sumario EUROPEAN JOURNAL OF

obstetrics & GYNECOLOGY AND REPRODUCTIVE BIOLOGY

European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology (Ed. Española) 2001; 1: 202-208

Original

Efectos de la IL-6 e IL-8 intrauterinas sobre la expresión del ARNm de apoproteínas del surfactante en pulmón fetal de rata Toshiya Ikegami, Akira Tsuda, Akihiro Karube, Hidoya Kodama, Hideto Hirano, Toshinobu Tanaka Departamento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina de la Universidad de Akita, 1-1-1 Hondo, Akita 010, Japón. Aceptado: 30 diciembre 1999

Resumen Objetivo: El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de la interleucina-6 (IL-6) y la interleucina-8 (IL-8), cuyas concentraciones se elevan con la corioamnionitis sobre la expresión del ARNm de las apoproteínas del surfactante en el pulmón fetal de rata. Diseño del estudio: Empleamos un modelo desarrollado en animales, en el cual podíamos administrar sustancias continuamente a la cavidad situada entre las membranas fetales y el endometrio, usando una bomba miniosmótica. Se administró lipopolisacárido (LPS), IL-6 o IL-8 a ratas gestantes durante tres días (días 16-19) y se evaluó la expresión en pulmón fetal de los ARNm de las apoproteínas del surfactante-A (SPA), SPB y SPC, mediante hibridación Northern blot. Resultados: La administración continua de LPS aumentó la expresión de todos los ARNm de las apoproteínas del surfactante, pero la expresión de los ARNm no fue dependiente de la dosis. Por otra parte, la administración continua de IL-6 o IL-8 aumentó la expresión de cada ARNm de las apoproteínas del surfactante de forma dependiente de la dosis. Conclusión: Puede aumentarse o promoverse la maduración del pulmón fetal por IL-6 o IL-8 producidas en respuesta a la corioamnionitis. © 2000 Elsevier Science Ireland Ltd. Reservados todos los derechos. Palabras clave: Ratas; Apoproteínas de surfactante; Interleucina-6; Interleucina-8; Maduración pulmonar.

Introducción El parto pretérmino sigue siendo una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad perinatal. Se ha publicado que existe una relación muy estrecha entre el parto pretérmino y la corioamnionitis, que parece ser una de las causas de rotura prematura de las membranas (RPM). Sin embargo, se ha comprobado también que la RPM se asocia con una reducción significativa de la incidencia del síndrome de distrés respiratorio (SDR) en niños nacidos pretérmino [1]. La RPM de más de 48 horas mejora significativamente la supervivencia de los niños con peso muy bajo al nacer y SDR establecido [2]. Además, la RPM de más de 24 horas eleva el cociente lectina/esfingomielina y aumenta el contenido de fosfatidilglicerol en el pulmón fetal [3]. Asimismo, nosotros confirmamos previamente que la fosfatidilcolina desaturada en líquido amniótico de pacientes con corioamnionitis era significativamen-

te más alta que la de pacientes sin corioamnionitis [4]. Sin embargo, se conoce poco el mecanismo que origina la promoción de la maduración del pulmón fetal en casos de RPM. La respuesta inflamatoria conlleva la producción de citoquinas inflamatorias, como interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8). IL-6 es una citoquina que regula la respuesta al estrés inducida por la infección y la lesión tisular. En el caso de infección intraamniótica, las concentraciones de IL-6 aumentan significativamente [5]. Del mismo modo, las concentraciones de IL-8, que tiene una actividad específica quimiotáctica que atrae a los neutrofilos a la zona inflamatoria, también están elevadas en el líquido amniótico, una vez que se ha producido la infección intraamniótica [6]. Este estudio fue diseñado para determinar si estas citoquinas son mediadores de la maduración del pulmón fetal. Nosotros administramos estas citoquinas de forma continua

Ikegami T, Tsuda A, Karube A, Kodama H, Hirano H, Tanaka T. Effects of intrauterine IL-6 and IL-8 on the expression of surfactant apoprotein mRNAs in the fetal rat lung. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 2000; 93: 97-103 (usen esta cita al referirse al artículo).

