ENZIMAS

ENZIMAS Las enzimas son proteínas con función catalítica Las enzimas son catalizadores biológicos que permiten que las reacciones metabólicas ocurran a gran velocidad en condiciones compatibles con la vida. En las células, la actividad secuencial de muchas enzimas permite que las moléculas se degraden, o bien se formen moléculas de mayor tamaño a partir de moléculas sencillas. Desde el punto de vista químico, las enzimas son proteínas globulares, algunas de ellas con estructura cuaternaria. Para cumplir su función requieren conservar su estructura nativa, en particular se destaca una región conocida como sitio activo, que es responsable de catalizar la reacción. Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción que catalizan Las enzimas pertenecen a seis grupos que aparecen a continuación: 1. Oxidoreductasas, actúan en reacciones de oxidoreducción y se las llama también deshidrogenasas. 2. Transferasas, transfieren grupos funcionales de un compuesto a otro. Las quinasas representan un grupo especializado que transfiere grupos fosfato. 3. Hidrolasas, rompen un enlace adicionando una molécula de agua. 4. Liasas, rompen enlaces por mecanismos distintos a la hidrólisis o la oxidación. Las decarboxilasas y aldolasas son ejemplos de liasas. 5. Isomerasas, catalizan reacciones de interconversión de isómeros. 6. Ligasas, unen moléculas utilizando energía proveniente del ATP. También se llaman sintetasas. El nombre de cada enzima hace referencia al sustrato y al tipo de reacción que cataliza. La denominación sistemática de una enzima se realiza según reglas nomenclaturales mediante cuatro números precedidos de la abreviatura E.C. (Enzymatic Code). Por ejemplo, la enzima que reduce el nitrógeno atmosférico a amonio en los rizobios, la nitrogenasa, es la E.C.1.18.6.1. Hay enzimas que para actuar necesitan un componente no proteico Algunas enzimas para actuar requieren un componente adicional que se llama cofactor. Los cofactores pueden ser inorgánicos (Fe+2, Mn+2, Zn+2, etc.) o moléculas orgánicas complejas llamadas coenzimas. Las coenzimas derivan de vitaminas o son la vitamina misma. Las enzimas son proteínas eficientes, específicas y regulables Las enzimas son catalizadores biológicos que, como los catalizadores químicos, aceleran reacciones y no se consumen durante la reacción, por lo que pueden intervenir muchas veces catalizando la misma reacción: son moléculas eficientes. A diferencia de otros catalizadores, las enzimas tienen un sitio activo que les permite unir y orientar las moléculas que intervienen en la reacción y de esa forma maximizan la posibilidad de formación o ruptura de enlaces necesarios para la obtención de productos. El interior de la célula es denso y, aunque los sustratos y las enzimas están en número relativamente pequeño, se pueden encontrar y dar lugar al complejo ES porque están en continuo movimiento. Las enzimas se mueven más lentamente que los sustratos y la velocidad de encuentro va a depender de la concentración de sustrato presente. El sitio activo tiene una forma determinada por el ordenamiento espacial de los -R que es única y que es reconocida por su sustrato. Esta es la base de otra de las características de las enzimas que es su especificidad. 11

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En el sitio activo los grupos -R están próximos debido a los plegamientos originados por las estructuras secundaria y terciaria, a pesar de que están alejados en la estructura primaria de la enzima. Estos -R participan en la reacción, algunos uniendo y orientando el sustrato y otros, formando o rompiendo enlaces. Algunas enzimas presentan especificidad absoluta porque la topografía del sitio activo además de ordenada es rígida lo que se ha esquematizado con el modelo de llave-cerradura. Sin embargo, muchas enzimas presentan especificidad relativa porque pueden catalizar el mismo tipo de reacción con más de un sustrato estructuralmente similar o permitir la unión de un sustrato no complementario que igual permita la formación de productos.

En el metabolismo, el producto de la acción de una enzima es el sustrato de la siguiente enzima y aunque las reacciones tienden al equilibrio, no llegan nunca a él porque los sustratos y productos están en continua transformación. El conjunto de reacciones que forman una vía metabólica está controlado por enzimas cuya estructura varía según la concentración de sustratos, productos, compuestos intermedios o de productos finales de las mismas: las enzimas son regulables. Las enzimas no modifican la constante de equilibrio sustrato producto, lo que hacen es bajar la energía de activación, aumentando la velocidad de reacción para alcanzar el equilibrio. Las enzimas tienen un pH y una temperatura óptimos Las enzimas son catalizadores biológicos que tienen una configuración nativa determinada por las fuerzas estabilizadoras de la proteína. Cualquier factor externo que altere esas fuerzas va a modificar la actividad de la misma. La gráfica muestra la variación de la actividad de una enzima mitocondrial a distintos pH.

Modelo llave-cerradura modelo de ajuste inducido.

