibra soluble, insoluble, o del blanco, respectivamente). A = Peso promedio de las cenizas de los blancos I y II (mg). % FS = Porcentaje de Fibra Soluble de la muestra; % FI = Porcentaje de Fibra Insoluble de la muestra. PM = peso promedio de muestra (mg); promedio de los pesos de muestras del cuadriplicado. % FDT = Porcentaje de Fibra Dietaria Total de la muestra.

a) Se determinó el peso del residuo de la fibra soluble (Ec. 2.1). Los subíndices “S” (Soluble) o “I” (Insoluble) determinaron cuales datos utilizar en las ecuaciones, según provengan del residuo de la fibra soluble o de la fibra insoluble. b) Se determinó el peso de las cenizas del residuo de la fibra soluble (Ec. 2.2). c) Utilizando las Ecs. 2.1 y 2.2, se repitieron los cálculos a y b para los residuos de la fibra insoluble. d) Se determinó la corrección del blanco de muestra (Ec. 2.3), utilizando el promedio de los datos obtenidos de los blancos I y II. e) Se calcularon los porcentajes de fibra soluble e insoluble (Ec. 2.4).

51 f) Por último se calculó el porcentaje de fibra dietaria total de la muestra (Ec. 2.5) 2.2.5. Propiedades físicas.

2.2.5.1. Actividad de agua (aw). Se utilizó el equipo AquaLab modelo CX-2 de la Decagón Devices Inc., que utiliza la tecnología de “medición del punto de rocío por espejo-enfriado”. 2.2.5.2. Color.

Se empleó el colorímetro HunterLab modelo Miniscan D-65 45/0 LAV, que reporta valores según la escala de Color Hunter L, a y b, que permiten caracterizar a la muestra, ubicándola dentro de las coordenadas que ilustra la Fig. 2.2. El parámetro L mide el nivel de luminosidad desde el cero (0) o negro, hasta el cien (100) o blanco; los parámetros a y b, miden la intensidad de los colores rojo (+) o verde (-), y amarillo (+) o azul (-), respectivamente.

Figura 2.2. Escala de color Hunter L, a, b. Fuente: HunterLab (2007).

52 2.2.6. Análisis químicos.

2.2.6.1. Perfil de ácidos grasos.

Para la determinación del perfil de ácidos grasos de la linaza por cromatografía de gases se preparó un extracto lipídico y su derivatización. La fracción lipídica de la muestra se obtuvo por extracción con una mezcla de solventes cloroformo/metanol (Bligh y Dyer 1959), a temperatura ambiente y en oscuridad, utilizando linaza recién molida. Para evitar posibles cambios en los ácidos grasos, la evaporación del cloroformo se efectuó en estufa de convección forzada a 30ºC, protegiendo en todo momento al extracto de la luz. El aceite obtenido se colocó en viales ámbar, con inyección de nitrógeno para remover el oxígeno presente en el espacio de cabeza. Los viales fueron almacenados en refrigeración ≈10ºC) (T hasta el momento del análisis cromatográfico. Para derivatizar el extracto lipídico se utilizó el método descrito por Blau y Halket (1993) con algunas modificaciones, se pesaron entre 10 y 15 mg del extracto en un vial ámbar de reacción; se agregó 1 ml de solución de HCl 3N en metanol, 250 ml de 2,2-dimetoxi-propano y 1 ml de hexano. Se selló el vial utilizando una tapa con tamiz molecular que actúa como agente desecante (SUPELCO), y se colocó en un baño de agua con agitación a 70ºC por 1h. Finalizado el tiempo, se agitó el vial y se dejó en reposo por 10 min a temperatura ambiente para permitir la completa separación de las fases (Sanabria y Sangronis 2007). Para determinar el perfil de ácidos grasos se tomó una alícuota de 0,1 µl del espacio de cabeza del vial con la muestra derivatizada, utilizando una inyectadora graduada de vidrio silanizado para gases (Gastight). La alícuota se inyectó en un cromatógrafo de gases (GC System) marca HP modelo 6890 Series, bajo las siguientes condiciones: 

Columna: SP-2380 (SUPELCO), de 30m de largo x 0,25 mm de diámetro interno.



Fase estacionaria: 0,20 µm film de Poli(90% bis/ 10% cianopropilfenil) xiloxano.



Fase móvil (carrier): Helio, a un flujo de 20 cm/seg, y una temperatura de 150ºC.



Presión de operación: 9,6 Psi



Detector: Ionizador de llama (FID) 250ºC. Flujo de H2: 35 ml/min.; Flujo de aire: 350 ml/min.; Flujo de Makeup: 45 ml/min.



Inyector: On-column.

53 

Modo: Track oven, que implica que la temperatura de la columna va subiendo con la temperatura del horno.



Tasa de variación de la temperatura del horno: 4 ºC/min desde los 50ºC hasta 250ºC; 10ºC/min hasta 260ºC.



Analisis de datos: Software HP ChemStation Plus Rev. A.06.03 1999.



Estándar utilizado para la determinación: Grain fatty Acid methyl ester mix (FAMG) marca SUPELCO.

2.2.6.2. Mucílago.

Se utilizó el método propuesto por Bhatty (1993), según el cual la extracción se realiza añadiendo a la muestra agua hirviendo (T ≈ 98ºC), en una proporción semilla:agua igual a 1:20, y aplicando agitación magnética durante toda la noche, sin calentamiento adicional, lo que implica que la temperatura del agua decrece durante la agitación hasta alcanzar la temperatura ambiente. La agitación no debe ser muy fuerte para evitar la ruptura de la semilla y la consiguiente extracción de las proteínas solubles del interior de la semilla. Posteriormente se filtró el extracto utilizando lana de vidrio, procurando ejercer una leve fricción entre las semillas para ayudar a despegar el mucílago que aun pudiera encontrarse adherido a la semilla. La cuantificación del mucílago se realizó por gravimetría, previa evaporación del extracto en cápsulas previamente taradas. Se utilizó una estufa de vacío (NAPCO) a 60ºC para evitar la carbonización del mucílago. 2.2.6.3. Polifenoles totales.

Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu (Sánchez-Moreno et al. 1998, 1999a; Singleton et al. 1999). Como estándar para la determinación se utilizó ácido tánico (Sigma), a partir de una solución madre con concentración 1mg/ml, utilizando agua destilada como solvente. Para preparar el extracto se pesó 1g de muestra desgrasada (ver 2.2.4.2.) y tamizada a 80 msh, en una fiola con tapa y se añadieron 40 ml de metanol en HCl 2N al 0.8% (Reactivo “A”, se preparó añadiendo 8 ml de HCl 2N/ 1000 ml de solución metanol-agua 50%). La mezcla se colocó en plancha con agitación magnética por 1h a temperatura ambiente para luego centrifugarse a 3000 rpm durante 10 min. Se separó el sobrenadante por succión con una