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en la cavidad extramniótica de ratas gestantes y examinamos la maduración del pulmón fetal, que se evaluó por el nivel del ARN mensajero de apoproteínas del surfactante pulmonar, usando hibridación Northern Blot. Nuestro estudio demuestra que las citoquinas inflamatorias, como IL-6 e IL-8, promueven la maduración del pulmón fetal.

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Materiales y métodos

no uterino en el espacio creado quirúrgicamente entre las membranas fetales y el endometrio y se fijó a la zona mediante sutura con Dexon 3-0 (Davis-Geck, Manati, PR, Estados Unidos). El útero y la bomba se introdujeron de nuevo en la cavidad peritoneal. Con tinta india confirmamos que el fármaco se había administrado en la cavidad entre las membranas fetales y el lumen uterino. Después de la intervención, todas las ratas gestantes se colocaron en una jaula individual y recibieron agua y comida ad libitum.

Ratas

Preparación del tejido pulmonar

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley, con edad gestacional conocida, sin patógenos específicos, de Japan SLC. Se determinó la edad gestacional designando el día del apareamiento como día 0 y el día de la prueba vaginal positiva como día 1 (día del nacimiento = día 22). Los animales se albergaron en condiciones controladas de luz y temperatura con libre acceso a la comida y al agua. Investigamos la ontogenia de las apoproteínas del surfactante usando fetos de rata desde el día 15 al día 22 y adultos.

Tres días después de la inserción de las minibombas, las ratas gestantes se anestesiaron y se extrajeron los fetos del segundo saco de cada cuerno uterino. Se extrajo rápidamente el pulmón fetal de la cavidad torácica, se colocó en hielo y se almacenó a –80ºC hasta realizar el ensayo. El sexo de los fetos no se determinó porque nunca se han descrito anteriormente diferencias sexuales en la expresión de los ARNm de las apoproteínas del surfactante [9]. Después de la histerectomía, las ratas gestantes se mataron por inyección intracardíaca de una sola dosis de nembutal.

Preparación de los fármacos Aislamiento del ARN y análisis de Northern blot Se reconstituyó IL-6 recombinante humana (Genzyme, Cambridge, MA) en solución salina tamponada con fosfato esterilizada (PBS) que contenía suero de rata al 1% (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá). La IL-8 recombinante humana (Genzyme) y el lipopolisacárido (LPS; Difco, Detroit, MI, Estados Unidos) se prepararon en PBS que contenía suero de rata al 0,1%. La concentración de LPS usada (10 ng/ml) corresponde a la dosis descrita previamente y la dosis de citoquinas (IL6, 10 pg/ml e IL-8, 100 pg/ml) corresponde a los niveles encontrados en líquido amniótico asociados con corioamnionitis [4, 7, 8]. Las soluciones se aplicaron bajo condiciones estériles al reservorio de bombas miniosmóticas Alzet (Alza, Palo Alto, CA, Estados Unidos), que se ha utilizado por numerosos investigadores para administrar diversas sustancias biológicas, como citoquinas in vivo, y aporta de forma continua las soluciones en una proporción de 0,5 ml/h. Los fetos control recibieron una bomba cargada con PBS que contenía suero de rata. Las bombas se ajustaron con un modelo de flujo conectado con un catéter y todos los aparatos se mantuvieron en solución salina a 37ºC hasta la implantación en el abdomen de las ratas gestantes. Tratamientos de infusión continua El día 16, el útero grávido se expuso bajo condiciones estériles mediante una incisión abdominal y se hizo una incisión pequeña en la parte estrecha entre el segundo saco fetal y el tercero en cada cuerno uterino bajo anestesia intraperitoneal con nembutal (0,05 ml/100 g peso corporal). El catéter conectado a la bomba se insertó en el cuer-

