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EMPLEO DE DESECHOS QUERATINOSOS PARA LA BIORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS.

CGPI 20050273

DIRECTORA DEL PROYECTO: DRA. LUZ IRENE ROJAS AVELIZAPA

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1.0 INTRODUCCION 1.1 Contaminación por hidrocarburos en México En México, existe una gran cantidad de sitios contaminados con hidrocarburos, los cuales presentan diferentes niveles de contaminación. Saval (1998) reportó que en Tabasco solamente existen aproximadamente 7200 hectáreas de tierra afectadas; de las cuales más del 90% se encuentran localizadas en pantanos o zonas inundables, lo cual dificulta el acceso de maquinaria y equipo para su tratamiento. Entre las principales fuentes de contaminación que han sido identificadas se encuentran los lodos de perforación; hidrocarburos provenientes de tuberías corroídas o tomas clandestinas; tiraderos de desechos, residuos de petroquímicas y refinerías (Adams et al., 1999). Los niveles y tipo de contaminación varían según la fuente de hidrocarburos y la antigüedad de la misma.

Rodríguez (1997), reportó que en un derrame, la mancha de

contaminación puede abarcar hasta 5 hectáreas con una concentración de hidrocarburos de 30% en la porción más contaminada, y concentraciones menores a su alrededor. Debido al grave problema de contaminación que presenta el país, se han buscado tecnologías apropiadas y de bajo costo para limpiar estos sitios y eliminar definitivamente los contaminantes allí presentes. En este contexto, las tecnologías biológicas de remediación se reconocen actualmente como unas de las opciones más seguras y viables (Saval, 1998). 1.2 Bioremediación La bioremediación se define como un proceso biológico, que utiliza microorganismos con el fin de convertir los compuestos químicos dañinos, en compuestos menos tóxicos o atóxicos para los seres vivos (Cookson, 1995). Esta alternativa biológica ha resultado ser una solución costeable y efectiva para la limpieza de sitios contaminados con hidrocarburos (Cho, et al., 2000; Heitzer & Sayler, 1993). En la remediación de sitios contaminados se emplean diferentes tecnologías, tales como bioventeo, fitorremediación, biolabranza, birreactores, composteo, etc., sin embargo, también puede llevarse a cabo de forma natural en el medio ambiente, a través de procesos de dispersión, adsorción y volatilización de los contaminantes, y acción biológica, a estos procesos se les conoce en su conjunto como atenuación natural (Hooker & Skeen, 1996).

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Antes de elegir alguna de las tecnologías mencionadas, es preferible realizar un estudio de factibilidad para caracterizar las propiedades del sitio. Estas pruebas permiten seleccionar y optimizar las condiciones de degradación del contaminante en cuestión. Dicho estudio consta de dos aspectos principales: la caracterización de las propiedades físico-químicas del contaminante y del material a tratar (suelo, lodo, sedimento); y la determinación del potencial de los microorganismos del sitio para degradar a los hidrocarburos blanco. Con base en los estudios de factibilidad, se puede entonces elegir también alguna(s) de las estrategias de bioremediación, como son la bioaumentación y/o la bioestimulación (Vogel, 1996). La bioaumentación es el proceso de introducir microorganismos para incrementar o acelerar la degradación de los contaminantes. Se aplica cuando la población microbiana del sitio o sistema contaminado (in situ o ex situ) es limitada, los microorganismos adicionados pueden provenir de la misma población autóctona o bien exógenos. Los microorganismos inoculados deben adaptarse al suelo, sobrevivir, crecer y demostrar su capacidad degradativa (Kerr, 1994). La bioestimulación consiste principalmente en la adición de nutrientes y la introducción de oxígeno o aceptores de electrones al sitio en donde reside la contaminación, de manera que pueda favorecerse o incrementarse la actividad biológica responsable de la degradación de los contaminantes orgánicos (Riser, 1998). 1.3 Utilización del composteo en la biodegradación de hidrocarburos El composteo es una tecnología que ha sido muy utilizada en el tratamiento de suelos contaminados con petróleo por lo que existen numerosos reportes que involucran dicho proceso. En la tabla 1 se describen algunas investigaciones realizadas, mencionando el residuo orgánico utilizado. Como puede observarse, el uso de residuos orgánicos utilizados en composteo favorece la biodegradación de hidrocarburos, sin embargo, hasta el momento el efecto de estos materiales sobre el proceso no son concluyentes. Algunos autores (Semple, et al., 2001; Carmichael & Pfaender, 1997; Rhodes, et al., 1994a; Rhodes, et al., 1994b) confieren al residuo la propiedad de proveer una mejor aireación al suelo, nutrientes y/o biota.

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Tabla 1. Procesos de composteo utilizados en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo Residuo

Observaciones

Referencia

orgánico Hojas de maple y alfalfa

El composteo se realizó en un suelo contaminado con Beaudin, et al., petróleo (7000 mg/Kg suelo) a escala de laboratorio. Los (1996) resultados mostraron una disminución del 50% del petróleo durante los primeros 105 días. Después de 180 días se observó una degradación de hidrocarburos alifáticos (60%), aromáticos (54%) y compuestos polares (83%). Después de 287 días, el 73% del petróleo había sido degradado.

Estiércol de caballo

El desecho se utilizó para ayudar a degradar los Kirchmann & sedimentos de una estación de petróleo, y los residuos de Ewnetu, (1998) una refinería. Se observó una degradación del 78 al 93% después de 4.5 meses.

Hojarasca verde, estiércol de vaca, yeso y nutrientes

Se estudió la degradación de los hidrocarburos totales del Turlouh, (2001) petróleo en un suelo, 3100±1270 mg/Kg. Después de 6 meses de tratamiento, la concentración de hidrocarburos totales disminuyó a 730 mg/Kg.

Paja de trigo, estiércol de pollo y yeso

Se demostró la degradación de hidrocarburos aromáticos Sasek, et al., policíclicos de un 20 a 60% después de 54 días de (2003) tratamiento.

El uso de materiales orgánicos no solo se limita a procesos de composteo, otros materiales de importancia son los que se utilizan en la limpieza de derrames, los cuales tienen la característica de presentar una alta capacidad de adsorción y/ absorción. En algunas ocasiones estos materiales llegan a ser reutilizados o bien solo son confinados y/o incinerados provocando una mayor contaminación al medio.

