EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN UNA SOPA COMERCIAL.

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Cartagena, España. 2008

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EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN UNA SOPA COMERCIAL

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Cartagena, España. 2008

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NOTA DE ADVERTENCIA ―La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia‖. Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

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EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN UNA SOPA COMERCIAL

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

APROBADO

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Dra. Ingrid Schuler Phd Bióloga Decana Académica

Dra. Janeth Arias Palacios M.Sc, Bacterióloga Directora de carrera

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Cartagena, España. 2008

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Después de 5 años de dura lucha por fin alcanzo la cima de esta metar. Es uno de los momentos cumbre anhelado por muchos y hoy soy yo el que vive ese momento, pero esto no hubiera sido posible sin la presencia de muchas personas (algunas aun hoy presentes, otras se perdieron y otras fueron llamadas ante el gran jefe), no sé si estaría mal decir que -―Soy una obra viviente, a la cual muchos contribuyen a darle forma y color, a partir de pinceladas de sentimientos bellos y cinceladas de palabras de justicia y verdad”- pero es la única forma de definir lo que quiero expresar. Debido a lo anterior dedico este trabajo a: Dios el arquitecto de todo, sin el nada de esto podría ser. Mi mamita donde quiera estés, ya hemos logrado la segunda gran meta, te extraño y sé que no estás muy lejos de mi porque estas en mí y a mi lado, protegiéndome y apoyándome. Mi padre, gordo gracias por tu amor y tu apoyo, en el momento más crítico de nuestras vidas asumiste el rol de papa y mamá y como todo lo que haces no te quedo grande, se cuantos sacrificios has hecho por nosotros se cuantas preocupaciones pasaste y solo por sacarnos adelante, como te dije delante de más de 50 personas mis metas, sueños, anhelos y logros son también tuyos este es mi regalo al mejor padre del mundo. Mi hermano, mijo se que aunque no andamos muy juntos, el sentimiento de amor es muy grande y siempre estamos como una sombra detrás del otro para protegernos y cuidarnos, sin usted, aunque no lo crea, esto no se hubiera hecho real, gracias. Mi abuelita, mi tío y la familia Huertas la mejor familia del mundo, su apoyo incondicional para con nosotros tres es una bendición, ustedes son más que tíos y primos padres madres y hermanos, Gustavito y Raulito 5 años y medio después el trato ha sido cumplido y ese trato más que con ustedes fue conmigo. Edna, una gran mujer, sin tu presencia en mi camino creo que nada de esto sería lo que es, pero más que todo te agradezco que AMES A MI PADRE Y LO HAGAS FELIZ creo que eso es lo que más ánimo me da pues la felicidad de él es la mía y todo es gracias a ti. Debo agradecer tu apoyo, tus consejos y el ánimo que me das en cada paso para seguir adelante creo que sin eso no hubiera podido poner esta bandera. Gracias por considerarme un hijo más estando siempre pendiente de mí, haciéndolo de corazón y no de obligación. También agradezco a tu familia unas personas que me quieren y los quiero unos amigos y compañeros geniales una familia que nos adopto en su seno a mi padre y a mí. Dorita, sin ti este gran sueño hubiera sido un poco imposible, tu eres un ángel que apareció en mi camino en el momento adecuado sin tu presencia tal vez nada de esto sería real. Familia Forero Vargas, mi segunda familia, una familia que ha estado para mí y conmigo en todo momento, una familia que me tomo como un hijo más creo que solo puedo decir que los amo mucho. Mis amigos los cuales no necesito plasmar sus nombres, pues ellos saben quiénes son, algunos desde el colegio y otros desde la universidad gente que plasmaron su huella, y de los cuales tuve y tengo el privilegio y el honor de decir son mis amigos y aun mas porque desde la distancia me lo muestran. Marta poco tiempo pero tu ayuda y tu apoyo en un mundo desconocido para mí fue y es muy importante. Ilusa esto es también gracias a ti, se que la vida pareciera injusta, pero todo posee un motivo.

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Agradecimientos  Al Dr. Pablo Fernández, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio, con su grupo de investigación e iniciar una nueva etapa en mi vida. Por confiar en mí y por toda la ayuda brindada tanto profesional como personal.  A la Dra. Janeth, por decirme donde buscar el pony y darme la oportunidad de venir a buscarlo. Una persona que desde que la conocí no fue una profesora fue una amiga, por siempre tener una palabra para iluminar cualquier camino.  A Leymaya, tanto que agradecerle, su apoyo cognoscitivo en el proyecto fue importante pero su amistad fue esencial, por estar conmigo en todo momento y en toda situación, por brindarme la mano cuando el mundo quería venirse encima, por siempre estar ahí para escucharme y darme animo Pieza fundamental en este proyecto y en mi nueva vida.  Al Dr. Alfredo Palop, por tener su despacho abierto a las miles de dudas que surgieron durante el proyecto, su ayuda fue de gran valor para comprender muchas cosas.  A May, Vera, Mª Dolores, Marina y Raquel, sin lugar a dudas el mejor grupo de laboratorio que existe, ¿que hubiera sido de mi sin su amistad, sin el cotilleo?, creo que hubiera sido imposible soportar tanto trabajo. Por siempre tener algún tema para amenizar el día, y bueno por tender la mano ante los miles de problemas y dudas que surgieron.  A Fermín, (dios mío para el un agradecimiento aparte) por soportar y arreglar cada cosa que sin querer se dañaba o se averiaba (insisto Fermín yo no fui), por enseñarme que en la vida toca ser y saber de todo un poco (microbiólogo, ingeniero, electricista, etc.) e igual que los demás gracias por su amistad.  A todos aquellos que en algún momento trabajaron conmigo en el laboratorio, por su compañía y amistad, personas que dejaron huella en mi: João, Clementina, Lola, José, Navarrete, Cifre, Lola y Loli, Sergio, Salva, Caro, Justine, y muchos más que tal vez se me pasaran pero nunca se les olvidará.  Juan D parce fundamental tu amistad, bacano tener un parcerazo como tú, bacan gracias.  Alicia & Grillo, 2 grandes amigos, espero su amistad perdure en el tiempo pues personas con sus cualidades no existen muchas. Gracias por estar en todo momento un abrazo tios.  A mis amigos de GPR, por brindarme su amistad, un chiste en el pasillo y estar pendientes de cómo iba todo.  Al personal docente de la PUJ, Martha, María M, Ana K, y todos aquellos que ayudaron en mi formación.  A la UPCT por brindarme las instalaciones, equipos y medios para la realización de este proyecto.

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RESUMEN Los consumidores de hoy en día están exigiendo alimentos mínimamente procesados sin aditivos químicos y que no sean expuestos a tratamientos agresivos como las altas temperaturas, los cuales pueden modificar sus características nutricionales y organolépticas. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de los aceites A.E. provenientes de las plantas de clavo y tomillo en combinación con tratamientos térmicos, para el control de uno de los principales patógenos de interés en la industria alimentaria como lo es L.monocytogenes. Para poder determinar el efecto de este tratamiento se aplicaron tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC solos y en combinación con los A.E. a dos concentraciones sobre la cepa L.monocytogenes CETC 4032. Después de cada tratamiento se recuperó el microorganismo en un medio no selectivo y en uno selectivo, obteniéndose que al exponer el microorganismo luego de los tratamientos en un medio de recuperación con un factor de inhibición, se observa una mayor reducción en la población. A nivel de los aceites esenciales se obtuvo que el aceite de tomillo inhibió por completo la población inicial del microorganismo a una concentración de 0.01% desde el tiempo 0 del tratamiento. Para el aceite esencial de clavo se obtuvo una reducción in vitro de 4-log de 3,29 min en un medio de recuperación no selectivo y de 2,5 en un medio selectivo a una concentración de 0,01%. Al aplicar el tratamiento anterior con una concentración de 0,05% del A.E. en una crema de calabacín se obtuvo una reducción decimal de 3-log en 1 min. Los resultados obtenidos en la investigación nos permiten concluir que los A.E. evaluados presentan gran eficacia en la disminución de la población de L.monocytogenes CETC 4032 siendo más efectivo el aceite esencial de tomillo que el de clavo.

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Tabla de Contenido 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 22 2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 24 2.1 Generalidades .............................................................................................. 24 2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) ................................ 24 2.2 Listeria monocytogenes .............................................................................. 25 2.2.1 Historia ................................................................................................. 25 2.2.2 Morfología ........................................................................................... 25 2.2.3 Factores de crecimiento........................................................................ 26 2.2.4 Clasificación ............................................................................................... 26 2.2.5 Reservorio ............................................................................................ 28 2.2.6 Alimentos ................................................................................................. 28 2.2.6.1 Leche y productos lácteos ................................................................. 30 2.2.6.2 Carne y productos carnicos ............................................................... 31 2.2.6.3 Otros Alimentos ................................................................................ 32 2.2.7 Métodos de detección............................................................................... 33 2.2.7.1 Métodos de aislamiento .................................................................... 35 2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas .................................................... 36 2.2.8 Virulencia ................................................................................................. 37 2.2.8.1 Entrada a las células del hospedero ................................................... 39 2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. ................................. 39 2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático ................................................. 40 2.2.8.4 Diseminación célula-célula ............................................................... 40 2.2.9 Listeriosis ................................................................................................. 41 2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis) ............................................................. 41 2.2.9.2 Invasivo ............................................................................................. 42 2.2.9.3 Tratamiento ....................................................................................... 42 2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos ……43 2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor) ............................ 43 2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z ........................................................... 43 2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D) .......................................... 44 2.3.2.2 Valor Z .............................................................................................. 45 2.3.3 Termorresistómetro .................................................................................. 46 2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los microorganismos ....................................................................................................................... 47

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2.4 Antimicrobianos naturales ............................................................................... 49 2.4.1 Aceites esenciales..................................................................................... 50 2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales ............................... 50 2.4.1.2 Eugenol (clavo) ..................................................................................... 52 2.4.1.3 Carvacrol y Timol (Tomillo)............................................................. 54 2.5 Modelo y distribución Weibull ........................................................................ 58 2.6 Factor de exactitud (Af) .................................................................................. 62 3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 64 4. OBJETIVOS ................................................................................................... 66 5. HIPOTESIS .................................................................................................... 67 5.1 Predicciones ................................................................................................ 67 6. MATERIALES Y METODOS .......................................................................... 68 6.1 Materiales .................................................................................................... 68 6.1.1 Microorganismo ................................................................................... 68 6.1.2 Medios de cultivo ................................................................................. 68 6.1.3 Aceites esenciales................................................................................. 69 6.1.4 Equipos................................................................................................. 69 6.1.5 Materiales ............................................................................................. 69 6.2 Metodología ................................................................................................ 70 6.2.1 Activación del microorganismo ........................................................... 70 6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro .................... 70 6.2.2 Recuento inicial .................................................................................... 70 6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC .................... 71 6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC ............... 72 6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites esenciales de tomillo y clavo......................................................................... 75 6.2.6 Tratamientos sobre el alimento ............................................................ 77 6.3 Análisis Estadístico de los datos ................................................................. 78 7 Resultados y Discusión...................................................................................... 78 7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC ..................................................... 79 7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC ........................................ 84 7.1.2.1 Predicciones ...................................................................................... 89 7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales. ....... 99 7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite esencial de tomillo....................................................................................... 100

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7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite esencial de clavo ......................................................................................... 101 7.3 Tratamientos sobre el alimento ................................................................. 107 7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC. .............................................. 108 8. Conclusiones ................................................................................................. 118 9. Recomendaciones .......................................................................................... 119 10. Bibliografia ................................................................................................. 120

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INDICE DE TABLAS TABLA 1. TIEMPO DE MUESTREO EN LOS TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS POR TEMPERATURA ................................................................................................................. 71 TABLA 2. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC (EN BASE 10) ............................................................................................................ 72 TABLA 3. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC (EN BASE 10) ............................................................................................................ 72 TABLA 4. PERFIL DE TEMPERATURAS PARA LOS TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. RANGO DE TEMPERATURAS Y VELOCIDADES POR PERFIL. ............................................................. 73 TABLA 5. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10). ................................................................................................... 74 TABLA 6.TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10). ................................................................................................... 74 TABLA 7 TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ............................... 75 TABLA 8. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.05%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL.................... 75 TABLA 9. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. .......................... 76 TABLA 10. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL............... 76 TABLA 11. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ............................... 76 TABLA 12. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL.................... 77 TABLA 13. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. TOMILLO 0.01% Y 0.05%, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10). ........................................ 77 TABLA 14. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE 2 CORRELACIÓN (RO) Y R PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC. ................................................................................. 80 TABLA 15. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE 2 CORRELACIÓN (RO) Y R PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC. ................................................................................. 82 TABLA 16. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS. ................................ 83 TABLA 17. . VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE 2 CORRELACIÓN (RO) Y R PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC. ............................................................................ 86 TABLA 18. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC. ............................................................................ 89 TABLA 19. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. ........................... 89 TABLA 20. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO HASTA 55ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN EL MEDIO BHIA. ................................................. 91 TABLA 21. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO HASTA 55ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y

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PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. .......................................... 92 TABLA 22. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO HASTA 60ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA. ...................................................... 93 TABLA 23. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO HASTA 60ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. .......................................... 94 TABLA 24. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO. ...................................................................................................... 102 TABLA 25. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO ....................................................................................................... 104 TABLA 26. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. .......................... 108 TABLA 27. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. .......................... 109 TABLA 28. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS EN CREMA DE CALABACÍN. ................................................................................................................... 109 TABLA 29. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON UNA CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO. ......................................... 114 TABLA 30. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON UNA CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO ......................................... 115