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Los valores de pH o temperatura óptimos varían según la enzima pero en todos los casos permiten que la estructura del sitio activo sea la más adecuada para la catálisis. La cinética enzimática ayuda a conocer el mecanismo de reacción La cinética enzimática estudia las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas y su variación frente a cambios de parámetros experimentales. La velocidad de una reacción química corresponde al número de moléculas de reactivo(s) que se convierten en producto(s) por unidad de tiempo y depende de la concentración de los compuestos incluídos en el proceso y de la constante de velocidad que es una característica de la reacción. Por ejemplo, la conversión reversible de A en B tiene una velocidad de reacción directa cuya ecuación es: v= k+1 [A] y otra inversa que es

v inversa = k-1 [B]

donde k+1 y k-1 son las constantes de velocidad y [A] y [B] simbolizan las concentraciones de A y B respectivamente. En el equilibrio, las dos velocidades son iguales lo que lleva a definir la constante de equilibrio de la reacción (Keq) Keq = k+1/k-1 = [B] / [A] Todas las enzimas actúan en general de la misma manera, aún cuando el mecanismo de acción de cada enzima es único. Los reactivos y los productos están en concentraciones cientos o miles de veces mayores que las de la enzima en una reacción enzimática típica. Por lo tanto, cada molécula de enzima cataliza la conversión en producto de varias moléculas de reactivo. A los reactivos en bioquímica los llamamos sustratos y su conversión en productos ocurre en el sitio activo de la enzima. El complejo que se forma cuando el sustrato y la enzima se combinan se llama complejo enzima-sustrato (ES). Entre la unión del sustrato a la enzima y la reaparición de enzima libre y productos se producen una serie de pasos que se resumen a continuación:

La cantidad de producto formado a partir de una determinada concentración de sustrato y de enzima varía con el tiempo. Solamente en los primeros minutos de la reacción existe una relación lineal entre el producto formado y el tiempo. La velocidad de la reacción calculada a partir de los datos de esos primeros minutos, es lo que llamamos velocidad inicial (Vo) y este es el término al que nos referiremos de ahora en adelante cuando hablemos de velocidad. La velocidad (Vo) de una reacción enzimática se puede medir por la variación de la cantidad de sustrato transformado, o la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. En algunas reacciones en las que intervienen coenzimas, la velocidad puede medirse por la cantidad de coenzima transformada por unidad de tiempo en lugar de medir el sustrato o el producto. Las reacciones catalizadas por enzimas tienen cinética de saturación Cuando se miden las velocidades iniciales (Vo) de una reacción enzimática con distintas concentraciones de sustrato [S] en las mismas condiciones de pH y temperatura y manteniendo constante la concentración de enzima [E], se obtiene una curva como se representa a continuación:

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Para valores bajos de [S] la vo aumenta en forma directamente proporcional a la [S]. En ese tramo, cada vez más moléculas de S forman el complejo ES y la reacción tiene cinética de primer orden. En este caso la reacción se representa como Vo µ k [S] 1 A determinada [S], todas las moléculas de S están formando ES y entonces la vo se hace independiente de la [S], la cinética de la reacción es de orden 0 y se alcanza la Vmáx. En este caso la reacción se representa como vo µ k [S] 0. La reacción en presencia de mayor [S] no produce mayor velocidad porque todas las moléculas de enzima están saturadas con sustrato. La relación entre la Vo y [S] se puede expresar cuantitativamente La cinética de las reacciones esquematizadas anteriormente fue caracterizada por los investigadores Michaelis y Menten. La ecuación de Michaelis-Menten es: Vo = Vmáx . [S] Km + [S]

(1)

Esta ecuación es una descripción cuantitativa de la relación entre la velocidad (vo) de una reacción catalizada por una enzima, la concentración de sustrato [S] y dos constantes Vmáx y Km (constante de Michaelis). Esta ecuación es una hipérbola equilátera con coordenadas vo y [S] y donde Vmáx es la asíntota de la gráfica. La ecuación puede ser usada para demostrar que la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de Vmáx, es numéricamente igual a Km. Las unidades de Km son, por lo tanto, unidades de concentración, usualmente molaridad. Km puede definirse como la [S] a la que la enzima alcanza la mitad de su velocidad máxima o la [S] a la que la mitad de las moléculas de enzima están formando ES. En condiciones definidas de pH y temperatura, los valores de Km y Vmáx son las constantes cinéticas de una determinada enzima frente a su sustrato. •

Km y Vmáx se calculan por el método de las inversas

La forma de determinar Km por el método gráfico definido antes, no es la usada en la práctica; rara vez se llega a medir Vmáx por problemas tales como la solubilidad del sustrato a concentraciones altas. Se utiliza entonces, la transformación de la ecuación (1) realizada por Lineweaver-Burk que consistió en tomar la inversa de cada término. La ecuación queda como : 1 = Km . 1 + 1 Vo Vmáx [S] Vmáx

(2)

La representación gráfica con coordenadas 1/vo y 1/[S] es una recta. El corte de la recta con el eje de las ordenadas permite calcular Vmáx y el corte con el eje de las abscisas permite calcular Km.