1.4 Utilización de absorbentes en la remoción de hidrocarburos Debido a la problemática que representa la contaminación por hidrocarburos, se han desarrollado varios procesos para removerlos de áreas contaminadas; entre ellos, la recuperación por absorbentes es uno de los procesos más promisorios, ya que los absorbentes

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además de remover el petróleo, también son utilizados para aumentar la superficie de contacto entre el hidrocarburo y los microorganismos, para así favorecer el proceso de degradación. Existen numerosos materiales celulósicos comercialmente disponibles para la bioremediación de ecosistemas acuáticos contaminados con petróleo (Ericsson, et al., 1985). Estos materiales absorben el petróleo incorporándolo dentro de su matriz y aumentando la superficie de contacto de forma significativa. Sin embargo, también se ha empezado a enfatizar el uso de residuos no industrializados como son las plumas de pollo, las cuales se han utilizado como absorbentes de hidrocarburos en áreas que no tienen un fácil acceso a equipo de limpieza y personal, tal es el caso de derrames en las costas que presentan abundante vegetación (Breitenbeck & Grace, 1998). En un estudio realizado por Breitenbeck & Grace (1998), se comparó la capacidad de absorción de cuatro absorbentes comerciales ricos en N, y dos naturales también ricos en N (bagazo 5.1% de N y plumas de pollo 14.1 % de N). Los resultados indicaron que todos los materiales fueron capaces de absorber petróleo por lo menos cinco veces su peso. La pluma de pollo fue el material que absorbió la mayor cantidad de petróleo (7.1g/g pluma). También se notó que además de excelente absorbente, los desechos de plumas mejoraban ligeramente la degradación microbiana del petróleo, este estudio se realizó en microcosmos que contenían material contaminado con 43,400 mg HTPs/Kg suelo y una relación suelo:residuo de 20:1, en este estudio se observo que después de 90 días de incubación el tratamiento con bagazo mejoró la degradación de hidrocarburos totales en un 99%, mientras que tratamiento con plumas de pollo lo mejoró en un 86%. Existen muy pocos reportes sobre el uso de plumas de pollo en bioremediación (Breitenbeck & Grace, 1998). Es posible que la degradación de hidrocarburos pueda incrementarse sí los microorganismos involucrados en la degradación de hidrocarburos posean además la actividad proteolítica (queratinolítica) para penetrar a la matriz del absorbente.

1.5 Utilización de los desechos avícolas queratinosos Las plumas de pollo son generadas principalmente por las plantas procesadoras de aves y las granjas avícolas. Estas representan una gran fuente de contaminación, pues constituyen entre el 5 y el 7% del peso total de las aves procesadas (Onifade et al., 1998; Santos et al.,

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1996). En México, la producción de pollo en 1995 fue de 1,200,000 toneladas en canal y 1,500,000 toneladas en pie (Claridades agropecuarias, 1995), lo que generó un total de 189,000 toneladas de plumas. Uno de los pocos usos que se han dado a las plumas es para la obtención de hidrolizados utilizados como suplemento en la alimentación avícola, sin embargo, presentan una baja digestibilidad y deficiente contenido de aminoácidos esenciales como metionina y triptófano (Baker, 1981; Dalev et al., 1997). Por otro lado, también pueden ser convertidas en fertilizantes, pegamento, películas, o ser usadas para la producción de aminoácidos como serina, cisteína y prolina (Papadopolous et al., 1986). Considerando que el volumen de producción es elevado, y que las plumas están constituidas en un 90% por queratina, este desecho representa un sustrato potencial para la obtención de compuestos de mayor valor agregado, o bien puedan ser utilizadas con algún beneficio ambiental como la bioremediación por composteo, utilizando microorganismos degradadores de queratina o directamente enzimas queratinolíticas.

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2.0 OBJETIVO GENERAL Investigar el efecto de la adición de desechos queratinosos en la biodegradación de hidrocarburos,

mediante

bacterias

previamente

seleccionadas

por

su

capacidad

hidrocarbonoclasta y queratinolítica, provenientes de la biota nativa de un suelo contaminado.

2.1 Objetivos Específicos a)

Averiguar qué proporción de la biota nativa presente en un suelo contaminado, presenta capacidad para degradar hidrocarburos del petróleo y poseen actividad de queratinasa.

b)

Averiguar si la biodegradación de hidrocarburos del petróleo, se incrementa por la adición de desechos queratinosos, utilizando microorganismos con las capacidades referidas previamente.

c)

Identificar por análisis del 16S rDNA a los componentes del cultivo mixto queratinolítico responsables de la degradación de hidrocarburos.

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3.0 METAS 1. Caracterizar fisicoquímicamente el suelo problema, procedente del campo petrolero “Paredón 31” ubicado en el estado de Tabasco. 2. Extraer con solventes orgánicos las fracciones del petróleo presente en el suelo y analizarlas para identificar los compuestos presentes en cada una, por espectroscopia de infrarrojo,

cromatografía de gases y cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas, según sea el caso. 3. Aislar y caracterizar la biota nativa heterótrofa aerobia presente en el suelo problema (hongos y bacterias), utilizando medios de enriquecimiento. 4. Evaluar mediante pruebas tamiz, la actividad queratinolitica y degradadora de hidrocarburos de los microorganismos que constituyen dicha biota. 5. Seleccionar en base a los resultados anteriores, a aquellos microorganismos que reúnan capacidad queratinolítica y que además degraden hidrocarburos. 6. Identificar bioquímicamente a los microorganismos seleccionados. 7. Realizar cinéticas de producción de queratinasas en un medio sintético adicionado de desechos plumas al 6% para cada uno de los microorganismos. 8. Analizar los resultados para establecer un consorcio microbiano con los microorganismos más queratinolìticos y degradadores de hidrocarburos, así como con los más queratinoliticos y degradadores de hidrocarburos. 9. Realizar cinéticas de crecimiento de los consorcios en un medio mineral adicionado de los hidrocarburos al 40% de su capacidad de retención en los residuos al 6% con el objetivo de seleccionar el tiempo de viabilidad de los consorcios. 10. Evaluar la degradación de hidrocarburos realizada por el consorcio durante el tiempo seleccionado anteriormente, en un medio mineral adicionado del residuo ( pluma) al 6% impregnado con diferentes concentraciones de hidrocarburo seleccionadas éstas en base a las capacidades de retención del mismo, así como evaluar la degradación del hidrocarburo sin el residuo. 11. Analizar los resultados para seleccionar la concentración de hidrocarburos. 12. Evaluar la adsorción de los hidrocarburos del petróleo en los residuos de plumas. 13. Realizar cinéticas de degradación de hidrocarburos, en un medio mineral adicionado de los hidrocarburos con la concentración seleccionada más los desechos de plumas y el

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consorcio microbiano seleccionado, evaluando cuenta viable, actividades enzimáticas, consumo de nutrientes (nitrógeno y fósforo), pH, proteína soluble y pérdida del residuo. 14. Identificar cada uno de los aislados que componentes de el cultivo mixto ( queratinolítico) mediante el análisis de 16S rDNA. 4.0 HIPÓTESIS La adición de desechos queratinosos en medio liquido y suelo, mejora la interacción entre los hidrocarburos del petróleo y la microbiota presente, así como también incrementa las condiciones nutrimentales, permitiendo un más rápido crecimiento microbiano, lo que propiciará una mayor biodegradación de los contaminantes por los microorganismos degradadores de hidrocarburos, que poseen también una capacidad queratinolítica.