54 pipeta y se recolectó en un matraz aforado de 100 ml. El extracto se mantuvo en la nevera y protegido de la luz. Al residuo de la primera extracción, se añadieron 40 ml de solución acetona-agua 70:30 (Reactivo “B”), y al igual que en la primera extracción se agitó por 1 h y se centrifugó, se separó el sobrenadante en el mismo matraz donde se encontraba el primer extracto, se enrasó con una mezcla 50:50 de HCl 2N al 0.8% en metanol:solución acetonaagua 70:30; es decir, una mezcla 50:50 de los reactivos A y B. Los extractos se prepararon el mismo día del análisis para evitar posibles subestimaciones en los resultados ocasionadas por la degradación de los compuestos durante el almacenamiento. Se preparó la curva patrón a partir de la solución madre de estándar, en un rango de 0,0 a 0,6 mg/ml. Se añadieron 0,5 ml del extracto preparado o de la muestra líquida, en matraces de 25 ml, identificados, se adicionaron 0,5 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu (Fluka), se agitó en vortex y se dejó reposar por 3 min. Posteriormente se añadieron 10 ml de solución saturada de Carbonato de Sodio (35g/100 ml), se enrasó con agua destilada, se agitó bien y se dejó reposar por 60 min, agitando periódicamente. Este mismo procedimiento se aplicó a cada punto de la curva patrón. Para las muestras líquidas, la determinación comenzó a partir de la adición del reactivo de Folin, sin necesidad de adicionar los reactivos A y B. Se leyó la absorbancia a 750 nm, utilizando un equipo Spectronic Milton Roy modelo 21D. La concentración de polifenoles totales en la muestra se determinó mediante regresión lineal de la curva patrón realizada. 2.2.6.4. Capacidad antioxidante. Se utilizó el método del radical DPPH* (2,2-difenil-1-picril-hidracil) (Sanchez-Moreno et al. 1998). Los extractos de las semillas se prepararon siguiendo la metodología empleada en la determinación de polifenoles totales (2.2.6.3.). Las muestras líquidas se utilizaron sin modificaciones físicas o químicas previas. La solución de DPPH (Sigma) utilizada para el análisis (0,025 g/lt en metanol de alta pureza) se mantuvo en la nevera y a resguardo de la luz mientras se inició el análisis y debió prepararse fresca cada vez que se realizó la metodología.

En la cubeta del espectrofotómetro se colocaron 3,9 ml de la solución metanólica de DPPH y 0,1 ml del extracto o de muestra líquida, se homogeneizó e inmediatamente se comenzó la lectura de la absorbancia (λ = 515 nm), anotando también la lectura obtenida para el tiempo

55 cero, y a intervalos de 5 min hasta que se alcanzó el equilibrio. El espectrofotómetro utilizado fue el Spectronic Milton Roy modelo 21D. Este ensayo se realizó por triplicado. Se debe analizar la muestra líquida o extracto de muestra 4 veces, a diferentes concentraciones; en este caso se utilizó la muestra sin diluir, y con diluciones 1:5, 1:8, y 1:10 en metanol. El parámetro Eficiencia Antirradical (AE) se determinó mediante la ecuación 2.6: AE =

1 EC 50 ⋅ TEC 50

 Ec. 2.6

Donde: EC50: Concentración de antioxidante necesario para disminuir la concentración inicial en 50%. TEC50: tiempo necesario para alcanzar la EC50.

Los cálculos de los parámetros EC50 y TEC50 se realizaron con los programas Excel XP (Microsoft) y StatGraphics Centurión (Statpoint Technologies Inc. 2006), aplicando regresión simple a las curvas obtenidas de absorbancia vs concentración de DPPH, % remanente de DPPH vs concentración de muestra, y tiempo de reacción vs concentración de muestra. 2.2.6.5. Ácido cianhídrico (HCN).

Se utilizó el método propuesto por Bradbury et al. (1994) con algunas modificaciones. Para la extracción ácida a partir de la muestra sólida se pesaron 2 g de muestra, se añadieron 40 ml de H2SO4 0,1M, se colocaron en el desintegrador de tejidos (Polytron modelo PT3100), por 2-3 min, para luego centrifugar a 3500 rpm por 15 min y separar el extracto para su análisis. Se colocaron 2 ml del extracto preparado (o de la muestra líquida) en un tubo de ensayo con tapa, y 2 ml de H2SO4 4M, y se llevaron a un baño en ebullición (T ≈ 98ºC) por 50 min . Luego, sin destapar el tubo, se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Una vez frío el contenido del tubo, se añadieron 5 ml de NaOH 3,6M, se agitó suavemente y se dejó en reposo por 5-10 min, para luego filtrar esta solución en caso necesario. Se preparó la solución patrón de la curva de calibración, disolviendo 37,5 mg de KCN (previamente deshidratado en estufa de convección por 2 h a 100ºC), en NaOH 0,2M enrasando a 500 ml. Esta solución patrón es estable por 2 meses si se almacena a temperaturas de al menos 4ºC. Para la curva de calibración, se diluyeron cantidades de solución stock hasta 10 ml con NaOH 0,2M (ver Tabla 2.2.).

56

Tabla 2.2. Preparación de la curva patrón de cianuro de potasio (KCN).

Blanco

ml de solución Stock de KCN 0

µg KCN / 10 ml de solución coloreada 0

1

0,2

1,5

2

0,4

3

3

0,8

6

4

1,2

9

5

1,6

12

Tubo

En tubos de ensayo debidamente identificados se añadieron 7 ml de buffer citrato (pH 5,0), 1,0 ml del extracto hidrolizado-alcalinizado o de la curva de calibración, y 0,4 ml de solución de Cloramina-T al 0,5% (solución 0,5% p/v en agua destilada), se dejaron reposar a temperatura ambiente por 5 min, y se añadió 1,6 ml de reactivo de König (preparado mediante la adición de 40 ml de piridina a 1,0 g de ácido barbitúrico disuelto en agua destilada, y enrasado a 200 ml con agua destilada). Se agitaron los tubos de ensayo con el vortex, y se dejaron reposar a temperatura ambiente por 60 min para el desarrollo del color. Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro (Spectronic Milton Roy modelo 21D) a 583 nm, utilizando el tubo que no contiene muestra ni patrón como blanco. A partir de la gráfica obtenida con los datos de la absorbancia vs concentración, se determinó la cantidad [µg] de KCN presente en los 10 ml de solución coloreada analizados (Y). Para calcular la cantidad equivalente de HCN presente en la muestra analizada se utilizó la siguiente ecuación:

HCN = 1,86615

Y ×V W

[=]

mg kg de muestra

Donde: Y = µg KCN/ 10 ml de solución coloreada. V = volumen [ml] de ácido en los que se desintegra la muestra (40 ml). W = peso de muestra [g] analizada.

 Ec. 2.7

57 2.2.7. Procesamientos caseros aplicados a la linaza.

Se aplicaron seis de los procesamientos caseros más comunes empleados en nuestro país: tostado; remojo de la semilla entera en agua caliente o fría; cocción; o remojo de la semilla molida en agua caliente y fría (Fig. 2.3.). Los parámetros de los procesamientos se fijaron de acuerdo a las condiciones generalmente utilizadas durante su preparación casera. Para la molienda se utilizó un ayudante de cocina (Oster).

Semilla entera

Semilla molida



Tostado



Remojo



Cocción



Remojo



Agua Fría



Agua Caliente



Agua Fría



Agua Caliente

Figura 2.3. Procesamientos caseros aplicados a las semillas de linaza.

2.2.7.1. Tostado. Se extendió la semilla entera de manera uniforme sobre una bandeja de metal, formando una capa delgada, y se colocó en una estufa de convección (Marca Memmert) precalentada a 180ºC, por un espacio de 25 min.

2.2.7.2. Cocción. Se cocinaron las semillas enteras en agua destilada por 5 min, contados a partir del momento en que se inició la ebullición. Se utilizó una proporción semilla/agua (p/v) = 1/8. Una vez concluida la cocción, se procedió al filtrado de la mezcla (utilizando un colador casero), para separar ambas partes para su posterior análisis.

58

2.2.7.3. Remojo.

Se realizaron en total 4 condiciones diferentes de remojo, para lo cual se combinaron los dos factores considerados: la condición de las semillas (enteras o molidas), y la temperatura del agua de remojo (en caliente, adicionando agua destilada en ebullición ≈ 98ºC, y en frío usando agua destilada, a temperatura ambiente ≈ 25ºC). Se utilizó las misma proporción semilla/agua que para la cocción (1/8 p/v). Las semillas de linaza se dejaron en remojo durante la noche (≈ 12 h). Finalizado el tiempo de remojo, se filtraron las muestras a fin de separar el agua y las semillas para su posterior análisis individual. Para la semilla entera se utilizó un colador casero, mientras que en el caso de las semillas molidas, el filtrado se realizó utilizando un colador tradicional de café (de tela). 2.2.8. Diseño experimental aplicado a los procesamientos.

