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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 218 807

51 Int. Cl. : G01N 33/00

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C07K 14/47 C07H 21/04 C12N 15/09 A61K 38/17 A61K 39/395

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98906471 .2

86 Fecha de presentación: 20.02.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 0970372

87 Fecha de publicación de la solicitud: 12.01.2000

54 Título: Ensayo para la detección de una forma conformacional de una proteína relacionada con una enferme

dad. 30 Prioridad: 21.02.1997 US 804536

73 Titular/es:

The Regents of the University of California 1111 Franklin Street, 12th Floor Oakland, California 94607-5200, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.11.2004

72 Inventor/es: Prusiner, Stanley, B. y

Safar, Jiri, G.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Díez de Rivera y Elzaburu, Ignacio

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16.11.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 218 807 T3 DESCRIPCIÓN Ensayo para la determinación de una forma conformacional de una proteína relacionada con una enfermedad. 5

La presente invención se refiere en general a inmunoensayos. Más particularmente, la invención se refiere a un ensayo que permite la detección de una forma conformacional relacionada con una enfermedad producida por una proteína (tal como PrPSc ) que puede tener afinidad de unión a anticuerpos muy reducida y que permite además la identificación de la cepa particular responsable de la enfermedad.

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Antecedentes de la invención

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Los priones son patógenos infecciosos que causan enfermedades producidas por priones invariablemente fatales (encefalopatías espongiformes) del sistema nervioso central en seres humanos y animales. Los priones se diferencian significativamente de las bacterias, virus y viroides. La hipótesis dominante es que no se necesita ácido nucleico para permitir que ocurra la infectividad de una proteína prión.

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Un paso importante en el estudio de priones y de las enfermedades que éstos causan fue el descubrimiento y la purificación de una proteína llamada proteína prión [Bolton, McKinley et al (1982) Science 218:1309-1311; Prusiner, Bolton et al (1982) Biochemistry 21:6942-6950; McKinley, Bolton et al (1983) Cell 35:57-62]. Desde entonces, los genes que codifican la proteína prión completos han sido clonados, secuenciados y expresados en animales transgénicos. La PrPc es codificada por un gen hospedante de una sola copia [Basler, Oesch et al (1986) Cell 46:417-428] y, cuando se expresa la PrPc , en general se halla en la superficie externa de las neuronas. Muchas líneas de evidencia indican que las enfermedades producidas por priones son consecuencia de la transformación de la forma normal de la proteína prión (PrPc ) en la forma anormal (PrPSc ). No existe una diferencia detectable en la secuencia de aminoácido de las dos formas. No obstante, la PrPSc , al compararse con la PrPc , posee una conformación con contenido mayor de hoja β y contenido menor de hélice α [Pan, Baldwin et al (1993) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 90:10962-10966; Safar, Roller et al (1993) J Biol Chem 268:20276-20284]. La presencia de la forma anormal de PrPSc en cerebros de seres humanos o animales infectados es el único marcador de diagnóstico específico de la enfermedad, en enfermedades producidas por priones. La PrPSc cumple una función clave tanto en la transmisión como en la patogénesis de enfermedades producidas por priones (encefalopatías espongiformes) y es un factor crítico en la degeneración neuronal [Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2ª Edición: 103-143]. Las enfermedades producidas por priones más comunes en animales son scrapie de ovejas y cabras y encefalopatía espongiforme en ganadería bovina (BSE) [Wilesmith y Wells (1991) Curr Top Microbiol Immunol 172:21-38]. Se han identificado cuatro enfermedades producidas por priones en humanos: (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), (3) Enfermedad de Gerstmann-StreusslerSheinker (GSS) y (4) insomnio familiar fatal (IFF) [Gajdusek (1997) Science 197:943-960; Medori, Tritschler et al (1992) N Engl J Med 326:444-449]. Inicialmente, la presentación de las enfermedades producidas por priones heredadas en seres humanos planteaban una cuestión intrincada que desde entonces ha sido explicada por el origen genético celular de la PrP. Los priones existen en aislamientos (cepas) múltiples con distintas características biológicas cuando estas cepas diferentes infectan en hospedantes genéticamente idénticos [Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2ª Edición:165-186]. Las cepas difieren por el tiempo de incubación, por la topología de acumulación de la proteína PrPSc y, en algunos casos, también por la distribución y características de la patología cerebral [DeArmond y Prusiner (1997) Greenfield’s Neuropathology, 6ª Edición:235-280]. Dado que la PrPSc es el principal, y muy probablemente el único, componente de priones, la existencia de cepas de priones ha planteado una cuestión intrincada en cuanto a cómo la información biológica puede cifrarse en una molécula que no sea una comprendida por ácidos nucleicos. Se ha descubierto que el tratamiento proteolítico parcial de homogeneizados cerebrales que contienen algunos aislamientos de priones genera péptidos con movilidades electroforéticas levemente diferentes [Bessen y Marsh (1992) J Virol 66:2096-2101; Bessen y Marsh (1992) J Gen Virol 73:329-334; Telling, Parchi et al (1996) Science 274:2079-2082] Estos hallazgos sugirieron diferentes sitios de escisión proteolítica debido a la conformación diferente de moléculas de PrPSc en diferentes cepas de priones. Alternativamente, las diferencias observadas podrían explicarse mediante la formación de diferentes complejos con otras moléculas, formando distintos sitios de escisión en la PrPSc de diferentes cepas [Marsh y Bessen (1994) Phil Trans R Soc Lond B 343:413-414]. Algunos investigadores han propuesto que los diferentes aislamientos de prión pueden diferir en los diferentes patrones de glicosilación de la proteína prión [Collinge, Sidle et al (1996) Nature 383:685-690; Hill, Zeidler et al (1997) Lancet 349:99-100]. No obstante, la confiabilidad tanto de los patrones de mapeo de péptidos como de glicosilación en diagnósticos de cepas de priones múltiples aún se debate [Collings, Hill et al (1997) Nature 386:564; Somerville, Chong et al (1997) Nature 386:564]. Un sistema para detectar la PrPSc aumentando la inmunoreactividad después de la desnaturalización se provee en Serban, et al., Neurology, Vol. 40, No 1, Ja 1990. Un ensayo directo lo suficientemente sensible y específico para PrPSc infecciosa en muestras biológicas podría potencialmente anular completamente la necesidad de inoculaciones animales. Desafortunadamente, esto no parece ser posible con los ensayos de PrPSc actuales; se estima que el límite de sensibilidad actual de detección de PrPSc basada en proteinasa K y transferencia western está en el intervalo de 1 µg/ml, lo que corresponde a 104 -105 unidades infecciosas de prión. Adicionalmente, la especificidad de los ensayos tradicionales basados en proteinasa K para PrPSc merece consideración, en vista de los hallazgos recientes de ninguna 2

ES 2 218 807 T3 resistencia o resistencia solamente relativa de proteinasa K de preparaciones de priones indudablemente infecciosos [Hsiao, Groth et al (1994) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 91:9126-9130; Telling, et al (1996) Genes & Dev. 10(14) 1736-1750]. 5

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La transtiretina (TTR) humana es una proteína de plasma normal compuesta por cuatro unidades estructuradas predominantemente de hoja β idénticas y sirve como portadora de la hormona tiroxina. El autoensamblaje anormal de TTR en fibrilas amiloides provoca dos formas de enfermedades humanas, a saber amiloidosis sistémica senil (SSA) y polineuropatía amiloide familiar (PAF) [Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol 6(1): 11-7]. El caso de formación amiloide en PAF son mutaciones puntiformes en el gen de TTR; la causa de SSA se desconoce. El diagnóstico clínico se establece histológicamente, detectando depósitos de amiloide in situ en material bióptico. Hasta el momento, se sabe poco acerca del mecanismo de conversión de TTR a amiloide in vivo. No obstante, varios laboratorios han demostrado que la conversión a amiloide se puede simular in vitro por desnaturalización parcial de TTR humana normal [McCutchen, Colon et al (1993) Biochemistry 32(45): 12119-27; McCutchen y Kelly (1993) Biocherm Biophys Res Commun 197(2) 415-21]. El mecanismo de transición conformacional comprende un intermediario conformacional monomérico que se polimeriza a fibrillas amiloides estructuradas de amiloide estructurada de hoja β lineal [Lai, Colon et al (1996) Biochemistry 35(20):6470:82]. El proceso se puede mitigar uniendo con moléculas estabilizadoras tales como tiroxina o triiodofenol [Miroy, Lai et al (1996) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 93(26): 15051-6].

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Kascsak et al (1993) Dev. Bio. Stand. 80, 141-151 describe el uso de anticuerpos para PrP en el diagnóstico de encefalopatías espongiformes transmisibles. La publicación internacional WO 93/23432 describe polipéptidos de priones solubles con terminales C modificadas y métodos para detectar los polipéptidos solubles. La patente estadounidense No 5.565.186 (Prusiner et al), patente estadounidense de los presentes inventores, describe un método para detectar priones, utilizando un animal transgénico. La publicación internacional WO 97/43649 describe chaperonas capaces de unirse a proteínas prión y distinguir las isoformas de PrPc y PrPsc . En vista de los puntos expuestos, existe claramente la necesidad de un ensayo específico, altamente transparente y rentable, para probar materiales de muestra para la presencia de proteínas patogénicas, incluyendo proteína prión y transtiretina. La invención presentada ofrece un ensayo no solo capaz de detectar proteínas patogénicas sino de determinar la cepa específica. Compendio de la invención

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Existen dos procedimientos diferentes para detectar niveles reducidos de una conformación de enfermedad de una proteína. El método más simple requiere que se haya calculado un estándar predeterminado y comprende proporcionar una muestra que se presume contiene una proteína que asume dos conformaciones (una primera conformación y una segunda conformación relacionada con enfermedad), tratar la muestra para convertir cualquier proteína de la segunda conformación en una conformación diferente que tiene mayor afinidad de unión de anticuerpos, poner en contacto la muestra tratada con un anticuerpo que se una a la proteína en su primera conformación y/o a la conformación diferente que tiene una afinidad mayor que la segunda conformación, determinar el nivel de unión de anticuerpos a la proteína y comparar el nivel de unión con el estándar predeterminado, determinando de este modo la probabilidad de que la muestra contenga proteína en la segunda conformación relacionada con enfermedad basada en la comparación. La metodología aquí descrita permite la detección de la conformación con enfermedad a un nivel de 1 x 103 partículas/ml o menos. El ensayo de la invención también se puede llevar a cabo sin utilizar un estándar predeterminado. Este método de ensayo comprende (a) proporcionar una muestra que se presume contiene una proteína (con una primera conformación y una segunda conformación relacionada con enfermedad), (b) dividir la muestra en primera y segunda porciones, (c) poner en contacto la primera porción con un anticuerpo que se una a la primera conformación con afinidad mayor que la segunda conformación, (d) tratar la segunda porción para provocar que cualquier proteína en la segunda conformación adopte una conformación diferente que tenga una afinidad mayor hacia el anticuerpo, (e) poner en contacto la segunda porción con el anticuerpo, (f) determinar los niveles relativos de unión de anticuerpos a dichas primera y segunda porciones y (g) determinar la presencia o ausencia de proteínas en la segunda conformación en base a la comparación.

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El ensayo de la invención es útil para ensayar muestras que contienen proteínas, las cuales están presentes en al menos dos conformaciones (p. ej., conformación con enfermedad y conformación sin enfermedad nativa) y están presentes a niveles de 1 x 103 partículas/ml o menos. La presente invención utiliza anticuerpos que no se unen o tienen un grado de afinidad relativamente reducido hacia la conformación de enfermedad estrechamente configurada de la proteína. Un anticuerpo útil es el anticuerpo monoclonal 263K 3F4 producido por la línea celular de hibridoma ATCC HB9222 depositada el 8 de octubre de 1986 en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 y revelada y descrita en la patente estadounidense 4.806.627, expedida el 21 de febrero de 1989, incorporada por referencia a los anticuerpos revelados que se unen selectivamente a PrPc . Un ejemplo específico del ensayo se puede llevar a cabo proporcionando una muestra dividida en una primera porción y una segunda porción. La primera porción está unida a un primer soporte sólido y luego en contacto con un anticuerpo marcado que se une a la forma sin enfermedad de la proteína con un grado mayor de afinidad (p. ej., afinidad 4 a 30 veces superior) que el anticuerpo que se une a la forma con enfermedad. La segunda porción de 3

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la muestra se trata en un modo que provoca la forma de enfermedad estrechamente unida de la proteína presente en la muestra (si la hay) para asumir una conformación más relajada que tenga una afinidad de unión superior al anticuerpo marcado. Después del tratamiento, la segunda porción también se une a la superficie de un soporte sólido. A partir de entonces, la segunda porción entra en contacto con el mismo tipo de anticuerpos marcados utilizados en la primera porción. En base a la cantidad de proteína unida a anticuerpos en el soporte, se determina luego el nivel de proteína en la primera porción. El nivel de proteína en la segunda porción tratada se determina del mismo modo. Se determina la diferencia entre ambas y si se observa que la cantidad de unión de anticuerpos a proteínas en la segunda porción es significativamente mayor que aquella de la primera porción, es posible deducir que la muestra original contenía proteínas en la conformación relacionada con enfermedad estrechamente unida. Además, mediante el uso de fórmulas y un sistema de ensayo particularmente sensible de la presente, es posible determinar la cantidad de la conformación relacionada con enfermedad de la proteína presente en la muestra original por unidad de volumen. Incluso, determinando la relación entre la unión de anticuerpo a proteína desnaturalizada y la unión de anticuerpo a proteína nativa, es posible determinar la cepa particular de una proteína presente relacionada con enfermedad. Para demostrar el concepto básico de la presente invención, es necesario incluir una muestra inicial que se divida en al menos dos porciones. La primera porción se pone en contacto con anticuerpos marcados sin tratar las proteínas y la segunda porción se trata con anticuerpos marcados después de que las proteínas han sido tratadas en un modo que provoca que cualquiera de las proteínas en la conformación con enfermedad asuma una conformación con un grado superior de afinidad de unión hacia los anticuerpos. Las lecturas se comparan (es decir, una se resta a la otra) y la presencia de proteínas en la conformación relacionada con enfermedad se deduce en base a la diferencia entre las dos lecturas. No obstante, es posible utilizar el concepto básico de la presente invención sin obtener dos lecturas para cada ensayo. Esto se puede efectuar estableciendo un estándar basado en la realización del ensayo en una cantidad estadísticamente significativa de muestras muy relacionadas. Después de que se ha establecido el estándar, se sabrá el nivel de unión de anticuerpos que deberá observarse cuando la muestra no contenga ninguna proteína en la conformación relacionada con enfermedad. Al utilizar el estándar, se trata luego una muestra para posterior prueba, como para convertir cualquier proteína de la conformación relacionada con enfermedad en una conformación diferente con un grado muy superior de afinidad de unión hacia los anticuerpos marcados. La medición obtenida se compara luego con el estándar. Si la diferencia entre el estándar y la medición obtenida está fuera de un intervalo determinado, se puede deducir que la muestra original incluía proteínas en la conformación relacionada con enfermedad.

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Una tercera realización de la invención puede utilizar cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas, junto con las fórmulas provistas en la presente, con el fin de calcular (cuantitativamente) el número de proteínas de la conformación relacionada con enfermedad presentes dentro de la muestra original. 35

En una cuarta realización, se determina la cepa particular de la proteína infecciosa presente en una muestra. La cepa se determina comparando el “índice de proteína” de la muestra probada con el índice de proteína conocido de una cepa de partícula de una proteína determinada. El “índice de proteína” de la muestra se calcula determinando la relación entre la cantidad de anticuerpo que se une a la forma desnaturalizada de la proteína y la cantidad de anticuerpo que se une a la proteína nativa.