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INDICE DE FIGURAS FIGURA 1. HABITAT DE L.MONOCYTOGENES Y VIAS DE CONTAMINACIÓN ................................ 28 FIGURA 2. RESUMEN MODIFICADO DE TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN PARA LISTERIA SPP. Y LISTERIA MONOCYTOGENES EN MUESTRAS AMBIENTALES Y DE ALIMENTOS..................................... 34 FIGURA 3. SISTEMA METODOLÓGICO PARA LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE LISTERIA SPP. MODIFICADO ............................................................................................................ 37 FIGURA 4. REPRESENTACIÓN ESQUÉMATICA DE LA BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN INTRACELULAR POR L.MONOCYTOGENES .......................................................................... 38 FIGURA 5. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FISIOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR LISTERIA SPP. .................................................................................................................... 41 FIGURA 6. GRÁFICA DE SUPERVIVENCIA .................................................................................. 44 FIGURA 7. GRAFICA DE VALOR D. ............................................................................................ 45 FIGURA 8. GRAFICA DE TERMO RESISTENCIA Y VALOR Z. ........................................................ 46 FIGURA 9. LOCALIZACIÓN Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE A.E SOBRE LA CÉLULA BACTERIANA. ...................................................................................... 51 FIGURA 10. EUGENOL .............................................................................................................. 53 FIGURA 11. ESQUEMA SUGERIDO DE ACCIÓN SUGERIDO PARA EL CARVACROL SOBRE LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA .......................................................................................... 55 FIGURA 12. TIMOL ................................................................................................................... 56 FIGURA 13. CARVACROL .......................................................................................................... 56 FIGURA 14. EJEMPLO MODIFICADO DE CONCAVIDADES. .......................................................... 61 FIGURA 15. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS (55ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL ...................... 79 FIGURA 16. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS (60ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ..................... 81 FIGURA 17. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO ISOTÉRMICAS (N.I) A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ............ 85 FIGURA 18. COMPORTAMIENTO DE LA POBLACIÓN DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DURANTE EL PERFIL N.I A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL...... 85 FIGURA 19. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO ISOTÉRMICAS (N.I) A 60ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ............ 88 FIGURA 20. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA. ............................................. 92 FIGURA 21. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ................................. 93 FIGURA 22. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA. ....................................... 94 FIGURA 23. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ........................... 95 FIGURA 24. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL MODELO DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE TEMPERATURA DE 3ºC/MIN............................................................................................... 97 FIGURA 25. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL

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MODELO DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE TEMPERATURA DE 3ºC/MIN............................................................................................... 98 FIGURA 26. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .................................................................................................................. 102 FIGURA 27. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL............................................................................................ 103 FIGURA 28. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL ................................................................................................................... 104 FIGURA 29. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL............................................................................................ 105 FIGURA 30. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS (55ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO SELECTIVO Y NO SELECTIVO. .......................................................................................... 108 FIGURA 31. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS (60ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO SELECTIVO Y NO SELECTIVO. .......................................................................................... 109 FIGURA 32. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 55ºC. .............. 111 FIGURA 33. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 60ºC. .............. 111 FIGURA 34. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .......................... 113 FIGURA 35. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ............................... 113 FIGURA 36. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 60ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .......................... 114 FIGURA 37. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 60ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ............................... 115

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1. INTRODUCCIÓN

Con el descubrimiento de los microorganismos gracias a la invención del microscopio por parte de Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723), la visión del mundo tal y como se conocía en ese tiempo cambió drásticamente, las teorías que formularon investigadores como el filósofo romano Lucrecio (circa 98-55 a.C.) y el médico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sobre la presencia de ―criaturas vivas invisibles‖ causantes de enfermedades fueron confirmadas.

Desde aquellos tiempos hasta la actualidad el ser humano se ha visto favorecido y afectado por los microorganismos. Beneficiado porque aprovecha las cualidades (metabólicas, genéticas, etc.) de algunos de estos para la elaboración de alimentos (pan, queso, cerveza, etc.), elaboración de medicamentos (antibióticos, vitaminas, vacunas, etc.) y en la actualidad como agentes recuperadores de ambientes y ecosistemas contaminados por la actividad industrial del hombre en una rama de la microbiología llamada biorremediación. Pero como se dijo anteriormente, también se ha visto afectado a nivel salubre debido a las enfermedades que estos provocan y que han generado grandes acontecimientos históricos como la peste negra en 1347. Con el descubrimiento del microscopio y la creación de la microbiología, el ser humano se ha preocupado por mejorar los niveles de la salud desde diferentes puntos, algunos de ellos como la industria farmacéutica, la industria alimentaria y la medicina entre otros.

Una de las ramas de la microbiología encaminada a asegurar la salud del hombre y de los animales es la microbiología de alimentos, esta rama es la encargada de verificar que los alimentos producidos por el sector agroalimentario, sean seguros, confiables e inocuos para la salud previniendo la generación de brotes epidemiológicos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), como por ejemplo: el cólera, la listeriosis, la salmonelosis, entre otras.

Para esto la industria utiliza conservantes químicos como nitritos, benzoato sódico y meta bisulfito sódico los cuales han demostrado gran eficacia en el control

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microbiológico de los alimentos. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que estos compuestos ó sustancias derivadas de estos son peligrosos para la salud, como por ejemplo las nitrosaminas, compuesto cancerígeno proveniente de la transformación de los nitritos.

Por otro lado, en la última década, los consumidores reclaman alimentos naturales mínimamente procesados,

es

decir, que

mantengan sus

características

organolépticas y nutricionales intactas, pero que a su vez sean inocuos con un mayor tiempo de frescura sin la adición de compuestos químicos ó aplicación de técnicas agresivas, como la exposición a altas temperaturas.

En este sentido, los investigadores han explorado varias alternativas, como la combinación de tratamientos, por ejemplo: temperaturas moderadas con pH, aw, entre otros; y lo más reciente es el uso de componentes antimicrobianos naturales los cuales han sido usados durante décadas para la conservación y sazonamiento.

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2. MARCO TEÓRICO 2.1 Generalidades 2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) son uno de los mayores problemas de la salud mundial, pueden causar una enfermedad pasajera o pueden ser tan graves que pueden llegar a causar la muerte. Estas enfermedades resultan por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con agentes químicos (plaguicidas, fertilizantes, etc.) o por agentes biológicos (microorganismos, parásitos, y/o algunas substancias toxicas que estos producen). Las ETAs pueden ser de 3 tipos: Infecciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de alimentos contaminados por microorganismos perjudiciales (patógenos) vivos (virus, bacterias, parásitos) Ej.: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, el virus de la Hepatitis A (Anónimo 1, 2007).

Intoxicaciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de toxinas formadas en tejidos de plantas o animales, o de productos metabólicos de microorganismos en los alimentos, o por sustancias químicas que se incorporan a ellos de modo accidental, incidental o intencional desde su producción hasta su consumo. Ocurren cuando estas toxinas o venenos de bacterias o mohos todavía están presentes en los alimentos ingeridos, las toxinas no son detectadas por el consumidor, pues no tienen olor ni sabor y algunas pueden soportar los tratamientos térmicos realizados a los alimentos como por ejemplo la cocción, a estas toxinas se les denomina toxinas termorresisentes. Entre los microorganismos que producen toxinas se encuentran: Clostridium botulinum (toxina botulínica), Escherichia coli (toxina shiga), toxinas del pez globo (Michanie, 2007; Anónimo 1, 2007).

Toxi-infecciones: Son enfermedades causadas por la ingestión de una cierta concentración de microorganismos vivos capaces de causar una enfermedad y

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poseen la capacidad de producir, sintetizar o liberar toxinas unas vez ingeridas. Ej. Vibrio cholerae (cólera) (Anónimo 1, 2007). 2.2 Listeria monocytogenes 2.2.1 Historia La primera descripción de Listeria monocytogenes fue en 1926 debida a un brote epidemiológico en unos cerdos de guinea y conejos, y no fue reconocida como un serio problema de salud, hasta que causó un gran brote invasivo con una alta tasa de mortalidad en las provincias marítimas de Canadá. Este fue el primer brote que demostró que este microorganismo es un patógeno alimentario y se ha demostrado que muchos de los casos de listeriosis son producidos por la ingestión de alimentos contaminados. Después de este brote, se dio un gran interés en investigar y conocer la epidemiología de este organismo, para proteger a los consumidores de la manera más efectiva contra el mismo, (Swatiman et al., 2007). 2.2.2 Morfología El género Listeria está constituido por bacilos Gram positivos cortos y regulares, de 0.4 a 0.5 m de ancho por 0.5 a 2.0 m de largo que pueden disponerse individualmente o en cadenas cortas, presentando a menudo formas en ―V‖ en cultivos viejos. Pueden aparecer en filamentos cortos y la capacidad de coloración puede perderse (Blanco, 1994), no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos, son catalasa positivos, productores de acido L(+) láctico en el metabolismo fermentativo de la glucosa, oxidasa negativos, esculina positivos (Blanco, 1994), L monocytogenes, L.seeligeri y L.ivanovii son  hemolíticos en agar sangre con 5% vol/vol de sangre de caballo o cordero. L.monocytogenes y L.seeligeri presentan un pequeño halo de hemólisis alrededor de las colonias que, en numerosas ocasiones, es difícil de observar de tal forma que se hace necesario retirar la colonia para poder detectarlo, L.ivanovii presenta un amplio doble halo de β-hemólisis. Para diferenciar más claramente entre estas especies, se utiliza un test de potenciación de su actividad hemolítica con Staphylococcus aureus productor de β-hemolisina (esfingomielinasa C) y Rhodococcus equi, denominado

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test de CAMP (Michanie, 2007). Mientras L. ivanovii presenta un característico efecto de potenciación en forma de ―pala‖ con R. equi, en L. monocytogenes y L. seeligeri se observa un efecto en forma de cerilla. Con S. aureus tan sólo L. monocytogenes y L. seeligeri muestran una potenciación de su actividad hemolítica (Blanco, 1994).

Son móviles por flagelos perítricos que se expresan mejor a 20-25ºC que a temperaturas más elevadas, son bastantes resistentes a agresiones fisico-químicas lo que les confiere una gran resistencia en el medio ambiente y puede sobrevivir por prolongados periodos de tiempo (15 años) siempre que se encuentren en presencia de materia orgánica y que las condiciones de pH, temperatura, aw, etc. Sean favorables. (Blanco, 1994). 2.2.3 Factores de crecimiento El género Listeria spp. presenta una temperatura mínima de crecimiento de 0.4ºC (Blanco, 1994), otros documentos reportan que la temperatura mínima es de -1.5 (Michanie, 2007), si bien la temperatura óptima es de 37ºC y la temperatura máxima es de 45ºC, el rango de pH es de 4.3 a 9.4 siendo el pH 7 el óptimo para su desarrollo y la actividad de agua (aw) mínima que permite su crecimiento es de 0.92 (Michanie, 2007; Anónimo 4, 2007). La atmósfera ideal para su desarrollo es de microaereofilia, pero tolera las condiciones aerobias, puede crecer en concentraciones altas de CO2 (Ej.30%) pero en concentraciones de 100% de CO2 es inhibida. 2.2.4 Clasificación La clasificación del género listeria ha sufrido muchas variaciones, a lo largo de más de 30 años, y se le ha incluido en diferentes familias y géneros dentro del Bergey`s manual of determinative bacteriology. En la séptima edición de 1957, fue incluido dentro de la familia Corynobacteriaceae debido a sus características morfológicas. Con el tiempo y gracias a estudios de taxonomía numérica y de pared celular, evidenciaron la nula o baja relación entre Listeria y las corinebacterias y evidenciaron su errónea clasificación, (Domínguez, 2001).

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Los estudios quimiotaxonómicos demostraron que el género Listeria posee un bajo contenido de Guanina+Citosina (G+C) 36-42%, carencia de ácidos micólicos y presencia de ácidos lipoteicoicos, presencia de peptidoglicano de la variedad A1 asociados a ácidos teicoicos del tipo polirribitol-fosfato, y por poseer como menaquinona principal la MK7. Todo esto, conllevó a la confirmación de la estrecha relación de este género con los géneros Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, Lactococcus gracias a la proximidad que los estudios de taxonomía numérica presentan y a la semejanza en las propiedades quimitaxonómicas. Con esto, en 1974 en la siguiente edición del manual Bergey aparece incluido en la sección 16 como género de afiliación incierta cerca de los géneros anteriormente mencionados y con los cuales posee relación, (Blanco, 1994; Garcia, 1995; Domínguez, 2001).

Gracias a los avances de tecnologías genéticas (hibridación DNA-DNA, análisis del ARNr 16S) se demostró la escasa relación filogenética entre el género Listeria y las corinebacterias y la cercanía con los géneros Brochotrix y Lactobacillus (Blanco, 1994). Gracias a estos avances, se ubicó este género en la familia Listeriaceae, que está ubicado en la subrama del genero Clostridium de las bacterias Gram positivas, basado en el bajo contenido de G+C en su genoma (Gasanov et al., 2005). Las cuatro secuencias disponibles hasta hoy de L.monocytogenes (cepas Ende, F6854, F2365, H7858) tienen un tamaño promedio entre 2,893,921 bp y 2,953,211 bp con un contenido aproximado de G+C del 38% y cerca de 2900 genes codificadores de proteínas. La cantidad de G+C de L.welshimeri y de L.innocua son de 36.4% y 37% respectivamente. Los análisis de los genomas, de estas bacterias del género Listeriaceae permitieron evidenciar particularidades y semejanzas entre estas, como las diferencias entre las cepas patógenas y no patógenas. Uno de los rasgos semejantes entre las bacterias pertenecientes a este género, es la fuerte conservación en la organización genómica, sin inversiones o cambios de largos segmentos geonómicos. Una casi perfecta conservación en el orden y en la relativa orientación de los genes heterólogos fue identificada, demostrando e indicando una gran estabilidad y una

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filogenia cercana entre los genomas de las bacterias del género Listeria (Buchrieser, 2007).