Con la finalidad de evaluar si existe o no, una influencia estadísticamente significativa del tipo de linaza y de los procesamientos caseros utilizados sobre ciertos constituyentes, tanto en la semilla como en el extracto, se aplicó un diseño experimental bifactorial (2 x 6) completamente aleatorio (Box et al. 2006), formulando las siguientes hipótesis de trabajo:



H0: La media de los constituyentes analizados no varía significativamente con el tipo de semilla ni con los tratamientos aplicados.



H1: Al menos uno de los tratamientos o de los tipos se semilla ocasiona variación significativa en los constituyentes analizados.

El diseño experimental se analizó utilizando el paquete estadístico Statgraphics Plus 5.1 (StatPoint Technologies, Inc. 2001). La hoja de trabajo generada por este software se presenta en el Anexo 1.

59 2.2.9. Análisis estadístico de los resultados.

2.2.9.1. Prueba t de dos muestras independientes.

Para comparar los resultados experimentales obtenidos de ambas muestras de linaza analizadas y determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre la composición de la semilla nacional y la importada, se plantearon las siguientes hipótesis de trabajo: 

H0: La composición de la linaza nacional es igual a la de la linaza importada analizada (µ1 = µ2).



H1: La composición de la linaza nacional difiere significativamente de la composición de la linaza importada analizada (µ1 ≠ µ2).

El número de réplicas realizadas para cada uno de los análisis se fijó en 5, de tal manera que en la curva característica de operación de la prueba t de dos lados, en un nivel de significación α = 0,05 y utilizando un parámetro establecido para d = 2,0, el error tipo II (β o probabilidad de aceptación de H0 siendo falsa) sea aproximadamente igual a 0,1 (Box et al. 2006). Se analizaron los resultados individuales en base seca de los quintuplicados de cada uno de los análisis, utilizando el paquete estadístico Minitab 15 (Minitab Inc. 2009), con α = 0,05, previa determinación de la normalidad de los datos utilizando la prueba de Anderson-Darling y la homogeneidad de varianza mediante el valor de F o del estadístico de Levene según sea el caso determinado por la normalidad (Box et al. 2006). 2.2.9.2. ANOVA Multifactorial.

Para analizar los resultados obtenidos en el diseño experimental realizado (ver 2.2.8.), se aplicó un análisis de varianza ANOVA multifactorial (2 vías) utilizando el paquete estadístico Statgraphics Centurión XV versión 15.1.02 (StatPoint, Inc. 2006), con α = 0,05 y utilizando la prueba de rangos múltiples de Duncan como análisis Post-Hoc. La interacción significativa entre los factores fue evaluada con un análisis unifactorial o ANOVA de una vía, previa

60 transformación de los datos y comprobación de la homogeneidad de varianza utilizando la prueba de Barlett (Box et al. 2006).

CAPÍTULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Análisis microbiológico.

En la Tabla 3.1. se presentan los resultados del análisis microbiológico de las muestras de linaza estudiadas. El análisis microbiológico de la linaza nacional (primera cosecha), reveló una elevada carga microbiana, particularmente de microorganismos esporulados tanto aerobios como anaerobios.

Tabla 3.1. Resultado del análisis microbiológico para la materia prima criolla e importada. Microorganismo

Linaza Importada

Linaza Nacional Cosecha I

Cosecha II

Coliformes Totales (NMP/g)

0,05) en el contenido de HCN con respecto a la semilla sin procesar, es decir no se produjo reducción alguna. El calentamiento por debajo de los 100°C mantiene la actividad enzimática de las β-glucosidasas, las cuales se inactivan por encima de los 120°C (Yamashita et al. 2007), por esta razón, la cantidad de HCN perdida en la semilla nacional cocida puede atribuirse a la evaporación, si se asume que durante la cocción se producen rupturas en la estructura de la semilla que permitan el contacto entre las enzimas y los glucósidos cianógenos. En este caso, se asume que la cáscara de la semilla nacional es más delgada o más susceptible a la temperatura que la de la semilla importada que no permitió el contacto de las enzimas con el sustrato cianogénico. Morris (2007) reporta que la cocción destruye las enzimas responsables de metabolizar a los

83 glucósidos pero no reporta las condiciones en las que se realizó su estudio. Probablemente el tiempo de cocción sea también un factor influyente en la degradación de los glucósidos cianógenos.

Tabla 3.13. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente en las semillas de linaza importada y nacional procesadas (mg /100 g SS). Tipo de Procesamiento

Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría Remojo, semilla molida, agua caliente

8,72 ± 0,87 a

7,42 ± 1,63 a

8,85 ± 0,84 a

18,06 ± 1,80 b

Remojo, semilla entera, agua fría Remojo, semilla entera, agua caliente

15,84 ± 0,47 b, c

14,86 ± 0,95 c

7,41 ± 0,90 a

9,72 ± 2,84 a

Cocción

41,02 ± 0,89 d

29,21 ± 1,06 e

Tostado

23,70 ± 0,95 f

22,75 ± 0,75 f

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados, expresados en base seca. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos y las variedades de linaza analizadas.

En la variedad importada no se observaron diferencias significativas entre el remojo de la semilla molida en agua fría o caliente, y el remojo de la semilla entera en agua caliente; en todos los casos se produjo una disminución de más del 77% del HCN. Por su parte, para la semilla nacional molida y remojada se produjo una disminución del 80,28% (en agua fría) y 51,99% (en agua caliente) del HCN; la diferencia observada entre el agua fría y agua caliente obedece a la actividad o inactividad de las enzimas según la temperatura de procesamiento (Yamashita et al. 2007). La disminución de la concentración en las semillas molidas remojadas puede atribuirse a que los glucósidos cianógenos o el HCN producido se solubiliza en los extractos. Estudios previos indican que durante el calentamiento, la semilla molida es capaz de retener mayor actividad enzimática que la semilla entera, lo cual es atribuido a que las β-glucosidasas responsables de la hidrólisis de los glucósidos cianógenos son mas efectivamente inactivadas en la semilla entera que en la semilla molida a causa de menor

84 pérdida de agua (Daun et al. 2003). Durante el remojo de la semilla entera en agua fría se produce una disminución cercana al 60% del HCN.

En la Tabla 3.14. se presenta el contenido de HCN en los extractos de remojo y cocción. El menor contenido de HCN lo presentan los extractos de la cocción, ya que la mayor parte de los cianógenos permanecen en la semilla (Tabla 3.13.). Por el contario, el extracto con la mayor concentración de HCN pertenece a las semillas molidas remojadas en agua caliente. En general se observa que los extractos provenientes del remojo en agua caliente presentan una mayor concentración de HCN con respecto a los extractos de remojo en agua fría, lo que podría sugerir que la temperatura exacerba en algún grado la reacción.

Tabla 3.14. Contenido de ácido cianhídrico en los extractos de remojo/cocción de las semillas de linaza (mg/ L de extracto). Tipo de Procesamiento

Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría Remojo, semilla molida, agua caliente

6,97 ± 0,15 a

6,85 ± 0,09 a

13,65 ± 0,33 b

21,74 ± 0,14 c

8,04 ± 0,01 a

8,98 ± 0,53 a, d

11,01 ± 0,11 b, d

8,36 ± 0,01 a, d

3,81 ± 0,06 e

2,24 ± 0,10 e

Remojo, semilla entera, agua fría Remojo, semilla entera, agua caliente Cocción

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos y las variedades de linaza analizadas.

Los resultados se corresponden con la disminución del HCN en la semilla (Tabla 3.13.), lo cual corrobora la hipótesis de que los glucósidos cianógenos se solubilizan en el agua de remojo. Aubourg et al. (2006) señalan que en el extracto acuoso de linaza están presentes diferentes tipos de glucósidos hidrosolubles, entre los cuales están la linamarina y la lotaustralina, ambos cianógenos. En países como Alemania, Estados Unidos, y el Reino Unido

85 el límite de toxicidad del HCN es de 10ppm (UNAM 2008). Según estas recomendaciones los extractos provenientes del remojo de la semilla molida en agua caliente no deberían ser consumidos sino desechados.