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De acuerdo con cualquiera de los sistemas, es preferible pretratar la muestra que está siendo probada en un modo que disminuya la concentración de la conformación sin enfermedad en relación con la concentración de la conformación con enfermedad de la proteína. Por ejemplo, la muestra inicial se puede tratar químicamente con un compuesto que preferentemente degrada la forma relajada, sin enfermedad de la proteína y/o se expone a anticuerpos que preferentemente se unen y en consecuencia eliminan la conformación sin enfermedad de la proteína. Puede ser posible aumentar más la sensibilidad de distintos aspectos de la invención, concentrando la conformación con enfermedad de una proteína, agregando un compuesto que selectivamente se une a la conformación con enfermedad para formar un complejo y centrifugando la muestra para precipitar el complejo que se prueba luego de acuerdo con los métodos aquí descritos. Los datos específicos respecto de dichos métodos de concentración se describen en detalle en el número de expediente de abogado de nuestra solicitud en tramitación con la presente 6510/098001, presentada en la misma fecha que la presente solicitud titulada “Procedimiento para concentración de proteínas con conformación relacionada con enfermedad” (ahora publicada como WO99/42487). Las diferentes realizaciones del ensayo de la invención anteriormente descritas son todas tipos de inmunoensayos “directos”, es decir, la muestra se ensaya directamente con el anticuerpo marcado, ya sea con o sin tratamiento para cambiar la conformación de cualquier proteína de conformación relacionada con enfermedad presente en la muestra. También se puede utilizar un ensayo “indirecto”. Por ejemplo, puede ser conveniente aumentar el número de proteínas relacionadas con enfermedad en la muestra (si las hay), mediante el uso de un ratón transgénico y reforzar de este modo cualquier señal obtenida. Para llevar a cabo estas realizaciones de la invención, la muestra se utiliza primero para inocular un ratón transgénico al que se le ha modificado su genoma, de modo que presentará síntomas de enfermedad al inocularse con proteínas de la conformación relacionada con enfermedad. Después de inocular los ratones, se deja transcurrir un período suficiente (p. ej., 30 días) después del cual se sacrifica al animal transgénico y se utiliza una muestra, tal como tejido cerebral homogeneizado del ratón, en el ensayo directo anteriormente descrito. La presente invención incrementa la capacidad de los ratones transgénicos para detectar priones, reduciendo el período que debe transcurrir hasta que se puede efectuar una determinación respecto de si la muestra original incluía proteínas en la conformación relacionada 4

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con enfermedad. También sería posible aplicar PrP marcada con epítopo, como se describe en la publicación internacional WO 97/46572 para purificar la afinidad de la PrPSc del cerebro de un ratón Tg y después aplicar el ensayo de la presente invención. Sin la presente invención, el ratón se inocula y se debe esperar hasta que el ratón inoculado realmente demuestre síntomas de la enfermedad. Dependiendo del ratón, esto puede llevar varios meses o incluso años. La metodología de ensayo de la presente invención se puede aplicar a cualquier tipo de muestra, cuando se presume que la muestra contiene una proteína que se presenta en al menos dos conformaciones. La proteína debe presentarse en una conformación que se una a anticuerpos conocidos, anticuerpos que se puedan generar u otros elementos enlazantes específicos. La segunda conformación debe ser suficientemente diferente de la primera conformación en términos de su afinidad de unión, de modo que las dos conformaciones puedan distinguirse utilizando anticuerpos o elementos enlazantes con un grado muy superior de afinidad hacia la primera conformación que hacia la segunda conformación. En su forma conceptualmente más simple, la invención funciona de modo óptimo cuando un anticuerpo conocido marcado se une a una forma sin enfermedad de una proteína con un alto grado de afinidad y no se une (o se une con un grado extremadamente bajo de afinidad) a la misma proteína, cuando está presente en su conformación relacionada con enfermedad. No obstante, en realidad, una proteína determinada puede tener más de dos conformaciones. La proteína puede tener más de un conformación sin enfermedad y más de una conformación relacionada con enfermedad, (Telling et al, Science (1996)). La invención es incluso útil cuando existen múltiples conformaciones de formas con y sin enfermedad de la proteína, siempre que (1) al menos una conformación sin enfermedad difiera de al menos una conformación con enfermedad en términos de su afinidad de unión; y (2) sea posible tratar la conformación relacionada con enfermedad de la proteína como para incrementar sustancialmente su afinidad de unión. Como se indicó anteriormente, el ensayo de la invención se puede utilizar para ensayar cualquier tipo de muestra para cualquier tipo de proteína, siempre que la proteína incluya una conformación sin enfermedad y una relacionada con enfermedad. No obstante, la invención se desarrolló particularmente para ensayar muestras para la presencia de (1) proteínas PrP y determinar si la muestra incluyó una proteína PrP en su conformación con enfermedad, es decir, incluyó PrPSc (2) formas insolubles de βA4 asociadas con enfermedad de Alzheimer y (3) transtiretina. Por consiguiente, gran parte de la siguiente descripción se dirige a utilizar el inmunoensayo de la presente invención para detectar la presencia de PrPSc (o a un grado menor βA4 o transtiretina (TTR)) en una muestra, entendiéndose que los mismos conceptos generales son aplicables para detectar conformaciones relacionadas con enfermedad de una amplia gama de diferentes tipos de proteínas. Asimismo, la descripción se dirige particularmente a describir cómo determinar la cepa particular de priones infecciosos (PrPSc ) en una muestra, entendiéndose que los mismos conceptos generales son aplicables para determinar la cepa particular de otras proteínas compactas asociadas con diferentes enfermedades. El presente método de detección de PrPSc se desarrolló marcando IgG purificada seleccionada con Europio. Los anticuerpos utilizados poseen una gran afinidad de unión hacia la PrPc (conformación sin enfermedad) que comprende una configuración α-helicoidal. Los anticuerpos poseen una afinidad de unión reducida hacia la PrPSc (conformación con enfermedad) que comprende una configuración hoja β. La IgG se puede obtener de anticuerpos monoclonales, policlonales o recombinantes comunes, que típicamente reconocen la secuencia 90-145 ó 222-231 de PrPc y proteína prión de modo conformacional no plegado. Diferentes conformaciones de proteína prión recombinante se reticularon químicamente a placas de poliestireno a través de una etapa de activación de glutaraldehído. Las afinidades relativas de la IgG marcada con Eu con conformación aleatoria en espiral, α-helicoidal y hoja β de proteína prión de hámster sirio recombinante correspondientes a la secuencia 90-231 se determinaron por fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo en un formato de placa de poliestireno de 96 pocillos.

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Se puede efectuar una determinación de las afinidades relativas de diferentes anticuerpos marcados hacia proteínas mediante diferentes métodos. No obstante, la conformación relacionada con enfermedad de una proteína a menudo está presente en una concentración muy reducida en relación con aquella de la conformación sin enfermedad. Por consiguiente, a menudo requiere métodos muy sensibles para detectar cualquier incremento causado por el tratamiento de la conformación con enfermedad de la proteína. Un método particularmente sensible es la fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo. Al calibrar cuidadosamente este método, es posible detectar el incremento de señal en la reactividad de los anticuerpos en la transición del estado conformacional hoja β al estado desnaturalizado. Esta señal es relativamente grande comparada con aquella obtenida de la transformación de su estado α-helicoidal nativo al estado relajado o desnaturalizado tratado. Por lo tanto, el estado conformacional original de la proteína prión se puede transferir mediante el ensayo diferencial en estados nativo y tratado. Cuando se trata una muestra que no contiene proteína en hoja β, se obtiene algún incremento en la inmunoreactividad. Esta cantidad de incremento se debe ajustar durante y después de hacerlo, de modo que se haga referencia a la concentración o cantidad resultante como la “cantidad ajustada”. La cantidad de unión específica de anticuerpos sobre aquella obtenida para una conformación α-helicoidal de PrPc (más allá de la cantidad ajustada) es una medida de la presencia de conformación hoja β, que es esencial para patogenicidad e infectividad de la PrPSc . Un objeto primario de la invención es proveer un inmunoensayo aplicable para ensayar muestras que contengan proteínas, en donde se presuma que las muestras contienen una proteína que se presenta dentro de una conformación relacionada con enfermedad y una conformación sin enfermedad nativa (p. ej., proteína PrP, proteína βA4 y transtiretina). 5

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Una ventaja de la presente invención es que el inmunoensayo puede determinar rápida y precisamente la presencia de proteínas en la conformación relacionada con enfermedad (p. ej., PrPSc , βA4 y transtiretina) aunque el anticuerpo utilizado en el ensayo no se una o tenga un grado muy reducido de afinidad de unión hacia la proteína en la conformación relacionada con enfermedad, y la conformación relacionada con enfermedad esté presente en una concentración menor que la conformación sin enfermedad. Otro objeto de la invención es proveer un ensayo que hace posible no solo determinar (1) si está presente una partícula patogénica en una muestra sino también (2) determinar la concentración de las partículas en una muestra, y (3) determinar la cepa particular de la partícula presente.

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Una característica de la invención es que la señal obtenida se puede aumentar mediante el uso de animales transgénicos, p. ej., ratones que se utilizan para detectar la presencia de una proteína en una muestra. 15

Otra característica es que la fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo se utiliza para aumentar la sensibilidad. Otra ventaja es que el ensayo puede detectar niveles de conformación de enfermedad en una proteína a una concentración de 1 x 103 partículas/ml o menos.

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Un objeto específico es proveer un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de la proteína prión infecciosa en materiales de muestra variables obtenidos o derivados de tejidos y/o fluidos corporales de seres humanos, primate, mono, cerdo, bovino, oveja, ciervo, alce, perro, gato, ratón y pollo. Otro objeto específico es proveer un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de proteína βA4 en materiales de muestra variables obtenidos o derivados de tejidos y/o fluidos corporales de seres humanos, primate, mono, cerdo, bovino, oveja, ciervo, alce, perro, gato, ratón y pollo. Otro objeto es proveer un ensayo rápido para proteína prión infecciosa nativa en los cerebros de animales transgénicos y no transgénicos inyectados con material de muestra que potencialmente contiene priones.

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Otro objeto es proveer un método para evaluar procedimientos de descontaminación, ensayando el nivel de desnaturalización de proteínas patogénicas (p. ej., priones o βA4 en hoja β) después de dichos tratamientos. 35

Otro objeto es proveer un método rápido para detectar diferentes compuestos a fin de evaluar su potencial en el tratamiento de enfermedades asociadas con conformaciones con enfermedad de diferentes proteínas, como puede ser detectando el efecto estabilizante de compuestos en diferentes conformaciones de proteínas (p. ej., PrPc o conformación α-helicoidal de βA4) o su impacto desestabilizante en la conformación patogénica (p. ej., PrPSc o conformación hoja β de βA4) de una proteína.

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Otro objeto es proveer un método rápido para detectar diferentes compuestos farmacéuticos con potencial para tratamiento de enfermedades producidas por priones, como puede ser detectando el efecto estabilizante de los compuestos sobre una conformación α-helicoidal de una isoforma normal de la proteína PrPc o su impacto desestabilizante en la conformación hoja β de la isoforma patogénica de la proteína PrPSc .

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Otra ventaja es que el procedimiento se puede llevar a cabo sin un anticuerpo directamente capaz de reconocer una conformación infecciosa de una proteína y sin utilizar una etapa de proteinasa K para eliminar la señal de isoformas normales (sin enfermedad) de la proteína, como PrPc .

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Otra ventaja es que en el procedimiento inventado no hay necesidad de que el anticuerpo sea directamente capaz de reconocer la conformación patogénica de βA4 o transtiretina. Una característica importante del ensayo es el diseño rápido, rentable y altamente transparente que se puede diseñar con la capacidad para detectar 96 muestras por día por placa de 96 pocillos.

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Otro aspecto de la invención es el método de diagnóstico para detectar cuantitativamente TTR en la conformación amiloide anormal en el material de muestra obtenido de fluidos corporales, tejidos humanos y animales, y compuestos farmacéuticos. El procedimiento inventado provee un método directo, sensible para distinguir y cuantificar las conformaciones normales y amiloides de TTR en una mezcla presente en materiales de muestra.

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La determinación se basa en una medición de la diferencia en afinidades de anticuerpos monoclonales o policlonales con TTR en conformación normal o amiloide contra conformación en espiral aleatoria. La presente invención describe tres métodos de evaluación y la fórmula matemática utilizada para dicha cuantificación.

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Un objeto importante es proveer un ensayo de diagnóstico específico para TTR patogénica en materiales de muestra variables obtenidos o derivados de tejidos de seres humanos, primate, mono, cerdo, bovino, oveja, ciervo, alce, canino, gato, ratón y pollo. Otro objeto es proveer un ensayo rápido para la forma amiloide de TTR en animales transgénicos. 6

ES 2 218 807 T3 Otro objeto es proveer un método rápido para detectar diferentes compuestos farmacéuticos con potencial para el tratamiento de amiloidosis sistémica senil (SSA) y polineuropatía amiloidótica familiar (PAF). Se detecta el efecto estabilizante de dichos compuestos sobre la conformación normal de TTR o su impacto desestabilizante sobre la conformación amiloide de TTR. 5

Otro objeto es proveer un método rápido para detectar el impacto de diferentes mutaciones espontáneas y diseñadas en el gen de TTR sobre la conformación, estabilidad y formación amiloide de dichos productos génicos de TTR en animales transgénicos que hospedan genes naturales o artificiales APP. 10

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La ventaja específica es que el ensayo inventado puede detectar formas patogénicas de TTR en una mezcla con formas no patogénicas desnaturalizadas de la misma o en una mezcla con una forma soluble de TTR, por ejemplo, detectar menos de 1 x 103 partículas por ml. Éstos y otros objetos, ventajas y características del procedimiento inventado serán obvios para aquellas personas con experiencia en la técnica, al leer los detalles del método de ensayo, el desarrollo y la prueba de anticuerpos y del ratón transgénico a medida que se describan más detalladamente a continuación, con referencia a las figuras anexas. Breve descripción de los dibujos

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La Figura 1 es un espectrógrafo de la conformación de SHaPrP90-231 recombinante de acuerdo con lo determinado por espectroscopia de dicroismo circular (CD) que muestra las dos bandas principales con mínimos a 208 y 222 nm, que indican una conformación α-helicoidal; la banda negativa simple con mínimos a 217 nm es característica de una conformación predominantemente hoja β;

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la Figura 2 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo competitivo de SHaPrP90-231 recombinante en conformaciones α-helicoidal y desnaturalizada en presencia de 5% de homogeneizado cerebral de ratón PrP0/0 en el que la diferencia en los puntos de cruzamiento e inclinación obtenida con IgG 3F4 marcada con Europio indica que cada una de las conformaciones tiene tanto una afinidad diferente como un número de sitios de unión y además en la que las barras y puntos de datos representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes;

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la Figura 3 es un gráfico que muestra la calibración de un ensayo directo con SHaPrP90-231 recombinante en una conformación α-helicoidal, en presencia de 5% de homogeneizado cerebral de ratón PrP0/0 , en el que las barras y puntos de datos representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; 35