5.0 JUSTIFICACIÓN En la presente investigación se pretenden utilizar las plumas molidas de pollo, para favorecer la degradación de los hidrocarburos presentes en un suelo contaminado, debido a dos factores principalmente: •

Estos residuos han sido reportados como absorbentes de hidrocarburos y/o metales, sin embargo, poco se ha investigado, sobre su posible

biodegradación con petróleo

impregnado dentro de su matriz. Además, tampoco se han utilizado en procesos de composteo para favorecer la degradación de hidrocarburos del petróleo. •

La disponibilidad de estos residuos en nuestro país es alta, se tienen cifras de disponibilidad de unas 189,000 toneladas de plumas por año, que a su vez ocasionan una grave contaminación.

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6.0 MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Suelo contaminado Para aislar y seleccionar a los microorganismos se utilizaron 12 muestras de suelo contaminado con hidrocarburos del petróleo provenientes del Campo petrolero “Paredón 31” ubicado en el Estado de Tabasco. 6.2 Desechos queratinosos Se utilizaron plumas molidas de pollo como fuente de queratina, las cuales se limpiaron manualmente de basuras y cuerpos ajenos, se lavaron al chorro de agua y se dejaron secar al sol. Después se molieron en un molino eléctrico de cuchillas (Willey), y las partículas se tamizaron a través de una malla del tamaño 20. La presente investigación se dividió en varias etapas, a continuación se describen las que han sido cubiertas. 6.3 Etapa 1 La investigación hasta este momento se encuentra dividida en dos etapas. La primera consistió en el aislamiento de microorganismos con capacidad queratinolitíca y degradadora de hidrocarburos, provenientes de los suelos contaminados. 6.3.1 Caracterización fisicoquímica de los suelos Los datos sobre las características físicas y químicas de las muestras de suelo utilizadas en este estudio fueron proporcionados por la Dra. Norma Gabriela Rojas Avelizapa del Instituto Mexicano del Petróleo. 6.3.2 Cultivo de enriquecimiento, aislamiento y caracterización morfológica de la biota proveniente de los suelos 6.3.2.1 Enriquecimiento en medio líquido Para obtener la biota heterótrofa aerobia de los suelos contaminados se realizaron cultivos en medios selectivos, caldo papa dextrosa y caldo nutritivo para hongos y bacterias respectivamente. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml de medio adicionado de 2.5 g de suelo, la incubación se realizó durante 24-48 h para

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bacterias y 120 h para hongos con una agitación de 180 rpm y 28 ºC. Paralelamente y con el fin de aislar selectivamente a la biota capaz de degradar hidrocarburos (hidrocarbonoclastas) y/o residuos, se utilizaron cultivos conteniendo 25 ml de medio mineral formulado a base de 0.3g de KNO3, 0.02g de FeCl3, 0.2g de MgSO4.7H2O, 0.1g de CaCl2, 1g de K2HPO4 por litro y ajustado a un pH 7, adicionado de carapacho de camarón al 6%, petróleo ligero al 0.5% y 2.5 g de suelo, además también se utilizaron cultivos con 25 ml de medio mineral adicionado con plumas de pollo al 6%, petróleo al 0.5% y 2.5 g de suelo e incubados a las mismas condiciones. La biota presente en los residuos se obtuvo utilizando caldo nutritivo y caldo papa dextrosa. 6.3.2.2 Crecimiento en medio sólido La biota nativa heterótrofa se cuantificó mediante siembra por dilución en placa. En el caso de bacterias se utilizó agar nutritivo y para hongos se utilizaron placas de agar papa dextrosa, la incubación se realizó a 28 ºC durante 24 h para bacterias y 120 h para hongos. En el caso de las bacterias hidrocarbonoclastas (capaces de degradar hidrocarburos), se aislaron mediante estría en placas de agar noble conteniendo el medio mineral antes mencionado y un papel filtro impregnado de hidrocarburos, el cual se colocó en la parte interna de la caja. La incubación se realizó durante 7 días a 28ºC.

6.3.2.3 Morfología colonial y microscópica de la biota nativa hidrocarbonoclasta Una vez habiendo separado los cultivos, se realizó una observación de las características morfológicas de las colonias después de 36 h de incubación a 28ºC, tales como: tamaño, pigmento, forma, bordes, elevación, superficie, luz reflejada, luz transmitida, consistencia y se realizó tinción de Gram. Para los hongos se observó color del micelio vegetativo y aéreo así como producción de pigmento. 6.3.3 Selección primaria de bacterias con capacidad querainolitica y degradadora de hidrocarburos 6.3.3.1 Evaluación semicuantitativa de la actividad queratinolítica Esta actividad se evaluó creciendo a las cepas nativas aisladas previamente, en un medio adicionado con lana molida y teñida con azul brillante de remazol. Las fibras de lana

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fueron lavadas y tratadas con sulfito de sodio 0.3M. Después se tiñeron con azul brillante de remazol al 1%. El color se fijó con dicromato de potasio al 3% y ácido tartárico al 3%. El exceso de colorante fue removido lavando primero con agua caliente y luego con etanol. La lana teñida y seca se molió en un molino Willey con una malla 40 y se adicionó al 0.4% al medio mineral. La actividad de queratinasa se midió en los sobrenadantes de los cultivos a una absorbencia de 585 nm debido al color liberado en el medio, por la acción lítica de las cepas positivas después de un periodo de 24 h de incubación. Como control positivo se utilizó a S. marcescens WF. 6.4 Etapa 2 La segunda etapa consistió en el estudio de las actividades enzimáticas de los microorganismos seleccionados previamente en medio líquido, así como la conformación de los consorcios (selección secundaria) y el estudio de degradación de hidrocarburos. En la Figura 2 se muestra de forma resumida las actividades realizadas en esta etapa, las cuales son detalladas a continuación. 6.4.1 Evaluación de actividades enzimáticas en medio líquido 6.4.1.1 Preparación de inóculo El inóculo se preparó en matraces Erlenmeyer de 125 ml; utilizando 25 ml de medio mineral adicionado con plumas de pollo o carapacho de camarón al 6% e inoculado con una asada del microorganismo a evaluar. Los matraces se incubaron a 28ºC y 180 rpm realizando un pase cada 24 h durante tres días, tomando 0.1 ml del cultivo y sembrándolo en medio fresco, con el fin de tener células jóvenes. En el caso de la evaluación del consorcio se cultivaron los aislados de la misma forma y al momento de inocular los matraces para la cinética, en un matraz estéril se adicionaron 3 ml de cada uno de los cultivos con los diferentes aislados y éste ultimo sirvió para inocular con 0.1 ml los matraces pertenecientes a las cinéticas de actividades enzimáticas. 6.4.2 Estudio de viabilidad de los aislados en medio con hidrocarburos-residuo ó hidrocarburos