Se aisló todo el ARN de los fetos (antes del día 16) y de todo el tejido pulmonar (después del día 17 y de la rata adulta). El ARN se cuantificó espectrofotométricamente determinando la absorción a 260 nm y se detectó la contaminación proteínica a 280 nm. Se utilizaron análisis posteriores de muestras con un cociente de 260/280 de más de 1,8. Aproximadamente 5 mg de ARN se desnaturalizaron con formaldehído y formamida y después se sometieron a eletroforesis a través de un gel de agarosa al 1%, que contenía formaldehído. Se visualizaron las bandas separadas con tinción de bromuro de etidio y se registraron fotográficamente las bandas de ARN de 18 S y 28 S. El ARN se transfirió por acción capilar desde los geles de agarosa a una membrana Hybond-N+ (Amersham, Reino Unido). La el ADNc de la SPA (apoproteína de surfactante-A) de rata fue una donación de los doctores N. Yokoyama y S. Takada y H. Nakamura (Departamento de Pediatría, Universidad de Kobe). La sonda del ADNc de SPA de rata (678 pares de bases) se preparó mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Toda la longitud del ADNc de SPA se utilizó como cebador, y un grupo de primers de PCR fueron 5´-GTGACAGACGTTTGTGCCTGG-3´ y 5´-TTCACAAACAGCCAGCCGGT-3´. Las secuencias de nucleótidos publicadas de los ADN de SPB de rata y SPC se utilizaron para producir una sonda de oligonucleótidos como 5´ATCTAGTAGAAGTACTGTGTAACGCTCAGCCAGGCACTGGCAGAT-3´para SPB y 5´-AAGACTAGGGATGCTCTCTGGAGCCATCTTCATGATGTAGCAGTA-3´ para SPC (Sawady, Tokio, Japón). La sonda de ADNc de SPA se marcó con 32P-dCTP por

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el método aleatorio usando un equipo comercial (Amersham) y las sondas de oligonucleótidos por el método de corte de 3´, usando desoxinucleotidil-transferasa terminal (Bethesda). Los blots de ARN se prehibridaron a 65ºC durante 15 minutos. Cada sonda se desnaturalizó a 95ºC durante 10 minutos y se añadieron 2 ng/ml de sonda a la solución de hibridación (Amersham). Se hizo una hibridación a 65ºC durante 2 horas. Después de lavar los blots de ARN con soluciones de citrato sódico 2 x a 0,5 x en solución salina que contenía dodecilsulfato sódico al 0,1%, se prepararon autorradiogramas a –70ºC usando película Kodak XAR (Rochester, NY, Estados Unidos). Se realizó densitometría integrada sobre los autógrafos con un escáner y con la aplicación informática NIH Image 1.44. La sonda de ADNc de SPA de rata hibridó con dos especies de ARN, los tamaños de los cuales fueron de 1,6 y 0,9 kilobases (Kb). Las secuencias de nucleótidos de la región codificada de estas dos transcripciones son iguales, atribuyéndose la diferencia de tamaño entre estos dos ARNm a las diferentes longitudes de las regiones 3´ no codificadas [12]. La sonda de oligonucleótidos de ADNc de SPB de rata se detectó a 1,5 kilobases y la de ADNc de SPC se detectó a 0,8 kilobases aproximadamente en el pulmón fetal de rata.