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la Figura 4 es un gráfico que muestra la calibración de un ensayo directo con SHaPrP90-231 recombinante en una conformación hoja β, en presencia de 5% de homogeneizado cerebral de ratón PrP0/0 , en el que las barras y puntos de datos representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 5 es un gráfico que muestra la validación de entrada-salida de un ensayo directo tanto para formas αhelicoidal como hoja β de SHaPrP90-231 en presencia de 5% de homogeneizado cerebral de ratón PrP0/0 , en el que la cantidad de la proteína en el eje x se determinó por análisis de aminoácidos y la cantidad de proteína en el eje y, se calculó a partir del ensayo; la Figura 6 es un gráfico que muestra la relación entre las señales de SHaPrP90-231 tratada (desnaturalizada) y nativa en conformaciones α- helicoidal y hoja β, desarrolladas con IgG 3F4 marcada con Europio, en donde las barras y puntos de datos representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo directo para la proteína PrPc en homogeneizados cerebrales de hámster, en el que los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo directo para PrPc+Sc en homogeneizados cerebrales de hámster infectado con scrapie, en el que los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 9 es un gráfico que muestra la cantidad total de proteínas PrP en cerebros de hámster normales y la cantidad de PrPSc hoja β en ambos cerebros calculada a partir del modelo, en el que los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes;

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la Figura 10 es un gráfico que muestra la cantidad total de proteínas PrP en cerebros de hámster infectados con scrapie y la cantidad de PrPSc hoja β en ambos cerebros, calculada a partir del modelo, en el que los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 11 es un gráfico que muestra la correlación de la infectividad y la cantidad de forma hoja β de SHaPrPSc , según lo calculado a partir del ensayo directo y la fórmula, en el que la SHaPrPSc purificada se sonicó en presencia de 5% homogeneizado cerebral de ratón PrP0/0 y se diluyó según lo descrito y en el que los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; 7

ES 2 218 807 T3 la Figura 12 es un gráfico de βA4 (1-40) tanto en conformaciones α-helicoidales como hoja β producidas por espectroscopia de dicroismo circular (CD), que muestra los enlaces principales a 208 y 222 nm para la conformación helicoidal y una banda negativa simple a 217 nm para la conformación predominantemente en hoja β (a pH 7,4); 5

la Figura 13 es un gráfico de un ensayo directo de A4β (1-40) soluble; la Figura 14 es un gráfico de un ensayo directo de la forma hoja β de A4β (1-40); la Figura 15 es un gráfico que muestra la relación de A4β (1-40) desnaturalizada a nativa ;

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la Figura 16 muestra la conversión de SHaPrP90-231 recombinante de conformación α-helicoidal a hoja β durante la incubación a 37ºC durante 72 hs, según lo determinado por espectroscopia de dicroismo circular (CD). La concentración de proteína fue 5 mg/ml; la Figura 17 muestra la conversión de ShaPrP90-231 recombinante de conformación α-helicoidal a hoja β durante la incubación a 37ºC durante 72 hs, según lo determinado por un ensayo diferencial directo. La señal aumentada de conformación nativa a ∼24 hs indica la desestabilización de la estructura nativa con conformación más abierta, seguida por conversión a una estructura secundaria en hoja β (véase Figura 16). La concentración de proteína fue 5 mg/ml; la Figura 18 muestra que tanto HFIP como glicerol son capaces de prevenir la transición conformacional de α a β en ShaPrP90-231 recombinante. Los cambios en la señal de TRF se expresan como la variación relativa, en la que los valores positivos indican estabilización, desestabilización negativa. Las condiciones experimentales fueron las de las Figuras 16 y 17; Figura 19: El pentosan polisulfato estabiliza la conformación nativa de ShaPrP90-231 a bajas concentraciones; el rojo Congo no tiene efecto sobre la estabilidad de ShaPrP90-231. Los cambios en la señal de TRF se expresan como variación relativa, en la que el valor positivo indica estabilización, desestabilización negativa. Las condiciones experimentales fueron las de las Figuras. 16 y 17; Figura 20: El detergente zwitteriónico ZW3-12 desestabilizó la conformación nativa, de Sha90-231 α-helicoidal. Las condiciones experimentales fueron las de las Figuras 16 y 17; los cambios en la señal de TRF se expresan como variación relativa, en la que el valor positivo indica estabilización, desestabilización negativa; la Figura 21 muestra la calibración de un ensayo directo con TTR humana purificada en conformación normal. Las placas se revelaron con anticuerpos primarios anti-TTR (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) y anticuerpo secundario anti-conejo marcado con Eu. Los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 22 muestra la calibración de un ensayo directo con TTR humana purificada en conformación amiloide. Las placas se revelaron con anticuerpos primarios anti-TTR y anticuerpo secundario anti-conejo marcado con Eu. Los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; la Figura 23 muestra la relación entre las señales de TTR desnaturalizada y nativa en conformaciones normales y amiloides, desarrolladas como se describió anteriormente. Los puntos de datos y barras representan ±SEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones independientes; Figura 24: Fórmula modificada para calcular la cantidad de TTR en conformación amiloide a partir de los datos obtenidos mediante el ensayo directo con anticuerpo policlonal anti-TTR. Los cambios de la ecuación general reflejan la relación inversa de los estados desnaturalizado y nativo para formas normales y amiloides de TTR. La diferencia entre la fluorescencia del estado desnaturalizado de la muestra y aquella esperada para la transición de proteína normal nativa al estado desnaturalizado es proporcionada a la cantidad de TTR en la conformación amiloide. Fn , señal total de conformación nativa; FnN y FnA , señales de conformaciones normales nativas y amiloides, respectivamente; Fd , señal total de TTR en estado desnaturalizado; FdN y FdA son las señales de estados amiloides o normales desnaturalizados de TTR; ∆Fn−d , el aumento total de la señal en la transición de estados nativo a desnaturalizado; ∆FNn−d , aumento en la señal de conformación normal en la transición de estado nativo a desnaturalizado; ∆Fnd , cambio en la señal de conformación amiloide en la transición de estado nativo a desnaturalizado; fNnd , factor de correlación para la transición de estado nativo a desnaturalizado de TTR normal; la Figura 25 es un gráfico del “índice de prión” (que es la relación de unión de anticuerpos a proteína PrP desnaturalizada frente a nativa) frente a la concentración de PrPSc en µg/ml. Los resultados exhibidos representan el ±SEM promedio obtenido a partir de tres cerebros diferentes de hámsteres sirio LVG/LAK infectados con diferentes cepas de priones. Descripción detallada de las realizaciones preferidas

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Antes de describir los presentes ensayos y métodos, se entenderá que la invención no está limitada a anticuerpos, proteínas, marcadores, ensayos o métodos particulares, los cuales, por supuesto, pueden variar. Asimismo, se entenderá que la terminología utilizada en la presente tiene como fin describir realizaciones particulares únicamente y no tiene 8

ES 2 218 807 T3 como fin ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones anexas. 5

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A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente interpreta una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Si bien en la práctica o prueba de la presente invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente, los métodos y materiales preferidos serán ahora descritos. Las publicaciones analizadas en la presente se proveen exclusivamente para la descripción anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. No se interpretará que la presente invención no está autorizada a anteceder a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Asimismo, las fechas de publicación provistas están sujetas a cambio si se descubre que la fecha de publicación real es diferente a la aquí provista. Definiciones

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El término “proteína”, como se utiliza en la presente, tiene como fin abarcar cualquier secuencia de aminoácido e incluir secuencias modificadas tales como glicoproteínas. El término incluye péptidos y proteínas naturales, como así también aquellos sintetizados recombinante o sintéticamente. Tal como se utiliza en relación con la presente invención, el término “proteína” tiene específicamente como fin cubrir proteínas naturales que se presentan en al menos dos conformaciones diferentes en donde ambas conformaciones tienen la misma o sustancialmente la misma secuencia pero tienen tres estructuras dimensionales diferentes. Las dos conformaciones de la proteína incluyen al menos una conformación no relacionada con un estado de enfermedad y al menos una conformación relacionada con un estado de enfermedad patogénico. Un ejemplo específico y preferido de una proteína, según lo utilizado en conexión con esta descripción, es una proteína PrP que incluye la forma sin enfermedad denominada forma PrPc y la forma relacionada con enfermedad denominada PrPSc . Si bien una proteína prión o la forma PrPSc de una proteína PrP es infecciosa y patogénica, la conformación con enfermedad de otras proteínas no es infecciosa aunque si patogénica. Tal como se utiliza en la presente, el término patogénico puede significar que la proteína realmente causa la enfermedad o simplemente puede significar que la proteína está asociada con la enfermedad y por lo tanto está presente cuando lo está la enfermedad. Por lo tanto, una proteína patogénica, como se utiliza en conexión con esta descripción, no es necesariamente una proteína que es el agente causante específico de una enfermedad. Los términos “tratar”, “tratamiento” y similares se emplean aquí intercambiablemente para describir un procedimiento mediante el cual una muestra o porción de la misma y específicamente proteínas en la muestra se manipulan física y/o químicamente, de modo de provocar que las proteínas en la muestra en una conformación relacionada con enfermedad cambien a una conformación diferente que tenga una afinidad de unión superior con un elemento enlazante tal como un anticuerpo. Las proteínas tratadas también se denominan proteínas desnaturalizadas o parcialmente desnaturalizadas o proteínas en una conformación relajada, cuya conformación aumenta la afinidad de unión de la proteína al elemento enlazante tal como un anticuerpo. Tratar incluye someter la muestra a calor, presión y/o compuestos químicos. En una realización preferida, las muestras que contienen PrPSc (que es la conformación relacionada con enfermedad que comprende configuraciones estructurales hoja β) se tratan de modo que la proteína asume una conformación diferente (p. ej., que comprende una configuración α-helicoidal y/o una configuración en espiral aleatoria) que tiene cuatro veces o más afinidad superior de unión a anticuerpos. Los términos “proteína PrP”, “PrP” y similares se utilizan intercambiablemente en la presente y significan tanto la forma PrPSc de partícula infecciosa que se conoce que provoca enfermedades (encefalopatías espongiformes) en seres humanos y animales, como la forma PrPc no infecciosa que, bajo condiciones apropiadas, se convierte a la forma PrPSc infecciosa. Los términos “prión”, “proteína prión” y “proteína PrPSc ” y similares se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a la forma PrPSc infecciosa de PrP y es una contracción de las palabras “proteína” e “infección”. Las partículas están comprendidas mayormente, si no exclusivamente, por moléculas de PrPSc codificadas por un gen de PrP. Los priones son distintos a las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos infectan animales para causar scrapie, una enfermedad transmisible, degenerativa del sistema nervioso de ovejas y cabras, como también encefalopatía espongiforme en bovinos (BSE) o “enfermedad de la vaca loca” y encefalopatía espongiforme felina en gatos. Las cuatro enfermedades producidas por priones que se sabe afectan a los seres humanos son (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), (3) Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Sheinker (GSS) y (4) insomnio familiar fatal (IFF). Tal como se utiliza en la presente, “prión” incluye todas las formas de priones que provocan todas y cada una de estas enfermedades u otras en cualquier animal utilizado, y en particular, en seres humanos y animales de granja domesticados.

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La expresión “gen de PrP” se utiliza en la presente para describir material genético que expresa proteínas, incluyendo mutaciones patogénicas y polimorfismos conocidos. La expresión “gen de PrP” se refiere en general a cualquier gen de cualquier especie que codifica cualquier forma de una proteína prión. Algunas secuencias de PrP comúnmente conocidas se describen en Gabriel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:9097-9101 (1992), patente estadounidense 5.565.186 y WO97/04814. El gen de PrP puede ser de cualquier animal, incluyendo animales “hospedantes” y “de prueba” descritos en la presente, y todos y cada uno de los polimorfismos y mutaciones de los mismos, reconociéndose que los términos incluyen dichos otros genes de PrP aún por descubrirse. La proteína expresada por dicho gen puede asumir ya sea una forma PrPc (sin enfermedad) como PrPSc (con enfermedad). 9

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El término “anticuerpo” equivale a una proteína de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno. Anticuerpo, tal como se utiliza en la presente, tiene como fin incluir al anticuerpo en su totalidad, como también a cualquier fragmento de anticuerpo (p. ej., F(ab)’, Fab, Fv) capaz de unirse al epítopo, antígeno o fragmento antigénico de interés. Los anticuerpos preferidos para los ensayos de la invención son inmunoreactivos o inmunoespecíficos y por lo tanto se unen específica y selectivamente a una proteína de interés, p. ej., una proteína amiloide A4β o una proteína PrP. Se prefieren los anticuerpos inmunoreactivos e inmunoespecíficos tanto para la forma sin enfermedad nativa como para la forma con enfermedad tratada, pero no para la forma con enfermedad no tratada (p. ej., tanto para PrPc nativa y PrPSc tratada pero no para PrPSc nativa). Los anticuerpos para PrP son preferentemente inmunoespecíficos, p. ej., no sustancialmente reactivos cruzados con materiales relacionados. Algunos anticuerpos específicos que se pueden emplear en conexión con la invención se describen en la solicitud PCT publicada, WO 97/10505. Los anticuerpos revelados en la solicitud PCT que selectivamente se unen a PrPSc no deberán utilizarse en la presente invención. El término “anticuerpo” abarca todos los tipos de anticuerpos, p. ej., policlonales, monoclonales y aquellos producidos por la metodología de exhibición de fago. Los anticuerpos particularmente preferidos de la invención son anticuerpos que tienen un grado relativamente alto de afinidad tanto hacia PrPc nativa como hacia PrPSc tratada, pero un grado relativamente bajo o sustancialmente ninguna afinidad de unión hacia PrPSc . Más específicamente, los anticuerpos de la invención preferentemente poseen cuatro veces o más, más preferentemente quince veces o más y aun más preferentemente 30 veces o más afinidad de unión hacia PrPc nativa y PrPSc desnaturalizada, en comparación con la afinidad de unión hacia PrPSc nativa. “Anticuerpo purificado” se refiere a aquel que sustancialmente no contiene otras proteínas, carbohidratos y lípidos con los cuales se asocia naturalmente. Dicho anticuerpo “preferentemente se une” a una conformación con enfermedad tratada o desnaturalizada de una proteína, tal como la conformación hoja β de la proteína PrPSc o A4β (o un fragmento antigénico de las mismas) y no reconoce sustancialmente o se une a otras moléculas no relacionadas de modo antigénico. Un anticuerpo purificado de la invención es preferentemente inmunoreactivo e inmunoespecífico para una especie específica y más preferentemente inmunoespecífico para PrPc nativa y para formas tratadas o desnaturalizadas de PrPc y PrPSc , pero no para PrPSc nativa o no tratada. “Fragmento antigénico” de una proteína (p. ej., proteína PrP) significa una porción de dicha proteína capaz de unirse a un anticuerpo.

