ELECTROPORACION MEDIANTE CORRIENTES PULSADAS DE ALTO VOLTAJE CON LA PLATAFORMA ADAC

La electroporación tiene muchos usos en los campos de la biología celular, medicina y microbiología. Nuevos usos están siendo descubiertos día a día. Además de muchos usos in vitro para electroporación, están apareciendo nuevos usos in vivo como la terapia génica, la fisioestética o, incluso la quimioterapia, con el simple fin de introducir por vía transdérmica un medicamento o un cosmecéutico. La piel es una barrera natural que impide el paso de sustancias extrañas al organismo. El estrato córneo de la dermis, representa la principal barrera para el paso de sustancias a través de la piel, tanto para las sustancias moleculares como ionizadas. Para que un producto atraviese la piel, debe atravesar los siguientes estratos: -Capa cornea -Epidermis -Dermis papilar, para poder llegar a la vascularización de la papila. El paso de sustancias, tal y como lo hemos comentado, puede suceder por dos mecanismos: -A través de los espacios intercelulares (iontoforesis, sonoforesis, electroporación). -A través de los poros formados en las células llamados pathways o porinas, pasando a través de estas (electroporación). Es bien conocida la condición primera que debe de tener una sustancia para que atraviese la piel, y es que dicha sustancia debe ser hidrolipídica o, en caso de ser cristalina, estar disuelta. Es por ello que los cosmecéuticos ADAC, han sido especialmente formulados en forma de serum, dotándolos de una carga negativa para facilitar su rápida penetración mediante electroporación. Una vez que un producto consigue introducirse en la piel, pueden ocurrir tres fenómenos: -Que alcance la microcirculación cutánea y sea totalmente absorbido y distribuido a nivel general. -Que se fije en el estrato córneo, actuando a modo de reservorio y retrasando su acción sistémica. -Que sufra un proceso de metabolización por parte de las propias enzimas cutáneas.

La corriente de alto voltaje pulsada de electroporación de la plataforma ADAC fué desarrollado para dar la máxima fiabilidad con gran sencillez de manejo para todas las labores actuales del fisioterapeuta.

Electroporación Electroporación es el nombre que usamos cuando empleamos un pulso eléctrico de muy alto voltaje para inducir un estado eficaz de poración en una membrana biológica. Comúnmente se denominan poros a la activación de proteínas trasnmembrana para formar canales. Su presencia permite a moléculas, iones, y el agua para pasar de un lado de la membrana al otro. La electroporación siempre se produce en las zonas más cercanas a los electrodos. Si el pulso eléctrico de alto voltaje tiene los parámetros apropiados, entonces las células electroporadas pueden recuperarse y las células seguirán cultivando y expresar su material genético. El empleo de electroporación se hizo muy popular durante los años 80 por ser un modo excepcionalmente práctico de introducir medicamentos, material genético (transfecciones), u otras moléculas en células. A finales de los años 80, los científicos comenzaron a usar protocolos electroporación con el tejido multicelular in vivo. Aunque la variabilidad biológica hace que algunas células sean más sensible a electroporación que otras células, la formación del poro, el número, y el diámetro eficaz sea generalmente una función del producto de la amplitud de pulso y la duración de pulso. Para poder formarse poros, este producto, amplitud de pulso por duración, tiene que ser encima de un umbral. En la siguiente figura se identifican los umbrales donde la formación del poro comienza.

El umbral de electroporación que debe alcanzarse, debe ser el adecuado y estar cacorde al tamaño de las células a electroporar, ya que si el poro formado es demasiado grande para la célula, puede provocarle un daño irreparable. Para prevenir este daño, los protocolos de pulso de la plataforma ADAC han sido desarrollados para estar en algún punto encima del umbral y debajo de la mortalidad.