Resultados Ontogenia de los ARNm de apoproteínas de surfactante en el pulmón fetal de rata La ontogenia de los ARNM de SPA, SPB y SPC en el pulmón de rata en desarrollo se muestra en la figura 1. La expresión de los ARNm de SPA y SPB fue poco detectable en los pulmones fetales el día 18. El primero alcanzó los niveles de adulto el día 21, y el último casi alcanzó los niveles de adulto el día 20. La expresión del ARNm de SPC fue poco detectable en los pulmones fetales el día 17 y alcanzó los niveles de adulto el día 21. Efectos de LPS, IL-6 e IL-8, sobre la expresión de los ARNm de las apoproteínas de surfactante en el pulmón fetal de rata El efecto de la administración continua de LPS sobre la expresión del ARNm de SPA, SPB y SPC en el pulmón fetal de rata se muestra en la figura 2. La administración de LPS aumentó la expresión de los ARNm y hubo una dependencia de la dosis del efecto de LPS sobre los niveles de expresión de estos ARNm. La expresión de cada ARNm fue mayor en el grupo tratado con IL-6 que en el grupo tratado con el vehículo PBS (figura 3). Sin embargo, no hubo una dependencia clara de la dosis del efecto de IL-6 sobre los niveles de expresión de estos ARNm. El nivel de expresión de cada ARNm, especialmente del ARNm de SPC, fue mayor en el grupo tratado con IL-8

que en el grupo tratado con el vehículo y se observó un efecto sobre la expresión dependiente de la dosis (figura 4).

Comentarios El surfactante pulmonar se compone de fosfolípidos, que responden de aproximadamente 90% del peso, proteínas (8% del peso) y glúcidos. La maduración del pulmón fetal puede conocerse determinando los fosfolípidos, como dilpamitoilfosfatidilcolina y fosfatidilglicerol o las apoproteínas del surfactante pulmonar en líquido amniótico y/o tejido pulmonar fetal. En este estudio evaluamos los ARNm de apoproteínas de surfactante como índice de desarrollo del pulmón fetal porque las apoproteínas del surfactante son importantes para la estructura y función de éste y porque la expresión de estos ARNm se observa más precozmente que el aumento de la producción de fosfolípidos [9, 13]. Encontramos que la expresión de todos los ARNm fue indetectable en los pulmones fetales el día 16, y permaneció por debajo de los niveles de adulto hasta el día 19. Estos resultados están de acuerdo con los datos publicados previamente por otros investigadores [9]. Por este motivo, administramos LPS y citoquinas desde el día 16 al día 19. Se sabe que los glucocorticoides favorecen la maduración del pulmón fetal. Los glucocorticoides estimulan la biosíntesis de fosfatidilcolina [14]. Por tanto, un tratamiento materno con glucocorticoides promueve la maduración del pulmón fetal [15] y reduce clínicamente la incidencia de SDR en los niños prematuros. En casos de RPM, que generalmente se asocia con corioamnionitis, la incidencia de SDR en niños pretérmino se reduce y los valores de corticosteroides en sangre neonatal obtenidos en el nacimiento están elevados con una mayor duración de la rotura de membranas antes del parto [1]. Estos resultados indican que los glucocorticoides promueven el desarrollo fetal. En este estudio nos centramos sobre el efecto de las citoquinas inflamatorias, que están elevadas en el líquido amniótico asociadas con la corioamnionitis, sobre la maduración pulmonar fetal. En general, el LPS actúa sobre los macrófagos produciendo la generación de IL-1 β y FNT (factor de necrosis tumoral), y estas citoquinas actúan sobre los macrófagos, originando la producción de IL-6 o IL-8. IL-1 β [16], FNT-α [17], IL-6 [5] e IL-8 [17] están elevadas en el líquido amniótico en casos de corioamnionitis. En experimentos in vitro se demuestra que la administración de LPS promueve la producción de IL-1 β [18] y FNT-α [19] en el tejido de la decidua, y la producción de IL-6 en células de corion [20] e IL-8 en células de amnios [21]. Además, el aumento de IL-1 β o FNT-α estimula la producción de IL-6 en células de corion [20] y de IL-8 en células de amnios [21]. Sin embargo, en nuestros estudios preliminares, la administración continua de IL-1 β o FNT-α, usando el mismo

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SPA

SPB

SPC

Cociente de densidad del ARNm (día de la gestación/pulmón de rata adulta)