La Tabla 3.15. muestra el efecto de los procesamientos sobre el contenido de polifenoles en la semilla. Se observan diferencias significativas entre los procesamientos y las variedades de semillas. Con excepción de la cocción, la semilla nacional se vio menos afectada por los procesamientos que la semilla importada, en la cual ocurrieron las mayores reducciones del contenido de polifenoles. Los menores porcentajes de reducción se produjeron para ambas variedades de linaza durante el remojo de la semilla entera en agua fría, siendo del 6,63% para la semilla nacional y del 11,45% para la semilla importada. Durante el remojo de la semilla entera en agua caliente se observó una disminución hasta del 42% del contenido inicial de polifenoles, mientras que la cocción ocasionó pérdidas hasta del 47,35%. Xu y Chang (2008) determinaron que durante el remojo de caraotas negras (P. vulgaris L) por 16h se disminuía en un 52% el contenido de polifenoles totales, mientras que la cocción por 1h ocasionaba hasta 76,7% de pérdidas; dichas pérdidas se atribuyeron a la difusión de algunos compuestos polifenólicos en el agua de remojo. Ismail et al. (2004) también observaron pérdidas significativas en el contenido de polifenoles en vegetales como la espinaca (S. oleracea L.) y el repollo (B. oleracea), que van del 12% al 26% después de solo 1 minuto de cocción en agua hirviendo.

Durante el tostado de las semillas, se produjo la mayor reducción (70,38%) del contenido de polifenoles para las semillas de linaza importada, mientras que para la nacional no se determinaron diferencias significativas entre el tostado, la cocción o el remojo de la semilla molida en agua caliente. La disminución de la concentración de secoisolariciresinol durante el tostado a 150°C después de 20 min observada por Murkovic et al. (2004), pudiera explicar la reducción abrupta del contenido de polifenoles durante este procesamiento.

86 Tabla 3.15. Contenido de polifenoles en las semillas de linaza nacional e importada procesada (mg*/100g). Tipo de Procesamiento

Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría Remojo, semilla molida, agua caliente

580,91 ± 50,01 a

1049,18 ± 44,32b

560,02 ± 62,17 a

830,03 ± 51,19 c

Remojo, semilla entera, agua fría Remojo, semilla entera, agua caliente

1270,64 ± 76,74 d

1545,31 ± 98,00e

831,28 ± 107,74 c

1286,49 ± 94,77d

Cocción

917,3 ± 99,49 c

871,33 ± 79,28 c

Tostada

425,05 ± 10,36 f

819,52 ± 40,64 c

*

Expresados como mg equivalentes de ácido tánico. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados expresados en base seca. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos y las variedades de linaza analizadas.

En la Tabla 3.16. se presenta el contenido de polifenoles de los extractos de remojo y cocción. No se detectaron polifenoles en los extractos de remojo de las semillas enteras, ni en el agua de cocción de la linaza importada. No se determinaron diferencias significativas entre ambos tipos de semilla pero si entre los procesamientos. La mayor concentración de polifenoles se detectó en los extractos de remojo de la semilla molida en agua fría. No se determinaron diferencias significativas entre la cocción y el remojo de la semilla en agua caliente. Se observó que el contenido de polifenoles presente en los extractos fue bajo en comparación con el vino blanco (292 mg/L), que resultó tener el menor contenido de polifenoles de las muestras de vino y jugo de uva (292-1869 mg/L) analizadas por Sánchez-Moreno et al. (1999a).

Xu y Chang (2008) detectaron niveles significativos de polifenoles (hasta 2,77 mg/g) en las aguas de remojo y cocción de caraotas negras; asimismo observaron que la suma de los polifenoles en el grano procesado y en el agua de remojo era menor al contenido inicial de polifenoles del grano sin procesar, lo que indica pérdida de los mismos. Aún cuando la naturaleza química de esta reducción no es completamente conocida, se atribuye a

87 transformaciones químicas como la descomposición de los polifenoles o la formación de compuestos complejos con proteínas (Jiménez-Monreal et al. 2009).

Tabla 3.16. Contenido de polifenoles en los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza (mg*/ L de extracto). Semilla Semilla Tipo de Procesamiento Importada Nacional a Remojo, semilla molida, 93,46 ± 9,12 81,63 ± 7,91 a, b agua fría Remojo, semilla molida, 67,44 ± 4,61 b, c 57,31 ± 1,00 c agua caliente Remojo, semilla entera, agua fría Remojo, semilla entera, agua caliente

ND

ND

ND

ND

Cocción

ND

48,71 ± 9,30 c

*

Expresados como mg equivalentes de ácido tánico. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos. ND: No detectado.

En la Tabla 3.17. se observa cómo se modificó la capacidad antioxidante de las semillas de linaza con los diferentes procesamientos aplicados. Se observó un aumento de la EC50 de la mayor parte de las muestras, lo cual significa una disminución en su poder antiradical. En la semilla importada, con excepción del proceso de cocción, la eficiencia antiradical no presentó variación significativa (p > 0,05) entre los procesamientos aplicados, pero si una considerable disminución (hasta del 65,38%) con respecto a la linaza sin procesar. Xu y Chang (2008) determinaron que la capacidad atrapadora de las caraotas negras disminuyó entre 6 y 8% después del remojo y del 17 al 44% durante la cocción; le atribuyen esta disminución al efecto acumulativo de diferentes factores como la solubilización de antioxidantes en el agua, la formación o ruptura de los mismos por efecto del calor (que resulta destructivo para ciertos compuestos antioxidantes), y la pérdida de sólidos durante los procesamientos.

Tabla 3.17. Capacidad antioxidante de las semillas de linaza procesadas. Semilla Importada

Semilla Nacional

Tipo de Procesamiento

EC50 (g* / g de DPPH·)

TEC50 (min)

EA (×10-3)

EC50 (g* / g de DPPH·)

TEC50 (min)

EA (×10-3)

Remojo, semilla molida, agua fría Remojo, semilla molida, agua caliente

7,99 ± 0,01 a

94,81 ± 2,23 a, b

1,32 ± 0,03 a

10,63 ± 0,22 b, c

114,16 ± 3,44 a, b

0,82 ± 0,02 a

11,18 ± 0,60 b, c

118, 14 ± 23,80 b

0,83 ± 0,02 a

7,25 ± 0,39 a

103,48 ± 8,42 a, b

1,36 ± 0,15 a

11,59 ± 0,81 c

111,57 ± 4,26 a, b

0,78 ± 0,02 a

7,49 ± 0,13 b

105,41 ± 0,05 a, b

1,28 ± 0,19 a

10,28 ± 0,82 b

95,23 ± 5,18 a, b

1,03 ± 0,14 a

4,85 ± 0,04 d

169,78 ± 8,79 c

1,22 ± 0,14 a

Cocción

1,63 ± 0,28 d

87,81 ± 0,93 a

7,22 ± 0,72 b

7,01 ± 0,04 a

90,30 ± 2,52 a, b

1,59 ± 0,02 a

Tostada

7,58 ± 0,38 a

100,91 ± 1,96 a, b

1,31 ± 0,09 a

5,75 ± 0,15 d

95,34 ± 2,50 a, b

1,85 ± 0,08 a

Remojo, semilla entera, agua fría Remojo, semilla entera, agua caliente

*

Gramos de muestra en base seca. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes en los mismos parámetros indican diferencias significativas entre el tipo de semilla y los procesamientos aplicados.