Actualmente, el género listeria se halla constituido por seis especies: L.monocytogenes, L.inonocua,L.seeligeri, L.welshimeri, L.grayi y L.ivanovii con sus dos subespecies indoniencis e ivanovii (Blanco, 1994). 2.2.5 Reservorio Listeria monocytogenes es un microorganismo ubicuo, está de modo saprofito en gran cantidad de nichos medioambientales, considerándose su hábitat principal el suelo y la materia vegetal en descomposición y en aguas continentales (Fig.1). También se encuentra normalmente en la flora intestinal de animales y está en las heces de un 2 a 6% de la población. Se encuentra también en ensilados y en el entorno de la producción de alimentos (Fig.1) (Blanco, 1994; Michanie, 2007).

Figura 1. Habitat de L.monocytogenes y vias de contaminación (Reguera et al., 1995) 2.2.6 Alimentos Como se comentó en un apartado anterior una de las principales vías de contaminación son los alimentos. Algunas investigaciones y reportes proponen que los alimentos susceptibles y con más probabilidad de encontrar este

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microorganismo son salchichas, fiambres, leche, leche pasteurizada y derivados lácteos, carne y productos cárnicos, y debido a su presencia en aguas servidas se puede encontrar en vegetales regados con agua contaminadas y no tratadas (Blanco, 1994; Michanie, 2007).

Diversos factores, son un reflejo de los cambios sufridos en el estilo de vida de los consumidores, entre estos se pueden incluir: (i) progresos médicos que han producido un cambio demográfico, incrementando la proporción de población de edad avanzada e inmunocomprometida; (ii) cambios en el sistema de producción primaria de alimentos (producción a gran escala de materias primas, modificación de las técnicas de procesado de los alimentos, expansión de la industria alimentaria y desarrollo de sistemas de almacenamiento en frío); (iii) modificaciones en los hábitos de alimentación (incremento en la demanda por parte de los consumidores de alimentos listos para comer, precocinados, refrigerados o congelados pero con un mínimo requerimiento de tiempo de cocinado antes de su consumo); (iv) realización de la compra una vez a la semana (Domínguez, 2001).

Como ya se comentó antes al ser este un microorganismo ubicuo y encontrarse presente de manera normal en la flora intestinal en algunos organismos, los enfermos y portadores sanos (animales y humanos) son una de la fuentes más importantes de contaminación en la industria alimentaria, debido a la diseminación en el ambiente de L.monocytogenes por parte de estos a través de la orina, heces y otras secreciones (Fig.1) (Blanco, 1994).

Se han aislado colonias de L.monocytogenes, de agua por la descongelación de refrigeradores domésticos, gracias a la capacidad de este microorganismo de soportar bajas temperaturas, lo que puede causar la contaminación cruzada de los productos refrigerados generando un riesgo para el consumidor (Blanco, 1994; Michanie, 2007; Farber, 1991; Mena et al., 2003).

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Otro punto de contaminación de los alimentos, es la contaminación cruzada por la mala higiene de equipos y personal que laboran en plantas de producción, en seis plantas de delicatesen en Francia, se identificó contaminación cruzada entre alimentos crudos y cocinados por los procedimientos inadecuados de limpieza y desinfección, como fuentes importantes de contaminación (Mena et al., 2003) 2.2.6.1 Leche y productos lácteos La leche y los productos lácteos son los alimentos en los cuales se han realizado mas investigaciones, debido a su alta incidencia en relación a los brotes de listeriosis presentados entre 1983 y 1987 en USA y Suiza.

L.monocytogenes por ser un microorganismo ubicuo puede contaminar a las vacas lecheras provocándoles mastitis, la cual puede presentarse con ó sin alteración mamaria y/o de la leche de los animales afectados y Listeria spp. puede seguir siendo excretada en la leche aun 3 meses después de la desaparición de los síntomas (Fig.1).

En los demás productos lácteos su presencia se debe a 2 factores: uno es la utilización de leche contaminada y mal tratada como materia prima para la elaboración de derivados lácteos (queso, leches achocolatadas, postres, etc.) y dos a la capacidad que tiene este microorganismo de crecer a temperaturas de refrigeración, y alcanzar niveles de hasta 107 ufc/mL durante el almacenamiento si el producto está contaminado (Blanco, 1994).

En estudios realizados por Mena et al. 2003 en Portugal, obtuvieron como resultado que de 6 muestras de leche cruda 1 estaba contaminada con Listeria (incidencia del 16.7%), de 28 muestras de leche pasteurizada ninguna presentó presencia del microorganismo, de 371 muestras de quesos fabricados a partir de leche pasteurizada 6 resultaron positivas (incidencia 1.6%) y de 50 muestras de queso fresco 2 dieron positivas en presencia del microorganismo (incidencia del 4.0%) y en España un estudio realizado por Vitas et al., 2003 obtuvieron que de 340 muestras de leche de vaca obtuvieron presencia de: 23 L.monocytogenes, 24

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L.innocua, 1 L.welshimeri, 1 L.seeligeri. La leche fresca pertenece a los productos crudos que sufren un proceso de cocción o calentamiento antes de su uso o consumo (Vitas et al., 2003) lo cual es reflejado por la ausencia de Listeria en las muestras de la lache pasteurizada, y la presencia de listeria en productos a partir de este tipo de materias primas es a causa de la contaminación cruzada durante elaboración de los productos.

La leche cruda permite una presencia medianamente alta de patógenos por el proceso de obtención, transporte y contaminación cruzada, pero como es un producto que no se consumirá crudo y sufrirá un proceso de calentamiento (pasteurización, UHT, entre otros) que asegurara la destrucción del 100% de patógenos no se tiene mucha relevancia sobre la misma. 2.2.6.2 Carne y productos carnicos Se ha aislado L.monocytogenes de muy diversos tipos de carne. La carne de ave y sus derivados, son los mas susceptibles y los que mayor incidencia presentan entre los diferentes alimentos investigados y la contaminación aumenta a medida que avanza el procesado y distribución del producto, aunque los recuentos obtenidos no son superiores a 102 UFC/mL (Vitas et al.,2003; Mena et al., 2003).

Las carnes rojas presentan una mayor presencia de Listeria spp. siendo esta mayor en la carne de porcino que en las de vacuno y ovino, aunque los recuentos no son superiores a 5 UFC/mL. En productos derivados como el paté se han llegado a obtener recuentos de hasta 106 UFC/g (Blanco, 1994).

Mena et al. 2003, analizaron 105 muestras de carne, 15 fueron de pollo crudo (músculo) de las cuales 9 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 60%), 17 de carne roja (músculo) de las cuales 3 dieron positivo (+) para la de Listeria (incidencia del 17.7%), 4 muestras de jamón de las cuales solo 1 dio positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 25%), 44 muestras de jamón curado (presunto) de los cuales 1 dio positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 2.3%) y 25 muestras de pescado crudo de las

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cuales 3 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 12.0%) y en España un estudio realizado por Vitas, y col. 2003 obtuvieron que de 295 muestras de carne cruda obtuvieron presencia de: 103 L.monocytogenes, 103 L.innocua, 45 L.welshimeri, 4 L.seeligeri, de 158 muestras de carne de ave de corral (pollo y pavo) obtuvieron presencia de 57 L.monocytogenes, 106 L.innocua, 6 L.welshimeri, 2 L.seeligeri.

Para las carnes crudas se acepta una presencia moderada de patógenos por los procesos que sufre el producto para su obtención (matanza, destripado, etc.) y la preparación de las porciones (picado, troceado, etc.) pero como estos productos sufrirán un proceso de cocción y su temperatura interna alcanzará los 70ºC y asumiendo que el proceso es listericida si realiza de manera correcta (Vitas et al., 2003; Mena et al., 2003). 2.2.6.3 Otros Alimentos Se han encontrado reportes de L.monocytogenes en productos refrigerados precocidos, listos para comer, congelados, y verduras y hortalizas crudas. (Blanco, 1994; Domínguez, 2001)

La presencia en alimentos listos para consumo (ALC) ó ready to eat , refrigerados y congelados se debe a que estos alimentos se consumen, sin ningún tratamiento térmico o tratamientos muy suaves, que no aseguran la eliminación de L.monocytogenes (Blanco, 1994).

Las investigaciones de Vitas et al.. 2003 y de Mena et al.. 2003, concuerdan en que los ALC poseen una alta probabilidad de causar listeriosis en los consumidores, aunque estos productos sufran procesos de conservación y/o maduración, y procesos de cocción que aseguren su inocuidad para los consumidores, el riesgo radica en la contaminación directa ó cruzada por contacto con superficies de equipos en los cuales se han manipulado alimentos crudos los cuales presentan una alta probabilidad de contaminación con Listeria spp. Otros estudios, han demostrado que los refrigeradores pueden ser una fuente potencial

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de colonización y contaminación de alimentos por parte de Listeria monocytogenes debido a su capacidad psicotrofa y a la generación de un ambiente adecuado para su desarrollo y multiplicación debido a la ausencia de microorganismos patógenos, y valores de pH y aw adecuados (Vitas et al., 2003). Algunos autores y entidades recomiendan cero tolerancia en 25 g de productos que posean un tiempo de vida útil mayor a una semana, debido a que investigaciones en microbiología predictiva han demostrado, que a una temperatura de almacenamiento de 0-5ºC y por más de 5 días la concentración final de listeria puede ser de 103 ufc/g partiendo de una concentración de 10 células, y si el almacenamiento es a 10ºC se puede alcanzar una concentración de 107 ufc/g , si el tiempo es menor recomiendan una concentración < 100 ufc/g, (Vitas et al.,2003).

Para los productos de carne cocinada y ALC, debido a sus cualidades y métodos de conservación como se ha descrito anteriormente, son un medio idóneo para el crecimiento de L.monocytogenes en todo el concepto microbiológico y por eso deben tener un control igual que el de productos que posean duración de más de una semana (Vitas et al., 2003; Mena et al., 2003). 2.2.7 Métodos de detección Desde la aparición de ETAs, ha habido una constante investigación, búsqueda y diseño de métodos más rápidos y más sensibles para la detección de microorganismos patógenos, sobre todo en la industria alimentaria, debido a las normas de gobiernos y organismos internacionales de ofrecer, alimentos inocuos para el consumidor y para mejorar su aceptación en el mercado ofreciendo tiempos de vida útil más largos.

Existen variados y diferentes procedimientos y protocolos avalados por agencias internacionales como FDA, ISO, para el aislamiento de Listeria monocytogenes, igualmente, existe gran diversidad de técnicas para la identificación de colonias aisladas, métodos de identificación epidemiológica y el futuro para la detección de

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microorganismos está encaminado a las tecnologías genéticas que se basan en el análisis del RNA y DNA (Gasanov et al., 2004).

Figura 2. Resumen modificado de técnicas y procedimientos generales de aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp. y Listeria monocytogenes en muestras ambientales y de alimentos (Gasanov et al., 2004). La mayoría de pruebas, protocolos y test usados para la detección de microorganismos en la industria alimentaria no diferencian las especies de Listeria.

Estos

protocolos

son

regulados

y certificados

por

agencias

gubernamentales como la FDA (Food and Drug Administration) o la USDA (US deparment of agricultura) en Estados unidos ó la ANZFA (Australian and New Zeland food administration) en Australia. Desde la perspectiva de higiene la presencia de alguna especie no patógenica de Listeria como L.innocua puede indicar la potencial transmisión o presencia de L.monocytogenes (Gasanov et al., 2004).

La mayoría de pruebas que se usan en la actualidad en los laboratorios de microbiología de alimentos para la detección de L.monocytogenes están basados

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en métodos de cultivo y anticuerpos, pero el reto de la industria alimentaría es usar métodos moleculares. Algunas de las desventajas de los método moleculares, es el costo de equipos y reactivos y que es necesario tener personal altamente entrenado y capacitado para este tipo de pruebas, aparte no diferencia entre células vivas y muertas, alguna de sus ventajas, es que no se basa en la expresión de factores antigénicos, enzimáticos o proteicos, es fiable y se basa en las diferencias entre los genomas y se pueden realizar en la misma fracción de tiempo que toman los métodos convencionales (Gasanov et al., 2004). 2.2.7.1 Métodos de aislamiento Históricamente, el aislamiento de Listera spp. de muestras de alimentos y ambientales ha sido un reto debido a la capacidad de este microorganismo de crecer a bajas temperaturas. Por lo que, antiguamente se solía aislar de las muestra clínicas poniéndolo a crecer en medios de cultivo a 4ºC por largos periodos de tiempo hasta poder evidenciar el crecimiento de colonias. Este tipo de método, toma demasiado tiempo y no permite la recuperación de células de Listeria spp. dañadas. Hay tres elementos claves: enriquecimiento, tiempo de aislamiento y recuperación de células dañadas, los cuales son factores que se han de tener en cuenta en los procesos de aislamiento si se desean obtener los mejores resultados para el control de Listeria spp. en la industria alimentaria.

Las pruebas aprobadas por agencias reguladoras, deben detectar por lo menos una célula de Listeria en 25 g de muestra ó producto a analizar. Esta sensibilidad solo se puede lograr usando métodos y medios en el cual el microorganismo sea capaz de llegar a una concentración de 104 UFC/mL el cual es un límite detectable. Dos de los protocolos más usados para la detección de Listeria spp. en cualquier alimento y que han sido certificados y avalados por agencias reguladoras son el método de análisis bacteriológico (BDMA) de la FDA y el de la Organización internacional de estándares (ISO) 11290, estos dos métodos poseen en común el uso de 25 g de muestra para enriquecimiento en un medio que sea selectivo e inhiba la microflora acompañante, y la siembra en medios sólidos selectivos e identificación bioquímica de las colonias sospechosas (Gasanov et al., 2004).

35

2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas Los métodos de enriquecimiento, demoran entre 30 y 48 horas y como se dijo anteriormente, debe continuarse con la identificación de los microorganismos aislados. Después de seleccionar un método de enriquecimiento validado para Listeria se debe considerar la extensión en la cual el método ha sido validado, en pocas palabras continuar usando protocolos validados y aceptados por agencias reguladoras. Mientras varios países tienen sus propios esquemas de validación, la AOAC en Washington, es la autoridad más reconocida en el mundo. La AOAC de métodos oficiales, posee una gran variedad de métodos para la búsqueda de Listeria que incluye métodos rápidos como inmunoensayos hasta pruebas basadas en genética

Para la identificación existen varios métodos tales como: Confirmación por pruebas bioquímicas, la Prueba de CAMP, pruebas de basadas en anticuerpos, ELISA, inmunocaptura, y a nivel de las pruebas moleculares tenemos: Hibridación de DNA y la PCR, en los estudios epidemiológicos se llega a la tipificación del microorganismo (Gasanov et al., 2004).