Tinción con bromuro

ARN m de SPA ARN m de SPA ARN m de SPC adulto

Día de gestación

Figura 1. (A) Ontogenia de los ARNm de SPA, SPB y SPC del pulmón de rata en desarrollo. Análisis de Northern blot del ARN aislado del pulmón fetal en diferentes edades gestacionales. Se aisló todo el ARN del cuerpo el día 15 de gestación (recorrido 1), el día 16 de gestación (recorrido 2), de tejido pulmonar desde el día 17 al 22 de gestación (recorridos 3-8), y de pulmón de rata adulta (recorrido 9); en cada uno se separaron 2,5 mg de ARN por electroforesis en gel de agarosa y se trasladaron a una membrana de nylon (blot). La tinción de bromuro de etidio del gel original confirmó una carga similar de todas las muestras de ARN. La mancha (blot) se procesó con sondas de oligonucleótidos ADNc de SPA, SPB y SPC marcadas con 32P-dCTP. Los ARN m de SPA se detectaron aproximadamente a 1,6 y 0,9 kb y se detectaron ARM sencillos de SPB y SPC a 1,5 kb y 0,8 kb, respectivamente (p10). (B) Análisis cuantitativos de variación de las concentraciones de ARNm de SPA, SPB y SPC.

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SPA

SPA

SPB

SPB

SPC

Tinción con bromuro de etidio

SPC

Tinción con bromuro de etidio

Figura 2. Análisis de Northern blot de la expresión de los ARNm de SPA, SPB y SPC en tejido pulmonar fetal estimulado por LPS. Se aisló todo el ARN del pulmón de rata adulta (recorrido 1), de pulmón fetal de animales tras la administración continua de PBS (recorrido 2), de 10 ng/ml de LPS (recorrido 3), de 1 ng/ml de LPS (recorrido 4) y de 0,1 ng/ml de LPS (recorrido 5); en cada grupo se separaron 5 mg de ARN por electroforesis en gel de agarosa, se trasladaron a una membrana de nylon (blot) y se procesaron con sondas de oligonucleótidos ADNc de SPA, SPB y SPC marcadas con 32 P-dCTP.

Figura 3. Análisis de Northern blot de la expresión de los ARNm de SPA, SPB y SPC en tejido pulmonar fetal estimulado por IL-6. Se aisló todo el ARN del pulmón de rata adulta (recorrido 1), de pulmón fetal de animales tras la administración continua de PBS (recorrido 2), de 0,1 pg/ml de IL6 (recorrido 3), de 1 pg/ml de IL-6 (recorrido 4) y de 10 pg/ml de IL-6 (recorrido 5); en cada grupo se separaron 5 mg de ARN por electroforesis en gel de agarosa, se trasladaron a una membrana de nylon (blot) y se procesaron con sondas de oligonucleótidos ADNc de SPA, SPB y SPC marcadas con 32P-dCTP.

dispositivo, no tuvo ningún efecto sobre la expresión de los ARNm de las apoproteínas del surfactante (datos sin publicar). Por tanto, en este estudio administramos IL-6 o IL-8 en la cavidad situada entre las membranas fetales y el lumen uterino. Uno de los objetivos de este estudio es crear un modelo animal por el cual varias sustancias pueden administrarse de forma continua en esta cavidad. En este estudio administramos LPS, IL-6 e IL-8 y observamos la respuesta de los pulmones fetales a estas sustancias. Previamente demostramos que la administración transitoria de LPS a conejas gestantes promovía la producción de fosfolípidos en el pulmón fetal (datos sin publicar), y la administración continua con PBS no aumentaba la expresión de los ARNm de las apoproteínas de surfactante. En este estudio confirmamos que la administración continua de LPS aumentaba la expresión de los ARNm de las apo-

proteínas del surfactante, usando un modelo de infección intrauterina. Hubo una correlación entre las concentraciones de LPS administradas y la expresión de los ARNm de las apoproteínas del surfactante. Estos resultados indican que la infección intrauterina promovía la maduración del pulmón fetal de acuerdo a su gravedad. Es conocido que IL-6 es una de las citoquinas inflamatorias que trabaja como importante mediador de la reacción inflamatoria aguda. IL-6 aumenta las concentraciones en sangre de corticosteroides, actuando a diferentes niveles del eje hipotalámico-pituitario-adrenal. No sólo estimula a las células de la hipófisis para secretar adenocorticotropina, sino que también estimula directamente a las glándulas suprarrenales para secretar corticosteroides [22]. El efecto directo de IL-6 sobre las células epiteliales respiratorias, especialmente neumocitos de tipo 2, es desconocida. Sin embargo,