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Para establecer el tiempo de duración de los estudios de degradación, se realizaron cinéticas de crecimiento de un aislado proteo-quitinolitico y de un queratinolítico, en matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml de medio mineral adicionado de hidrocarburos a una concentración equivalente al 40% de la capacidad de retención de las plumas de pollo. O bien utilizando únicamente el hidrocarburo como fuente de carbono a la misma concentración. Cada 12 h durante 30 días se evaluó el crecimiento de los microorganismos por dilución en placa. 6.4.4 Selección de la concentración de hidrocarburos a estudiar Para evaluar las diferentes concentraciones de hidrocarburos, se prepararon series de 5 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de medio mineral, plumas de pollo al 6% e hidrocarburos al 5, 10, 20, 30 y 40% de la capacidad de retención de los residuos, estos matraces fueron inoculados con el consorcio respectivo o con el aislado que presentó mayor actividad enzimática. Los matraces fueron incubados a 180 rpm durante 12 días a 28ºC. La degradación de los hidrocarburos se evaluó al inicio y al final del periodo de incubación, extrayendo el hidrocarburo residual del medio de cultivo, mediante una extracción liquido-liquido en un embudo de separación utilizando diclorometano como solvente y el total del contenido del matraz Erlenmeyer, el extracto orgánico obtenido se concentró a sequedad utilizando un rotavapor Vacuubrand CVC2 a una presión de 990 mbar y una temperatura de 40 ºC, los hidrocarburos totales del petróleo (HTP) obtenidos fueron resuspendidos en diclorometano para su análisis por cromatografía de gases, inyectando 1 µl de muestra en un cromatógrafo Agilent Technologies serie 6850 GC System, utilizando una columna capilar HP-1 de metil siloxano cuyas dimensiones son 30 m x 320 µm x 0.25 µm y un detector de flama (FID). El equipo operó bajo las siguientes condiciones: rampa de temperatura 30ºC/1 min., 30º-100 ºC/ 15min., 100º-200 ºC/7 ºC/min., 200º-250 ºC/6 ºC/min, temperatura de inyector 250 ºC, detector 280 ºC, se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 1.5 ml/min. La remoción de hidrocarburos totales se determinó por diferencias en áreas bajo la curva interpolando en una curva tipo de concentraciones conocidas realizada con el mismo petróleo. Con el fin de evaluar las pérdidas abióticas, también se evaluó la degradación al inicio y al final del tratamiento en matraces control que contenían las diferentes concentraciones de petróleo y el residuo y que no fueron inoculados.

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6.4.5 Estudio de crecimiento del consorcio, actividad de queratinasa, pérdida del residuo y evaluación de la degradación de hidrocarburos Las cinéticas se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml de medio mineral más 6% de plumas molidas como fuente de queratina, 40% de la capacidad de retención de hidrocarburos por el residuo (64,800 ppm) y 0.1 ml de inóculo del consorcio, los matraces se incubaron a 28°C y 180 rpm. Cada 12 h durante 30 días se realizó la cuenta de bacterias hidrocarbonoclastas, evaluación de actividad queratinolítica (ver 6.4.1.3), pérdida del residuo (gravimétricamente) y degradación de hidrocarburos (ver 6.4.4). 6.4.7 Análisis estadístico Todos los experimentos fueron realizados por duplicado, por lo que los datos de las graficas mostradas corresponden a valores promedio. El calculo de las correlaciones de Pearson, el Análisis de Variancia y la comparación entre grupos (Tukey) se realizó utilizando el programa Sigma-Stat versión 2.0. 6.4.6 Estudios de biodegradación Para evaluar el efecto de la adición de plumas de pollo sobre la biodegradación del petróleo, se preparó una serie experimental en matraces Erlenmeyer de 125 ml, conteniendo 25 ml del medio mineral, sé adicionó el residuo queratinoso (6 % w/v) y se esterilizó a 121ºC y 15 psi. Posteriormente se adicionaron 64,800 mg/L de petróleo estéril (40% de la capacidad de retención de las plumas de pollo). Una vez preparados los matraces, estos fueron inoculados con 0.1 ml del cultivo mixto e incubados a 28 ºC, 180 rpm durante 30 días. Cada 6 h durante los primeros 3 días; cada 12 h durante los siguientes 6 días y finalmente cada 3 días durante los últimos 21 días, se retiraron tres matraces para realizar los análisis correspondientes. Los análisis fueron cuenta viable, degradación de hidrocarburos, adsorción del petróleo en el residuo queratinoso, evaluación de los hidrocarburos remanentes, degradación del residuo queratinoso, actividad queratinolítica, contenido de nitrógeno y fósforo, contenido de productos ninhidrina positivos y pH.

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Paralelamente se prepararon cuatro series experimentales como controles: 1) mismas condiciones sin la adición del residuo queratinoso, 2) mismas condiciones sin adición de petróleo, 3) y 4), los anteriores pero éstos no fueron inoculados. 6.4.7 Biodegradación del petróleo La degradación de los hidrocarburos se determinó mediante la cuantificación de los hidrocarburos totales del petróleo (HTP’s), extrayendo el hidrocarburo residual del medio de cultivo de cada uno de los matraces, para lo cual, se realizó una extracción liquido-liquido en un embudo de separación utilizando diclorometano como solvente y el total del contenido del matraz Erlenmeyer. El extracto orgánico obtenido se concentró a sequedad utilizando un rotavapor Vacuubrand CVC2 a una presión de 990 mbar y una temperatura de 40 ºC. Los HTP’s obtenidos fueron resuspendidos en diclorometano para su análisis por cromatografía de gases (CG-FID), inyectando 1 µl de muestra en un cromatógrafo Agilent Technologies serie 6850 GC System, utilizando una columna capilar HP-1 de metil siloxano cuyas dimensiones son 30 m x 320 µm x 0.25 µm y un detector de flama (FID). El equipo operó bajo las siguientes condiciones: rampa de temperatura 30ºC/1 min., 30º-100 ºC/ 15min., 100º-200 ºC/7 ºC/min., 200º-250 ºC/6 ºC/min, temperatura de inyector 250 ºC, detector 280 ºC y se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 1.5 ml/min. La concentración de HTP’s se determinó por diferencias en áreas bajo la curva interpolando en una curva tipo de concentraciones conocidas (0-14,000 mg/L) realizada con el mismo petróleo. Con el objetivo de cuantificar la biodegradación neta de HTP’s en los sistemas adicionados con residuo queratinoso, se evaluó el contenido de hidrocarburos del petróleo adsorbido a este residuo. 6.4.8 Hidrocarburos del petróleo adsorbidos al residuo queratinoso Después del proceso de extracción liquido-liquido, el residuo queratinoso seco fue sometido a una extracción liquido-sólido utilizando un equipo Soxhlet, la extracción se llevo a cabo durante 8 h utilizando diclorometano como solvente, los extractos orgánicos obtenidos fueron analizados concentrados y aforados a un volumen de 5 ml para su posterior análisis por CG-FID.