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Por “se une específicamente” se entiende gran fuerza y/o gran afinidad de unión de un anticuerpo a un polipéptido específico, p. ej., epítopo de una proteína, p. ej., una proteína PrPc o A4β. La unión de un anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es preferentemente más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente aquellos que pueden estar presentes en moléculas asociadas, o en la misma muestra, que el polipéptido específico de interés, p. ej., se une más fuertemente a fragmentos de epítopo de una proteína tal como PrPSc , de modo que al ajustar las condiciones de unión, el anticuerpo se une casi exclusivamente a un sitio o fragmentos de epítopo de una proteína deseada tal como un fragmento de epítopo expuesto por tratamiento de PrPSc y, no expuesto en PrPSc nativa no tratada. Por “anticuerpo detectablemente marcado”, “anti-PrP detectablemente marcada” o fragmento de “anti-PrP detectablemente marcado” se entiende un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que retiene especificidad de unión), que tiene un marcador detectable acoplado. El marcador detectable normalmente se acopla mediante conjugación química pero cuando el marcador es un polipéptido, podría alternativamente acoplarse mediante técnicas de ingeniería genética. Los métodos para la producción de proteínas detectablemente marcadas se conocen en la técnica. Los marcadores detectables se conocen en la técnica pero normalmente son radioisótopos, fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante u otras fracciones o compuestos que ya sea emiten una señal detectable (p. ej., radioactividad, fluorescencia, color) o emiten una señal detectable después de la exposición del marcador a su sustrato. Los distintos pares de marcador/sustrato detectables (p. ej., peroxidasa de rábano picante/diaminobenzidina, avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferina), métodos para marcar anticuerpos y métodos para usar anticuerpos marcados se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). El europio es un marcador particularmente preferido. Las abreviaturas utilizadas en la presente incluyen:

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SNC para sistema nervioso central; BSE para encefalopatía espongiforme en bovinos; ECJ para Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob;

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IFF para insomnio familiar fatal; GSS para Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker; 65

Hu para humano: HuPrP para proteína prión humana; 10

ES 2 218 807 T3 Mo para ratón; MoPrP para proteína prión de ratón; 5

SHa para hámster sirio; SHaPrP para una proteína de prión de hámster sirio; Tg para transgénico;

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Tg(SHaPrP) para un ratón transgénico que contiene el gen de PrP de un hámster sirio; Tg(HuPrP) para ratones transgénicos que contienen el gen de PrP humano completo; 15

Tg(ShePrP) para ratones transgénicos que contienen el gen de PrP de oveja completo; Tg(BovPrP) para ratones transgénicos que contienen el gen de PrP de vaca completo; PrPSc para la isoforma de scrapie de la proteína prión;

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PrPc para la isoforma normal, común contenida celular de la proteína prión; MoPrPSc para la isoforma de scrapie de la proteína prión de ratón; 25

MHu2M para un gen de PrP de ratón/ser humano quimérico en el que una región del gen de PrP de ratón se reemplaza por una secuencia humana correspondiente que difiere del PrP de ratón en 9 codones; Ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos de la invención que incluyen el gen MHu2M quimérico;

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MHu2MPrPSc para la isoforma de scrapie del gen de PrP humano/de ratón quimérico; PrPECJ para la isoforma ECJ de una proteína PrP; Pmp0/0 para ablación de ambos alelos de un gen de proteína prión endógena, p. ej., el gen de MoPrP;

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Tg(SHaPrP+/0 )81/Pmp0/0 para una línea particular (81) de ratones transgénicos que expresan SHaPrP, +/0 indica heterocigótico; Tg(HuPrp)/Pmp0/0 para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de proteína prión humana (HuPrP) con un ratón con ambos alelos del gen de proteína prión endógena rotos; Tg(MHu2M)/PmP0/0 para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de proteína prión quimérico (MHu2M) con un ratón con ambos alelos del gen de proteína prión endógena rotos;

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TTR para transtiretina; FVB para una cepa endogámica estándar de ratones, a menudo utilizada en la producción de ratones transgénicos, ya que los huevos de ratones de FVB son relativamente grandes y toleran relativamente bien la microinyección de ADN exógeno;

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[PrPβ ] - concentración de proteína prión en conformación hoja β; [βA4β ] - concentración de βA4 en conformación hoja β;

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[DRC] - concentración de una conformación relacionada con enfermedad de una proteína. Aspectos generales de la invención

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El método de ensayo comprende proveer una muestra, la cual se presume contiene una proteína que asume una primera conformación y una segunda conformación relacionada con enfermedad y es capaz de detectar una conformación con enfermedad de la proteína, cuando está presente en una concentración muy reducida en relación con la concentración de la conformación sin enfermedad. La muestra se divide en una primera porción y una segunda porción. La primera porción está preferentemente unida a la superficie del soporte sólido y a partir de allí se pone en contacto con un anticuerpo marcado. El anticuerpo es de un tipo que se une a la proteína en su primera configuración con un grado de afinidad mayor (cuatro veces o más) que como se une a la proteína en su segunda conformación relacionada con enfermedad. La segunda porción de la muestra se trata luego en un modo que causa que cualquier proteína en la segunda conformación relacionada con enfermedad asuma una conformación diferente, cuya conformación posee un grado de afinidad mayor (cuatro veces superior o más) para el anticuerpo marcado, en comparación con 11

ES 2 218 807 T3 la afinidad hacia la proteína en la segunda conformación relacionada con enfermedad no tratada. La segunda porción tratada luego se une, preferentemente, a la superficie del soporte sólido. La proteína tratada unida al soporte luego se pone en contacto con un anticuerpo marcado bajo condiciones que permiten que el anticuerpo se una a las proteínas en la primera configuración o a proteínas en la configuración diferente asumida. 5

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Después de que los anticuerpos marcados han sido provistos de tiempo, temperatura y condiciones químicas suficientes (p. ej., pH) para unir las proteínas apropiadas presentes en las respectivas porciones, se determina el nivel de unión del anticuerpo marcado a la proteína en cada porción. Se utiliza un ensayo altamente sensible, tal como un ensayo que comprende fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo, posibilitando la detección de concentraciones en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 1 x 103 partículas por ml o menos. Se requiere un alto grado de sensibilidad, ya que en la mayoría de las muestras la concentración de proteína en la conformación con enfermedad será muy reducida en comparación con la concentración de la proteína en la conformación sin enfermedad, p. ej., 3 órdenes de magnitud o más diferentes. Por ejemplo, la conformación sin enfermedad de la proteína podría estar presente en una cantidad de aproximadamente 1 x 108 partículas/ml, mientras que la conformación con enfermedad de la proteína está solamente presente en una cantidad de 1 x 104 partículas/ml. Por lo tanto, cualquier incremento en la señal observado, debido al tratamiento de la conformación con enfermedad de la proteína será muy pequeño en relación con la señal que está siendo obtenida de la proteína en la conformación sin enfermedad. Después de obtener el nivel de unión para ambas porciones de la muestra, se comparan los niveles. Por ejemplo, el nivel de unión de un anticuerpo marcado a una proteína en la primera porción se resta al nivel de unión de un anticuerpo a una proteína en la segunda porción. La diferencia entre los dos refleja la cantidad de proteína presente en la muestra original que estaba en la segunda conformación relacionada con enfermedad, después de ajustar las diferencias provocadas (si las hubiese) aumentando la afinidad de unión de la proteína en la primera porción. Más específicamente, con algunas proteínas puede haber algunas diferencias debido al efecto del tratamiento en las proteínas que están en la conformación sin enfermedad nativa, p. ej., por tratamiento, se exponen más epítopos de la proteína en la conformación relacionada con enfermedad. Esta diferencia debería considerarse al llegar a conclusiones con respecto a si la muestra original incluía proteínas en la segunda conformación relacionada con enfermedad. La explicación de este efecto se muestra dentro de las Figuras 3 y 4. En la Fig. 3, se muestra una comparación de la unión de anticuerpos a una muestra no tratada que contiene solamente proteína nativa en su configuración sin enfermedad con la misma proteína nativa después del tratamiento. Como se muestra dentro de la Fig. 3, hay alguna diferencia entre los resultados obtenidos con la proteína tratada que muestra una señal más fuerte, en el sentido que el tratamiento aumentó la afinidad de unión de la proteína. No obstante, la Fig. 4 muestra los mismos resultados cuando la muestra original incluía proteínas que estaban en la segunda conformación relacionada con enfermedad. Las proteínas nativas no tratadas proveen una señal muy débil. No obstante, las proteínas tratadas proveen una señal muy fuerte. La gran diferencia entre las muestras tratadas y no tratadas es una clara indicación de que la muestra original incluía proteínas con la segunda conformación relacionada con enfermedad, en el sentido que estas proteínas no se unen a anticuerpos o se unen a anticuerpos con un grado muy reducido de afinidad de unión. Sin embargo, después del tratamiento, estas proteínas se unen a los anticuerpos tan bien o prácticamente tan bien o mejor que las proteínas en la conformación sin enfermedad que fueron tratadas. El ensayo se puede utilizar para probar la presencia de la conformación con enfermedad de una proteína determinada dentro de cualquier tipo de muestra. Algunas de las muestras más típicas que se probarán incluyen compuestos farmacéuticos que incluyen componentes que derivan de mamíferos vivos o usan materiales que derivan de mamíferos vivos en su procesamiento. También sería conveniente probar órganos para trasplante y artículos alimenticios tales como carne vacuna, que se sospechaba que contenían priones infecciosos. La invención podría utilizarse para probar la presencia de la conformación con enfermedad de uno o más tipos de proteínas, tales como PrPSc infecciosa en productos farmacéuticos, productos cosméticos, tejido de biopsia o autopsia, cerebro, médula espinal, nervio periférico, músculo, fluido cerebroespinal, sangre y componentes sanguíneos, ganglios linfáticos y en cultivos derivados de animales o seres humanos infectados o potencialmente infectados por las formas con enfermedad de proteínas tales como priones. Tratamiento o desnaturalización

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Tal como se indicó anteriormente, “tratar” puede incluir exponer las proteínas a cualquier medio físico y/o químico que provoca que la proteína que está originalmente presente en una conformación compacta relacionada con enfermedad, asuma una conformación más relajada con un grado superior de afinidad de unión hacia un elemento enlazante tal como anticuerpos. En general, el tratamiento o la desnaturalización, como se denomina algunas veces en la presente, comprende someter la proteína a algún medio que provoca que se expongan los epítopos de la proteína que no estaban previamente expuestos, de modo tal que un anticuerpo u otro elemento enlazante pueda unirse al epítopo recientemente expuesto. Los métodos de tratamiento que se pueden utilizar incluyen: (1) físico, tal como temperatura o presión hidroestática, (2) químico, tal como pH ácido o alcalino, sales caotrópicas, detergentes desnaturalizantes y proteinasas, tales como Proteinasa K y (3) combinaciones de los métodos recientemente mencionados. El tiempo de tratamiento variará dependiendo del tratamiento utilizado, pero deberá llevarse a cabo con tiempo suficiente como para exponer nuevos sitios de unión pero no tan prolongado como para desnaturalizar completamente la proteína. 12

ES 2 218 807 T3 Pretratamiento o destrucción/eliminación de la proteína

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Antes de llevar a cabo el tratamiento o la prueba de anticuerpos de cualquiera de las porciones de la muestra, puede ser conveniente someter la muestra a un pretratamiento. El pretratamiento se lleva a cabo con el fin de destruir o eliminar la forma sin enfermedad de la proteína presente dentro de la muestra. Los ejemplos de metodología de pretratamiento incluyen producir una columna que incluye anticuerpos unidos a superficies de soporte cuyos anticuerpos se unen a la conformación sin enfermedad de la proteína, eliminando de este modo tanta conformación sin enfermedad de las proteínas como sea posible. Alternativamente, la muestra puede someterse a tratamiento físico tal como presión hidroestática de temperatura a largo plazo, sola o en combinación con productos químicos tales como ácidos o alcalinos, como se indicó anteriormente en la fase de “tratamiento” pero llevándose a cabo durante un período más prolongado y en un modo tal como para destruir las proteínas presentes en la muestra, cuyas proteínas se encuentran en la conformación sin enfermedad. En algunos casos, las proteínas en la conformación sin enfermedad y con enfermedad se destruirán. No obstante, un porcentaje relativo superior de las proteínas en la conformación sin enfermedad se destruirá, ya que estas proteínas se encuentran inicialmente en una conformación suelta, que es más vulnerable a destrucción. Por lo tanto, la metodología de pretratamiento resulta en una muestra que incluye una concentración relativamente inferior de la conformación sin enfermedad de la proteína, en relación con la concentración de la conformación con enfermedad de la proteína. Esto aumenta la sensibilidad del ensayo, haciendo posible la detección de concentraciones inferiores de la conformación con enfermedad de la proteína. Se prefiere la eliminación a la destrucción de las proteínas, dado que la destrucción disminuirá la sensibilidad si se destruye la conformación con enfermedad. Un método de pretratamiento particularmente útil se revela en el expediente de abogado de nuestra solicitud 6510/098001, presentada en la misma fecha que la presente solicitud titulada “Procedimiento para concentración de proteínas con conformación relacionada con enfermedad” (ahora publicada como WO 99/42487). Unión de proteínas a superficies de soporte

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El método de acoplamiento químico o por afinidad de la proteína PrP al soporte plástico se describe en general en la literatura existente y puede variar. Los anticuerpos utilizados en el ensayo de diagnóstico consisten en Fab recombinante, policlonal o monoclonal y necesitan ser especies específicas con unión preferencial a la PrPc nativa o a la forma desnaturalizada de PrPSc , preferentemente con reactividad al menos 4 veces inferior con PrPSc infecciosa, asumiendo la misma cantidad del antígeno. Utilización del ensayo para detección de priones

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Un aspecto de la invención es un procedimiento en dos etapas para diagnosticar enfermedades producidas por priones, midiendo cuantitativamente la forma nativa infecciosa de la proteína PrPSc en un material de muestra o en los cerebros de animales susceptibles inoculados con dicho material. La muestra se divide en dos alícuotas. La primera alícuota se reticula con el soporte plástico sólido en la conformación nativa a través de una etapa de activación química bajo condiciones no desnaturalizantes, es decir, sin tratamiento. La segunda porción de la muestra se trata primero y luego se reticula con el soporte plástico. Ambas porciones del material de muestra reaccionan in situ con los anticuerpos marcados que preferentemente reconocen la PrPc nativa o PrPSc tratada de las especies animales determinadas. La cantidad del anticuerpo unido a conformaciones tratadas o nativas de proteína PrP se registra mediante la señal del marcador de IgG. El exceso de la señal obtenida con la muestra desnaturalizada en función de aquel esperado a partir de un incremento en la señal obtenida con la conformación α-helicoidal nativa de PrPc (es decir, el incremento en función de la cantidad ajustada) es la medida de la cantidad de PrPSc estructurada con hoja β infecciosa en la muestra original. La fórmula desarrollada para cálculos de contenido de PrPSc se muestra en las fórmulas aquí provistas y se ilustra en el Ejemplo 11. El diagnóstico de enfermedades producidas por priones se establece mediante tres procedimientos: (1) medición de la muestra tratada sola y detección del incremento en la cantidad de PrP total en la muestra examinada por encima de los niveles de fondo de PrPc obtenidos a partir de controles normales; (2) cálculo de la relación entre señal desnaturalizada frente a nativa para anticuerpos determinados, por ejemplo, valores superiores a 2,2 para IgG 3F4 marcada con Europio indican la presencia de PrPSc , preferentemente utilizando fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo; (3) evaluación del exceso de señal de la muestra desnaturalizada en función de aquel esperado a partir del incremento en la señal para conformación α-helicoidal de PrPc como una medida de la cantidad de PrPSc estructurada con hoja β infecciosa en la muestra original. Preferentemente, antes de la etapa (1), el método utiliza una etapa de pretratamiento por medio de la cual se elimina o destruye la PrPc en cantidades relativas superiores a aquella de la PrPSc . En un cerebro de hámster sirio infectado con scrapie, la concentración de PrPSc es 5-10 veces mayor que la de PrPc cuando se enferman los animales. En ese momento, la concentración de priones en sus cerebros es 107 -108 unidades ID50 /ml de 10% homogeneizado. El sistema altamente cuantitativo que se ha desarrollado permite sustraer la señal de PrPc . La sustracción se puede llevar a cabo fácilmente cuando la concentración de PrPSc es mayor que la de PrPc . No obstante, la sustracción se torna difícil cuando la concentración de PrPSc es mucho menor que la de PrPc . Para dirigirse al problema mencionado, el presente ensayo utiliza el principio de afinidad entre diferentes conformaciones de antígeno y anticuerpo. Para medir la concentración de PrPSc cuando es mucho menor que la de PrPc , el sistema de detección debe poseer una sensibilidad extrema y un alcance lineal de al menos 104 . El ensayo descrito en la presente puede detectar fácilmente PrPSc a una concentración de (aproximadamente) 50 pg/ml, utilizando IgG marcada 13