89 Durante la cocción de la semilla importada se observó un incremento del 220% de la EA con respecto a la semilla sin procesar. Efectos positivos como este, en el que la actividad antioxidante se ve incrementada durante los procesamientos térmicos han sido observados por diversos investigadores en té, tomates y maíz dulce (Jiratanan y Liu 2004, Xu y Chang 2008). Este efecto es atribuido a 2 causas: la formación de compuestos de Maillard como consecuencia del calor y la ruptura de compuestos fenólicos en otros con mayor actividad antioxidante. El hidroximetilfural es uno de los compuestos tipo Maillard generados cuya presencia se ha observado en ciruelas procesadas a 65 y 85°C, y que se degrada a temperaturas mayores a 160°C; la formación de compuestos fenólicos durante el proceso de calentamiento puede deberse a la disponibilidad de precursores de moléculas fenólicas por interconversión no enzimática por efectos de un factor externo como la temperatura (Soong y Barlow 2004). La EC50 y la EA de la linaza importada cocida es comparable a la de la cáscara de guayaba rosada (1,92 g SS/g DPPH y 7,00×10-3, respectivamente) (Jiménez-Escrig et al. 2001). La EA también es similar a la del pericarpio de mamón (7,32×10-3) (Padilla et al. 2008). La correlación entre el contenido de polifenoles de la linaza importada y la EC50 (R2 = 0,0075) o la EA (R2 = 0,0336) no fue significativa y fue muy baja.

Por su parte, en la semilla nacional, los procesamientos no afectaron la EA de la linaza. Un comportamiento similar observaron Jiratanan y Liu (2004), quienes no determinaron efectos significativos sobre la actividad antioxidante durante la cocción de remolacha (Beta vulgaris var. conditiva) a diferentes tiempos y temperaturas. Jiménez-Monreal et al. (2009) tampoco observaron variación significativa en la actividad antioxidante de vainitas (P. vulgaris, Savi.) después de la cocción por 21 min y el horneado a 200°C y 35 min. La EC50 de la linaza nacional tostada es comparable a la del pericarpio y la semilla de mamón (5,88 y 5,69 g/g DPPH, respectivamente), mientras que la EC50 de la linaza entera remojada es ligeramente menor a la del sorgo (12,44 g/g DPPH) (Padilla et al. 2008). La EA de la linaza nacional es ligeramente menor que la del sorgo (1,65×10-3) (Padilla et al. 2008). El TEC50 aunque disminuyó en algunos casos, en comparación a las semillas sin procesar, sigue clasificado como lento (> 30 min). En el caso de la semilla nacional, a pesar de no haberse obtenido una correlación significativa (R2 = 0,0003), se pudo observar que la disminución en el contenido de polifenoles ocasionó un efecto negativo sobre las EC50 de las muestras, pero no sobre su

90 eficiencia antiradical (R2 = 0,1927), lo que quizás si es debido al mayor contenido de polifenoles en esta variedad. Kähkönen et al. (1999) e Ismail et al. (2004) tampoco observaron relación alguna entre el contenido de polifenoles y la actividad antioxidante, concluyendo que la capacidad antioxidante no solo depende de los polifenoles sino de la interacción de los diversos componentes de cada alimento.

En la Tabla 3.18. se observa que el procesamiento afecta significativamente la capacidad antioxidante de los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza, obteniendo la mejor actividad antiradical los extractos de la cocción; sin embargo, la mejor eficiencia antiradical está presente en los extractos del remojo de la semilla entera en agua fría. Xu y Chang (2008) analizaron la capacidad antioxidante de las aguas de remojo y cocción de caraotas negras para confirmar su hipótesis sobre la solubilización de algunos compuestos fenólicos durante estos procesamientos, y determinaron una mayor actividad antioxidante en los extractos de la cocción que en los de remojo, lo cual hace suponer que la temperatura juega un papel importante en las reacciones de formación de los compuestos fenólicos producidos durante la aplicación de calor. No se observó relación entre el contenido de polifenoles de los extractos y su capacidad antioxidante, lo cual sugiere que sus propiedades antioxidantes se deben a la solubilización de otros compuestos no polifenólicos y/o a la sinergia de sus componentes. Como se mencionó anteriormente, Aubourg et al. (2006) señalan que en el extracto acuoso de linaza están presentes diferentes tipos de glucósidos hidrosolubles, lo cual de acuerdo con sus estudios, le confiere al agua ciertas propiedades antioxidantes. Estudios más profundos a la composición de los extractos acuosos de linaza permitirían conocer mejor a que se atribuyen sus propiedades antioxidantes. En comparación con la semilla, se observaron valores altos de la EC50, lo que indica que el poder antiradical de los extractos es menor. El TEC50 de las semillas enteras remojadas es menor que el del resto de los extractos, pero sigue clasificado como lento (TEC50 >30 min). Las EC50 de los extractos obtenidos a partir del remojo de la semilla molida en agua fría son comparables, aunque ligeramente menores que la del vino blanco (15,65 g/g DPPH) (Sánchez-Moreno et al. 1999b), mientras que la EA es comparable con la del ácido tánico (0,57×10-3) y la del DL-α-tocoferol (0,52×10-3), ambas clasificadas como de eficiencia baja (Sánchez-Moreno et al. 1998). Estos extractos de remojo de la semilla molida en agua fría presentaron el mayor contenido de polifenoles (Tabla 3.16.).

91

Tabla 3.18. Capacidad antioxidante de los extractos de remojo/cocción de las semillas de linaza. Tipo de Procesamiento Remojo, semilla molida, agua fría Remojo, semilla molida, agua caliente Remojo, semilla entera, agua fría Remojo, semilla entera, agua caliente Cocción *

Semilla Importada

Semilla Nacional

EC50 (g* / g de DPPH·) 14,06 ± 1,17 a, b

TEC50 (min)

EA (×10-3)

TEC50 (min)

EA (×10-3)

0,58 ± 0,03 a

EC50 (g* / g de DPPH·) 14,97 ± 1,36 b

122,58 ± 3,34 a, e

108,72 ± 1,37 a

0,62 ± 0,01 a

13,66 ± 0,27 c

133,24 ± 3,51 d, e

0,56 ± 0,02 a

9,34 ± 1,57 d, e

107,60 ± 5,69 a

1,01 ± 0,12 b

8,19 ± 0,55 d, e

55,86 ± 7,01 b, c

2,29 ± 0,02 c

13,13 ± 0,70 a, b

40,97 ± 3,27 b

1,89 ± 0,04 d

10,95 ± 0,27 a, e

55,55 ± 0,01 b, c

1,64 ± 0,04 d, e

21,26 ± 0,85 c

58,30 ± 0,46 c

0,81 ± 0,09 a, b

3,98 ± 0,24 f

148,80 ± 5,22 d

1,69 ± 0,16 d, e

6,11 ± 0,08 d, f

112,17 ± 0,63 a

1,46 ± 0,03 e

Gramos de muestra en base seca. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes en los mismos parámetros indican diferencias significativas entre el tipo de semilla y los procesamientos aplicados.

CAPÍTULO IV CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1. Conclusiones

El manejo de la cosecha y la posterior manipulación de la semilla de linaza afectan la calidad microbiológica de la semilla, lo cual se evidenció claramente en la variedad nacional.

Las variedades de linaza, nacional e importada, difieren en su composición proximal, con excepción del contenido de fibra dietaria. En ambas variedades destacó el alto contenido de grasa insaturada, fibra dietaria, proteínas y minerales como potasio, fósforo y magnesio, así como también un elevado contenido de ácido α-linolénico (ALA).

El contenido de polifenoles es mayor en la linaza nacional; sin embargo, en ambas variedades la eficacia antiradical está clasificada como media y con un tiempo de reacción lento. No se observó relación entre el contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante, lo que sugiere que otros compuestos presentes en la semilla, así como su sinergia, también contribuyen en dicha capacidad.

La aplicación de la cocción, el remojo de la semilla en agua fría o el remojo de la semilla en agua caliente fueron igualmente efectivos en la remoción de mucílago.