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Las enzimas pueden ser inhibidas por moléculas específicas Algunos antibióticos, medicamentos quimioterapéuticos, insecticidas y herbicidas son sustancias que interfieren en el funcionamiento de enzimas específicas. En las células naturalmente se producen inhibiciones de enzimas lo que se conoce como biorregulación. Los inhibidores pueden unirse reversible o irreversiblemente a las enzimas. Los inhibidores irreversibles se unen covalentemente a residuos aminoacídicos de la enzima impidiendo su acción. Este es el efecto de Hg+2, Pb+2 , los gases neurotóxicos y los compuestos arsenicales. Los inhibidores reversibles se unen a la enzima por el mismo tipo de interacciones que se producen entre las enzimas y los sustratos y dentro de ellos se encuentran los inhibidores competitivos y no competitivos. •

Inhibición competitiva

Cuando un inhibidor competitivo (Ic) y un sustrato S están en presencia de una enzima, compiten entre sí por ocupar el sitio activo de la misma. El inhibidor competitivo tiene generalmente una estructura similar a la del sustrato por lo que tiene posibilidad de formar un complejo EIc que no permite formar el complejo ES. El complejo EIc no da productos y disminuye el número de moléculas de E libres en condiciones de interaccionar con el S. Por eso la cantidad de producto formado con la misma cantidad de sustrato es menor en presencia de inhibidor competitivo. La unión del inhibidor competitivo a la E es reversible y por eso se puede aumentar el número de moléculas de E libre aumentando la [S]. Las sulfas que inhiben pasos metabólicos exclusivos de bacterias y el fluoruracilo que se usa para tratar el cáncer, son ejemplos de inhibidores competitivos. A nivel de bioregulación se puede citar como ejemplo la inhibición por producto cuando se empieza a acumular el producto de una reacción. En la figura se esquematizan la interacción enzima sustrato y el mecanismo de acción de dos tipos de inhibidores.

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Inhibición no competitiva

Cuando el efecto de una sustancia inhibidora no se puede revertir aumentando la [S], el inhibidor es no competitivo. Este compuesto se une a un sitio distinto al sitio activo y por eso puede formarse el complejo 15

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enzima-sustrato-inhibidor (EIS) que no da productos. De hecho, la presencia del inhibidor actúa como si disminuyera la [E] presente y por eso nunca se llega a la Vmáx por más que se aumente la [S]. Las moléculas de E libre que están en condiciones de actuar y dar producto, se comportan como si no hubiera inhibidor y por eso el Km de la reacción no varía. Las modificaciones de las constantes cinéticas de una enzima frente a un inhibidor competitivo y a uno no competitivo, se presentan en la figura siguiente:

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Enzimas alostéricas

La mayoría de las enzimas que catalizan reacciones sucesivas en las vías metabólicas tienen cinética de Michaelis Menten. Sin embargo la regulación de la vía está a cargo de enzimas alostéricas que tienen una cinética distinta. Las enzimas alostéricas catalizan pasos ubicados al principio de la vía o en puntos de ramificación de la misma y su actividad está modulada por la unión de moléculas fisiológicamente importantes que se conocen como efectores o moduladores. Además del sitio activo, estas enzimas tienen sitios alostéricos a los que se unen los moduladores alostéricos. La unión del modulador al sitio alostérico origina cambios conformacionales que se trasmiten a través de la molécula de la proteína hasta el sitio activo alterando las propiedades catalíticas de la enzima. Los que incrementan la actividad catalítica, se conocen como moduladores positivos. Los que reducen o inhiben la actividad catalítica son moduladores negativos.

Un ejemplo de regulación alostérica en una vía metabólica es la inhibición por retroalimentación donde la acumulación de producto final actúa como modulador negativo de la primera enzima de la vía como se esquematiza a continuación. 16

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Modificaciones covalentes

Existen enzimas que se regulan por el pasaje de una forma activa a inactiva debido a la formación o rotura reversible o irreversible de enlaces covalentes. En muchos casos no es suficiente la modulación alostérica para la regulación de todas las vías metabólicas. Por eso algunas enzimas tienen un mecanismo rápido de regulación que permite el pasaje de una forma activa a una forma inactiva. Un ejemplo de este tipo de regulación es la unión de un grupo fosfato a un – OH de un residuo de aminoácido de la molécula de enzima que permite la transformación de una forma en otra. Esta es una modificación covalente reversible.

La transformación de zimógenos en enzimas activas es un tipo de modificación covalente irreversible. Esto ocurre en enzimas en las que se elimina parte de la cadena proteica y, como consecuencia, el nuevo ordenamiento (plegamiento) permite la formación del sitio activo en la molécula. Este es el caso de la transformación de pepsinógeno, tripsinógeno o quimiotripsinógeno en enzimas proteolíticas activas. En las células eucariotas la compartimentación es otra forma de regular el funcionamiento simultáneo de distintas reacciones; por ejemplo la degradación de los ácidos grasos ocurre en la mitocondria y su síntesis en el citoplasma.

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