ES 2 218 807 T3 con Europio. Asumiendo 105 -106 moléculas de PrPSc por unidad ID50 , el presente ensayo puede detectar fácilmente 5 x 102 - 5 x 103 unidades ID50 por ml. 5

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El ensayo puede detectar PrPSc en mezclas (mediante el método directo) en el que la concentración de PrPSc es menor que 1% de la concentración de PrPc . Se puede lograr una sensibilidad adicional a través de inmunoprecipitación, utilizando un formato del tipo sándwich para un ensayo de estado sólido, centrifugación diferencial con extracción de detergente para eliminar la PrPc , el método indirecto de animal transgénico o combinaciones de estos métodos. Una estimación conservadora es que dichos procedimientos deberían permitir la medición entre 5 y 50 unidades ID50 por ml o menos conservadoramente medir entre 0,1 y 0,01 unidades ID50 por ml. Dichas mediciones proporcionarían un medio “positivo” rápido para establecer la esterilidad biológica, que es la “ausencia” de la infectividad. Método para identificación de fármacos

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Los ensayos anteriormente descritos, que pueden identificar la presencia de una conformación relacionada con enfermedad de una proteína, se pueden aplicar para identificar compuestos que luego podrían utilizarse como fármacos en el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas con la conformación con enfermedad de la proteína. Por ejemplo, las composiciones que se conoce incluyen conformaciones relacionadas con enfermedad de una proteína se pueden utilizar para inocular un ratón transgénico del tipo revelado y descrito en la patente estadounidense 5.565.186 y en la publicación PCT WO97/04814. El ratón inoculado puede luego tratarse con un compuesto que se cree previene la infección. Después de proporcionar un período suficiente para la incubación, el cerebro de ratón se extrae y prueba utilizando el ensayo anteriormente descrito, para determinar si el compuesto de tratamiento fue eficaz para prevenir la infección. La metodología también podría aplicarse a situaciones en las que la infección ya ha tenido lugar, con el fin de determinar si un compuesto particular podría estabilizar la infección, es decir, prevenir mayor formación de la conformación con enfermedad de la proteína.

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El ensayo de la presente invención se puede emplear en combinación con la metodología descrita dentro de la publicación internacional WO 97/16728 ya presentada. Esta solicitud revela compuestos que se pueden poner en contacto con proteínas en una conformación sin enfermedad, con el fin de convertir esos compuestos en una conformación con enfermedad. La metodología es útil en el sentido que permite detectar la capacidad de los compuestos de prevenir la formación de la conformación relacionada con enfermedad de la proteína. El ensayo de la presente invención hace posible medir precisamente el efecto de cualquier compuesto de prueba en la prevención de la formación de la conformación relacionada con enfermedad. En base a lo previamente mencionado, se puede observar que la invención incluye un método para detectar compuestos que afectan la forma conformacional de cualquier proteína tal como una proteína PrP, que posee una primera conformación no relacionada con enfermedad (p. ej., PrPc ) y una segunda conformación relacionada con enfermedad (p. ej., PrPSc ). El método comprende proveer primero una muestra con la proteína presente en la primera conformación sin enfermedad. La muestra luego se pone en contacto con un compuesto de prueba al que se le está evaluando su utilidad terapéutica. Después de agregar el compuesto de prueba, la muestra se pone en contacto con un compuesto o grupo de compuestos que inducen la proteína en la primera configuración sin enfermedad a convertirse en la segunda conformación con enfermedad. Después de un período suficiente, la muestra se ensaya utilizando la presente invención. El ensayo de la presente invención hará posible determinar con precisión cómo el compuesto de prueba afectó la conversión de la proteína de la conformación sin enfermedad a la conformación con enfermedad. Será obvio para aquellas personas con experiencia en la técnica que lean esta descripción, que el compuesto de prueba puede agregarse en diferentes puntos de tiempo en relación con la adición del compuesto que afecta el cambio conformacional. En consecuencia, la metodología se puede utilizar para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para estabilizar otros cambios de la conformación sin enfermedad a la conformación con enfermedad y/o determinar la capacidad del compuesto de prueba para prevenir la iniciación de cualquier conversión de la conformación sin enfermedad a la conformación con enfermedad. Si bien la publicación internacional WO 97/16728 revela un medio para convertir una conformación sin enfermedad a una conformación con enfermedad, otros medios para obtener el mismo resultado serán obvios para aquella persona con experiencia en la técnica al leer la presente solicitud y revisar el estado de la técnica relacionado. Por consiguiente, la presente invención tiene como fin abarcar cualquier medio físico, químico o biológico que se utilizaría para convertir una proteína dentro de una primera conformación sin enfermedad, a una segunda conformación con enfermedad y aplicar el ensayo aquí descrito. Además, la presente invención tiene como fin abarcar compuestos terapéuticos que se obtienen como resultado de la aplicación del método de detección de la invención, es decir, compuestos producidos mediante el método de la invención. Anticuerpos

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Las personas con experiencia en la técnica en general conocen los métodos para generar anticuerpos. Dado que la forma con enfermedad se encuentra a menudo en una configuración más compacta que la forma sin enfermedad, con menos epítopos expuestos, se pueden generar fácilmente anticuerpos que se unen solamente a la forma sin enfermedad de la proteína o a la forma tratada con enfermedad. Por ejemplo, los anticuerpos que detectan formas tratadas de proteína PrPSc y proteína PrPc se pueden generar inmunizando conejos o ratones con conformaciones α-helicoidales de PrP recombinante, PrPc nativa de cerebros animales, péptidos sintéticos en conformaciones α-helicoidales o en espiral aleatorias, o contra PrPSc desnaturalizada o PrP 27-30. Solo deberán seleccionarse los anticuerpos con afinidad al menos 4 veces superior hacia PrPc (o conformación desnaturalizada de PrPSc de la misma especie), en comparación con su afinidad hacia PrPSc . El método de generación, purificación, marcaje y detección de anticuerpos puede variar. 14

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La IgG o Fab se puede purificar a partir de diferentes fuentes por HPLC de afinidad, utilizando HPLC de exclusión por tamaño y columna de proteína A. Los anticuerpos purificados se pueden marcar con Europio y detectar mediante fluorescencia de resolución en el tiempo. La unión de anticuerpos con diferentes conformaciones de proteína PrP se puede medir mediante fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo. No obstante, el sistema de detección de IgG unida a PrP en soporte sólido in situ o en disolución puede variar. A su vez, también es posible utilizar métodos inmunológicos directos o indirectos, incluyendo fluorescencia, luminiscencia, ampliación de avidinabiotina, radiomarcadores directos o ensayos unidos a enzimas con sustratos de color o luminiscentes. Un anticuerpo que se puede utilizar en la invención se describe en la publicación internacional US 4.806.624, expedida el 21 de febrero de 1989, la cual describe un anticuerpo monoclonal 263K 3F4, producido por la línea celular ATCC HB9222, depositada el 8 de octubre de 1986, incorporada a la presente por referencia. La línea celular que produce el anticuerpo se puede obtener de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. En general, la infección de scrapie no puede producir una respuesta inmune, siendo los organismos hospedantes tolerantes a la PrPSc de algunas especies. Los anticuerpos que se unen ya sea a PrPc o a PrPSc se describen en la WO97/10505, publicada el 20 de marzo de 1997. Se puede usar cualquier anticuerpo que se una a PrPc y no a PrPSc y aquellos con experiencia en la técnica podrán generar los procedimientos conocidos, p. ej., véanse métodos para producción de bibliotecas de anticuerpos en la publicación internacional US 5.223.409. Los anticuerpos anti-PrP policlonales podrían ser preparados en conejos después de la inmunización con grandes cantidades de ácido fórmico o SHaPrP 27-30 desnaturalizada con SDS [Bendheim, Barry et al (1984) Nature 310:418-421; Bode, Pocchiari et al (1985) J Gen Virol 66:2471-2478; Safar, Ceroni et al (1990) Neurology 40:513-517]. De modo similar, se ha producido una cantidad escasa de anticuerpos monoclonales anti-PrP contra PrP 27-30 en ratones [Barry y Prusiner (1986) J Infect Dis 154:518-521; Kascsak, Rubinstein et al (1987) J Virol 61:3688-3693]. Estos anticuerpos se generaron contra PrP 27-30 desnaturalizada con SDS o ácido fórmico y son capaces de reconocer PrPc nativa y PrPSc tratada o desnaturalizada tanto de SHa como de seres humanos igualmente bien, pero no se unen a MoPrP. No sorprendentemente, los epítopos de estos anticuerpos se localizaron en regiones de la secuencia que contenía diferencias de aminoácidos entre SHa y MoPrP [Rogers, Yehiely et al (1993) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 90: 3182-3186]. No está totalmente clara la razón por la cual muchos anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones previamente citadas se unirán a PrPc y PrPSc tratada o desnaturalizada pero no a PrPSc nativa. Sin influencias de ninguna teoría particular, se sugiere que esto puede ocurrir porque los epítopos que están expuestos cuando la proteína tiene la conformación PrPc , no están expuestos o están parcialmente ocultos en la configuración PrPSc , en la que la proteína es relativamente insoluble y está más compactamente plegada.

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Para los propósitos de la invención, una indicación de que no hay unión significa que la constante Ka de equilibrio o afinidad es 106 l/mol o menos. Asimismo, la unión será reconocida como existente cuando la Ka , sea de 107 l/mol o superior, preferentemente 108 l/mol o superior. La afinidad de unión de 107 l/mol o más se puede deber a (1) un anticuerpo monoclonal simple (es decir, grandes cantidades de una clase de anticuerpos) o (2) una pluralidad de anticuerpos monoclonales diferentes (p. ej., grandes cantidades de cada uno de los cinco anticuerpos monoclonales diferentes) o (3) grandes cantidades de anticuerpos policlonales. También es posible usar combinaciones de (1)-(3). Los anticuerpos seleccionados preferidos se unirán al menos 4 veces más ávidamente a las formas de PrPSc tratadas o desnaturalizadas de la proteína, en comparación con su unión a la conformación nativa de PrPSc . Esta cuádruple diferencia en la afinidad de unión se puede lograr utilizando varios anticuerpos diferentes como para (1)-(3) anteriores y como tales, algunos de los anticuerpos en mezcla podrían tener más de una diferencia cuádruple.

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Una variedad de diferentes tipos de ensayos de la invención se puede utilizar con uno o más anticuerpos diferentes. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que los anticuerpos se pueden marcar con marcadores conocidos y utilizarse con robótica, ensayos del tipo sándwich, detectores electrónicos, citometría de flujo y similares actualmente disponibles.

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Cálculos cuantitativos 55

Utilizando la metodología anteriormente descrita, es posible calcular la diferencia entre la cantidad de señal obtenida de una muestra que no ha sido tratada y la señal obtenida con una muestra que ha sido tratada. Esta diferencia representa (después de ajustarse para el efecto del tratamiento en la conformación sin enfermedad) la cantidad (concentración) de proteína en la conformación con enfermedad presente en la muestra original. Después de obtener la diferencia, la fórmula expuesta a continuación se puede utilizar para calcular la cantidad de proteína en la conformación con enfermedad presente en la muestra original por unidad de volumen.

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a) Fn = Fnα + Fnβ → Fnα = Fn - Fnβ · Fnβ ∼ fondo b) Fd = fdα + Fdβ 65

∆Fn−d = ∆Fαn−d + ∆Fβn−d

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ES 2 218 807 T3 ∆Fβn−d = Fd − Fn − ∆Fαn−d [PrPβ ] o [DRC] ∼ ∆Fβn−d = Fd - (Fn * fαn−d ) 5

A continuación se provee la definición de cada una de las variables anteriormente mencionadas. F - señal de fluorescencia (obsérvese que se puede emplear cualquier señal detectable);

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Fn - señal de fluorescencia de una conformación nativa; Fnα y Fnβ señales de fluorescencia de conformaciones α-helicoidales y hoja β nativas, respectivamente; Fd - señal de fluorescencia de PrP en el estado tratado o desnaturalizado;

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Fdα y Fdβ - son las señales de estados hoja β y α-helicoidales desnaturalizados de PrP; ∆Fn−d - aumento de la señal de fluorescencia en la transición de estado nativo a desnaturalizado;

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∆Fαn−d - incremento en la señal de fluorescencia de una conformación α-helicoidal en la transición de estado nativo a desnaturalizado; ∆Fβn−d - incremento en la señal de conformación hoja β en la transición de estado nativo a desnaturalizado;

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fαn−d - factor de correlación para la transición de estado nativo a desnaturalizado de una PrP α-helicoidal; [PrPβ ] - concentración de proteína prión en conformación hoja β. [DRC] - concentración de cualquier proteína en conformación relacionada con enfermedad.