36

Figura 3. Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp. modificado (Gasanov et al., 2004) 2.2.8 Virulencia L.monocytogenes puede invadir el ojo y la piel del hombre después de una exposición directa, se ha observado en accidentes de laboratorio, veterinario y personal que labora en mataderos. Pero en la mayoría de casos de listeriosis en humanos la puerta de entrada es la parte superior del tracto gastrointestinal por el consumo de alimentos contaminados con dosis muy altas del microorganismos (106 UFC/mL ó g de alimento consumido) (Garza et al., 2002; Álamo et al., 2006).

La bacteria luego de entrar por el tracto, atraviesa la barrera mucosa del intestino probablemente ayudada por la endocitosis de las células endoteliales (placas de peyer), y crece eficazmente dentro de los enterocitos y mononucleares, lo cual

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permite que parte de su población alcance el torrente sanguíneo y se disemine por vía hematógena. Luego de la translocación del intestino el hígado es el primer órgano blanco donde se multiplica activamente antes de que la infección sea controlada por la inmunidad mediada por células, luego de alcanzar el hígado los otros tres órganos blancos de este patógeno son la placenta, el cerebro y el sistema nervioso, (Álamo et al., 2006; Reguera et al., 1995).

Cuando la bacteria se interna en la célula, sea por fagocitosis o fagocitosis inducida, queda englobada en un fagosoma monomembranal, del cual luego escapa asegurando su libertad en el citosol, multiplicándose libremente en el citoplasma, luego se desplaza por el interior hacia el exterior de la célula hospedora alcanzando las células subyacentes, quedando nuevamente englobadas en el nuevo hospedador dentro de un fagosoma bimembranal. En concreto, los eventos implicados en el proceso infectivo global, son (Vazquez et al., 2001; Garza et al., 2002) (figura 4):

i)

Entrada a las células del hospedador.

ii)

Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.

iii)

Desplazamiento intracitoplasmático.

iv)

Diseminación célula-célula.

Figura 4. Representación esquématica de la biología de la infección intracelular por L.monocytogenes (Reguera, et al., 1995)

38

2.2.8.1 Entrada a las células del hospedador La forma en la cual el microorganismo ingresa a las células no fagocíticas es semejante a la clásica fagocitosis, ya que implica la interacción del ligando del primero con el receptor de las segundas, como ya se dijo las placas de peyer y las células M son el primer sitio de invasión, posteriormente el bacilo es englobado por los macrófagos residentes. Las proteínas que participan en la internalización inducida de Listeria en la célula, son las internalinas A y B que son codificadas por los genes InlA e InlB. Luego de su ingreso las células quedan internadas en un fagosoma constituido de una sola membrana, que luego interactuara con un lisosoma para la destrucción de las bacterias pero este microorganismo es capaz de escapar antes que esto suceda (Garza et al., 2002; Domínguez, 2001). 2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. Dentro del fagosoma la bacteria queda englobada alrededor de 30 minutos en el caso de L.monocytogenes, el fagosoma se acidifica rápidamente por medio de ATPasas de protones. La supervivencia bacteriana y su posterior multiplicación en el citosol van a ser el resultado de una competición entre la fusión del fagosoma-lisosoma y la exposición oxidativa de las células hospedadoras (Domínguez, 2001), los mecanismos para evitar esto son la expresión de los genes (hly) de las toxinas líticas (listeriosina O con interacción sinérgica de fosfolipasas) para la destrucción del fagosoma y la expresión de dos enzimas, catalasa y superóxido dismutasa, que la protegen de la oxidación fagolisosómica (Garza et al., 2002).

Una vez que se concreta la lisis del fagosoma (en el fagosoma monomembranal solo interfiere la listeriosina O y en el fagosoma bimembranal intervienen las fosfolipasas junto con la listeriosina) el microorganismo se libera al citosol donde se multiplica en un tiempo de 50 minutos (Garza et al., 2002).

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2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático Dentro del citoplasma la bacteria expresa otro gen de virulencia denominado ActA, que es una proteína que manipula los componentes del citoesqueleto de la célula hospedadora para su tránsito intracelular e intercelular. Durante la internalización, el microorganismo absorbe varios filamentos cortos de actina (Garza et al., 2002), y durante su división se observa una densa nube de actina que la rodea. Asociada con la replicación bacteriana se va a producir una redistribución de los filamentos de actina, concentrándose en uno de los polos de la bacteria (Domínguez, 2001), formándose estructuras (actínicas) semejantes a la cola de una cometa.

Posteriormente, se produce una polimerización continua de la actina en dicho polo que mediante un mecanismo similar al de los cohetes, propulsa las bacterias por el citoplasma (Domínguez, 2001), aportando una fuerza locomotora que

logra

velocidades de 0.05 a 0.3 m/seg (Garza et al., 2002). 2.2.8.4 Diseminación célula-célula La adquisición de movilidad asociada a la polimerización de los filamentos de actina alcanza la membrana plasmática de la célula infectada para poder invadir a las células vecinas (Garza et al., 2002; Álamo et al., 2006).

Los bacilos se desplazan a través del citoplasma hacia la membrana citoplasmática, utilizando los filamentos de actina polimerizados, una vez logran este objetivo, la empujan progresivamente provocando que se produzcan prolongaciones alargadas llamadas filópodos o protruciones, desde cuyo interior continúan ejerciendo presión, de esta manera dichas proyecciones terminan siendo fagocitadas por las células adyacentes (Garza et al., 2002). Como consecuencia de esto, las bacterias quedan atrapadas en una vacuola rodeada por una doble membrana, la interna constituida por la membrana citoplasmática de la primera célula y la externa por la membrana de la nueva célula invadida (Domínguez, 2001; Vazques et al., 2001).

40

2.2.9 Listeriosis A pesar de la amplia presencia de la bacteria en el ambiente la enfermedad no es frecuente y afecta principalmente a adultos inmunocomprometidos, mujeres embarazadas, recién nacidos, granjeros, veterinarios y enfermos crónicos (Michanie, 2007).

La listeriosis presenta dos tipos de cuadros: invasivo y no-invasivo, el cuadro invasivo suele ocurrir en personas con sistemas inmunes muy débiles (VIH positivos, gerontes, embarazadas, fetos y neonatos, personas que padecen cáncer, diabetes, cirrosis, y en las que reciben medicamentos inmunodepresores o han sido sometidas a transplantes), y la no invasiva ocurre en cualquier persona que haya consumido una alta dosis de Listeria monocytogenes (Garza et al., 2002).

Figura 5. Representación esquemática de la fisiopatología de la infección por Listeria spp. (Vasquez et al., 2001) 2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis) Los síntomas son diarrea, fiebre, dolor muscular, dolor de cabeza, dolor abdominal y vomito en casos menos frecuentes, la incubación del microorganismo y reflejo de los síntomas se dan entre la primera hora y los 7 días.

41

2.2.9.2 Invasivo Las infecciones invasivas tienen un tiempo de incubación de 1 a 90 días, se presentan síntomas parecidos a una gripe, diarrea con presencia de vomito, tiene una mortalidad del 30% y una tasa de hospitalización del 92%, la concentración de microorganismo para causar la enfermedad es de 100-1000 células.

Las enfermedades que puede causar son (Garza et al., 2002; Michanie, 2007) :

I. Infecciones durante el embarazo. II. Granulomatosis linfatiséptica. III. Sepsis de origen desconocido (septicemia). IV. Meningoencefalitis, cerebritis, y romboencefalitis. V. Infecciones focales. 2.2.9.3 Tratamiento L.monocytogenes es susceptible a gran cantidad de antimicrobianos y su resistencia es ocasional, excepto a las tetraciclinas, estudios han comprobado que es capaz de adquirir genes de resistencia provenientes de Enterococcus spp. y Streptococcus spp. entre otros, lo cual puede aportarle resistencia a gentamicina, estreptomicina, eritromicina y sulfametoaxol (Michanie, 2007).

Algunos autores reportan que la combinación de penicilina, ampicilina y opcionalmente un amino glucósido (ej.gentamicina) es el más efectivo, algunos otros adicionan el tratamiento con quinolonas, macrolidos y trimetropimsulfametaxol, y otros recomiendan que la asociación ampicilina-cotrimoxazol, subrayando que es superior a la combinación de ampicilina-penicilinagentamicina, ya que reduce la mortalidad y las secuelas cerebrales (Garza et al., 2002).

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2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos 2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor) La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes microorganismos (bacterias, levaduras, mohos), y estos alimentos pueden resultar perjudiciales para la salud del consumidor.

El fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esterilizar y desinfectar desde la época de los griegos, siendo el calor aún hoy en día uno de los métodos más comunes para la destrucción de microorganismos (Prescott et al., 1999), debido a que los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a las de su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminarlos por termodestrucción, la sensibilidad de los microorganismos a los tratamientos térmicos es diferente, las esporas son más termorresistentes que las células vegetativas y los microorganismos Grampositivos lo son más que los Gram-negativos (Anónimo 2, 2007). 2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z Al someter a una población bacteriana a la acción del calor, a una temperatura constante, el número de supervivientes es una función exponencial del tiempo de tratamiento: a intervalos iguales de calentamiento la población se reduce en igual proporción. La cinética de destrucción microbiana es, por tanto, una cinética de reacción de primer orden (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007): Nt = N0 e-kt Siendo: Nt: número de microorganismos trás ―t‖ minutos de tratamiento. N0: número inicial de microorganismos. k: constante de inactivación. t: tiempo de tratamiento. Así pues, al representar el logaritmo del número de supervivientes a un tratamiento térmico, realizado a temperatura constante, frente al tiempo, se

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obtiene una línea recta. Esta representación se denomina gráfica de supervivencia (Palop, 2007).

Figura 6. Gráfica de supervivencia (Palop, 2007) 2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D) Para definir la termorresistencia microbiana se creó un parámetro al que se denominó ―tiempo de reducción decimal o valor DT‖ que se definió como el tiempo que es preciso tratar a una población microbiana a la temperatura T para reducir su recuento a la décima parte, o lo que es lo mismo, para que la línea de supervivencia atraviese un ciclo logarítmico. Si consideramos N0 como el número de células al inicio del tratamiento y NX el número de células sobrevivientes después de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el valor D se calcula:

𝐷𝑡 =

𝑋 𝑙𝑜𝑔 𝑁0 𝑁𝑥

DT= x/Log(N0/NX) ó DT=-1/m (donde m es la pendiente de la grafica de supervivencia (Prescott et al., 1999; Palop, 2007).

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Figura 7. Grafica de valor D (anónimo 1, 2007). 2.3.2.2 Valor Z Si aumentamos la temperatura del tratamiento, el valor D disminuye de forma logarítmica. Por tanto, representando el logaritmo de los valores DT frente a la temperatura de tratamiento, obtendremos una línea recta denominada gráfica de termodestrucción.

La

gráfica

de

termodestrucción

permite

conocer

la

termorresistencia que presentará el microorganismo a cualquier temperatura de tratamiento y su pendiente indica la termodependencia de las reacciones que conducen a su destrucción. A partir de la gráfica de termodestrucción se define el valor z como el número de ºC que hay que aumentar a la temperatura de tratamiento para reducir el valor DT a la décima parte, es decir, para que la línea de termodestrucción atraviese un ciclo logarítmico, el valor z se calcula: ΔT z = log DT2 – log DT1 o simplemente Z=-1/m (donde m es la pendiente de la gráfica de termodestrucción) (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007, Palop, 2007).

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Figura 8. Grafica de termorresistencia y valor Z. (Anónimo 2, 2007). 2.3.3 Termorresistómetro El termorresistómetro es un instrumento diseñado para la determinación de la resistencia de los microorganismos al calor. Este instrumento permite la aplicación directa de un tratamiento térmico preestablecido, durante un tiempo determinado en condiciones controladas, a una muestra de alimento o a un medio sintético. (Palop, 2007)

El termorresistómetro consiste en un tanque de acero presurizado, calentado por una resistencia eléctrica y homogeneizado mediante una hélice de agitación. La temperatura del instrumento se controla mediante un autómata programable. Está dotado de un puerto para adicionar los microorganismos, por medio de una jeringa y una aguja estéril. En este instrumento se pueden realizar tratamientos isotérmicos (temperatura constante a través del tiempo) y no isotérmicos (rampas de temperatura, la temperatura aumenta de manera gradual y constante durante el tiempo deseado hasta una temperatura final) (Fernández, 2007).

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2.3.4 Factores que microorganismos.

influyen

sobre

la

termorresistencia

de

los

En cualquier tratamiento antimicrobiano puede ocurrir que algunas células sean dañadas pero no mueran debido a que algunas células sean más termorresistentes que las demás por la producción de proteínas de choque térmico ó HSP (Heat Shock Proteins) u otros mecanismos (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006). Aparte de esto, la resistencia de los microorganismos al calor esta supeditada a una serie de factores, entre los cuales están:

-Tipo de microorganismos: Las bacterias esporuladas son las formas mas resistentes, llegando algunas de ellas, a sobrevivir a tratamientos de varios minutos a 120ºC, seguido están las bacterias vegetativas, levaduras y hongos presentan una termorresstencia similar, la mayoría mueren tras estar unos minutos a una temperatura entre 70 y 80ºC (Anonimo 3, 2007; Garza, 2007).