Los glucósidos cianógenos presentes en la semilla de linaza importada y nacional producen aproximadamente 40 mg/ 100g de HCN equivalente. De los procesamientos evaluados, el remojo de la semilla entera o molida permite reducir la mayor parte del contenido de glucósidos cianógenos presentes, lo cual hace suponer que estos compuestos están asociados a las capas externas de la semilla. El contenido de HCN presente en los extractos de remojo de

93 la semilla molida en agua caliente supera los límites de toxicidad establecidos en varios países por lo que no debería consumirse en esa forma.

El contenido de polifenoles se ve considerablemente afectado por los procesamientos que involucran calor, tales como el remojo en agua caliente, cocción, y tostado.

La cocción ocasionó un incremento significativo de la Eficiencia Antiradical de la semilla importada, mientras que el resto de los procesamientos aplicados no ocasionaron variación alguna en este parámetro, pero si una considerable disminución en comparación con la semilla sin procesar. Por el contrario, en la semilla nacional los procesamientos no afectaron significativamente la EA.

Durante el remojo y la cocción de la linaza, la mayor parte del mucílago, grasas y proteínas quedan adheridas a la semilla o formando parte de la torta remanente de linaza molida y solo una pequeña parte pasa al agua de remojo. Los extractos acuosos de linaza poseen entonces pocas propiedades funcionales en comparación con la ingesta de la semilla completa. La presencia de una baja pero significativa capacidad antioxidante en los extractos, a pesar de la ausencia de compuestos polifenólicos en algunos de ellos, sugiere la presencia de otros componentes hidrosolubles con propiedades antioxidantes.

En virtud de las modificaciones en la composición de la semilla obtenidas por los procesamientos aplicados, el índice que debe considerarse para evaluar la forma mas apropiada de consumo de linaza es el contenido de HCN equivalente. Por tal razón se recomienda la ingesta de la semilla recién molida con o sin remojo previo, sin ingerir el agua de remojo. 4.2. Recomendaciones

Dadas las propiedades nutricionales y como alimento funcional de la semilla de linaza, se recomienda promover el cultivo de linaza en el país para disminuir, aunque sea parcialmente, la dependencia de la importación de la semilla canadiense.

94 Se deben realizar evaluaciones adicionales para conocer mas sobre la composición de la semilla, como por ejemplo, contenido de vitaminas, taninos, inhibidores de tripsina, flavonoides y otros componentes cuya presencia ha sido descrita de manera imprecisa por diferentes autores. Adicionalmente, sería de interés profundizar los análisis de la fracción proteica y la fibra dietaria de linaza, cuyos estudios han sido relegados por los de otros constituyentes.

Es necesario analizar los extractos de remojo para detectar las sustancias polifenólicas y no polifenólicas presentes que le atribuyen actividad antioxidante. Conjuntamente, se deben utilizar métodos adicionales para evaluar la capacidad antioxidante de la linaza y tener un mejor conocimiento sobre sus propiedades antiradicales. Asimismo, se debe determinar la concentración de lignanos en la semilla nacional y evaluar su contribución a las propiedades antioxidantes.

Sería de interés realizar un estudio de estabilidad a la semilla tostada, la más usada a nivel industrial, con énfasis en la modificación de su perfil de ácidos grasos para observar los cambios producidos por este procesamiento.

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ANEXOS

Anexo 1. Hoja de diseño experimental.

Proteínas Solubles

DPPH

Polifenoles

HCN

Molida. Remojo en agua caliente Molida. Remojo en agua caliente Molida. Remojo en agua caliente Entera. Remojo en agua fría Cocción Entera. Remojo en agua caliente Molida. Remojo en agua fría Cocción Entera. Remojo en agua caliente Molida. Remojo en agua caliente Entera. Remojo en agua caliente Tostada Molida. Remojo en agua fría Entera. Remojo en agua fría Entera. Remojo en agua caliente Tostada Cocción Tostada Molida. Remojo en agua fría Entera. Remojo en agua fría Tostada Entera. Remojo en agua fría Cocción Molida. Remojo en agua fría

Mucílago

Nacional Importada Importada Nacional Importada Nacional Importada Importada Nacional Nacional Importada Nacional Nacional Importada Importada Nacional Nacional Importada Nacional Nacional Importada Importada Nacional Importada

Extracto DPPH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Polifenoles

Procesamiento

Grasa HCN

Tipo de Semilla

Mucílago

Corrida

Semillas

106

107 Anexo 2. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: Prueba t de dos muestras independientes. 

Color

(Parámetro L) Two-Sample T-Test and CI Sample 1 2

N 3 3

Mean 52,2000 40,4700

StDev 0,0200 0,0900

SE Mean 0,012 0,052

Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 11,7300 95% CI for difference: (11,5822; 11,8778) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 220,37

P-Value = 0,000

DF = 4

(Parámetro a) Two-Sample T-Test and CI Sample 1 2

N 3 3

Mean 5,3500 4,6800

StDev 0,0300 0,0300

SE Mean 0,017 0,017

Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,670000 95% CI for difference: (0,601991; 0,738009) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 27,35

P-Value = 0,000

DF = 4

P-Value = 0,000

DF = 4

(Parámetro b) Two-Sample T-Test and CI Sample 1 2

N 3 3

Mean 7,9800 4,8300

StDev 0,0300 0,0500

SE Mean 0,017 0,029

Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 3,15000 95% CI for difference: (3,05653; 3,24347) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 93,57



Proteínas

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla Criolla Importada

N 5 6

Inferior 0,0997850 0,0546820

Desv.Est. 0,178235 0,093261

Superior 0,616611 0,266814

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 3,65; valor p = 0,188

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 2,12; valor p = 0,179

108

T de dos muestras para Proteínas

Semilla Criolla Importada

N 5 6

Media 22,309 21,4678

Media del Error estándar 0,080 0,038

Desv.Est. 0,178 0,0933

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,8412 IC de 95% para la diferencia: (0,6527; 1,0298) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 10,09 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,1377



Valor P = 0,000

GL = 9

Grasas

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla Criolla Importada

N 5 6

Inferior 0,148084 0,195387

Desv.Est. 0,264505 0,333235

Superior 0,915068 0,953366

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,63; valor p = 0,675

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,00; valor p = 0,947

T de dos muestras para Grasa

Semilla Criolla Importada

N 5 6

Media 40,664 43,463

Desv.Est. 0,265 0,333

Media del Error estándar 0,12 0,14

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -2,800 IC de 95% para la diferencia: (-3,217; -2,382) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -15,18



Valor P = 0,000

Cenizas

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillas Criolla Importada

N 6 6

Inferior 0,0122588 0,0073070

Desv.Est. 0,0209075 0,0124622

Superior 0,0598153 0,0356537

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 2,81; valor p = 0,281

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,26; valor p = 0,287

GL = 9

109 T de dos muestras para Cenizas

Semillas Criolla Importada

N 6 6

Media 3,2158 3,2745

Desv.Est. 0,0209 0,0125

Media del Error estándar 0,0085 0,0051

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,05877 IC de 95% para la diferencia: (-0,08091; -0,03663) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -5,91 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0172



Valor P = 0,000

GL = 10

Fibra Dietaria Total

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillatipo Criolla Importada

N 3 3

Inferior 0,437529 0,396009

Desv.Est. 0,915892 0,828977

Superior 8,16630 7,39134

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,22; valor p = 0,901

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,01; valor p = 0,936

T de dos muestras para FibraTotal

Semillatipo Criolla Importada

N 3 3

Media 33,544 31,974

Desv.Est. 0,916 0,829

Media del Error estándar 0,53 0,48

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 1,570 IC de 95% para la diferencia: (-0,410; 3,551) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 2,20 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,8735



Valor P = 0,092

GL = 4

Fibra insoluble

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillatipo Criolla Importada

N 3 3

Inferior 0,066988 0,426282

Desv.Est. 0,140228 0,892348

Superior 1,25031 7,95637

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,02; valor p = 0,048

110

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,80; valor p = 0,422

T de dos muestras para F_Insoluble

Semillatipo Criolla Importada

N 3 3

Media 17,271 16,385

Desv.Est. 0,140 0,892

Media del Error estándar 0,081 0,52

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,886 IC de 95% para la diferencia: (-0,562; 2,334) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 1,70 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,6387