Parámetros como amplitud, voltaje, intérvalo entre pulsos, y duración y número de pulsos, deben estar perfectamente parametrizados para no proporcionar daño alguno a los tejidos tratados. También hay que tener en cuenta, que una parametrización incorrecta de los anteriores factores, puede proporcionar un calentamiento en el tejido, que en cualquier caso será inaceptable para producir una correcta electroporación sin producir daños irreversibles a los tejidos tratados. Hemos de reseñar, que tal y como se demostró en los estudios publicados por Sukharev y colaboradores en el año 92, la electroporación es siempre dependiente de la polaridad. En el caso de la electroporación con las corrientes de alto voltaje de la plataforma ADAC, todos los cosmecéuticos están formulados con carga negativa. La corriente de alto voltaje de la plataforma ADAC opta para electroporar por un pulso exponencial entretenido, evitando así cualquier tipo de calentamiento en el tejido. Según la ecuación de Schwann, que estima las necesidades del campo eléctrico necesario para electroporar, es necesario colocar los electrodos próximos uno al otro. Otro aspecto importante a tener en cuenta a la hora de realizar una electroporación, es la resistencia, ya que la cantidad de corriente es igual al voltaje emitido dividido por la resistencia. También se ha de recordar, que el tamaño de los poros generados, el cual marcará la posibilidad, en cuanto a tamaño y cantidad de sustancias electroporadas, es proporcional a la amplitud del pulso empleado. Además, la especial onda entretenida exponencial del electroporador de la plataforma ADAC, consigue generar una poración estable en el tiempo, mantenida incluso durante varios minutos tras finalizar el tratamiento. Es muy importante conocer el denominado voltaje de ruptura, que marca, según el tamaño de la zona o estructura a tratar, la cantidad de voltaje mínimo para producir el primer poro. Como ejemplo de la necesidad de usar un alto voltaje, baste reseñar que para electroporar una única célula de 40 micras de diámetro, son necesarios 330 voltios por centímetro, ya que el voltaje mínimo está directamente relacionado con el diámetro de dicha célula. Hemos de recordar que todos los estudios realizados

de

esta

técnica,

afirman

rotundamente

que

para

conseguir

la

electroporación, deben emitirse pulsos exponenciales de entre 10.000 y 100.000 voltios, por lo que, muchos pretendidos electroporadores existentes hoy día en nuestro mercado, basados en emitir ondas senoidales diatérmicas pulsadas, es imposible que electroporen, ya que por definición, la diatermia con ondas senoidales es siempre una

corriente de bajo voltaje. Los 30.000 voltios que aplica el electroporador de la plataforma ADAC representan un voltaje más que suficiente para producir el voltaje de ruptura. No obstante, aún así, se aconseja colocar los dos electrodos electroporadores cercanos el uno al otro cuando se está operando con el equipo. Cuando el ADAC Ionica emite su corriente de pulsos exponenciales de alto voltaje, se produce una electrorotación de los lípidos de la doble capa lipoproteína celular, provocándose un electroporo, sin que por ella exista ni deeba existir nunca un aumento de temperatura. Tras mesurar la velocidad y cantidad de penetración de producto que produce la corriente del ADAC ionica, podemos concluir que el paso de los cosmecéuticos ADAC, debido a su especial formulación en forma de serum hidrolipídicos, es de aproximadamente 1 gramo cada dos minutos. Para comprobar la eficacia de la electroporación con la corriente de alto voltaje de la plataforma ADAC se utilizó el pigmento nigrosina, también conocido por negro ácido número 2, cuyo número CAS es 8005-03-6, su índice de color CI 50420, su fórmula C11N2O2H10 y su peso molecular 202’21gr/mol. La zona a tratar es la piel de un abdomen de una mujer de 42 años, la cual se presto voluntariamente a la realización del experimento. En primer lugar se procedió a aplicar la nigrosina, dando un masaje de frotación durante 10 minutos, tiempo tras el cual se tomaron las biopsias oportunas, que se prepararon y tiñeron con hematoxilina eosina, para, posteriormente visualizar en un microscopio óptico bifocal de gran aumento con fuente externa de luz fría de 150W, mediante contraste de fases.

“La anatomía patológica demuestra que la nigrosina no penetra por la acción del simple masaje de frotación en la piel, ya que podemos observar en las imágenes que el pigmento queda en el exterior de la célula más externa de la capa córnea de la epidermis”.

En segundo lugar, se procedió en otra zona a realizar un peeling de glicólico al 30% con pH 1, para posteriormente aplicar mediante masaje de frotación la misma cantidad de pigmento nigrosina aplicada con anterioridad, también durante 10 minutos, tiempo tras el cual se tomaron las biopsias oportunas, que se prepararon y tiñeron con hematoxilina eosina, para, posteriormente visualizar en un microscopio óptico bifocal de gran aumento con fuente externa de luz fría de 150W, mediante contraste de fases.

“La anatomía patológica demuestra que la nigrosina no penetra por la acción del simple masaje de frotación en la piel, ni tan siquiera después de realizar un peeling que elimina por completo la capa córnea de la epidermis, ya que podemos observar en las imágenes que el pigmento queda en el exterior de la dermis”.