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6.4.9 Identificación de los HTP’s remanentes Para la identificación de los HTP’s remanentes, el extracto orgánico conteniendo los HTP’s fue fraccionado de acuerdo al protocolo reportado por Arce-Ortega et al., 2004. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-MS) en un HP 6890 y GC-MS 5973 utilizando una columna capilar MS-5. Se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 0.9 ml/min. La temperatura del inyector fue 280ºC, la programación del horno fue 80 ºC durante 1 min, 80-240 ºC a 15 ºC/min, 240-280ºC a 7ºC min-1, y 2 min a 2 80°C. Para la identificación del tipo de hidrocarburos presentes se utilizó un estándar UST rango diesel (Supelco). 6.4.10 Biodegradación del residuo queratinoso La biodegradación de las plumas de pollo se cuantificó gravimétricamente mediante pérdida de peso, una vez que los HTP’s fueron extraídos del residuo, las plumas de pollo fueron secadas y pesadas. 6.4.11 Actividad queratinolítica La actividad queratinolítica fue cuantificada utilizando el método de sustrato teñido (Cedillo, 1998), haciendo reaccionar, en tubos Ependorff, 20 mg de lana teñida con azul brillante de remazol suspendida en 0.5 ml de solución amortiguadora de glicina-NaOH, 0.2M pH 9, con 1 ml del sobrenadante del cultivo, ésta mezcla fue incubada a 37ºC durante 1 h. La reacción enzimática se detuvo al sumergir los tubos en un baño con agua a temperatura de ebullición durante 15 min. Posteriormente los tubos se dejaron en reposo a 7ºC por 30 min, y se centrifugaron a 10,000 rpm durante 15 min. Las absorbancias de los sobrenadantes se leyeron a 590 nm. La actividad se expresó en unidades de queratinasa por ml (UQ/ml), definiéndose una unidad como la cantidad de enzima necesaria para solubilizar el sustrato teñido y producir un incremento de 0.01 en la absorbancia, bajo las condiciones experimentales utilizadas. Los tubos testigos se prepararon usando el sobrenadante del cultivo, con la enzima inactivada previamente por inmersión en un baño con agua en ebullición por 15 min. 6.4.12 Determinación de nitrógeno y fósforo

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El contenido de fósforo fue determinado en los sobrenadantes utilizando la técnica de Bray and Kurtz (Goijberg, 1996). El contenido total de nitrógeno fue cuantificado mediante el método de micro-Kjeldahl (AOAC, 1970) en los sobrenadantes y en el remanente del residuo queratinoso. 6.4.13 Determinación de proteína soluble El contenido de proteína soluble fue determinado en los sobrenadantes libres de células utilizando el método de Bradford (Bradford, 1976), y haciendo uso de una curva tipo de albúmina serica de bovino (0-300 µg/ml). 6.4.14 Determinación de productos ninhidrina positivos El contenido de productos ninhidrina positivos fue cuantificado de acuerdo al método de Harding (Block & Weiss, 1956), el cual se basa en la reacción de ninhidrina con grupos amino primarios para formar el complejo púrpura denominado “purpura de Ruhemann”, por lo tanto, su determinación cuantifica los posibles aminoácidos presentes, en este caso como resultado de la degradación del residuo queratinoso Esta determinación se realizó en tubos de vidrio, a los cuales se adicionaron 5 ml de los sobrenadantes de cada matraz y se colocaron en un baño de agua a ebullición durante 15 min para precipitar las proteínas residuales. Posteriormente, los sobrenadantes fueron centrifugados a

7000 rpm durante 15 min,

1.9 ml de cada uno de los sobrenadantes

centrifugados y 0.1 ml del reactivo de ninhidrina (5 partes de ninhidrina al 1 % en piridina y 1 parte de ácido acético glacial a ebullición durante 5 min) fueron adicionados a otros tubos, los cuales fueron posteriormente incubados en un baño con agua a ebullición durante 20 min y después incubados a 4ºC durante 15 min., el complejo púrpura formado fue determinado mediante absorbancia a 570 nm. Los resultados fueron interpolados en una curva de leucina con una concentración de 0 a 300 µg/ml. 6.4.15 Determinación de pH El pH se determinó en los sobrenadantes de los cultivos a 25ºC utilizando un potenciómetro marca Oakton.

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6.4.16 Análisis estadístico Los datos obtenidos fueron procesados mediante análisis de variancia ANOVA utilizando el método de Tukey o de Student Newman-Keuls. La correlación de los resultados fue analizada por correlación de Pearson. Tales resultados fueron considerados significativos cuando la probabilidad fue P 0 Abundance (b) 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 4.00 6.00 8.00 10.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00 24.00 0 Time-->

4.00 6.00 8.00 10.0012.0014.00 16.0018.00 20.0022.0024.00

(d)

4.00 6.00 8.00 10.00 12.0014.00 16.00 18.0020.0022.00 24.00

Figura 13. Perfiles cromatograficos de la fracción alifática obtenida a partir de los HTP' s recuperados después de los tratamientos incubados a 28 ºC y 180 rpm (a): Sistema conteniendo petróleo y residuo queratinoso como fuentes de carbono (tiempo = 0 días) (b): Sistema conteniendo petróleo y residuo queratinoso como fuentes de carbono (tiempo = 15 días) (c): Sistema conteniendo petróleo como única fuente de carbono (tiempo = 0 días) (d): Sistema conteniendo petróleo como única fuente de carbono (tiempo = 15 días) Existe poca información referente a la degradación de un grupo particular de compuestos provocado por la presencia de alguna fuente de carbono compleja. Tan solo, Kastner & Mahro, 1996 y Sasek, et al., 2003, reportaron que la adición de composta mejoró la degradación de HAP’s en un suelo contaminado debido al incremento de nutrientes, así también Namkong, et al., 2002 reportaron la degradación preferencial de n48

49

alcanos en un suelo contaminado con diesel debido a la adición de materia orgánica. También se ha reportado que la adición de quitosana, quitina y queratina incrementa la biodegradación de HTP’s (Setti et al., 1999). La degradación preferencial de compuestos alifáticos con número de átomos de carbono C18 a C28 (Figura 13b) probablemente se deba a un menor grado de ramificación en comparación con los C10 a C17.