Valor P = 0,165

GL = 4

Fibra soluble

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillatipo Criolla Importada

N 3 3

Inferior 0,499516 0,086042

Desv.Est. 1,04565 0,18011

Superior 9,32326 1,60594

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 33,70; valor p = 0,058

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,88; valor p = 0,401

T de dos muestras para F_Soluble

Semillatipo Criolla Importada

N 3 3

Media 16,27 15,589

Desv.Est. 1,05 0,180

Media del Error estándar 0,60 0,10

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,684 IC de 95% para la diferencia: (-1,017; 2,385) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 1,12 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,7503



Valor P = 0,327

GL = 4

Mucílago

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares S_tipo Criolla Importada

N 5 5

Inferior 0,401460 0,362426

Desv.Est. 0,717083 0,647361

Superior 2,48078 2,23958

111 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,23; valor p = 0,848

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,18; valor p = 0,685

T de dos muestras para Mucilago

S_tipo Criolla Importada

N 5 5

Media 20,994 24,379

Media del Error estándar 0,32 0,29

Desv.Est. 0,717 0,647

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -3,385 IC de 95% para la diferencia: (-4,381; -2,389) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -7,84 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,6831



Valor P = 0,000

GL = 8

Minerales

(Sodio, Na) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla Criolla Importada

N 5 5

Inferior 6,37508 1,91591

Desv.Est. 11,3871 3,4222

Superior 39,3942 11,8392

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 11,07; valor p = 0,039

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 5,83; valor p = 0,042

T de dos muestras para Na

Semilla Criolla Importada

N 5 5

Media 46,6 55,75

Desv.Est. 11,4 3,42

Media del Error estándar 5,1 1,5

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -9,12 IC de 95% para la diferencia: (-23,89; 5,64) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -1,72

Valor P = 0,161

(Potasio, K)

GL = 4

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares

112 Semilla Criolla Importada

N 5 5

Inferior 14,5718 7,2639

Desv.Est. 26,0280 12,9746

Superior 90,0451 44,8863

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 4,02; valor p = 0,206

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,31; valor p = 0,285

T de dos muestras para K

Semilla Criolla Importada

N 5 5

Media 2227,4 2221,6

Desv.Est. 26,0 13,0

Media del Error estándar 12 5,8

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 5,8 IC de 95% para la diferencia: (-24,2; 35,8) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,44 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 20,5645

Valor P = 0,669

GL = 8

(Magnesio, Mg) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla Criolla Importada

N 5 5

Inferior 6,70136 3,78079

Desv.Est. 11,9699 6,7532

Superior 41,4104 23,3630

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 3,14; valor p = 0,293

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,39; valor p = 0,272

T de dos muestras para Mg

Semilla Criolla Importada

N 5 5

Media 388,2 390,64

Desv.Est. 12,0 6,75

Media del Error estándar 5,4 3,0

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -2,41 IC de 95% para la diferencia: (-16,59; 11,76) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -0,39 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 9,7181

Valor P = 0,705

GL = 8

113 (Calcio, Ca) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla Criolla Importada

N 5 5

Inferior 1,14313 2,35477

Desv.Est. 2,04185 4,20605

Superior 7,0639 14,5510

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,24; valor p = 0,190

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,78; valor p = 0,403

T de dos muestras para Ca

Semilla Criolla Importada

N 5 5

Media 239,51 239,39

Desv.Est. 2,04 4,21

Media del Error estándar 0,91 1,9

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,13 IC de 95% para la diferencia: (-4,70; 4,95) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,06 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 3,3061

Valor P = 0,953

GL = 8

(Cromo, Cr) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla Criolla Importada

N 3 5

Inferior 0,0303217 0,0517193

Desv.Est. 0,0634734 0,0923803

Superior 0,565942 0,319594

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,47; valor p = 0,691 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,46; valor p = 0,521

T de dos muestras para Cr

Semilla Criolla Importada

N 3 5

Media 0,2326 0,3150

Desv.Est. 0,0635 0,0924

Media del Error estándar 0,037 0,041

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,0824 IC de 95% para la diferencia: (-0,2322; 0,0675) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -1,35 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0839

Valor P = 0,227

GL = 6

114 (Zinc, Zn) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Inferior 0,204543 0,236233

Desv.Est. 0,365353 0,421956

Superior 1,26395 1,45978

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,75; valor p = 0,787

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,01; valor p = 0,933

T de dos muestras para Zn

Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Media 8,295 7,293

Desv.Est. 0,365 0,422

Media del Error estándar 0,16 0,19

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 1,002 IC de 95% para la diferencia: (0,427; 1,578) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 4,02 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,3947

Valor P = 0,004

GL = 8

(Hierro, Fe) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Inferior 0,649858 0,885360

Desv.Est. 1,16077 1,58142

Superior 4,01573 5,47099

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,54; valor p = 0,564

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,46; valor p = 0,515 T de dos muestras para Fe

Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Media 15,82 12,41

Desv.Est. 1,16 1,58

Media del Error estándar 0,52 0,71

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 3,407 IC de 95% para la diferencia: (1,384; 5,430) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 3,88 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 1,3871

Valor P = 0,005

GL = 8

115 (Cobre, Cu) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Inferior 0,0428218 0,0928170

Desv.Est. 0,076488 0,165788

Superior 0,264613 0,573553

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,21; valor p = 0,163

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 2,62; valor p = 0,144

T de dos muestras para Cu

Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Media 0,9112 1,252

Desv.Est. 0,0765 0,166

Media del Error estándar 0,034 0,074

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,3405 IC de 95% para la diferencia: (-0,5287; -0,1522) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -4,17 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,1291

Valor P = 0,003

GL = 8

(Manganeso, Mn) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Inferior 0,0427172 0,0194953

Desv.Est. 0,0763009 0,0348223

Superior 0,263967 0,120469

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 4,80; valor p = 0,158 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,60; valor p = 0,241

T de dos muestras para Mn

Tipo_Sem Criolla Importada

N 5 5

Media 3,8536 3,1565

Desv.Est. 0,0763 0,0348

Media del Error estándar 0,034 0,016

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,6972 IC de 95% para la diferencia: (0,6107; 0,7837) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 18,59 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0593

Valor P = 0,000

GL = 8

116 (Fósforo, P) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares TipoSem Criolla Importada

N 3 5

Inferior 0,607706 0,465943

Desv.Est. 1,27213 0,83226

Superior 11,3426 2,8792

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 2,34; valor p = 0,425

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,13; valor p = 0,733

T de dos muestras para P

TipoSem Criolla Importada

N 3 5

Media 524,07 490,637

Desv.Est. 1,27 0,832

Media del Error estándar 0,73 0,37

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 33,433 IC de 95% para la diferencia: (31,645; 35,221) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 45,75 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 1,0006

Valor P = 0,000

GL = 6

(Selenio, Se) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares tipoSemilla Criolla Importada

N 3 3

Inferior 0,0002440 0,0001800

Desv.Est. 0,0005108 0,0003769

Superior 0,0045542 0,0033604

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,84; valor p = 0,705 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,13; valor p = 0,736

T de dos muestras para Se

tipoSemilla Criolla Importada

N 3 3

Media 0,025828 0,026167

Desv.Est. 0,000511 0,000377

Media del Error estándar 0,00029 0,00022

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,000339 IC de 95% para la diferencia: (-0,001357; 0,000678) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -0,93 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0004

Valor P = 0,407

GL = 4

117 

Ácidos Grasos

(Palmítico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 Criolla Import

N 2 2

Inferior 0,0043334 0,0189799

Desv.Est. 0,0108236 0,0474063

Superior 0,69085 3,02586

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,05; valor p = 0,286 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Importada

C1 Criolla Import

N 2 2

Media 4,6313 5,0428

Desv.Est. 0,0108 0,0474

Media del Error estándar 0,0077 0,034

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: -0,4115 IC de 95% para la diferencia: (-0,5594; -0,2635) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -11,97 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0344