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La fórmula previamente provista se utiliza para calcular específicamente la concentración de proteína prión en la conformación hoja β. No obstante, las mismas fórmulas se pueden utilizar para calcular la concentración de cualquier proteína, es decir, la concentración de cualquier conformación compacta con enfermedad de una proteína tal como [βA4β ]. Más generalmente, [DRC] representa la concentración de la conformación relacionada con enfermedad de una proteína. Para proveer un ejemplo específico, las definiciones anteriores han sido expuestas específicamente con respecto a proteínas PrP, en las que las proteínas incluyen al menos una conformación relajada sin enfermedad (PrPc ), que incluye una configuración α-helicoidal y al menos una conformación compacta relacionada con enfermedad (PrPSc ) que incluye una configuración hoja β. Las fórmulas se utilizan para calcular la concentración de la conformación relacionada con enfermedad de la proteína presente en la muestra. Para las fórmulas y definiciones específicas anteriormente provistas, las fórmulas se utilizan para calcular la concentración de proteínas prión que incluyen la configuración hoja β (véase Ejemplo 11). La señal utilizada para calcular la fórmula anteriormente expuesta es una señal de fluorescencia. No obstante, se puede emplear cualquier señal detectable. La señal total está representada por Fn que es una combinación de la señal recibida de las conformaciones con y sin enfermedad. Ésta es una señal que se calcularía a partir de la porción No 1, que no es tratada en el ensayo anteriormente descrito. La variable Fd es la señal que se obtiene tratando la porción No 2 de la muestra. Esta señal es una combinación de la señal recibida de una proteína tratada en la conformación sin enfermedad más la proteína tratada en la conformación con enfermedad. Se ha reconocido que hay una diferencia en la señal obtenida tratando una muestra que no incluye la conformación relacionada con enfermedad de la proteína. La diferencia debe explicarse para obtener una lectura precisa. La diferencia en la señal obtenida entre la muestra nativa y la muestra tratada es, por supuesto, una combinación de la diferencia en la señal obtenida tratando la conformación relacionada con enfermedad y la conformación sin enfermedad. El incremento en la señal obtenida tratando la conformación con enfermedad, es decir, la diferencia entre la señal de la conformación con enfermedad no tratada y la señal recibida de la conformación con enfermedad tratada, se puede calcular restando la señal recibida al tratar la muestra completa de la señal recibida al calcular el incremento en señal obtenido de la conformación sin enfermedad no tratada y de la conformación sin enfermedad tratada. Al utilizar estas ecuaciones, es posible producir la ecuación final que provee la concentración de proteína en la conformación con enfermedad presente en la muestra original (véase Ejemplo 11). Diferenciación (tipificación) de cepas de proteína

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Diferentes animales, incluyendo seres humanos, se pueden infectar con diferentes cepas de proteínas patogénicas. Se provee aquí una “tabla de mutaciones” para enumerar algunas de las diferentes mutaciones asociadas con diferentes cepas de infecciones producidas por priones. Algunas veces, puede ser importante conocer qué cepa específica ha infectado a un individuo, dado que dicha información puede ser útil en (1) proveer un diagnóstico más preciso, (2) 16

ES 2 218 807 T3 administrar el tratamiento apropiado o (3) determinar el origen de la infección comparando la cepa con una cepa en un origen probable de infección. 5

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La cepa particular de proteína patogénica que provoca una infección se puede determinar a partir de dos partes de información que se pueden calcular utilizando la presente invención. El Ejemplo 11 muestra cómo la presente invención se puede utilizar para determinar la cantidad absoluta, es decir, la concentración de priones en una muestra de un tamaño determinado. El Ejemplo 8 muestra cómo calcular el “índice de prión” que es la relación de unión de anticuerpos a proteína PrP desnaturalizada: nativa. Un “índice de proteína” para otras proteínas es la relación de unión de cualquier elemento enlazante a la forma desnaturalizada: nativa de la proteína. En términos generales, el “índice de prión” es simplemente una caracterización numérica del efecto que tiene el tratamiento sobre la proteína. Para determinar la cepa particular, se debe calcular primero un estándar para cada cepa. Esto se realiza determinando el efecto (índice de prión) de un tratamiento particular en una cantidad conocida de una cepa conocida. Esto se puede trazar como se muestra en la Figura 25. Una vez calculado el estándar, la cepa de otras muestras se puede determinar fácilmente; los estándares se calculan preferentemente en una cantidad de concentraciones diferentes para cada cepa. Para determinar la cepa de una muestra simple, se calcula la concentración de proteína en la muestra y el efecto del tratamiento en esa concentración. Los resultados se comparan con el estándar (como se muestra en la Figura 25) para determinar la cepa. El Ejemplo 18 es un ejemplo específico de esto, tomado en combinación con la Figura 25. La misma concentración de la misma cepa se efectuará del mismo modo mediante un tratamiento determinado. No obstante, la misma concentración de diferentes cepas se efectuará de modo diferente mediante el mismo tratamiento, haciendo posible la determinación de la cepa. Enfermedades asociadas con proteínas insolubles

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Gran parte de la descripción y de los ejemplos específicos provistos en la presente se refieren al uso del ensayo en conexión con la determinación de la presencia de PrPSc en la muestra. Sin embargo, como se indicó anteriormente, el ensayo de la invención se puede aplicar para determinar la presencia de cualquier proteína que asuma dos formas conformacionales diferentes, una de las cuales estará asociada con enfermedad. El siguiente es un listado no limitante de enfermedades con proteínas insolubles asociadas que asumen dos o más conformaciones diferentes.

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Enfermedad Enfermedad de Alzheimer 35

Proteínas insolubles APP, Aβ péptido, α1-antiquimotripsina, tan, componente sin Aβ

Enfermedades producidas por priones, enfermedad de Creutzfeld Jakob, encefalopatía espongiforme en bovinos y scrapie PrPSc SOD y neurofilamento Cuerpo de Pick Cuerpo de Lewy Amilina

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ALS Enfermedad de Pick Enfermedad de Parkinson Diabetes de Tipo I Mieloma múltiple - discrasias de células plasmáticas

IgGL-cadena 50

Polineuropatía amiloidítica familiar Transtiretina Procalcitonina

Carcinoma medular de tiroides Insuficiencia cardiaca crónica 55

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β2 -microglobulina Factor natriurético atrial

Insuficiencia cardiaca congestiva Amiloidosis sistémica y cardiaca senil

Transtiretina Amiloide A del suero ApoA1 Gelsolina

Inflamación crónica Aterosclerosis Amiloidosis familiar

Deberá observarse que las proteínas insolubles anteriormente enumeradas incluyen, cada una, un número de variancia o mutaciones que resultan en diferentes cepas, todas abarcadas por la presente. Las mutaciones patogénicas conocidas y los polimorfismos en el gen de PrP relacionados con enfermedades producidas por priones se exponen a continuación y las secuencias de seres humanos, ovejas y bovinos se exponen en la publicación internacional US 5.565.186, expedida el 15 de octubre de 1996. 17

ES 2 218 807 T3 Tabla de mutaciones

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Mutaciones humanas patogénicas

Polimorfismos humanos

Polimorfismos de ovejas

Polimorfismos bovinos

2 inserciones de octarepeticiones 4 inserciones de octarepeticiones 5 inserciones de octarepeticiones 6 inserciones de octarepeticiones 7 inserciones de octarepeticiones 8 inserciones de octarepeticiones 9 inserciones de octarepeticiones Codón 102 Pro-leu Codón 105 Pro-Leu Codón 117 Ala-Val Codón 145 Finalizador Codón 178 Asp-Asn Codón 180 Val-Ile Codón 198 Phe-Ser Codón 200 Glu-Lys Codón 210 Val-Ile Codón 217 Asn-Arg Codón 232 Met-Ala

Codón 129 Met/Val Codón 219 Glu/Lys

Codón 171 Arg/Glu Codón 136 Ala/Val

5 ó 6 octarepeticiones

También se debe observar que dichas proteínas poseen dos conformaciones tridimensionales diferentes con la misma secuencia de aminoácidos. Una conformación está asociada con las características de enfermedad y es en general insoluble, mientras que la otra conformación no está asociada con las características de enfermedad y es soluble. La metodología de la presente invención no está limitada a las enfermedades, proteínas y cepas mencionadas. Detección de la forma hoja β de βA4

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Un aspecto de la invención comprende un procedimiento en dos etapas para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer basándose en la presencia de una forma compacta de una proteína (amiloidosis de βA4), midiendo cuantitativamente la forma hoja β de la proteína βA4 en un material de muestra, p. ej., en el cerebro o en los fluidos corporales. La muestra se divide en dos alícuotas. La primera alícuota se reticula con un soporte de plástico sólido (material polimérico de cadena larga) en conformación nativa a través de una etapa de activación química bajo condiciones no desnaturalizantes. La segunda porción de la muestra se desnaturaliza primero y luego se reticula con el soporte plástico. Ambas porciones del material de muestra reaccionan in situ con los anticuerpos marcados que preferentemente reconocen la βA4 soluble o la βA4 desnaturalizada del ser humano o de una especie animal determinada. La cantidad del anticuerpo unida a las conformaciones desnaturalizadas o nativas de la proteína βA4 se registra mediante la señal del anticuerpo secundario marcado. El exceso de la señal obtenida con la muestra desnaturalizada en comparación con ese cambio esperado en la señal obtenida con la conformación α-helicoidal nativa de la proteína βA4 es la medida de la cantidad de βA4 estructurada con hoja β en la muestra original. La fórmula desarrollada para el cálculo de contenido de βA4 se proporcionó anteriormente en relación con el cálculo de contenido de PrPSc . El diagnóstico de amiloidosis de βA4 (enfermedad de Alzheimer) se establece a través de tres procedimientos: (1) medición de muestra desnaturalizada sola y detectando el incremento en la cantidad (concentración) de βA4 total en la muestra examinada por encima de los niveles de fondo de βA4 soluble obtenidos a partir de controles normales; (2) cálculo de la relación entre señal desnaturalizada frente a nativa para anticuerpos determinados (índice de proteína) por ejemplo valores superiores a 2 para anticuerpo monoclonal 6F3D y anticuerpo secundario marcado con europio; (3) evaluación del cambio de la señal de muestra desnaturalizada en función de aquel cambio esperado en la señal para conformación α-helicoidal de βA4 como una medida de la cantidad de βA4 estructurada con hoja β infecciosa en la muestra original. La fórmula desarrollada para el cálculo de contenido de βA4 se proporcionó anteriormente. La cepa particular de βA4 también se puede determinar utilizando la misma metodología ya descrita para determinar la cepa de PrPSc en una muestra. 18

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La invención provee un método de diagnóstico directo para detectar la presencia de formas patogénicas de la proteína βA4 en compuestos farmacéuticos, tejido de autopsia o biopsia, cerebro, médula espinal, nervios periféricos, músculo, fluido cerebroespinal, sangre y componentes sanguíneos, ganglios linfáticos, y en cultivos derivados de animales o seres humanos que expresan o expresan potencialmente la proteína βA4. La invención también hace posible seguir la transición conformacional de hélice α a hoja β de la proteína βA4 o sus fragmentos de origen sintético o recombinante y proporciona un método para detectar compuestos por su capacidad de estabilizar la conformación soluble normal de la proteína βA4 y por lo tanto prevenir la conversión en proteína βA4 insoluble, patogénica y estructurada con hoja β. Los métodos típicos de desnaturalización de la muestra incluyen: (1) físico, tal como temperatura o presión hidroestática, (2) químico, tal como pH ácido o alcalino, sales caotrópicas o detergentes desnaturalizantes, y (3) combinaciones de los ya mencionados. Los métodos de acoplamiento químico o de afinidad de la proteína βA4 a un soporte plástico se describen en la literatura existente y pueden variar. Los anticuerpos utilizados en el ensayo de diagnóstico pueden ser Fab recombinante, policlonales o monoclonales y deben ser especies específicas con unión preferencial a la forma desnaturalizada o soluble de βA4, preferentemente con por lo menos una diferencia doble en la reactividad entre la βA4 estructurada con hoja β y hélice α, asumiendo la misma cantidad de antígeno. Los métodos para acoplamiento de la muestra al soporte plástico pueden variar y ser covalentes o no covalentes, tal como se describe en la literatura existente. La sensibilidad del ensayo descrito en los ejemplos se puede aumentar utilizando anticuerpos de gran afinidad, formato del tipo sándwich, inmunoprecipitación o centrifugación diferencial. No obstante, únicamente los anticuerpos que tiene una afinidad de al menos el doble para conformación desnaturalizada y comparada con la conformación de hoja β nativa de βA4 de la misma especie se utilizarán para el ensayo de diagnóstico. Los métodos de generación, purificación, marcaje y detección de anticuerpos pueden variar. Se midió la unión de anticuerpos a diferentes conformaciones de la proteína βA4 mediante fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo. Sin embargo, el sistema de detección de IgG unida a βA4 en soporte sólido in situ o en disolución puede variar y se pueden emplear métodos inmunológicos directos o indirectos, incluyendo radiomarcadores directos, fluorescencia, luminiscencia, ampliación avidina-biotina, o ensayos de enlace a enzimas con sustratos de color o luminiscentes. Ejemplos Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, una revelación y descripción completa de cómo llevar a cabo y utilizar los ensayos de la presente invención y no tienen como fin limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención, ni tampoco representar o implicar que los experimentos expuestos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se ha hecho lo posible para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) aunque deberán tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en peso, temperatura es en grados centígrados y presión es presión atmosférica o prácticamente presión atmosférica.

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Ejemplo 1 Expresión de proteínas prión recombinantes 45

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Para el desarrollo y la calibración de los ensayos de diagnóstico, se replegaron proteínas prión de hámster sirio recombinantes de secuencia 90-231 en conformaciones α-helicoidal u hoja β, como se describe en [Mehlhorn, Groth et al (1996) Biochemistry 35:5528-5537]. Se usó PCR (Perkin-Elmer) para ampliar el ADN correspondiente a diferentes porciones de la proteína prión de hámster sirio con el fin de ligarse a vectores de secreción de E. coli. Se sintetizaron varios cebadores de oligonucléotido 5’ con un sitio de restricción de Mlu 1 dentro de la secuencia de codificación C-terminal del péptido de señal STII [Lee, Moseley et al (1983)] Infect Immun 42:264-268; Picken, Mazaitis et al (1983) Infect Immun 42:269-275] y los aminoácidos iniciales de la secuencia de PrP apropiada. Se utilizó un cebador de oligonucléotido 3’ unido al extremo 3’ de PrP, un codón finalizador y un sitio de restricción Bam HI con cada uno de los oligonucléotidos 5’. Los productos ampliados con PCR se purificaron, ligaron a los vectores previamente digeridos con Mlul/Bam HI y se transformaron en DH5a. Los clones que contenían la inserción de PrP se secuenciaron y transformaron en la cepa de expresión deficiente de proteasa 27C7 (ATCC# 55244). La expresión a gran escala se llevó a cabo como se describió previamente para otras proteínas, utilizando un medio diferente [Carter, Kelley et al (1992) Biotechnology 10:163-167]; Se inocularon 500 mL de un cultivo que se desarrolló toda la noche en medio LB complementado con ampicilina, en 7 L de medio de fermentación en un fermentador aireado de 10 L (Braun, modelo E10). Se desarrollaron células a 37ºC, a una alta velocidad de agitación y se indujo la expresión a través de un medio de cultivo sin fosfato. Después de 4 hs, se agregó una disolución de glucosa al 50% a una velocidad de 1 mL/min; los niveles de glucosa se controlaron utilizando una tira reactiva de glucosa (Diastix, Miles Inc.). Se mantuvo un pH de 7,4 en toda la prueba mediante la adición automática de 10% H2 SO4 o 24% NH4 OH. El volumen final fue 10 L en el cual se logró un OD600 de ≥ 100 después de 36 hs. La E. coli se recogió por centrifugación a 10.000 x g durante 30 min y la pasta resultante se almacenó a -20ºC. Para la purificación, se resuspendieron 100 g de pasta de E. coli en 1 L de 25 mM Tris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA (tampón A). Esto se centrifugó a 10.000 x g durante 20 min y se descartó el sobrenadante que contenía las proteínas 19

ES 2 218 807 T3

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periplásmicas solubles. El sedimento se resuspendió en 1 L de tampón A, se pasó dos veces a través de un destructor celular (Microfluidics International, modelo MF110) y se centrifugó a 30.000 x g durante 1 h, después de lo cual se descartó el sobrenadante y el sedimento se lavó una vez en el tampón A y se centrifugó nuevamente a 30.000 x g durante 1 h. En esta etapa, el sedimento pudo almacenarse a -20ºC antes de la separación. Subsiguientemente, se solubilizó en 8M Gdn HCl/25 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM DTT (tampón B) y se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min para eliminar la materia insoluble restante. Se separaron alícuotas de 6 mL del sobrenadante que contenían ∼200 mg de proteína total, por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), utilizando una columna de 26 mm x 60 cm HiLoad Superdex 200 (Pharmacia), eluyendo con 6M Gdn HCl/12,5 mM Tris-HCl, pH 8,0/5mM DTT/1 mM EDTA (tampón C) a un caudal de 2 mL/min. Las fracciones enriquecidas para la proteína prión recombinante según lo identificado por SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) se mezclaron y se purificaron adicionalmente por cromatografía líquida de alta performance de fase inversa (RP-HPLC), empleando una columna C-4 de 25 mm x 25 cm (Vydac); Tampón 1: H2 O/0,1% TFA, Tampón 2: acetonitrilo/0,09% TFA, caudal 5 mL/min. Se halló la proteína rPrP recombinante en fracciones que contenían 40% acetonitrilo. Si el eluato de SEC se almacenaba a 4ºC durante varios días antes de RP-HPLC, la proteína recombinante se eluía en fracciones más tempranas que contenían solo 35% acetonitrilo. Las muestras de la proteína reducida y la forma oxidada replegada se concentraron utilizando una columna Centricon (Amicon) con un peso molecular reducido de 10.000 Da. El tampón para la proteína reducida fue 10 mM MES, pH 6,5, mientras que la forma oxidada se concentró en el tampón para repliegue anteriormente descrito. Las conformaciones de las formas oxidada replegada y reducida de la proteína SHaPrP90-231 se determinaron por espectroscopia de dicroismo circular (CD) (Fig. 1). Ejemplo 2

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Purificación de PrPc de hámster de PrPSc y normal de cerebros de hámster infectados con scrapie Ambas proteínas producidas para el Ejemplo 1 se usaron como estándares para el ensayo de prión y para establecer la sensibilidad y el alcance lineal del método de diagnóstico. La PrPc de cerebro de hámster sirio se usó para la calibración de la detección de la proteína prión y se correlacionó con los resultados obtenidos en SHaPrP90-231 recombinante en conformaciones α-helicoidales, hoja β y desnaturalizadas. La proteína PrPc se purificó tal como se describe, con algunas modificaciones menores [Pan, Stahl et al (1992) Protein Sci 1:1343-1352; Pan, Baldwin et al (1993) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 90: 10962-10966]. El contenido de proteína se determinó mediante análisis de aminoácidos. La pureza de la proteína PrPc , según lo demostrado en SDS PAGE con posterior tinción de plata y Western fue ≥ 95%.