Solano et al., 1999, reportaron que después de un

tratamiento de biodegradación de gasolina, los componentes residuales fueron alcanos altamente ramificados con carbonos terciarios y cuaternarios, los cuales resultaron ser remanentes por su alta ramificación. Entre los HAP’s identificados en el petróleo en estudio encontraron compuestos del tipo 2,3,5-trimetil-naftaleno, fenantreno, antraceno

y criseno, así

como metil-

dibenzotiofeno perteneciente a los compuestos azufrados, sin embargo su biodegradación no fue detectada en ningún sistema. 7.9.4 Biodegradación del residuo queratinoso Al igual que el petróleo, el residuo queratinoso fue degradado. Las figuras 14a y 14b muestran la pérdida de peso del residuo. Al igual que el petróleo, el residuo queratinoso fue degradado en mayor porcentaje durante los primeros 12 días de incubación. El residuo fue degradado 42% cuando fue utilizado por el cultivo mixto como única fuente de carbono (figura 14a), mientras que cuando fue suministrado junto con el petróleo (figura 14b), solamente se degradó en un 20%. Esto es, el residuo queratinoso presentó menor degradación cuando el petróleo estuvo presente y no representó competencia para la degradación de los HTP' s, al contrario, la presencia del residuo favoreció la degradación de los HTP' s y ambos fueron degradados paralelamente. Es importante mencionar que probablemente, una de las razones en el incremento de la degradación de HTP' s por efecto de la presencia del residuo queratinoso se debió a que el cultivo mixto posee la actividad enzimática especifica para degradar la queratina, componente del cual esta constituido el residuo en un 90 %.

49

50

(a) Contenido de residuo queratinoso

80 70

90 80 70

60

60

50

50

40

40

Actividad queratinolítica

30

30

20

20

10

10

0

0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time (Days)

90

(b)

80

100 90 80

Contenido de residuo queratinoso

70

70

60

60

50

50

40

40

Actividad queratinolítica

30

30

20

20

10

10

0

Plumas de pollo (%)

90

100 Actividad queratinolitica (UK/ml)

100

Plumas de pollo (%)

Actividad queratinolitica (UK/ml)

100

0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Tiempo (dias)

Figura 14. Degradación del residuo queratinoso (plumas de pollo) y actividad queratinolítica evaluados en la cinética de degradación de HTP’s en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (14a): residuo queratinoso, (14b): residuo queratinoso + petróleo. 7.9.5 Evaluación de la actividad queratinolítica Durante la biodegradación del residuo queratinoso, la actividad queratinolítica se expresó en ambos tratamientos (figuras 14a, 14b). La mayor actividad se expresó al segundo día de incubación en el medio con residuo como única fuente de carbono (figura 14a), mientras que en el medio con petróleo y residuo, la mayor actividad fue expresada 50

51

durante el cuarto día de incubación. Esto es, el petróleo ocasionó que la expresión de la actividad queratinolítica se retrasara en relación a la expresión en el cultivo con el residuo queratinoso como única fuente de carbono. El análisis de resultados mostró que la actividad queratinolitica tiene una correlación positiva (r> 0.9) con la degradación del residuo en ambos medios (con y sin petróleo), así como con el crecimiento del cultivo queratinolítico. Lo anterior sugiere, que tanto el petróleo como el residuo fueron degradados por el cultivo mixto al mismo tiempo. Muchos autores han reportado el incremento en la biodegradación de hidrocarburos debido a la adición de una gran cantidad de fuentes de carbono adicionales, tales como paja de trigo, estiércol de pollo (Sasek, et al., 2003), quitosana, quitina, queratina (Setti, et al., 1999) o mediante el uso de fertilizantes de liberación prolongada (Hu, et al., 2005). Sin embargo el uso de estos materiales se ha realizado con conocimiento limitado de las posibles consecuencias, puesto que algunas veces pueden resultar recalcitrantes o pueden absorber el compuesto blanco y evitar su degradación. Por eso, es importante que el material adicionado sea biodegradable y a su vez permita la degradación del contaminante blanco. 7.9.6 Cuantificación de proteína soluble y aminoácidos Como resultado del crecimiento microbiano y del proceso de degradación, el medio de cultivo presentó cambios en su composición, estos posiblemente fueron ocasionados por la acumulación de productos y/o por el consumo de otros. En la presente investigación, se evaluó el contenido de proteína soluble en los sobrenadantes libres de células, las figuras 15a, 15b y 15c muestran los resultados obtenidos. Los sistemas conteniendo el residuo queratinoso (figura 15a y 15c) presentaron mayor contenido de proteína soluble que el cultivo conteniendo únicamente petróleo como fuente de carbono (figura 15b). La mayor acumulación de proteína soluble en los sistemas con residuo se presentó durante los primeros tres días de incubación, al igual que la fase exponencial de crecimiento del cultivo mixto (figura 12a y 12c)

y que la mayor

biodegradación del residuo (figuras 14a y 14b). En el caso del cultivo con petróleo como única fuente de carbono, éste presentó una máxima acumulación de proteína soluble durante los primeros 12 días de incubación, lo anterior correlacionó con el crecimiento del 51

52

cultivo (r> 0.9) (figura 12b), debido que este cultivo no tuvo otra fuente de proteína, la única proteína cuantificada proviene de la lisis de las mismas células. En los sistemas con residuo, la proteína soluble evaluada puede provenir tanto de las células como de la biodegradación del residuo.

52

53

1200

(a)

1000

Proteína

600

800

500 400

600

300

400

Amino ácidos

200

200

100

0 0

2

4

6

8

Tiempo (dias)

700 Proteína soluble ( µg/ml)

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

(b)

Proteína

600

400

600

300

400

200

Amino ácidos

200

100 0

0

0

2

4

6

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time (days)

700 Proteína soluble ( µg/ml)

1000 800

500

800

1200

Aminoacidos (µg/ml)

0

800

Aminoacidos (µg/ml)

700

Proteína

(c)

1200 1000

600 800

500

Amino ácidos

400

600

300

400

200

Amino acidos ( µg/ml)

Preoteína soluble ( µg/ml)

800

200

100 0

0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Tiempo (dias)

Figura 15. Proteina soluble y contenido de aminoácidos evaluados en la cinética de degradación de HTP’s en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (15a): residuo queratinoso, (15b): petróleo y (15c): residuo queratinoso + petróleo.

53

54

La alta correlación positiva r>0.9 entre la biodegradación del residuo queratinoso, el crecimiento microbiano y el contenido de proteína soluble durante los primeros tres días de incubación en los cultivos conteniendo residuo y petróleo, sugiere que el residuo queratinoso fue utilizado como fuente de carbono y energía por el cultivo mixto queratinolítico y que la proteína soluble es el resultado de la biodegradación del residuo queratinoso y del crecimiento microbiano. La presencia de proteína soluble en los sobrenadantes indicó de forma indirecta la biodegradación del residuo, y así mismo su presencia representa una fuente de carbono secundaria que puede ser utilizada. Con el objetivo de conocer el grado de degradación del residuo queratinoso y el consumo de proteína soluble, se cuantificó el contenido de aminoácidos. Las figuras 15a, 15b y 15c muestran los resultados obtenidos. En el cultivo conteniendo petróleo como única fuente de carbono (figura 15b), los productos ninhidrina positivos fueron detectados después de 12 días de incubación y aunque antes en el sobrenadante se detectó proteína soluble, ésta no fue metabolizada hasta aminoácidos. Después de12 días, la proteína comenzó a degradarse, este resultado podría explicar el porque después de 12 días el contenido de HTP' s no fue significativamente diferente; sin embargo la fase estacionaria de crecimiento del cultivo mixto se mantuvo. Es decir, después de 12 días de incubación el cultivo mixto queratinolítico probablemente se mantuvo utilizando algunos peptidos y aminoácidos como fuentes de carbono y energía. En el caso del cultivo con únicamente residuo queratinoso como fuente de carbono (figura 15a), la acumulación de posibles aminoácidos comenzó desde los dos primeros días de incubación, es decir la queratina de las plumas de pollo comenzó inmediatamente a ser degradada produciendo algunos polipéptidos solubles cuantificados como proteína, así como aminoácidos. El mismo comportamiento se presentó cuando ambas fuentes de carbono (residuo queratinoso y petróleo) fueron adicionadas (figura 15c). Sin embargo, el contenido de productos ninhidrina positivos en el cultivo conteniendo residuo como única fuente de carbono (figura 15a) comenzó a disminuir a partir del día 12; mientras que en el cultivo con residuo y petróleo, el contenido de productos ninhidrina positivos se mantuvo casi constante hasta el final al igual que el contenido de proteína, probablemente debido a la