-Temperatura: Algunas investigaciones han demostrado que la termorresistencia de las esporas está influenciada por la temperatura de esporulación, así si la esporulación tiene lugar a la temperatura óptima de crecimiento, o superior, su termorresistencia será mayor que si el crecimiento hubiera tenido lugar en temperaturas más bajas. Las formas vegetativas presentan un comportamiento similar a las esporuladas pues en general, cuanto más se aproxima a la temperatura óptima de crecimiento durante la fase de crecimiento más elevada es su termorresistencia (Garza, 2007; Der Lin et al., 2003).

-pH del medio de tratamiento: Quizás el factor más importante que afecta la termorresistencia sea el pH. La resistencia de los microorganismos es generalmente máxima a valores de pH próximos a la neutralidad, entre 6.0 y 8.0, y decrece cuando el medio es ácido (Garza, 2007). Investigaciones de Hassani et al. 2003 y de Hassani et al. 2007, demostraron que a un pH ácido la termorresistencia disminuía y conforme aumentaba el pH la termorresistencia también aumentaba. -Actividad del agua: La reducción en la actividad del agua en el medio de tratamiento aumenta considerablemente la termorresistencia tanto en los esporos

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como en las células vegetativas, lo que se refleja en la necesidad de utilizar temperaturas de tratamiento más elevadas o tiempos más prolongados (Garza, 2007). Fernández, y col. 2006, realizaron un modelo en el cual el efecto del a w sobre la termorresistencia de L.monocytogenes varía dependiendo de la temperatura del tratamiento.

-Composición del medio: El contenido de azúcares, la adición de conservantes, la presencia y el tipo de ácidos orgánicos y la presencia de sales, tienen un efecto importante sobre la termorresistencia de los microorganismos. El azúcar en concentraciones altas protege a las células contra la inactivación térmica pero no solo la concentración influye, sino también el tipo de azúcar interviene significativamente en el efecto protector (Garza, 2007). La sal en los alimentos juega un rol importante pues el primer efecto que tiene sobre las células es la plasmolisis, luego tiene otros efectos como deshidratación, interferencia enzimática, retiro de oxígeno y la toxicidad de los iones, cloro y sodio, cuando el cloruro de sodio es ionizado (Der lin et al., 2003). Schultze, et al.. 2006, determinaron en su investigación que el D60 de L.monocytogenes en una mezcla de frankfurter con una concentración de 8.5% es de 2.2 minutos y a concentraciones de 11 y 23% fue de 1.7 minutos, lo que desmiente que una mayor concentración de grasas produce un aumento de la termorresistencia de los microorganismos.

Listeria spp. es capaz de sobrevivir a bajas temperaturas debido al cambio de composición que realiza en su membrana (Gandhi et al., 2006). Según la teoría de membrana fluida, la membrana en los organismos, al estar a temperaturas altas aumenta su proporción de ácidos grasos saturados, y a bajas temperaturas las de ácidos grasos insaturados y hopanoides.

Listeria spp. a bajas temperaturas,

aumenta la proporción de C15:0 a expensas de C17:0 cuando la temperatura es reducida de la ideal (7ºC), todo esto con el objeto de mantener la fluidez adecuada de la membrana (Gandhi et al., 2006) ajustándose al modelo de mosaico fluido de Singer y Nicholson.

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Las condiciones conocidas que afectan la resistencia a los tratamientos térmicos por parte de Listeria spp son, entre otros, el estado en el ciclo de crecimiento, temperatura alta (19 ò 37ºC) durante el crecimiento (debido a que afecta la biosíntesis de lípidos), la composición membranal y síntesis de proteínas, exposición a otros estreses y las células que se encuentran en fase estacionaria, influyen en la resistencia a la inactivación térmica por parte de este microorganismo. La termotolerancia tiende a aumentar significativamente después de un shock térmico (30 minutos a 48ºC) en células crecidas a 4ºC. El caldo de crecimiento juega un papel importante, pues afecta la tasa de crecimiento y la composición de constituyentes celulares que determinan la termotolerancia de las células bacterianas. (Doyle, 1999; Doyle et al., 2000). 2.4 Antimicrobianos naturales Los antimicrobianos son sustancias que pueden inhibir o detener el crecimiento de microorganismos, estos pueden ser de origen natural (animal, vegetal y microbiano) ó sintético (ácidos orgánicos y ésteres) (Raybaudi et al., 2006).

Se estima que en la parte aérea de las plantas, la filosfera y especialmente en las hojas,

existen

alrededor

de

106-107

células/cm2

(108

células/g)

de

microorganismos, principalmente bacterias. Globalmente las plantas producen más de 100.000 productos naturales de bajo peso molecular, también conocidos como metabolitos secundarios. Esta diversidad tan rica resulta de un proceso evolutivo para la adquisición de defensa mejorada frente a los ataques de microorganismos, insectos y otros animales (Domingo et al., 2003).

Desde tiempos antiguos y en la actualidad se conocen y reconocen las propiedades antimicrobianas de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. Se han realizado investigaciones y se ha encontrado que los compuestos presentes en estas plantas son derivados simples y complejos del fenol, los cuales son volátiles a temperatura ambiente (Marcén, 2000; Raybaudi et al., 2006).

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2.4.1 Aceites esenciales Los aceites esenciales (A.E.) son compuestos lipídicos muy olorosos obtenidos mediante la extracción de diferentes partes de plantas (flores, yemas, semillas, hojas, ramas, corteza, hierba, madrea, frutos, raíces, etc.) usando solventes orgánicos ó técnicas como la destilación. Estos aceites están compuestos por mezclas de ésteres, aldehídos, cetonas, terpenos, hidrocarburos cíclicos y alcoholes. Además son compuestos muy solubles en alcohol pero poco solubles en agua (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).

Los A.E que contenían un aldehído o un fenol como principal componente fueron los más activos frente a bacterias del tracto respiratorio, seguido por los alcoholes y, con una menor acción antimicrobiana, los aceites que contenían mayoritariamente cetonas, ésteres o hidrocarburos. La actividad de un aceite esencial está relacionada con sus constituyentes principales (estos pueden constituir hasta un 85% del total, mientras que el resto se presentan como trazas), la configuración estructural y grupos funcionales de sus compuestos, y con posibles sinergias entre los compuestos. En consecuencia hay que diferenciar entre la mezcla total del aceite esencial de una planta y cada uno de sus componentes activos (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).

La composición de los aceites esenciales puede variar mucho dependiendo de la variedad (propiedades determinadas genéticamente), la zona geográfica o climatología (medio ambiente), la edad de la planta, la parte utilizada en la extracción, y el método de secado y extracción del aceite (Castillejos, 2005). 2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales Los aceites esenciales al tener un gran número de compuestos, su acción antimicrobiana no se atribuye a un único mecanismo, sino a varios debido a los múltiples blancos en la célula. Una característica importante de los aceites esenciales es su hidrofobicidad, característica que les permite unirse a los lípidos de la membrana celular desestabilizando su estructura y aumentando su

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permeabilidad, generando la salida de iones, metabolitos y demás moléculas que pueden conllevar a la muerte (Burt, 2004; Castillejos, 2005). Estudios demuestran que la mayoría de las propiedades antibacterianas frente a microorganismos patógenos por parte de los A.E se debe en un alto porcentaje a los compuestos fenólicos como el timol, el carvacrol y el eugenol presentes en estos (Burt, 2004).

Según algunos estudios señalan, la localización y la cantidad de grupos hidroxilo sobre los grupos fenólicos de estas moléculas está relacionado con su toxicidad: una mayor oxidación es responsable de una mayor capacidad bactericida (Castillejos, 2005). Es razonable pensar que sus mecanismos de acción sean parecidos a los de otros compuestos fenólicos, generalmente se consideran la desestabilización de la membrana citoplasmática, la interrupción en la fuerza protón motriz (FPM), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación de componentes celulares, (Burt, 2004). También pueden actuar sobre las proteínas de la membrana citoplasmática. Los hidrocarburos lipofílicos pueden acumularse en la bicapa lipídica e interferir en la interacción lípido proteína. Además, también es posible una interacción directa entre los compuestos lipofílicos con la parte hidrofóbica de la proteína. Como consecuencia, pueden modificar la actividad de las enzimas que regulan la producción de energía o la síntesis de compuestos estructurales (Castillejos, 2005).

Figura 9. Localización y mecanismo de acción de los componentes de A.E sobre la célula bacteriana. (Burt, 2004; Castillejos, 2005)

51

Aparentemente los componentes de los A.E. interaccionan con las ATPasas que están presentes en la membrana citoplasmática (Burt, 2004), Gill y col. 2006, en su investigación determinaron que el eugenol, el carvacrol, y el cinemaldehido, componentes de aceites esenciales, inhibían la obligada actividad de la ATPasa de membrana de E.coli y L.monocytogenes. Las membranas bacterianas contienen un alto número de diferentes enzimas con función ATPasa incluyendo aquellas involucradas en el transporte activo de proteínas, como la ATPasa F1F0 que es la encargada de la regulación del pH celular. La inhibición de estas funciones puede afectar la sobrevivencia celular, las concentraciones para inhibir la actividad de las ATPasas es la misma que se necesita para la desestabilización de la membrana celular, lo que sugiere que la interrupción de las funciones de estas enzimas es una causa secundaria más que una primaria de la muerte celular.

Otra investigación de Gill et al. 2005, permitió evidenciar que el carvacrol y el eugenol aumentan la permeabilidad de la membrana afectando la movilidad de E.coli y L.monocytogenes ofreciendo gran evidencia que la desestabilización de la membrana es la causa primaria de la muerte celular por acción de estos compuestos. El flagelo de estas bacterias esta estructuralmente integrado a la membrana y el cual recibe energía proveniente del gradiente de protones más que por los intermediarios fosforilados del ATP. 2.4.1.2 Clavo (Eugenol) El clavo es una especia proveniente de las plantas del género Syzygium spp, esta ha sido usada desde tiempos antiguos en la medicina tradicional, teniendo usos de expectorante, estimulante, analgésico, anti flatulento, etc, y en la odontología como antiséptico, por lo cual es común encontrarlo en gomas y en cremas dentales para el tratamiento y prevención de la caries (Chaieb et al., 2007).

El aceite esencial proveniente del clavo está constituido por 36 componentes (Chaieb, K, et al., 2007) y con altas concentraciones de: eugenol (figura 12), caryophyleno, -humuleno, epóxido de humuleno, etil hexanoato, 2-heptanona,

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humulenol, calacoreno y calameneno (Chaieb et al., 2007; Raina et al., 2001; Fu et al., 2007).

Figura 10. Eugenol

El eugenol pertenece al grupo de los fenilpropanos que son sustancias ampliamente distribuidas entre los vegetales y se caracterizan por un anillo aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados biosintéticamente del ácido shikímico 2-metoxi-4-(2-peopenil) fenol (bolilla, 2007), los compuestos con estructura fenólica demostraron tener una actividad antimicrobiana superior debido a su carácter hidrofóbico. Estudios dan importancia al grupo hidroxilo y su localización en la estructura fenólica para obtener una mayor capacidad antimicrobiana (Castillejos, 2005).

Se teoriza sobre la posible interacción del grupo hidroxilo con proteínas inhibiendo su acción, concentraciones subletales de eugenol inhibieron la producción de las amilasas y proteasas de B.cereus. El deterioro de la pared celular y el alto grado de la lisis celular también se comprobó en otras investigaciones (Burt, 2004).

Estudios han comprobado la eficacia del aceite esencial del clavo como antimicrobiano pero todavía no se conoce muy bien su forma de acción, pero se sabe que el componente responsable de esta actividad antimicrobiana es el eugenol. Kamel y col. 2007, determinaron la acción antibacteriana del eugenol

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extraído del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, L.monocytogenes, E.fecalis, P.aureginosa, S.typhimurium y M.luteus, y determinaron que el menor diámetro de inhibición fue de 8 mm. Para L.monocytogenes el halo de inhibición por parte del A.E fue de 15 mm con una DS (desviación estándar) de 0, dando un resultado muy bueno al compararlo con la gentamicina que dio como resultado un halo de 38mm sobre este mismo microorganismo.

En otro estudio Fu y col. 2007, realizaron un estudio de la actividad antimicrobiana del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, P.aureginosa, B.subtilis y P.vulgaris encontraron que a menor halo de inhibición fue de 9mm para P.aureginosa y el mayor fue de 18.2mm para P.vulgaris lo cual fueron resultados óptimos teniendo como control la estreptomicina. 2.4.1.3 Tomillo (Carvacrol y Timol) El tomillo es una especia proveniente de las plantas del género Thymus spp, y se le

atribuyen

propiedades

antiespasmódica,

expectorante,

antiséptica,

antiinflamatoria y otras más (Ettayebi et al.,1999; López, 2006; Bounatirou et al., 2007). El tomillo es usado en la industria alimentaria como agente saborizante y aromático y en las preparaciones farmacológicas su aceite esencial esta en le ranking de los 10 aceites esenciales más usados en el mundo (Solomakos et al., 2007; Rasooli et al., 2005).

Se sugiere que la presencia y el número de grupos hidroxilo sobre el grupo fenol de estas moléculas está relacionado con su toxicidad: una mayor hidroxilación es responsable de una mayor capacidad bactericida. La presencia del grupo hidroxilo en la molécula de carvacrol, al igual que en el timol, provoca la entrada y el escape de iones potasio (Figura 13), que conlleva a la disminución del pH, el aumento en el gasto de energía (ATP) y, finalmente, la muerte celular del patógeno. (Castillejos, 2005).