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Se purificó PrPSc de hámster sirio estándar de una mezcla estándar de cerebros de hámster infectados con cepa Sc237 de scrapie, tal como se describe, solamente con modificaciones menores [Turk, Teplow et al (1988) Eur J Biochem 176:21-30]. La infectividad de este estándar, según lo determinado por un ensayo de tiempo de incubación en hámsteres sirio después de la inoculación intracerebral, fue de 107,3 ID50 /ml y la infectividad específica de 108,2 ID50 /mg de proteína PrPSc . No obstante, la infectividad específica puede variar de parte a parte ± 100,5 ID50 /mg. El contenido de proteína se determinó a través de un ensayo BCA, utilizando albúmina de suero bovino como un estándar. La preparación se consideró homogénea con una banda principal en SDS PAGE después de la tinción con plata y de las transferencias western. Ejemplo 3 Método para selección, marcaje y detección de anticuerpos utilizado en el ensayo

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Los protocolos y métodos para producción y caracterización de anticuerpos se describen en general en otras partes [Harlow y Lane (1998) supra: 726]. Los datos descritos en éste y en los siguientes ejemplos se generaron con anticuerpo N12 y P3 policlonal purificado de inmunoafinidad y [Safar, Ceroni et al (1990) Neurology 40: 513-517; Rogers, Serban et al (1991) J Immunol 147:3568-3574] elaborado contra la secuencia correspondiente de péptidos sintéticos 90-145 (N12) y 222-231 (P3) de PrP de Hámster sirio [Barry, Vincent et al (1988) J Immunol 140:11881193]; JS2 contra PrP 27-30 desnaturalizada de hámster sirio [Safar, Ceroni et al (1990) Neurology 40:513-517]. El desarrollo y las características del anticuerpo monoclonal 3F4 utilizado en el ensayo se describen en otras partes (Kascsak, Rubenstein et al (1987) J Virol 61:3688-3693] y se describen en la publicación internacional US 4.806.627, todas incorporadas por referencia para revelar y describir los anticuerpos que se pueden utilizar con la invención y los métodos para elaborar aquellos anticuerpos y otros relacionados. Las formas de proteína prión desnaturalizadas que reconocen Fab recombinante se desarrollaron muy recientemente [Williamson, Peretz et al (1996) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 93:7279-7282]. La SHaPrP90-231 en conformaciones en espiral aleatorias, α-helicoidales y de hoja β se acopló covalentemente a placas de poliestireno activadas con glutaraldehído y se incubó con anticuerpo primario diluido en serie. La cantidad de IgG que reaccionó con cada conformación de SHaPrP90-231 se determinó ya sea directamente con IgG 3F4 marcada con Eu o indirectamente con anticuerpo anti-ratón o anti-conejo marcado con europio, de acuerdo con protocolos usuales y se midió la señal total a través de fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo. Para el desarrollo del ensayo se seleccionaron anticuerpos con la relación de señal de conformación desnaturalizada frente a conformación hoja β de SHaPrP90-231 igual o superior a 4. 20

ES 2 218 807 T3 Ejemplo 4 Formato de ensayo competitivo y directo 5

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SHaPrP90-231 recombinante purificada, replegada en conformación α-helicoidal u hoja β se diluyó en 5% (p/v) de homogeneizado cerebral obtenido de ratón PrP0/0 y sin proteína prión. El homogeneizado cerebral se elaboró mediante tres ráfagas de 30 seg en un homogeneizador PowerGen equipado con sonda desechable plástica en TBS, pH 7,4 que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa (1 mM PMSF, 2 µg/ml de Aprotinina y 2 µg/ml de Leupeptina) y se centrifugó a 5ºC durante 5 min a 500 G en una máquina centrífuga de escritorio. El sobrenadante resultante se diluyó 1:1 en TBS con 4% (p/v) Sarcosilo final y se homogeneizó nuevamente mediante tres ráfagas de 30 seg en un homogeneizador PowerGen. Luego, el homogeneizado se mezcla con diferentes diluciones de SHaPrP90-231 recombinante en conformaciones α-helicoidales u hoja β. En un ensayo competitivo típico, el analito PrP en diferentes conformaciones se preincuba con IgG 3F4 marcada con europio y se transfiere luego a la placa de poliestireno revestida con ShaPrP90-231 recombinante en estado desnaturalizado de SDS. Los resultados del analito SHaPrP90-231 en un estado α-helicoidal y desnaturalizado (Figura 2) indican una notable diferencia tanto en los sitios de unión existentes como en la afinidad de la IgG 3F4 marcada con europio con conformaciones diferentes de la proteína prión. En el ensayo directo, cada muestra de curva de dilución se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada y designada nativa; (2) mezclada con 4M Gdn HCl final y calentada durante 5 min a 100ºC y designada desnaturalizada. Ambas muestras se diluyeron 20 veces con H2 O y se cargaron las alícuotas en una placa de poliestireno activada con glutaraldehído. Las placas, incubadas durante toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con los anticuerpos marcados con europio ya mencionados. Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de contraste suministrada por el proveedor de marcadores de europio (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Ejemplo 5

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Prueba diferencial para distintas conformaciones de SHaPrP90-231

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Los parámetros obtenidos del ensayo directo con IgG 3F4 marcada con Eu se trazaron como una función de la concentración. Los resultados obtenidos con SHaPrP90-231 en conformación α-helicoidal (Figura 3) indican una diferencia relativamente pequeña entre la señal de proteína α-helicoidal y desnaturalizada. El límite de sensibilidad para la PrP desnaturalizada en presencia de 5% homogeneizado cerebral es ≤ 1 ng/ml y el alcance lineal sobre 3 órdenes de magnitud. En los experimentos con la forma hoja β de SHaPrP90-231 (Figura 4), la IgG 3F4 marcada con Eu se une fuertemente a una forma desnaturalizada de la proteína. En contraste, la reactividad con la forma hoja β nativa de la proteína solo excede marginalmente el fondo, incluso a altas concentraciones de la proteína. Cuando los resultados se expresan como la relación de la fluorescencia de estados desnaturalizados frente a nativos de la proteína prión (Figuras 3 y 4), la relación para conformación α-helicoidal es 1-1,8 y para SHaPrP90-231 recombinante en conformación hoja β es 5-50. Este efecto se utilizó además para analizar muestras de PrP de conformación desconocida, donde el pequeño incremento en señal de IgG 3F4 marcada con Eu después de la desnaturalización de PrP es una característica de la conformación α-helicoidal. En contraste, el gran incremento en la señal por encima del cambio esperado para una conformación α-helicoidal es el diagnóstico de la PrP90-231 en conformación hoja β (Figuras 3 y 4). Los resultados se expresan en dos formas diferentes: (1) como una relación (Figura 6), donde el índice ≤ 1,8 para SHaPrP90-231 recombinante indica que la proteína estaba originalmente en toda la conformación hélice α y el índice > 1,8 indica la presencia de conformación hoja β; (2) como una fórmula que se muestra en la presente y se ilustra en el Ejemplo 11, donde el incremento en exceso de señal por encima de aquel esperado para la conformación α-helicoidal es proporcionado a la cantidad de SHaPrP90-231 en la conformación hoja β. Ejemplo 6

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Ensayo cuantitativo para PrPc Y SHaPrP90-231 recombinante

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La calibración de entrada/salida de ShaPrP90-231 desnaturalizada, tanto en conformaciones α-helicoidales como hoja β, fue lineal dentro de tres órdenes de magnitud y proporciona un alto grado de certeza (Figura 5) para el ensayo. También se ensayó la PrPc , diluida en serie en homogeneizados de ratón PrP0/0 que proporcionó resultados con alto grado de certeza dentro del alcance lineal de 3 órdenes de magnitud. Luego, el ensayo se calibró mediante PrPSc infecciosa purificada en presencia de 5% de homogeneizado cerebral PrP0/0 . La calibración con PrPSc proporcionó una respuesta lineal dentro de un alcance similar. Al utilizar el método diferencial, la relación entre la señal de PrPc cerebral nativa frente a desnaturalizada fue para IgG 3F4 monoclonal marcada con Eu 2,2 (Figura 7), para P3 y N12 monoclonal 1,0. La calibración para PrPSc produjo una relación ≥ 20 (Figura 8) para IgG 3F4 marcada con Eu y >4 para anticuerpos N12 y P3. Al utilizar las fórmulas desarrolladas que se muestran en la presente, toda la PrPc estuvo en alcance total en la conformación α-helicoidal. En 21

ES 2 218 807 T3 contraste, la cantidad calculada de PrPSc en conformación hoja β infecciosa estuvo, como se anticipó, próxima a la cantidad total de proteína prión. Ejemplo 7 5

Diagnóstico de enfermedad producida por priones basada en incremento de proteína prión total por encima de niveles fisiológicos de PRPC 10

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La medición cuantitativa precisa de PrP total, evaluando exclusivamente la señal de muestra desnaturalizada, produjo un valor promedio de PrPc en 5% de homogeneizados cerebrales de Hámster sirio normal de 5,0 ± 0,2 µg/ml (Media ± SEM) (Figura 9). La dilución en serie de homogeneizados cerebrales de hámster infectado con scrapie (Cepa Sc237) en homogeneizado cerebral de ratón PrP0/0 produjo valores de PrP total 36,0±4 µg/ml (Figura 10) con amplio alcance de la medición. Dado que la única condición conocida para acumulación de la proteína prión es la acumulación de la forma PrPSc infecciosa, los niveles aumentados de PrP total en la muestra probada indican la presencia de priones. Este ensayo de priones se puede utilizar: (1) en modo directo en muestras de cerebro, tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos después de la determinación de valores de control normales; o (2) en modo indirecto, detectando la elevación de PrP total en el cerebro de animales experimentales inoculados intracerebralmente con la muestra probada de producto farmacéutico, fluido corporal o tejido que se presume contiene priones. Ejemplo 8 Diagnóstico de enfermedad producida por priones basado en el aumento de relación de señal entre prp desnaturalizada frente a nativa (“índice de prión”)

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35

La relación entre la afinidad de anticuerpos hacia proteína PrPc de cerebro de hámster sirio desnaturalizada frente a nativa se encuentra en el alcance de concentración amplio para IgG 3F4 marcada con Eu entre 0,8-2,2. La relación en el cerebro infectado con scrapie se encuentra en todo el alcance lineal por encima de esos valores (Figura 11). El “índice de prión” es un indicador relativo de la presencia de PrPSc infecciosa y por consiguiente de priones. Este modo de ensayo de priones se está utilizando: (1) en modo directo en muestras de tejido, cerebro, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos después de la determinación del índice para controles normales; o (2) en modo indirecto, detectando el índice elevado de proteína prión desnaturalizada/nativa en el cerebro de animales experimentales inoculados intracerebralmente con muestras probadas de tejido, fluido corporal o compuestos farmacéuticos que se presume contienen priones. Ejemplo 9 Diagnóstico de enfermedad producida por priones a partir del ensayo diferencial, calculando el contenido de PrPSc

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Al utilizar el ensayo directo y las fórmulas provistas en la presente, no existe cantidad detectable de forma hoja β de PrPSc en homogeneizado cerebral normal. A la inversa, la mayoría de la PrP total en cerebro de hámster infectado con scrapie se debió a la acumulación de PrPSc (Figuras 9 y 10). La correlación entre la valoración de priones y la PrPSc calculada a partir de la fórmula posee un límite lineal y de sensibilidad de ∼103 ID50 /ml (Figura 11). La fórmula produce un indicador cuantitativo de la presencia de proteína PrP en conformación anormal que se correlaciona cuantitativamente con la valoración de priones. Este modo de ensayo de priones se utiliza: (1) en modo directo en muestras de cerebro, tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos; o (2) en modo indirecto, calculando el contenido de PrPSc en cerebros de animales experimentales inoculados intracerebralmente con muestras probadas de tejido, fluido corporal o productos farmacéuticos que se presume contienen priones. Después de establecer una curva de calibración entre la valoración de priones y la PrPSc , es posible estimar la valoración directamente a partir del contenido de PrPSc . Ejemplo 10 Medición de conversión de hélice a A hoja B de proteína PrP in vitro para detectar generación de priones de novo y agentes terapéuticos potenciales de enfermedad

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Las alícuotas de una disolución de 100 µg/ml de la forma α-helicoidal de SHaPrP90-231 o SHaPrP29-231 recombinante, o péptidos correspondientes recombinantes o sintéticos de la proteína prión se incuban en 20 mM tampón de acetato de Na, pH 5,5, durante 24 hs a 37ºC con 10−3 -10−6 M concentraciones de glicerol, ciclodextrinas, heparina, sulfato de heparina, Rojo Congo, éster de colesterol, dimiristoilfosfatidilcolina. Las muestras se dividen luego en dos alícuotas: (1) no tratada, designada nativa; (2) mezclada con 4M Gdn HCl final y calentada durante 5 min a 100ºC, designada desnaturalizada. Ambas muestras se diluyen 20 veces con H2 O y las alícuotas se cargan en una placa de poliestireno activada con glutaraldehído. Las placas, incubadas toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con IgG 3F4 marcada con europio. Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de contraste proporcionada por el proveedor del marcador de europio (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia). El grado de conversión de conformación α-helicoidal a hoja β de la PrP se calcula a partir del “índice de prión” o alternativamente a partir de las fórmulas provistas en la presente. Algunos compuestos que inhiben la conversión 22

ES 2 218 807 T3 estabilizando aparentemente la conformación del tipo nativo de la proteína prión pueden poseer potencial terapéutico in vivo. Ejemplo 11 5