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SPA

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SPC

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atrae a los neutrófilos a la zona inflamatoria y los neutrófilos activados desempeñan un papel importante en la eliminación de bacterias por aumento de la producción de IL-8 [6]. En la infección intraamniótica, la concentración de IL8 en el líquido amniótico es elevada [6]. Kitajima et al. [25] publicaron que: 1) existe una buena correlación entre IL-8 en el suero de cordón y el complejo inhibidor proteinasa elastasa-α1 de los leucocitos polimorfonucleares traqueales; y 2) un nivel elevado de IL-8 en suero de cordón se relaciona con enfermedades pulmonares crónicas en niños. La administración intravenosa de anticuerpos anti-IL-8 evita la lesión por reperfusión pulmonar en conejos [27]. Estos resultados indican que IL-8 produce una lesión tisular pulmonar. Por otra parte, nuestros datos indican que concentraciones elevadas de IL-8 pueden originar la producción del surfactante pulmonar fetal. Está claro que el daño del tejido pulmonar fetal después de la administración de IL-8 podría producir el aumento de las concentraciones de los ARNm de las apoproteínas del surfactante, originando la maduración del pulmón fetal. Por tanto, permanecen sin dilucidarse los mecanismos por los cuales IL-8 induce la elevación de los niveles de los ARNm de las apoproteínas del surfactante.

Resumen

Figura 4. Análisis de Northern blot de la expresión de los ARNm de SPA, SPB y SPC en tejido pulmonar fetal estimulado por IL-8. Se aisló todo el ARN del pulmón de rata adulta (recorrido 1), de pulmón fetal de animales tras la administración continua de PBS (recorrido 2), de 1 pg/ml de IL-8 (recorrido 3), de 10 pg/ml de IL-8 (recorrido 4) y de 100 pg/ml de IL-8 (recorrido 5); en cada grupo se separaron 5 mg de ARN por electroforesis en gel de agarosa, se trasladaron a una membrana de nylon (blot) y se procesaron con sondas de oligonucleótidos ADNc de SPA, SPB y SPC marcadas con 32P-dCTP.

por medio del estudio de recién nacidos prematuros después de la rotura prolongada de membranas, se ha sugerido que los niveles elevados de IL-8 en el líquido de lavado broncoalveolar interaccionan directamente con las células epiteliales respiratorias [23]. Además, IL-6 estimula la expresión del ARNm de SPA en células de cáncer de pulmón humano cultivadas [24]. Aunque no puede descartarse la participación de los glucocorticoides inducidos por Il-6 en la maduración del pulmón fetal, los niveles elevados de IL-6 en el líquido amniótico podrían actuar directamente sobre los neumocitos de tipo 2, originando la estimulación de la producción de surfactantes en el pulmón fetal. Para dilucidar la interacción directa entre los neumocitos de tipo 2 e IL-6 deben realizarse estudios más precisos. La IL-8 tiene una actividad quimiotáctica específica, que

La administración continua de IL-6 o IL-8 en el útero aumenta de forma considerable la expresión de los ARNm de las apoproteínas del surfactante en el pulmón fetal de rata.

Agradecimientos Este estudio fue financiado en parte por la Beca de Investigación Científica © [2] nº 07807151 del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura, Tokio. Agradecemos a Jerome F. Strauss III, de la Universidad de Pensilvania (Filadelfia, PA, Estados Unidos) su ayuda en la preparación del original.

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