54

Figura 11. Esquema sugerido de acción sugerido para el carvacrol sobre la membrana citoplasmática (Castillejos, 2005) El aceite esencial que se obtiene del tomillo esta compuesto por 60 componentes (Solomakos et al., 2007) de los cuales 32 fueron identificados por Bounatirou, y col. 2007. Los componentes mayoritarios y a los cuales se les atribuye la capacidad antibacteriana son el timol y el carvacrol y se da alguna responsabilidad minoritaria a los componente minoritarios como lo son el p-cimeno, -terpineno y -caryphyleno los cuales pueden actuar de manera sinérgica con el timol y el carvacrol aumentando su capacidad antimicrobiana (Bounatirou et al., 2007; Solomakos et al., 2007). Muchos autores discrepan sobre cual es el componente mayoritario del tomillo (timol ó carvacrol) y dan diferentes porcentajes de presencia de cada uno. Burt, 2004, en su revisión da que el timol esta entre un 10 a un 64%, el carvacrol está entre un 2 a 11%, el -terpineno entre un 2 a 31% y que el p-cimeno esta entre un 10 a 56%, por otro lado Bounatirou, y col. 2007, comentan que el p-cimeno está en mayores cantidades cuando el carvacrol está en menores cantidades y esto se presenta cuando la parte de la planta que se usa para la extracción del aceite esencial es muy joven, y aseveran que este aceite es el precursor del carvacrol.

El timol (figura 14) y el carvacrol (figura 15), son compuestos fenólicos que son similares estructuralmente difiriendo en la posición del grupo hidroxilo. Como ya

55

se dijo en el apartado anterior, los compuestos con estructura fenólica poseen una mayor actividad antimicrobiana que los que no la poseen y la presencia y localización del grupo hidroxilo es un factor importante en esta actividad, Algunos investigadores, observaron que el carvacrol y el timol actuaban de forma diferente frente a microorganismos Gram positivos y negativos, también en otros estudios no se observó la importancia de la posición del grupo hidroxilo, y la capacidad antimicrobiana del timol y carvacrol fue similar (Castillejos, 2005).

Figura 12. Timol

Figura 13. Carvacrol El carvacrol y el timol aumentan la permeabilidad de la membrana celular desintegrando la membrana externa de las bacterias Gram negativas, liberando los lipolisacáridos (LPS) y aumentando la permeabilidad de la membrana citoplasmática a ATP (Castillejos, 2005; Burt, 2004). Las mediciones de ATP

56

interno y externo revelaron que el ATP celular interno disminuía mientras que no había un aumento proporcional en el exterior celular, de acuerdo a esto se presume que la tasa de síntesis de ATP disminuyo o que la tasa de hidrólisis de ATP incrementó. En un estudio, se evidenció que las toxinas diarreicas de B.cereus se vieron inhibidas por la presencia de carvacrol tanto en medio de cultivo como en sopa y esto puede deberse a que la excreción de la toxina es un proceso activo, y de acuerdo a las dos presunciones anteriores no hay suficiente ATP o fuerza protonmotriz (FPM) para exportarla fuera de la célula. Alternativamente el crecimiento específico da a teorizar que la célula usa la energía (ATP) para mantener las funciones vitales para sostener su viabilidad, dejando a un lado la producción de toxinas (Burt, 2004).

El carvacrol interactúa con la membrana uniéndose a la bicapa de fosfolípidos, provocando la desestabilización de la misma, aumentando su fluidez e incrementando la permeabilidad pasiva. También, se ha observado el paso de metabolitos celulares a través de la membrana celular. El potencial de membrana también disminuye, debilitando la FPM y el gradiente de pH a través de la membrana (Catillejos, 2005). Se concluye por tanto que el carvacrol crea canales a través de la membrana empujando las cadenas de ácidos grasos de los fosfolípidos, permitiendo que los iones abandonen el citoplasma (Burt, 2004).

Por otro lado, el timol se une a las proteínas de membrana de manera hidrofóbica y por puentes de hidrogeno, lo que cambia las características de la permeabilidad de la membrana. Estudios demostraron, que el timol tiene un efecto más inhibitorio en un pH de 5.5 que en uno de 6.5. Al estar en un pH acido la molécula de timol se vuelve más indisociable y por tanto mas hidrofóbica, y por tanto se puede unir mejor a las aéreas hidrofóbicas de las proteínas disolviéndose mejor en la fase lípida (Burt, 2004) lo que puede apoyar la confirmación de la salida de iones intracelulares de K+ (Castillejos, 2005) por el cambio de la permeabilidad de la membrana.

57

2.5 Modelo y distribución Weibull El método convencional para calcular la eficiencia de la inactivación térmica de los microorganismos en seguridad alimentaria, se basa en el método clásico de los valores D y z, desarrollado por Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo,1973), el cual se basa en la hipótesis de que las curvas de supervivencia microbianas y de esporas bacterianas siguen una cinética de primer orden, apoyándose en el postulado de la teoría mecanística en la cual la muerte celular es causada por la inactivación de enzimas vitales ó de complejos enzimáticos.

En consecuencia, el valor D es estimado a partir de la relación lineal que existe entre el logaritmo de la reducción decimal del número de microorganismos supervivientes y el tiempo del tratamiento a una temperatura dada. En muchos casos, en las curvas de supervivencia obtenidas a partir de tratamientos térmicos no se observa una relación lineal, y por tanto no obedece una cinética de primer orden, siendo normalmente observado los fenómenos de hombros (concavidades hacia abajo) y colas (concavidades hacia arriba).

Se han desarrollado y propuesto gran variedad de modelos para la descripción de las curvas de supervivencia no lineales, algunos de tendencia mecanística o pseudo-mecanistica o simplemente empíricos. La teoría mecanística postula que todos los microorganismos de una misma población tienen la misma probabilidad y por tanto existe una homogeneidad en la población. En contraposición a esta teoría, está la teoría probabilística, la cual asume que ―en una población, aunque esta sea pura, existe una variación biológica, en otras palabras, una heterogeneidad entre las células microbianas‖ (van Boekel, 2002) por tanto, la muerte celular por la inactivación térmica no está gobernada por modelos cinéticos de primer orden, hallándose más relacionada a una distribución exponencial.

Existen gran variedad de modelos para sustentar esta teoría; entre estos el modelo Weibull es el que gana en popularidad debido a su simplicidad y flexibilidad. Su

58

uso se debe a la aplicación del principio de la parsimonia, el cual postula: que para un problema existen dos ó más respuestas y entonces la más simple será la correcta, argumentándose lo anterior en la teoría de la navaja de Ockham la cual se fundamenta en dos premisas muy simples: ―en igualdad de condiciones la solución más sencilla es probablemente la correcta” y ―No ha de presumirse la existencia de más cosas que las absolutamente necesarias”, indicado lo anterior las explicaciones nunca deben multiplicar las causas sin necesidad. Lo anterior en pocas palabras indica que el modelo presenta mayor flexibilidad, robustez y simpleza entre los demás modelos (Mafart et al., 2002; van Boekel, 2002).

El modelo proviene de ingeniería donde se usa para describir el tiempo de fallo en sistemas mecánicos y electrónicos y es igualmente útil para el análisis de datos de supervivencia en microbiología, como por ejemplo, el tiempo de muerte luego de la aplicación de un estrés.

La forma acumulativa de la distribución de Weibull para el análisis de curvas de supervivencia no lineales (Eq.1) fue empleada (Ruiz et al., 2002): 𝐿𝑛

𝑁 𝑁𝑜

=−

𝑡 𝛽 𝛼

(1)

La cual fue modificada por Mafart et al., 2002 (Eq.2) y esta última es la que se aplicará en la investigación para la modelización:

𝐿𝑜𝑔

𝑁 𝑁𝑜

=−

𝑡 𝑝 𝛿

(2)

Donde No es el número inicial de microorganismos (CFU/mL), N el número de supervivientes luego de un tiempo de exposición en un tratamiento térmico t (CFU/mL), t tiempo del tratamiento (min), δ tiempo de la primera reducción decimal o factor de escala, p factor de forma (Mafart et al., 2002).

La distribución de Weibull puede ser:

59

a. Cóncava hacia arriba si p1 (Fig.16A), que indicaría que las células supervivientes se volverían mas termosensibles, en otras palabras; el daño acumulado provocado haría más difícil que las células sobrevivan. c. Y seguiría una distribución exponencial si p=1 (Fig.16C), lo que indica que la probabilidad de muerte de las células no depende del tiempo, o en otras palabras, cada célula es igualmente susceptible no importando cuanto dure el tratamiento. La hipótesis implícita es que no existe variación biológica, por lo que se ajustaría a una cinética de primer orden clásica (valores D y z). (Mafart et al., 2002; Van Boekel, 2002; Chen and Hoover, 2004).

60

Figura 14. Ejemplo Modificado de concavidades (A) Concavidad hacia abajo p>1, (B) Concavidad hacia arriba p1 existe una correlación pero con cierta desviación, es decir, existe una buena correlación entre los valores predichos y los experimentales pero no es exacta, si Af=1 existe una correlación exacta, denotando que los valores experimentales y los de la predicción encajan perfectamente, en ambos casos los modelos son seguros y la probabilidad de fallo es mínima; no obstante si Af0,05) entre las diferentes combinaciones probadas y sus replicas.

78

7.1 Tratamientos térmicos Se realizaron tratamientos isotérmicos y no isotérmicos, para observar el comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 utilizando las graficas de supervivencia, con el propósito de determinar el tratamiento que presentaba las mejores condiciones y así evaluar el efecto producido sobre el patógeno al combinarlo con aceites esenciales de clavo y tomillo. 7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC Luego de aplicar el tratamiento isotérmico a 55ºC por un tiempo de 30 minutos, se obtuvo una disminución de un ciclo logarítmico (4,43x107 UFC/mL) en el medio BHIA con respecto a la población inicial (8,93x108 UFC/mL) y de 4 ciclos logarítmicos (8x104 UFC/mL) en el medio BHIA+NaCl con respecto a la población inicial (6,8x108 UFC/mL) (figura 15). En la tabla 14, se muestran los valores D, junto con los intervalos de confianza (IC), R2 y coeficiente de

Log ufc/ml

correlación (r0).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

55º ISO NaCl 55ºC

0

10

20

30

40

Tiempo (min)

Figura 15. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones isotérmicas (55ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl

79

Tabla 14. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación (ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento isotérmico a 55ºC.

Sin NaCl

D(a)

ICs

ICi

R2

23,19

48,83

2,02

0,99

16,33

1,17

0,97

7,30 NaCl (a) Media de tres réplicas

Como puede observase en el medio de recuperación no selectivo, el cual permite el crecimiento de todas las células (tanto lesionadas como no lesionadas), se obtuvo un D55=23,19, indicando que la población de Listeria monocytogenes CETC 4032 disminuye un ciclo logarítmico tras 23 minutos de tratamiento en promedio, y permite deducir que el microorganismo posee una alta termorresistencia a estas condiciones

En comparación, en el medio de recuperación selectivo, que solo permite el crecimiento de células no lesionadas letalmente por el tratamiento térmico, se obtuvo un D55NaCl=7,30, indicando que la exposición del microorganismo a un factor adicional reduce en más de 10 veces el tiempo necesario para disminuir la población de L.monocytogenes CETC 4032 en 1 ciclo logarítmico. En la figura 15, se puede observar que casi la mitad de la población sufre daños sub-letales por el tratamiento térmico aplicado, corroborándose así uno de los principios de la teoría probabilística, el cual postula que “en un cultivo puro existe una heterogeneidad entre las células” (Van Boekel, 2002). Los resultados anteriores, se asemejan a los obtenidos por Miller et al., 2006, en su investigación, en la cual determino que el D55 para Listeria innocua en un medio selectivo es de 10,66 minutos con un R2 de 0,97.

Los

resultados

anteriores, conllevan a deducir que la población de

L.monocytogenes CETC 4032 después de aplicarle un proceso isotérmico a 55ºC

80

durante 30 minutos se reduce en: i) un 50% si el microorganismo posteriormente del tratamiento se recupera en un medio que contenga un elemento de inhibición adicional y ii) en un 10% si el medio carece de este componente. Esto sugiere, que el daño causado a la población es a nivel de factores vitales de crecimiento y de recuperación, pudiendo ser estos enzimas o proteínas.

Cuando se aplico el tratamiento isotérmico a 60ºC por un tiempo de 5 minutos, se obtuvo una disminución de 6 ciclos logarítmicos (1,92x103 UFC/mL) con respecto a la población inicial (1,25x109 UFC/mL) en el medio BHIA y de 7 ciclos logarítmicos (4,83x101 UFC/mL) con respecto a la población inicial (6,32x108 UFC/mL) en el medio BHIA+NaCl. Cabe resaltar, que la población inicial en el medio de recuperación selectivo se encontraba 1 ciclo logarítmico por debajo con respecto a la población inoculada (4,8x109 UFC/mL) y a la del medio de recuperación no selectivo, como se observa en la figura 16, evento que no sucedió en el tratamiento a 55ºC. En la tabla 15, se especifican los valores D junto con los IC, R2 y r0.

10 9 8

Log UFC/mL

7 6 5 60ºC NaCl

4

60ºC

3 2 1 0 0

1

2

3

4

5

6

Tiempo (min)

Figura 16. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones isotérmicas (60ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.

81

Tabla 15. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación (ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento isotérmico a 60ºC. D(a)

ICs

ICi

R2

BHIA

0,87

2,02

0,16

0,96

BHIA+NaCl

0,78

2,39

0,26

0,83

(a) Media de tres replicas Como puede notarse, el valor D60 en el medio de recuperación no selectivo fue de 0,877, lo que sugiere que es necesario un tiempo de 0,88 minutos, para disminuir la población de L.monocytogenes CETC 4032 en 1 ciclo logarítmico, y que el microorganismo bajo esta condición no presenta una alta resistencia al tratamiento.

Sin embargo, en el medio de recuperación selectivo se obtuvo un D60NaCl= 0,783, indicando que son necesarios 0,78 minutos para disminuir la población 1 ciclo logarítmico, pero como se comento anteriormente, la población inicial fue 1 unidad menos en comparación con la del cultivo inoculado y con la población inicial del medio no selectivo. Este resultado, apunta a que un 10% de la población sufrió un daño letal con el simple hecho de ponerla en contacto con el medio a la temperatura de tratamiento, sugiriendo, que el daño producido pudo haber sido sobre componentes celulares, los cuales son importantes para la recuperación y crecimiento de L.monocytogenes CETC 4032. Estos valores, no se asemejan a los obtenidos por Miller et al., 2006, en su investigación con Listeria innocua donde obtuvo un D60 de 2,73 en un medio no selectivo y de 1,08 en un medio selectivo, apuntando esto a que posiblemente L.monocytogenes es menos termorresistente que L.innocua en un tratamiento isotérmico a 60ºC.