Valor P = 0,007

GL = 2

(Esteárico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 Criolla Import

N 2 2

Inferior 0,0076415 0,0269840

Desv.Est. 0,0190862 0,0673980

Superior 1,21824 4,30189

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,08; valor p = 0,351 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Esteárico

C1 Criolla Import

N 2 2

Media 2,7476 2,8556

Desv.Est. 0,0191 0,0674

Media del Error estándar 0,013 0,048

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: -0,1080 IC de 95% para la diferencia: (-0,3211; 0,1052) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -2,18 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0495

Valor P = 0,161

GL = 2

118 (Oleico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 Criolla Import

N 2 2

Inferior 0,181227 0,205533

Desv.Est. 0,452652 0,513361

Superior 28,8919 32,7669

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,78; valor p = 0,920 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Oleico

C1 Criolla Import

N 2 2

Media 14,216 14,009

Desv.Est. 0,453 0,513

Media del Error estándar 0,32 0,36

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: 0,206 IC de 95% para la diferencia: (-1,876; 2,289) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,43 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,4840

Valor P = 0,711

GL = 2

(Linoleico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 Criolla Import

N 2 2

Inferior 0,0243214 0,0338351

Desv.Est. 0,0607478 0,0845100

Superior 3,87742 5,39412

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,52; valor p = 0,794 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Linoleico

C1 Criolla Import

N 2 2

Media 16,5002 16,5161

Desv.Est. 0,0607 0,0845

Media del Error estándar 0,043 0,060

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: -0,0159 IC de 95% para la diferencia: (-0,3325; 0,3008) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -0,22 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0736

Valor P = 0,849

GL = 2

119 (α-linolénico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 Criolla Import

N 2 2

Inferior 0,144931 0,125734

Desv.Est. 0,361994 0,314047

Superior 23,1054 20,0450

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,33; valor p = 0,910 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para alfa-linolénico

C1 Criolla Import

N 2 2

Media 61,905 61,576

Desv.Est. 0,362 0,314

Media del Error estándar 0,26 0,22

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: 0,329 IC de 95% para la diferencia: (-1,129; 1,787) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,97 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,3389



Valor P = 0,434

GL = 2

Polifenoles

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla_tipo Criolla Importada

N 3 3

Inferior 21,6206 27,3032

Desv.Est. 45,2591 57,1546

Superior 403,540 509,603

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,63; valor p = 0,771

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,12; valor p = 0,748

T de dos muestras para Polifenoles

Semilla_tipo Criolla Importada

N 3 3

Media 1655,0 1435,0

Desv.Est. 45,3 57,2

Media del Error estándar 26 33

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 220,0 IC de 95% para la diferencia: (103,1; 336,8) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 5,23 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 51,5511

Valor P = 0,006

GL = 4

120 

HCN

Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Sem_tipo Criolla Importada

N 5 5

Inferior 0,44533 1,19891

Desv.Est. 0,79545 2,14148

Superior 2,75190 7,40854

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,14; valor p = 0,081

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,87; valor p = 0,208 T de dos muestras para HCN

Sem_tipo Criolla Importada

N 5 5

Media 37,619 39,38

Media del Error estándar 0,36 0,96

Desv.Est. 0,795 2,14

Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -1,76 IC de 95% para la diferencia: (-4,11; 0,60) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -1,72 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 1,6153



Valor P = 0,124

GL = 8

Capacidad Antioxidante

(EC50) 95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations Muestra Criolla Imp

N 3 3

Lower 0,057469 0,132013

StDev 0,120301 0,276348

Upper 1,07263 2,46398

F-Test (normal distribution) Test statistic = 0,19; p-value = 0,319

Levene's Test (any continuous distribution) Test statistic = 1,03; p-value = 0,368

Two-sample T for EC50 Muestra Criolla Imp

N 3 3

Mean 6,571 3,879

StDev 0,120 0,276

SE Mean 0,069 0,16

Difference = mu (Criolla) - mu (Imp) Estimate for difference: 2,69240 95% CI for difference: (2,20927; 3,17553) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 15,47 Both use Pooled StDev = 0,2131

P-Value = 0,000

DF = 4

121 (TEC50) 95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations Muestra Criolla Imp

N 3 3

Lower 0,26211 5,50864

StDev 0,5487 11,5314

Upper 4,892 102,816

F-Test (normal distribution) Test statistic = 0,00; p-value = 0,005

Levene's Test (any continuous distribution) Test statistic = 2,06; p-value = 0,225 Two-sample T for TEC50 Muestra Criolla Imp

N 3 3

Mean 112,139 115,2

StDev 0,549 11,5

SE Mean 0,32 6,7

Difference = mu (Criolla) - mu (Imp) Estimate for difference: -3,06733 95% CI for difference: (-31,74530; 25,61064) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,46

P-Value = 0,691

DF = 2

(AE) 95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations Muestra Criolla Imp

N 3 3

Lower 0,0000130 0,0000788

StDev 0,0000271 0,0001649

Upper 0,0002417 0,0014707

F-Test (normal distribution) Test statistic = 0,03; p-value = 0,053

Levene's Test (any continuous distribution) Test statistic = 0,80; p-value = 0,422

Two-sample T for AE Muestra Criolla Imp

N 3 3

Mean 0,0013574 0,002253

StDev 0,0000271 0,000165

SE Mean 0,000016 0,000095

Difference = mu (Criolla) - mu (Imp) Estimate for difference: -0,000896 95% CI for difference: (-0,001164; -0,000628) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -9,28 Both use Pooled StDev = 0,0001

P-Value = 0,001

DF = 4

122 Anexo 3. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: ANOVA multifactorial para mucílago y grasa en semillas procesadas. 

Mucílago en Semillas Procesadas

Analysis of Variance for Mucilago_Semilla - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square MAIN EFFECTS A:Tipo 0,474067 1 0,474067 B:Procesamiento 28,4204 3 9,47346 INTERACTIONS AB 16,0962 3 5,3654 RESIDUAL 18,9086 8 2,36357 TOTAL (CORRECTED) 63,8992 15 All F-ratios are based on the residual mean square error.



F-Ratio

P-Value

0,20 4,01

0,6661 0,0517

2,27

0,1574

F-Ratio

P-Value

10,63 0,17

0,0311 0,7023

0,21

0,6712

Grasa en Semillas Procesadas

Analysis of Variance for Col_3 - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square MAIN EFFECTS A:Tipo 108,93 1 108,93 B:Procesamiento 1,72934 1 1,72934 INTERACTIONS AB 2,14235 1 2,14235 RESIDUAL 40,9871 4 10,2468 TOTAL (CORRECTED) 153,788 7 All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for Col_3 by Tipo Method: 95,0 percent Duncan Tipo Count LS Mean Nacional 4 34,4754 Importada 4 41,8554

LS Sigma 1,60053 1,60053

Contrast Sig. Difference Importada - Nacional * 7,38003 * denotes a statistically significant difference.

Homogeneous Groups X X

123 Anexo 4. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de polifenoles en semillas procesadas. Analysis of Variance for Polifenoles - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square MAIN EFFECTS A:Tipo 547381, 1 547381, B:Procesamiento 1,62427E6 5 324854, INTERACTIONS AB 182803, 5 36560,6 RESIDUAL 33250,0 12 2770,83 TOTAL (CORRECTED) 2,38771E6 23 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test Bartlett's 3,14626

Mean Square 214041, 2770,83

Multiple Range Tests for Respuesta by Factor Method: 95,0 percent Duncan Col_4 Count Mean Homogeneous Groups X Xii 2 425,049 X II 2 560,023 X VI 2 580,912 X Viii 2 819,515 X I 2 830,025 X VII 2 831,275 X Xi 2 871,334 X IV 2 917,335 X iX 2 1049,18 X X 2 1270,64 X V 2 1286,49 X III 2 1540,94

Sig.