54

55

presencia de otros compuestos provenientes de la degradación del petróleo que pudieron soportar el crecimiento microbiano. 7.9.7 pH, contenido de N y P Otros factores que pueden ayudar a entender el comportamiento del proceso de biodegradación son el pH, oxigeno, temperatura, presencia de nutrientes, calidad, cantidad y biodisponibilidad de los contaminantes, ya que éstos afectan directamente la velocidad de degradación de hidrocarburos. .

El intervalo de pH optimo comúnmente reportado para la degradación de

hidrocarburos se encuentra entre 6.5-8.0 (Morgan & Watkingon, 1989). Sin embargo, Dible & Bartha (1979) concluyeron que un pH de 7.7-7.8 es el optimo para la degradación de hidrocarburos y que valores menores puede dar como resultado inhibición parcial de la degradación. En el presente estudio, el pH se mantuvo alrededor de 7.0 cuando solo se adicionó petróleo, sin embargo, cuando el residuo queratinoso fue adicionado junto con el petróleo, el pH del medio se alcalinizó ligeramente (pH 8) durante los primeros 8 días de incubación, y cuando el residuo queratinoso fue utilizado como única fuente de carbono, el pH también incremento a 8 durante los primeros 2 días de incubación. El incremento de pH en los sistemas conteniendo el residuo queratinoso puede deberse a la biodegradación de la queratina (Zerdani, et al., 2003). El cambio de pH en los sistemas fue otra forma indirecta de corroborar la actividad metabólica del cultivo mixto, además que éste correlacionó positivamente con la actividad queratinolítica y la biodegradación del residuo. El contenido de nitrógeno (N) y fósforo (P) es sumamente importante en cualquier proceso de biodegradación, algunos autores han reportado niveles específicos de estos nutrientes en los que se mejora y se acelera la biodegradación de hidrocarburos, algunos de ellos son 100/10/1, 120/10/1 (Morgan & Watkinson, 1989). Sin embargo, la biodisponibilidad también es importante, ya que algunas veces se ha reportado que la fertilización no incrementa la biodegradación del contaminante o puede inhibirla (Faday & Overton, 1995). Las figuras 16a, 16b y 16c muestran el contenido de N y P en los tres sistemas de tratamiento durante el periodo de incubación. El contenido de nutrientes provienen de la propia composición del medio, el P principalmente proviene del composición del medio 55

56

mineral, mientras que el contenido de N no solo proviene de la composición del medio sino también proviene del residuo queratinoso, el cual contiene 15% de N, por lo tanto, el cultivo conteniendo solo petróleo como fuente de carbono (figura 16b) presentó el mas bajo contenido de N. El contenido promedio inicial de P en los tres sistemas fue 130 m/l, este contenido disminuyó rápidamente durante los 2 primeros días de incubación en los sistemas conteniendo el residuo queratinoso (figuras 16a y 16c). La disminución de P correlacionó positivamente (r >0.9)

con la fase logarítmica del cultivo queratinolítico en estos

tratamientos. La disminución del contenido de P durante los 2 primeros días de incubación en el cultivo conteniendo solamente residuo queratinoso fue de 85%, mientras que en el cultivo conteniendo petróleo y el residuo, la disminución fue del 75%. Por otro lado, el cultivo con petróleo como única fuente de carbono (figura 16b) presentó una disminución del 70% durante los primeros 12 días y esta disminución correlacionó con la fase exponencial del cultivo mixto La disminución considerable en el contenido de P en los tres sistemas provocó un desbalance en la relación N/P a pesar de que el nitrógeno también fue consumido. Las figuras 16a, 16b y 16c muestran el contenido de N total durante el periodo de degradación de hidrocarburos. El contenido de N total fue 8000 mg/l en los sistemas con residuo queratinoso (figure 16a y 16c), mientras que en el cultivo con petróleo como única fuente de carbono, el contenido de N fue de 75 mg/l (figure 16b). Lo anterior ocasionó que las proporciones iniciales de N/P fueran 100/1.5 y 100/175 respectivamente. Los resultados mostraron que una de las funciones atribuidas al residuo queratinoso, fue el mejoramiento en la

interacción cultivo microbiano-petróleo. Sin

embargo, al parecer no es la única función ya que también se le puede atribuir un papel importante en el aporte de N.

56

57

9000

(a)

140

7000

Nitrógeno

6000

100

5000

80

4000

60

3000

Fósforo

40

2000

20

1000

160

0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Time (days)

140

(b)

Fosforo (mg/l)

6000

100

5000

80

4000

60

Fósforo

40

3000 2000

Nitrógeno

20 0 0

2

4

6

8

140

1000 0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 9000 Time (days) 8000 Nitrógeno (c) 7000

120 Fosforo (mg/l)

8000 7000

120

160

9000

Nitrogeno total (mg/l)

0

6000

100

5000

80

4000

60

3000

Fósforo

40 20

2000

Nitrogeno total (mg/l)

Fosforo(mg/l)

120

8000 Nitrogeno total (mg/l)

160

1000

0

0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Tiempo (dis)

Figura 16. Contenido de nitrógeno y fósforo evaluados en la cinética de degradación de HTP’s en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (16a): residuo queratinoso, (16b): petróleo y (16c): residuo queratinoso + petróleo. 57