Estos resultados, señalan que el daño recibido por L.monocytogenes CETC 4032 a causa de un tratamiento isotérmico a 60ºC es letal, logrando una termodestrucción de más del 50% de la población, tanto en el medio selectivo como en el no selectivo tras 5 minutos de tratamiento. Si el medio en el cual el microorganismo

82

se encuentra, no contiene un factor de inhibición adicional menos del 50% de la población podrá recuperarse, pero si el medio presenta un factor de inhibición adicional solamente un 10% de la población sería capaz de recuperarse.

A partir de los resultados obtenidos se calcularon los valores z que se presentan en la tabla 16. Tabla 16. Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos.

D55

D60

Z

BHIA

23,19

0,88

3,51

BHIA NaCl

7,30

0,78

5,16

De acuerdo, con los resultados anteriores, se puede deducir que aplicar un tratamiento isotérmico a 55ºC no es efectivo para la termodestrucción de L.monocytogenes CETC 4032, pues el D obtenido es demasiado alto y sería necesario un mayor tiempo para una disminución significativa de la población, opción que no es muy favorable, si el tratamiento se quisiera evaluar sobre un alimento. Pero si el alimento tratado, contiene otros factores de inhibición de crecimiento como: pH, aw, atmosfera modificada, entre otros, puede que el tratamiento sea más efectivo, produciendo una reducción significativa en el tiempo de tratamiento, siendo muy interesante su evaluación.

En el caso de un tratamiento a 60ºC, los resultados obtenidos son destacables, pues en un tiempo relativamente corto se reduce la población en casi el 50% y en presencia de un factor de inhibición adicional se destruye cerca del 90%, con una disminución de casi un 10% al contacto del microorganismo con el medio, siendo el tratamiento propicio para ser evaluado en un alimento y observar el comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032, incluso también podría evaluarse si el alimento ó alguno de sus componentes influyesen en un aumento o disminución del efecto del tratamiento sobre el microorganismo.

83

7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC El estudio del comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 bajo condiciones de inactivación no isotérmicas (55ºC y 60ºC), asemejan las condiciones reales durante un proceso de pasteurización, tratamiento que es empleado en la industria alimentaria, lo cual concibe un mayor interés en su evaluación e investigación.

Los tratamientos se realizaron conforme a los perfiles de aumento de temperatura establecidos en la metodología (ver tabla 4) presumiendo una disminución del valor D y en consecuencia un incremento en la reducción de la población, partiendo de la suposición, de que un tratamiento no isotérmico es más letal que un tratamiento isotérmico. Al efectuar el tratamiento a 55ºC, exclusivamente con el aumento de temperatura establecido en la metodología, no se observó una reducción importante en la población de L.monocytogenes CETC 4032, durante el tiempo que requirió el termorresistometro para lograr que el medio de evaluación alcanzase la temperatura final de tratamiento, el cual fue de 3 minutos aproximadamente. Resultados similares, se obtuvieron en el tratamiento a 60ºC. Al ver que los resultados obtenidos eran contrarios a los esperados se adicionó un perfil isotérmico, el cual tenía como temperatura establecida la temperatura final de cada tratamiento, de acuerdo con lo propuesto por Conesa et al., 2003 en su investigación.

En la figura 17, se presenta la curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 elaborada a partir de los resultados obtenidos en el tratamiento a 55ºC en ambos medios:

84

9,000 8,000 7,000

Log UFC/mL

6,000 5,000 4,000

N.I 55

3,000

N.I 55 NaCl

2,000 1,000 0,000 0

10

20

30

40

50

60

70

Tiempo (min)

Figura 17. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no isotérmicas (N.I) a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl. Si se amplía lo sucedido durante el periodo no isotérmico (0-3 min) del tratamiento se observa lo siguiente (fig. 18):

8,400 8,200

Log UFC/mL

8,000 7,800 55ºC

7,600

55ºC NaCl 7,400 7,200 7,000 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Tiempo (min)

Figura 18. Comportamiento de la población de L.monocytogenes CETC 4032 durante el perfil N.I a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.

85

Estos resultados apuntan a que durante el periodo del aumento gradual de temperatura, la población del microorganismo no disminuye, lo cual ya ha sido comentado, dándose la disminución durante el perfil isotérmico (60 minutos). En la tabla 17, se muestran los valores D, IC, r0 y R2 calculados para este tratamiento. No obstante, se podría sugerir que estos resultados pertenecen más a un tratamiento isotérmico que a uno no isotérmico y por tanto los valores D calculados son fiables, debido a la disminución exponencial de la población. Tabla 17. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación (ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no isotérmico a 55ºC.

D

ICs

ICi

R2

DNI55

13,16

28,92

1,86

0,96

DNI55NaCl

10,52

23,97

1,87

0,93

Si se detallara el comportamiento del microorganismo durante los 63 minutos de duración del tratamiento, podría decirse, que en el medio de recuperación no selectivo durante los 3 primeros minutos la población se mantuvo en el mismo nivel, a los 10 minutos siguientes la población disminuyo 2 ciclos logarítmicos (3,67x106 UFC/mL) y al minuto 63 la población había disminuido 5 ciclos logarítmicos (3,63x103 UFC/mL), todo lo anterior con respecto a la población inicial en el mismo medio (1,67x108 UFC/mL). Mientras, en el medio de recuperación selectivo durante los 3 primeros minutos, la población disminuyo un ciclo logarítmico (1,33x107 UFC/mL), a los 10 minutos siguientes, se observó una disminución de 3 unidades logarítmicas, y al minuto 63, la población había disminuido 6 ciclos logarítmicos (1,36x102 UFC/mL) con respecto a la población inicial (1,47x108 UFC/mL) en el mismo medio.

De acuerdo con lo anterior, se podría inferir varios comportamientos de L.monocytogenes CETC 4032 frente al tratamiento y la repercusión del mismo sobre el microorganismo. En la grafica 17, se puede observar que la disminución

86

de la población luego de los 3 primeros minutos sucedió de manera exponencial, pero desde el minuto 33 hasta el 43 la población de L.monocytogenes CETC 4032 generó una resistencia al tratamiento térmico de casi 10 minutos en ambos medios. Lin, et al., 2003 en su investigación con L.monocytogenes encontró que luego de aplicar un tratamiento térmico al microorganismo, este incremento su tolerancia a otros factores de inhibición, como el NaCl, a modo de efecto secundario, resultado que concuerda con lo observado en nuestra investigación.

Aunque el microorganismo incremento su resistencia al tratamiento durante un corto periodo de tiempo, se puede presumir que durante la fase de calentamiento, el microorganismo experimento un daño letal, posiblemente al aumento rápido de la temperatura, lo cual se vio reflejado en la disminución de la población y en la reducción de casi 10 veces el valor D en comparación con el obtenido en el tratamiento isotérmico.

En la figura 19, se presenta la curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 a partir de los resultados obtenidos en el tratamiento a 60ºC en ambos medios. Se puede observar, que durante los primeros 2 minutos de tratamiento se produce la aparición de hombros, apuntando esto a una acumulación de daños letales por parte del microorganismo debido al efecto de la temperatura, lo cual provocó una reducción en la población, confirmándose lo anterior en los tiempos subsiguientes, donde se detalla una disminución exponencial de casi la mitad de la población a los 4 minutos en el medio no selectivo y de casi un 90% al quinto minuto en el medio selectivo; sin embargo, posteriormente se evidencia la presencia de colas que de acuerdo con los resultados obtenidos por Mafart et al., 2002; Aragao et al., 2007 y van Boekel, 2002, indica que la población superviviente ha generado una resistencia tal al tratamiento que su eliminación es complicada.

87

9,000 8,000 7,000 6,000 5,000 N.I 60ºC 4,000

N.I 60ºC NaCl

3,000 2,000 1,000 0,000 0

2

4

6

8

10

Figura 19. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no isotérmicas (N.I) a 60ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl. La fase de calentamiento ocasionó daños letales en L.monocytogenes CETC 4032, resultados similares se obtuvieron en el tratamiento a 55ºC, sin embargo, a diferencia del anterior, este tratamiento no fue más eficaz que el isotérmico a la misma temperatura. En la grafica de inactivación térmica del microorganismo durante el tratamiento, se observó la presencia de los fenómenos de hombros y colas, a consecuencia de esto, los valores D calculados empleando el método tradicional propuesto por Bigelow, no son fiables, ver tabla 18. Fernández et al., 1999, sugirieron que en este tipo de resultados el valor D debe ser determinado, considerando la sección lineal de la curva, lo cual no se pudo llevar a cabo en este caso, dado que tan solo se tomarían en cuenta 3 datos lo que no es un número de datos estadísticamente representativo.

88

Tabla 18. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación (ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no isotérmico a 60ºC.

D

ICs

ICi

R2

DNI60

1,32

3,27

0,32

0,88

DNI60NaCl

0,92

2,15

0,18

0,92

A partir de los resultados obtenidos de los tratamientos se calcularon los valores Z que se presentan en la tabla 19. Tabla 19. Valores Z obtenidos para tratamientos no isotérmicos.

D55

D60

Z

N.I

13,16

1,32

5,00

N.I NaCl

10,52

0,92

4,72

El aumento de la termorresistencia por parte de L.monocytogenes CETC 4032 durante los tratamientos no isotérmicos, puede deberse a la activación de genes que producen cambios en la composición de su membrana y/ó producción de proteínas de shock térmico (HPS) (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006) dándose esta activación durante la fase de calentamiento. 7.1.2.1 Predicciones Con los resultados experimentales obtenidos a partir de los tratamientos no isotérmicos, se aplicó el valor F para la predicción del comportamiento del microorganismo. Las predicciones se realizan, con objeto de poder extrapolar los tratamientos a medios ó alimentos con características parecidas ó similares al medio utilizado, dando un avance en el conocimiento de la cinética de muerte de L.monocytogenes CETC 4032 frente a los tratamientos aplicados.

89

De acuerdo a Periago et al., 2004, la eficacia de un proceso de preservación térmica tiende a ser evaluado en términos de valores F. Los valores F, son calculados utilizando la integración del efecto acumulativo del cambio de temperatura durante el tratamiento del organismo blanco o espora incorporándolo en la formula (Eq.5).

𝐹 = 10

T−T R Z

(5)

Donde T es la temperatura del medio en un tiempo t del tratamiento, TR es la temperatura de referencia (ºC) y Z es el incremento de temperatura necesario para reducir en un ciclo logarítmico el valor D a la temperatura de referencia (TR) en un tratamiento isotérmico.

El valor F puede definirse como el efecto equivalente de f minutos a TR (asumiendo un calentamiento y enfriamiento instantáneo), sumando todos los efectos letales producidos durante todas las combinaciones de tiempo y temperaturas durante el tratamiento (Stumbo, 1973). Los tratamientos no isotérmicos, se pueden considerar como tratamientos isotérmicos de muy corta duración a temperaturas progresivamente altas (Conesa et al., 2003)

A partir de los datos obtenidos por el registrador de temperaturas, se realizó la integración de las temperaturas (Valor F) utilizando la ecuación 5 en todos los tiempos; con los resultados obtenidos se aplico la ecuación 6 (Eq.6) para la obtención de la población superviviente teórica (tablas 20, 21, 22 y 23).

𝐿𝑜𝑔 𝑁 = 𝐿𝑜𝑔 𝑁0 –

𝐹 𝐷

(6)

Donde N es el número de células supervivientes, N0 es la población en el tiempo 0, F es la letalidad integrada y D es el tiempo de reducción decimal isotérmico a la temperatura final del tratamiento no isotérmico evaluado.

90

Los resultados obtenidos a partir de la ecuación 6 se graficaron (figuras 20, 21, 22 y 23) junto con los resultados experimentales, para obtener una mejor interpretación de las predicciones y su ajuste frente a los resultados reales, sustentando esto último con el factor Af (tabla 20, 21, 22 y 23).

Tabla 20. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico hasta 55ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC 4032 en el medio BHIA.

Tiempo (min)

Temperatura (ºC)

Letalidad Acumulada (min a 55ºC)

Supervivientes Log UFC/mL (Predicción)

Supervivientes Log UFC/mL (experimentales)

0 1 2 3 13 23 33 43 53 63 Af

24,96 38,7 46,93 57,01 55,81 55,9 55,85 55,84 55,71 55,88

4,87E-11 1,37E-06 0,002 0,85 18,17 35,33 52,58 69,90 87,30 104,70

8,22 8,22 8,22 8,18 7,44 6,70 5,95 5,20 4,45 3,70

8,22 8,02 8,10 8,23 6,56 5,90 4,93 4,74 4,27 3,56

1,07

91

9 8 7

Log UFC/mL

6 5 4

prediccion

3

experimentales

2 1 0 0

20

40

60

80

Tiempo (min)

Figura 20. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA. Tabla 21. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico hasta 55ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA+NaCl. Tiempo (min)

Temperatura (ºC)

Letalidad Acumulada (min a 55ºC)

0 1 2 3 13 23 33 43 53 63 Af

24,96 38,7 46,93 57,01 55,81 55,9 55,85 55,84 55,71 55,88

2,48E-08 5,71E-05 0,02 0,72 15,20 29,66 44,17 58,71 73,31 87,90

Supervivientes Log UFC/mL (Predicción)

8,16 8,16 8,16 8,06 6,08 4,10 2,11 0,12 -1,87 -3,86 1,70

92

Supervivientes Log UFC/mL (experimentales)

8,16 8,07 7,47 7,12 5,44 4,60 3,56 3,46 2,65 2,13

10 8

Log UFC/mL

6 4 prediccion NaCl

2

experimentales 0 0

20

40

60

80

-2 -4 -6

Tiempo (min)

Figura 21. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA+NaCl. Tabla 22. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico hasta 60ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA.