En tercer lugar se procedió a realizar una electroporación con la corriente de alto voltaje de la plataforma ADAC, con la misma cantidad de pigmento nigrosina empleada en los experimentos anteriores, y durante tan sólo 5 minutos de tiempo de aplicación, tiempo tras el cual se tomaron las biopsias oportunas, que se prepararon y tiñeron la mitad con hematoxilina eosina, y la otra mitad con un tricrómico de Masson, para, posteriormente visualizar en un microscopio óptico bifocal de gran aumento con fuente externa de luz fría de 150W, mediante contraste de fases.

“Acúmulos de pigmento nigrosina observados en dermis reticular tras la electroporación”.

“Detalle a gran aumento de acúmulo de pigmento nigrosina tras 5 minutos de electroporación con la plataforma ADAC”.

“Acúmulos de pigmento nigrosina tras la electroporación en tejido graso hipodérmico”

“Cuando se tiñen las muestras obtenidas tras la electroporación con un tricrómico de Masson, se puede observar la gran dispersión de pigmento nigrosina (en amarillo brillante) tanto a nivel del dermis reticular como a nivel del dermis papilar”.

BIBLIOGRAFIA Farabee, MJ. 2001. Transport In and Out of Cells. Accessed 2003 17 Feb.

Gunn L et. al. 1995. Transfer of Episomal and Integrated Plasmids from Saccharomyces cerevisiae to Escherichia coli by electroporation. In: Nickoloff JA, editor. Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p 55-66.

Inovio. 2002. Technology Platform: Electroporation. Accessed 2003 15 Feb.

Maeda, H et. al. 1998. Electrochemotherapy Potentiation of Antitumor Effect of Cyclophosphamide by Local Electric Pulses on the Metastatic Lesion of Hamster Oral Fibrosarcoma. Accessed 2003 15 Feb.

Maxcyte. 2002. Technology. Accessed 2003 15 Feb.

Melcher, Ulrich. 1997-2000. Molecular Genetics: Electroporation. Accessed 2003 13 Feb.

Miller EM and Nickoloff JA. 1995. Escherichia coli Electrotransformation. In: Nickoloff JA, editor. Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p 105-114.

Nickoloff JA. 1995. Preface. In: Nickoloff JA, editor. Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p v-vi.

Prausnitz MR et al. 1993. Electroporation of mammalian skin: a mechanism to enhance transdermal drug delivery. Proc Natl Acad Sci USA 90: 10504-8.

Purves WK. et. al. 2001. Life: The Science of Biology- 6th ed. Sinauer Associates, pp.316-317.

Saito, Tetsuichiro. 2001. In Vivo Electroporation. Accessed 2003 15 Feb.

Weaver JC. 1995. Electroporation Theory: Concepts and Mechanisms. In: Nickoloff JA, editor. Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p 1-26.

Withers HL. 1995. Direct Plasmid Transfer Between Bacterial Species and Electrocuring. In: Nickoloff JA, editor. Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p 47-54.

Prausnitz MR, Bose VG, Langer R, Weaver JC. Electroporation of mammalian skin: a mechanism to enhance transdermal drug delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 1993; 90(22):10504-10508.

Panchagnula, R. Transdermal delivery of drugs. Ind J Pharmacol1997; 29: 140-156.

Badkar AV, Betagen GV, Hofmann GA, Banga AK. Enhancement of transdermal iontophoretic delivery of a liposomal formulation of colchicines by electroporation. Drug Deliv 1999; 6: 111-115.

Lan CY, Tan PH, Cheng JT, Lu HF, Lin MW, Hsiao PN et al. Immunoneutralization of c-Fos using intrathecal antibody electroporation attenuates chronic constrictive injury -

induced hyperalgesia and regulates prepodynorphin expression in rats. Anesthesiology 2003; 99 (4):938-946.

Dev SB. Electrochemotherapy for. Cancer Wt1996;5(2): 23-24.

Glass LF, Pepine ML, Fenske Na Jaroszeski MJ, and Reintger DS. Bleomycin mediated electrchemotherapy of metastatic melanoma. Arch Dermatol 1996; 132 (11): 1352 -1357.

Heller R, Jaroszeski MJ, Glass LF, Messina JL, Rapaport DP, DeConti RC et al. Phase I /II trial for the treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy. Cancer 1996; 77(5):964-971.