58

El contenido de N total fue cuantificado mediante la suma de dos determinaciones parciales, una en el sobrenadante y la otra en el residuo queratinoso remanente. Los resultados de estas dos determinaciones mostraron que el contenido de N en los sobrenadantes de los sistemas con residuo queratinoso, se incrementó durante el periodo de incubación, lo cual fue atribuido a la liberación de N durante la biodegradación del residuo queratinoso, mientras que el contenido de N evaluado únicamente en el residuo remanente mostró disminución. La concentración neta de este nutriente mostró un perfil de disminución (figuras 16a y 16c). El mayor consumo de N se presentó durante la fase logarítmica de crecimiento del cultivo mixto, y por lo tanto del periodo en el que se llevó a cabo la mayor biodegradación de los hidrocarburos de petróleo, mostrando una correlación de r >0.9. A pesar de que ambos nutrientes (N y P) fueron consumidos durante el periodo de degradación, la relación N/P no fue constante, lo cual posiblemente influyó en la eficiencia de degradación de hidrocarburos, aunque cabe mencionar que las proporciones iniciales de estos nutrientes no fueron las óptimas que se han reportado para la biodegradación de hidrocarburos, debido al alto contenido de nitrógeno aportado por el residuo queratinoso. Sin embargo, se ha reportado que la utilización de absorbentes o materia orgánica rica en N incrementa la biodegradación de los contaminantes (Thomas et al., 1992). 7.10 Identificación de los aislados que conforman el cultivo mixto La identificación de cada uno de los aislados que conforman el cultivo mixto queratinolítico se realizó mediante la secuenciación de un fragmento del 16s rDNA amplificado por los primers UniRev-UniFor. La figura 17 muestra la localización del producto amplificado dentro del 16s RNA de E. coli.

58

59

FBac-RBac 341bp FBac

UniFor-UniRev amplified region

RBac

UniFor

UniRev

Figura 17. Esquema de la secuencia 16S rDNA de E. coli indicando los productos de amplificación por los primers (Brosius, et al., 1978). Después de clonar y secuenciar el producto de PCR obtenido usando los primers universales, se llevó a cabo el análisis BLAST utilizando la base de datos del Gen Bank. La tabla 6 muestra los resultados obtenidos.

59

60

Tabla 6. Identificación de bacterias hidrocarbonoclastas mediante el análisis de un fragmento del 16S rDNA Aislado 6d

Identidad (%) 98.9

EE

pb

Store (bits) 898

E

Gaps

Microorganismo

472/477

No. de acceso AY841799

0

1/477

Stenotrophomonas maltophilia

99.7

448/449

DQ228956

882

0

0

Pseudomonas aeuroginosa

FF

98.9

472/477

AY841799

898

0

0

Stenotrophomonas maltophilia

1d

98.5

467/474

DQ124701

844

0

5/474

Stenotrophomonas sp

4c

99.1

472/476

AM110964

912

0

0

Stenotrophomonas sp.

9-2

98.7 98.7 98.7 97.6

467/473 467/473 467/473 462/473

AF005016 AF00507 AF005001 AY148082

874 874 874 835

0 0 0 0

2/473 2/473 2/473 2/473

Nocardioides fulvus Nocardioides luteus Nocardioides albus Nocardioides sp.

1c

98.6 98.6

483/490 483/490

916 916

0 0

0 0

Bacillus sp. Bacillus cereus

98.6

483/490

DQ219340 DQ207856 2 AE017355

916

0

0

98.6 98.6

483/490 483/490

AE017225 AY425946

916 916

0 0

0 0

Bacillus thuringiensis serovar konkurian Bacillus antrhacis Bacillus cereus

9b

99.1 99.1 98.7 98.7 98.7

467/471 467/471 465/471 465/471 465/471

AY37.357 AF506057 DQ207562 AE017355 AE017334

902 902 886 886 886

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

Bacillus mycoides Bacillus sp. Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Bacillus antrhacis

11-4

98.7 98.31 97.7 97.7

469/475 467/475 464/475 464/475

AY278907 AJ422145 AY686594 AY960115

894 872 854 854

0 0 0 0

0 2/475 0 0

Bacillus sp. Bacillus barbaricus Bacillus holodurans Bacillus clausil

CC

99.4 99.4 99.4 99.4 99.1

470/473 470/473 470/473 470/473 470/474

AY745849 AY523411 AY904033 AY550276 AJ583158

914 914 914 914 900

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

Bacillus sp. Bacillus catenulatus Bacillus kuguryoae Bacillus cibi Bacillus indicus

AA

99.1 98.9 98.9

473/477 472/477 472/477

AB188213 AJ717368 AM15892

906 906 906

0 0 0

1/477 1/477 1/477

Micrococcus sp Micrococcus lacteos Micrococcus indicus

60

61

El resultado del análisis BLAST mostró que las 11 bacterias hidrocarbonoclastas queratinoliticas, fueron identificadas con un alto porcentaje de identidad utilizando la base de datos del Gen Bank (Tabla 6). Sin embargo, algunas de ellas presentaron identidades con más de una especie (aislados: 9-2, 1c, 9b, 11-4, CC, AA). Hasta el momento solo se puede decir que se han identificado los géneros

Micrococcus, Stenotrophomonas., Bacillus, Nocardiodes y Pseudomonas. Las bacterias del genero Bacillus, Pseudomonas y Micrococcus han sido ampliamente reportadas como degradadoras de hidrocarburos de petróleo tanto en la biorestauración de suelos como en el tratamiento de efluentes. Mientras que el género Stenotrophomonas y Nocardiodes ha sido encontrado con menor frecuencia. Con el objetivo de complementar la identificación e intentar disminuir el número de posibles especies, se amplificará el mismo DNA con otros primers que reconocen el inicio de la secuencia 16S para posteriormente clonar y secuenciar. Además se completará el análisis de resultados con otras pruebas especificas para discernir entre especies cercanas, como lo es el grupo de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus antrhacis, donde la prueba final para su identificación se basa en que B. antrhacis presenta cápsula, B.

thuringiensis la formación de un cristal bipiramidal y B. cereus ninguna de las dos anteriores.

61

62

8.0 CONCLUSIONES Durante la cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo, se observó que la velocidad de crecimiento del cultivo queratinolítico se incrementó por la presencia del residuo queratinoso, y además en este sistema con petróleo y residuo, la degradación de HTP’s fue significativamente mas alta que en el sistema adicionado únicamente con petróleo. El periodo de mayor degradación de hidrocarburos en ambos sistemas (con y sin residuo), se presentó durante los primeros 12 días de incubación, mismo tiempo en que se presentaron las fases logarítmicas de los cultivos queratinoliticos, se presentaron variaciones significativas en el consumo de N y P, y se detectó la producción de proteína soluble. Así también, la expresión de la actividad queratinolítica, la degradación del residuo, la producción de aminoácidos y la variación del pH fueron parámetros que se modificaron de manera significativa en el sistema con petróleo y residuo. Estos parámetros correlacionaron (r>0.9) entre si en cada uno de los sistemas. Los géneros identificados mediante análisis del 16S rDNA de las bacterias hidrocarbonoclastas queratinolíticas fueron Micrococcus, Bacillus, Pseudomonas,

Nocardiodes y Stenotrophomonas. Lo tres primeros géneros han sido ampliamente reportados en los procesos de degradación de hidrocarburos tanto en la biorestauración de suelos como en el tratamiento de efluentes. Mientras los géneros

Stenotrophomonas y Nocardiodes han sido encontrados con menor frecuencia.

62

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9.0 BIBLIOGRAFIA

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