Tiempo (min)

Temperatura (ºC)

Letalidad Acumulada (min a 60ºC)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

25,08 28,34 50,3 56,32 61,2 60,99 61,09 61,16 61,11

2,00E-12 1,98E-10 0,0002 0,01 1,56 3,50 5,65 7,79 9,95

Af

Supervivient Supervivientes es Log Log UFC/mL UFC/mL (Experimentales) (Predicción) 8,43 8,43 8,42 8,41 6,65 4,43 1,98 -0,46 -2,91

1,30

93

8,43 8,23 7,89 7,09 4,08 4,20 4,11 3,57 3,19

10 8

Log UFC/mL

6 4 Prediccion 2

Experimentales

0 0

2

4

6

8

10

-2 -4

Tiempo (min)

Figura 22. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 después de un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA. Tabla 23. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico hasta 60ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA+NaCl. Tiempo (min)

Temperatura (ºC)

Letalidad Acumulada (min a 60ºC)

Supervivientes Log UFC/mL (Predicción)

Supervivientes Log UFC/mL (Experimentales)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Af

25,08 28,34 50,3 56,32 61,2 60,99 61,09 61,16 61,11

2,81E-09 2,27E-07 0,002 0,045 1,33 2,90 4,59 6,27 7,96

8,19 8,19 8,19 8,14 6,49 4,48 2,33 0,18 -1,97

8,20 7,77 7,58 5,57 3,26 1,90 1,26 1,38 0,77

1,105

94

10 8

Log UFC/mL

6 4 Prediccion 2

Experimentales

0 0

2

4

6

8

10

-2 -4

Tiempo (min)

Figura 23. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 después de un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA+NaCl. Los resultados obtenidos de las predicciones realizadas a partir de la integración de la temperatura para 55ºC se ajustan mucho mejor que para 60ºC.

Para 55ºC, el modelo en el medio de recuperación no selectivo se ajusta de manera

ideal,

notándose

un

comportamiento

similar

entre

los

datos

experimentales y los predichos, apoyando esta presunción con el valor Af, el cual fue de 1,06 para este medio. Para el medio de recuperación selectivo, se obtuvo un valor de 1,7 lo cual sugiere, que la predicción obtenida se ajusta, pero se desvía de los resultados experimentales, debido a que se encuentra considerablemente alejado de 1. Si se detalla la figura 21, se puede observar que los resultados experimentales siguen la misma tendencia de los resultados predichos, pudiendo ser que los valores negativos obtenidos en la predicción causen un aumento en el Af. En general, el modelo para este tratamiento se ajusta muy bien. Por otro lado, el microorganismo no presentó un comportamiento irregular, observándose una misma tendencia de destrucción del microorganismo entre los datos reales y predichos.

95

A 60ºC, el microorganismo presentó un comportamiento irregular como se observa en la figura 19, lo cual ya se discutió en un apartado anterior, conllevando esto a que los resultados experimentales no se ajusten de manera exacta, aunque los valores Af calculados indiquen lo contrario debido a su cercanía a 1. Es interesante observar, que para el medio de recuperación selectivo a 55ºC el Af sea mayor que los obtenidos a 60ºC cuando a esta condición (ver figuras 22 y 23) las curvas de supervivencia experimentales no se asemejan ni siguen un comportamiento similar a los predichos, caso contrario en el medio de recuperación selectivo a 55ºC (ver figura 21). Sería muy interesante el estudio de este fenómeno, pero en esta investigación no se realizó debido a que no era el objetivo.

El comportamiento irregular del microorganismo a 60ºC y las inconsistencias en la modelización con el valor F, nos condujo a la búsqueda de otro modelo para la predicción del comportamiento del microorganismo. Se optó por utilizar el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos el cual se basa en la aplicación de la siguiente ecuación (Eq.7):

𝐿𝑜𝑔 𝑁 = 𝐿𝑜𝑔𝑁0 −

𝑧 𝐷𝑅 ×𝐿𝑛 10

× 10

𝑇 0 −𝑇 𝑅 𝑍

×

10

𝑇−𝑇 0 𝑍

𝑎

(7)

Donde N es la población final predicha, No la población inicial experimental, T es la temperatura del medio en un tiempo t del tratamiento, TR es la temperatura de referencia (ºC), T0 la temperatura inicial del tratamiento (ºC), Z es el incremento de temperatura necesario para reducir en un ciclo logarítmico el valor D calculado en el tratamiento, DR el valor D a una temperatura de referencia y a la velocidad de incremento de temperatura durante el tratamiento (ºC/min).

Al aplicar la ecuación 7, a los datos obtenidos a partir del tratamiento isotérmico a 60ºC se estableció que el modelo no se ajustaba (resultados no se muestran) como se presumía. De acuerdo con lo propuesto por Cunha et al., 1997, para que este modelo ajuste de manera correcta y la eficiencia este cerca al 100% debe cumplir

96

con los siguientes 2 factores: i) el aumento de temperatura debe estar entre 1ºC/min y 10ºC/min, y ii) la temperatura mínima de inicio debe estar oscilando los 40ºC.

Con los factores anteriormente nombrados aplicamos la formula a nuestros resultados pero con una velocidad de aumento de 2ºC/minuto obteniendo un modelo que se ajusta perfecto a los 2 medios a 60ºC como se observa en las figuras 24 y 25. Por lo tanto si en esta experiencia se hubiese utilizado una velocidad de calentamiento de 2ºC/min los resultados esperados podrían haber sido diferentes.

Real

Gráfica de supervivencia

Calculada

9 8

log UFC / ml

7 6 5 4 3 2 1 0

1

2

3

4

5

6

7

Tiempo (min)

Figura 24. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min.

97

Real

Gráfica de supervivencia

Calculada

9 8

log UFC / ml

7 6 5 4 3 2 1 0

1

2

3

4

5

6

7

Tiempo (min)

Figura 25. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA+NaCl, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min. De acuerdo con los resultados obtenidos por la aplicación del modelo de Bigelow, se determina que el comportamiento inusual del microorganismo es debido a las velocidades de incremento de temperatura utilizadas en la investigación. Lo anterior deja como resultados importantes que: i) dependiendo de las condiciones de tratamiento, se pueden aplicar diferentes modelos buscando el que mejor se ajuste a los resultados obtenidos, siendo un factor muy importante el incremento de temperatura el cual debe ser constante y lineal (de acuerdo a los modelos utilizados en la investigación) y no se debe superar los 10ºC/min, para una eficacia óptima de los modelos, ii) El inicio de un tratamiento isotérmico a una temperatura tan baja como 24ºC, puede ser un factor que ayude al aumento en la resistencia a los tratamientos térmicos por parte del microorganismo y iii) la exposición del microorganismo, a un aumento de temperatura rápido hasta 55ºC (3min) y su posterior mantenimiento en condiciones isotérmicas, es más efectiva en la termodestrucción de L.monocytogenes CETC 4032 que el tratamiento isotérmico solo, obteniéndose una reducción de 4 unidades en el medio no selectivo a los 30 minutos del tratamiento y de 5 en el medio selectivo.

98

Los tratamientos térmicos, en su mayoría, producen un efecto sub-letal en L.monocytogenes CETC 4032, pues necesito de un mayor tiempo de incubación para su crecimiento y recuperación, tanto en el medio BHIA y BHIA+NaCl, observándose, tiempos de crecimiento de 48 horas y en algunos casos de 72 horas para el medio selectivo, en comparación con el tiempo de crecimiento del microorganismo, sin ningún tratamiento en medio BHIA el cual es de 24 horas. Resultado semejante al obtenido por Miller et al.,2006 y por Jasson et al., 2007 en sus investigaciones, los cuales obtuvieron que luego de los tratamientos térmicos aplicados sobre L.monocytogenes y L.innocua los microorganismos presentaron un incremento en el tiempo de crecimiento.

El BHIA+NaCl 0.5% (medio selectivo), solo permite el desarrollo de las células que no fueron afectadas letalmente por el tratamiento, y pueden recuperarse sin ser inhibidas por la concentración de sal. El NaCl causa alteraciones en la pared celular a nivel de permeabilidad, incrementando el estrés osmótico y promoviendo la plasmólisis celular. Algunos otros efectos de la sal para inhibir el crecimiento de las células afectadas, son deshidratación, remoción de oxigeno y la toxicidad de los iones sodio cuando se da la ionización del NaCl (Miller et al.,2006).

Del mismo modo, estos resultados corroboran la efectividad de los tratamientos para el control de microorganismos patógenos en los alimentos y que la combinación de estos con otros tratamientos ofrece mejores resultados asegurando la inocuidad del alimento tratado. 7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales. Se realizaron las pruebas con los aceites esenciales en los tratamientos isotérmicos, debido a que fueron los tratamientos en los que menor reducción de población se presentó y el comportamiento del microorganismo en estos permitiría observar de una manera más clara el efecto de los aceites esenciales.

99

7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite esencial de tomillo. Los resultados obtenidos en la investigación, no fueron los esperados de acuerdo con la bibliografía consultada. Las investigaciones de Bounatirou et al., 2007, Periago et al., 2001 A, Periago et al., 2001 B y Ettayebi et al., 2000, han demostrado que los componentes mayoritarios del aceite esencial de tomillo (carvacrol y timol) y el propio aceite esencial, no tienen un efecto listericida muy amplio. En nuestra investigación, el A.E de tomillo a concentraciones de 0,01% y de 0,05% en las 2 temperaturas evaluadas inhibió por completo el crecimiento de L.monocytogenes CETC 4032 (los resultados no se indican). La inhibición total a una concentración de 0,01%, la cual es considerablemente inferior a la empleada en la bibliografía consultada, es un resultado muy importante e interesante, pues si se observa la figura 15, pasados 30 minutos de tratamiento a 55ºC la disminución de la población en el medio no selectivo fue de 1 unidad logarítmica, mientras que con la adición del A.E de tomillo a una concentración de 0,01% en el tiempo 0 el microorganismo no presento crecimiento, y aplicando el tratamiento por 15 minutos. Se realizaron réplicas acortando los tiempos de muestreo y del tratamiento pero el resultado en todos los casos (no se presentan los resultados) fue el mismo.

Periago et al., 2001 en su investigación con Bacillus cereus, obtuvo que los componentes de aceites esenciales carvacrol y timol por separado a concentraciones de 0,3 mmol/L, no presentaron efecto inhibitorio sobre las células vegetativas de B.cereus, ni aun luego de haber expuesto el microorganismo a un shock térmico, pero la combinación de estos junto con la nisina exhibieron un efecto inhibitorio destacable. En otra investigación con dos diferentes cepas de L.monocytogenes (STCC4031 y NCTN4032), Periago et al., 2001, obtuvieron como resultados que el incremento de la concentración de carvacrol aumenta el efecto antimicrobiano sobre el microorganismo y por otra parte, que la resistencia a los efectos antimicrobianos varía entre cepas de un mismo microorganismo, siendo este un factor importante en el estudio de estos.

100

Rasooli et al., 2005 en su investigación evidenciaron que el A.E de tomillo afecta a L.monocytogenes a nivel de su pared celular, y dependiendo de la concentración puede causar su ruptura, generando daño en organelos y hasta lisis celular. Los resultados anteriores concuerdan con el efecto de los dos componentes mayoritarios del tomillo (carvacrol y timol) propuestos por Burt 2004.

Los resultados obtenidos junto con la revisión bibliográfica realizada nos hacen suponer que una concentración de 0,01% genera un debilitamiento y/o ruptura de la pared celular, dejando la membrana expuesta a los efectos del calor (aumento en la fluidez de la membrana, aumento en la permeabilidad y desnaturalización de enzimas y proteínas) y a los efectos del propio A.E.

Parece ser que la temperatura, potencia el efecto del A.E. sobre L.monocytogenes, pues de acuerdo con lo planteado por Moreira et al., 2005 en su investigación, la actividad antimicrobiana de los compuestos principales con mayor actividad antimicrobiana, mostraron su efecto máximo cerca a los 60 minutos de incubación, teniendo en cuenta que no se aplico tratamiento térmico, mientras que en nuestra investigación el efecto de los A.E sobre L.monocytogenes CETC 4032 fue casi inmediato, puesto que el tiempo transcurrido entre la inoculación del microorganismo y la toma de la muestra de la población inicial fue considerablemente corto. Se descarta, la posibilidad que el cultivo hubiera sufrido daños letales durante la incubación, estuviera inviable ó presentará contaminación, ya que antes del tratamiento se realizo el recuento del cultivo obteniéndose un cultivo axenico con una concentración de 108 UFC/mL tras 24 horas de incubación. 7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite esencial de clavo Los resultados obtenidos con el A.E de clavo a una concentración de 0,05% son similares a los obtenidos con el A.E de tomillo, pues desde el tiempo 0 no se observo crecimiento en ninguna de las 2 temperaturas (los resultados no se

101

indican). Sin embargo, con una concentración de 0,01% si se observó crecimiento. Los datos obtenidos fueron analizados utilizando la ecuación de Weibull (eq.2). En la Tabla 24 se presentan los parámetros δ (tiempo de la primera reducción) y p (factor de forma) para un tratamiento a 55ºC y las curvas de los supervivientes en las figuras 26 y 27. Tabla 24. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo. δ

p

BHIA

0,04

0,32

BHIA+NaCl

0,13

0,47

8 7 Log UFC/ml

6 Log UFC/mL

LogNpred

5 4 3 2 1 0 0

1

2

3

4

5

Tiempo (min)

Figura 26. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio BHIA. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.

102

7 Log UFC/ml

6

LogNpred

Log UFC/mL

5 4 3 2 1 0 0

1

2 3 Tiempo (min)

4

5

Figura 27. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio BHIA+NaCl. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull. Los resultados tanto en medio BHIA y BHIA+NaCl presentan una concavidad hacia arriba (p