Hyacinthe M, Jaroszeski MJ, Dang VV, Coppola D, Karl RC, Gilbert RA et al. Electrically enhanced drug delivery for the treatment of soft tissue sarcoma. Cancer 1999 15; 85(2):409 -417.

Jaroszeski MJ, Dang V, Pottinger C, Hickey J, Gilbert R, Heller R. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anticancer Drugs 2000; 11(3):201-208.

Tsong TY. Electroporation of cell membranes. Biophys J 1991; 60(2):297-306.

Mir LM, Banoun H, Paoletti C. Introduction of definite amounts of nonpermeant molecules into living cells after electropermeabilization: direct access to the cytosol. Exp Cell Res 1988; 175(1):15 -25.

Barnett, A. and J. C. Weaver. 1991. Electroporation: a unified, quantitative theory of reversible electrical breakdown and mechanical rupture in artificial planar bilayer membranes. Bioelectrochem. Bioenerg. 25:163-182.

Teruel MN, Blanpied TA, Shen K, Augustine GJ, Meyer T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Neurosci Methods 1999; 93(1):37-48.

Neumann E, Schaefer -Ridder M, Wang Y, Hofschneider PH. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J 1982; 1(7):841-5.

Belehradek J Jr, Orlowski S, Poddevin B, Paoletti C, Mir LM. Electrochemotherapy of spontaneous mammary tumours in mice. Eur J Cancer 1991; 27(1):73-6.

Mir LM, Glass LF, Sersa G, Teissie J, Domenge C, Miklavcic D et al. Effective treatment of cutaneous and subcutaneous malignant tumours by electrochemotherapy. Br J Cancer. 1998; 77(12):2336-42

Gehl J, Geertsen PF. Efficient palliation of haemorrhaging malignant melanoma skin metastases by electrochemotherapy. Melanoma Res 2000; 10(6):585-9.

Sersa G, Stabuc B, Cemazar M, Miklavcic D, Rudolf Z. Electrochemotherapy with cisplatin: the systemic antitumour effectiveness of cisplatin can be potentiated locally by the application of electric pulses in the treatment of malignant melanoma skin metastases. Melanoma Res 2000; 10(4):381-5.

Treco DA, Selden RF. Non -viral gene therapy. Mol Med Today 1995; 1(7):314-21. Weaver JC. Electroporation theory: concepts and mechanisms. In: Nickoloff JA, ed. Molecular Biology: Methods. Totowa: Human Press; 1995: 3-28.

Prausnitz MR, Gimm JA, Guy RH, Langer R, Weaver JC, Cullander C. Imaging regions of transport across human stratum corneum during high -voltage and low-voltage exposures. J Pharm Sci 1996b ; 85(12):1363-70.

Edwards D.A. Prausnitz M.R. Langer R., Weaver J.C. Analysis of enhanced transdermal transport by skin electroporation. J Control Release 1995; 34: 211-221.

Banga AK, Bose S, Ghosh TK. Iontophoresis and electroporation: comparisons and contrasts. Int J Pharm 1999 ; 179(1):1-19

Banga AK, Prausnitz MR. Assessing the potential of skin electroporation for the delivery of protein - and gene-based drugs.Trends Biotechnol 1998; 16(10):408-12.

Prausnitz MR, Gimm JA, Langer R, Weaver JC, Cullander C. Imaging Regions of transport across human stratum corneum during high-voltage exposures. J Pharm Sci 1996b;85(12):1363-70

Pliquett UF, Zewert TE, Chen T, Langer R, Weaver JC. Imaging of fluorescent molecule and small ion transport through human stratum corneum during high voltage pulsing: localized transport regions are involved. Biophys Chem 1996; 58(1-2):185-204.

Pliquett UF, Vanbever R, Preat V, Weaver JC. Local transport regions in human stratum corneum due to short and long high -voltage pulses. Bioelectrochem Bioenerg 1998; 47: 151 -161.

Vanbever R, Preat V. In vivo efficacy and safety of skin electroporation. Adv Drug Deliv Rev 1999 Jan 4; 35(1):77-88

Ilic L, Gowrishankar TR, Vaughan TE, Herndon TO, Weaver JC. Spatially constrained skin electroporation with sodium thiosulfate and urea creates transdermal microconduits J Control Release 1999; 61(1-2):185-202.

Panchangula R. Transdermal delivery of drugs. Ind J Pharm 1997;29:140-156.