El método de ensayo se demuestra en el siguiente ejemplo con homogeneizado cerebral de hámster sirio infectado con scrapie, diluido 4 veces 10

a) Cada placa se calibra con un estándar interno que consiste en cinco puntos de dilución de SHaPrP90-231 desnaturalizada. La fluorescencia de resolución en el tiempo (TRF) de PrP total se desarrolla con IgG 3F4 marcada con Eu y los valores de la fluorescencia de resolución en el tiempo se trazan como una función de la concentración de PrP (Figura 4). Los datos se ajustan dentro de una ecuación lineal o polinomial, utilizando el método menos cuadrado y se selecciona la mejor función para el cálculo de PrP desnaturalizada. PrP[µg/ml] = −0, 22935 + 0, 00026567*[TRF]+

15

0, 0000000012255*[TRF]2

(1)

20

b) En el resto de la placa, se incubaron alícuotas nativas y desnaturalizadas de homogeneizado cerebral de hámster sirio infectado con scrapie, diluidas 4 veces y reticuladas con el soporte plástico, con IgG 3F4 marcada con Eu. El contenido de PrP total se calculó de acuerdo con la fórmula anteriormente expuesta, a partir de la señal de fluorescencia de la muestra desnaturalizada: 25

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50

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Concentración de homogeneizado de cerebro infectado con scrapie [%]

TRF nativa [cpm]

TRF desnaturalizada [cpm]

PrPc+Sc [µg/ml]

5

4214

109814

43,7

1,25

1381

30804

9,1

0,3125

1070

11240

2,9

Se calcula la relación de las señales de fluorescencia entre muestras nativas y desnaturalizadas: Concentración de homogeneizado de cerebro infectado con scrapie [%]

TRF nativa [cpm]

TRF desnaturalizada [cpm]

Relación desnaturalizada/ nativa

5

4214

109814

26,1

1,25

1381

30804

22,3

0,3125

1070

11240

10,5

El valor normal de PrPc determinado a partir de homogeneizado de cerebro de hámster normal es 2,2; los valores superiores a 2,2 se consideran anormales e indican la presencia de PrPSc . a) El exceso de señal de fluorescencia en función de aquel esperado para PrP α-helicoidal en la transición de estado nativo a desnaturalizado es una medida de la cantidad de PrPSc y se calcula de acuerdo con las fórmulas provistas:

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∆Fβn−d = Fd − (Fd *fαn−d )

65

(2)

donde f = es el valor máximo del factor para la señal de fluorescencia en la transición del estado de PrPc nativo a desnaturalizado; Fd es la fluorescencia de la muestra desnaturalizada; y Fn es la fluorescencia de la muestra nativa. La cantidad de PrPSc se calcula luego a partir de ∆Fβn−d y la ecuación (1):

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ES 2 218 807 T3

5

10

15

Concentración de homogeneizado de cerebro infectado con scrapie (%)

∆TRFβn−d nativa [cpm]

PrPSc [µg/ml]

5

100543,2

38,9

1,25

27765,8

8,1

0,3125

8886

2,2

El valor positivo calculado para la forma hoja β de proteína prión indica la presencia de PrPSc . Ejemplo 12

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30

Estándares de formas solubles (α-helicoidal) e insolubles (hoja β) de proteína βA4 Las formas solubles de βA4 (1-40) y βA4 (1-42) se obtuvieron de Bachem (Torrance, CA). Se solubilizó una porción del péptido liofilizado nuevo en PBS, pH 7,4, que contenía 20% (v/v) de HFIP (hexafluoroisopropanol; 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol) o 1% (p/v) SDS (dodecilsulfato de sodio) en concentración de proteína final de 50 µM; esta proteína se designó “soluble” y se almacenó a -80ºC hasta su uso. Una segunda porción del péptido se resuspendió en PBS, pH 7,4, en la concentración final ≥ 350 µM y se incubó durante 72 hs a 37ºC. Esta porción de la proteína se designó “insoluble” y se almacenó hasta su uso a -80ºC. Se utilizaron ambas proteínas como estándares para el desarrollo del ensayo y para establecer el alcance lineal y la sensibilidad. La espectroscopia de CD (dicroismo circular) (Figura 12) demostró que la proteína soluble tiene una conformación α-helicoidal (véase la línea llena de la Figura 12). En contraste, la proteína βA4 tratada durante 72 hs a 37ºC se convirtió completamente en conformación hoja β (véase la línea de rayas de la Figura 12). Método de selección, marcaje y detección de anticuerpos utilizado en el ensayo

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Los protocolos y métodos de producción y caracterización de anticuerpos se describen en general en otras partes [Harlow y Lane (1988) supra:726]. Los datos descritos en éste y en los siguientes ejemplos se generaron con anticuerpo monoclonal 6F3D, desarrollado contra péptido sintético correspondiente a la secuencia de proteína βA4 humana (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). No obstante, también podrían utilizarse anticuerpos policlonales elaborados contra análogos sintéticos de proteína βA4. También se podrían utilizar formas desnaturalizadas que reconocen Fab recombinante de proteína βA4. La proteína βA4 en conformaciones α-helicoidales, hoja β y en espiral aleatorias se acoplaron covalentemente a placas de poliestireno activadas con glutaraldehído y se incubaron con anticuerpo primario diluido en serie. La cantidad de IgG que reacciona con cada conformación de βA4 se determinó con anticuerpo anti-ratón o anti-conejo marcado con europio, de acuerdo con protocolos usuales y la señal total se midió por fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo. Para desarrollar el ensayo, se seleccionaron anticuerpos con la relación de señal de la conformación desnaturalizada frente a hoja β de βA4 igual o superior a 2. Formato de ensayo directo y competitivo En el ensayo directo, cada muestra de la curva de dilución de formas α-helicoidal y hoja β de proteína βA4 se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada (designada nativa); y (2) mezclada con 4M Gdn.HCl/1% Sarcosilo final y se calentó durante 5 min a 100ºC (designada “desnaturalizada”). Ambas muestras se diluyeron 20 veces con H2 O y las alícuotas se cargaron en una placa de poliestireno activada con 0,2% de glutaraldehído durante 2 hs. Las placas, incubadas durante toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). Las muestras se lavaron luego tres veces con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con anticuerpos primarios contra proteína βA4 (6F3D, Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). Las muestras se lavaron y luego se desarrollaron con anticuerpos secundarios marcados con europio contra IgG de ratón (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de contraste (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Los resultados para el analito indican una diferencia notable tanto en sitios de unión como en IgG anti-βA4 de afinidad con diferentes conformaciones de proteína βA4. El método podría llevarse a cabo utilizando un ensayo competitivo, en el que el analito βA4 en diferentes conformaciones se preincuba con IgG anti-βA4 y luego se transfiere a la placa de poliestireno revestida con proteína βA4 sintética en estado desnaturalizado Gdn.HCl.

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ES 2 218 807 T3 Prueba diferencial para distintas conformaciones de βA4

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Los parámetros obtenidos del ensayo directo con IgG 6F3D anti-βA4 de se trazan como una función de la concentración. Los resultados obtenidos con βA4 en conformación β-helicoidal (Figura 13) muestran una gran diferencia entre la señal de proteína de hoja β y desnaturalizada. El límite de sensibilidad para βA4 desnaturalizada es ≤ 1 µg/ml y el alcance lineal es más de 2 órdenes de magnitud. En los experimentos con la forma α-helicoidal de βA4 (Figura 14), la IgG 6F3D se une igual de fuerte para ambas formas nativa y desnaturalizada de la proteína. En contraste, la reactividad con la forma nativa de hoja β de la proteína solo excede marginalmente el fondo, incluso a altas concentraciones de la proteína. Cuando los resultados se expresan como una relación de la fluorescencia de los estados desnaturalizado frente a nativo de βA4 (Figura 15), la relación para conformación α-helicoidal es ≤ 1 y para βA4 en conformación hoja β está en un intervalo de concentración ≥ 1,5. Este efecto se utilizó además para analizar muestras de βA4 de conformación desconocida en las que el incremento pequeño en señal de IgG 3F4 marcada con Eu, después de la desnaturalización de βA4, es una característica de conformación α-helicoidal. En contraste, el gran incremento en la señal por encima del cambio esperado para la conformación α-helicoidal es el diagnóstico de la conformación hoja β (Figura 15). Los resultados se pueden expresar en dos formas diferentes: (1) como una relación (Figura 15), en la que el índice ≤ 1,0 para βA4 indica que la proteína estaba originalmente en toda la conformación hélice α y el índice > 1,5 indica la presencia de conformación hoja β; (2) como para la fórmula anteriormente expuesta, en la que el incremento en exceso de señal por encima de aquel esperado para una conformación α-helicoidal es proporcionado a la cantidad de βA4 en la conformación hoja β. Ejemplo 13

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Diagnóstico de enfermedad de alzheimer basado en incremento de proteína βA4 total por encima de los niveles fisiológicos La medición cuantitativa precisa de βA4 total, evaluando exclusivamente la señal de muestra desnaturalizada, es aparentemente más precisa que la medición de βA4 en conformación nativa (Figuras 13 y 14). El valor normal de la proteína puede ocultar una porción significativa de la forma hoja β de proteína βA4, debido a la reactividad inferior de esta forma con anticuerpos. Ya que la única condición conocida para acumulación de proteína βA4 es la acumulación de la forma hoja β de βA4 en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer, los niveles aumentados de βA4 total en la muestra probada indican la presencia de formas patogénicas de βA4. Este ensayo de βA4 se puede utilizar en muestras de tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos que se presume contienen las formas hoja β de βA4. Diagnóstico de enfermedad de alzheimer basado en incremento de relación de señal entre βa4 desnaturalizada frente a nativa (“índice amiloide de βA4”)

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La relación entre afinidad de anticuerpos hacia la proteína βA4 humana nativa frente a desnaturalizada se encuentra en el intervalo de concentración amplio para IgG 6F3D, entre 0,8-1,0. La relación para βA4 de hoja β se encuentra en todo el alcance lineal por encima de esos valores (Figura 15). El “índice amiloide de βA4” produce un indicador relativo de la presencia de βA4 en hoja β insoluble patogénica. Este modo de ensayo de βA4 se puede usar en modo directo en muestras de cerebro, tejido, compuestos farmacéuticos o fluidos corporales después de la determinación del índice para controles normales. Diagnóstico de enfermedad de alzheimer a partir del ensayo diferencial, calculando el contenido de βA4

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Al utilizar el ensayo directo y la fórmula anteriormente expuesta, se puede calcular la cantidad de formas patogénicas de proteína βA4 en hoja β en muestras de cerebro, tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos. Ejemplo 14

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Medición de conversión de hélice α a hoja β de proteína βA4 in vitro para detectar agentes terapéuticos potenciales de enfermedad Las alícuotas de una disolución 350 µM de la forma α-helicoidal de βA4 sintética (1-40) o péptidos sintéticos o recombinantes correspondientes de la proteína βA4 se incuban en PBS, pH 7,4, durante 72 hs a 37ºC con 10−3 10−6 M concentraciones de glicerol, ciclodextrinas, heparina, sulfato de heparina, Rojo Congo, éster de colesterol, dimiristoilfosfatidilcolina. Las muestras se dividen luego en dos alícuotas: (1) no tratada, que contiene 1% Sarcosilo y designada “nativa”; y (2) mezclada con 4M Gdn HCl/1% Sarcosilo final y calentada durante 5 min a 100ºC, designada “desnaturalizada”. Ambas muestras se diluyen 20 veces con H2 O y las alícuotas se cargan en una placa de poliestireno activada con glutaraldehído. Las placas, incubadas durante toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con IgG 6F3D y luego con anticuerpo anti-ratón marcado con Eu. Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de contraste y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia). 25

ES 2 218 807 T3 El grado de conversión de conformación α-helicoidal a hoja β de βA4 se calcula a partir del “índice amiloide” (Figura 15) o alternativamente a partir de la fórmula anteriormente expuesta. Cualquier compuesto que inhibe la conversión estabilizando la conformación α-helicoidal de la proteína βA4 puede tener potencial terapéutico in vivo, previniendo la formación amiloide madura. 5

Ejemplo 15 Estándares de formas normales y amiloides de TTR 10

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Se obtuvieron formas solubles de TTR de Sigma Chemical Comp. Una porción de la proteína se solubilizó en 100 mM tampón KCl, pH 7,4, en concentración de proteína final de 0,5 mg/ml; esta proteína se designó “normal” y se almacenó a -80ºC hasta su uso. La segunda porción de la proteína se convirtió a amiloide, tal como se describe [Lai, Colon et al (1996) Biochemistry 35(20):6470-82]. En breve, la proteína se resuspendió en 100 mM de tampón KCl, que contenía 50 mM acetato de sodio, pH 4,4, a una concentración de proteína de 0,2 mg/ml y se incubó durante 72 hs a 37ºC. A esta porción de la proteína se la designó “amiloide” y se almacenó hasta su uso a -80ºC. El ensayo de unión de Rojo Congo y la turbidimetría verificaron la conversión eficiente a amiloide [Lai, Colon et al (1996) Biochemistry 35(20):6470-82]. Ambas proteínas se utilizaron como estándares para el desarrollo del ensayo y para establecer la sensibilidad y el alcance lineal. Formato de ensayo directo Los protocolos y métodos de la producción y caracterización de anticuerpos se describen en general en otras partes. Los datos descritos en éste y en los siguientes ejemplos se generaron con anticuerpo policlonal existente en plaza, desarrollado contra TTR humana purificada (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY).

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En el ensayo directo, cada muestra de proteína tomada a partir de la curva de dilución de formas normales y amiloides de TTR se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada y designada “nativa”; (2) mezclada con 4M Gdn HCl/1% Sarcosilo final y calentada durante 5 min a 100ºC y designada “desnaturalizada”. Ambas muestras se diluyeron 20 veces con H2 O y las alícuotas se cargaron en una placa de poliestireno activada con 0,2% glutaraldehído durante 2 hs. Las placas, incubadas toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía 0,05% (v/v) de Tween 20 y se incubaron con anticuerpos primarios contra TTR (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY), se lavaron y luego se evaporaron con anticuerpos secundarios marcados con europio contra IgG de conejo (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Las placas se revelaron después de siete etapas de lavado adicionales en disolución de contraste y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Ejemplo 16

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Diagnóstico de SSA y FAP basado en aumento de la relación de señal entre TTR desnaturalizada frente a nativa (“índice amiloide de TTR”) La relación entre la afinidad de anticuerpos hacia la forma desnaturalizada frente a la nativa de TTR humana normal se encuentra en el amplio intervalo de concentración para el anticuerpo policlonal 1-3:3. La relación para la forma amiloide de TTR se encuentra en el alcance lineal total entre 0,7 y 1,0 (Figura 18). El “índice amiloide de TTR” produce un indicador relativo de la presencia de TTR formadora de amiloide patogénica e insoluble. Este modo de ensayo de TTR se está utilizando en modo directo en muestras de cerebro, tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos después de la determinación del índice para controles normales. Diagnóstico de SSA y FAP a partir del ensayo diferencial, calculando el contenido amiloide de TTR

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Al utilizar la fórmula del ensayo directo (Figura 19), se puede calcular la cantidad de forma amiloide de TTR en muestras de tejido, nervio periférico, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos. En la fórmula (Figura 19), el incremento inferior al esperado de la señal para la conformación normal es proporcional a la cantidad de TTR en la conformación amiloide. 55

Ejemplo 17 Medición de conversión normal a amiloide de TTR in vitro para detectar agentes terapéuticos potenciales de enfermedad 60

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Las alícuotas de una disolución de 0,2 mg/ml de la forma normal de TTR sintética, o los péptidos recombinantes o sintéticos correspondientes de la TTR, se incuban en 100 mM tampón de KCl, que contiene 50 mM de acetato de sodio, pH 4,4, durante 72 hs a 37ºC con 10−3 - 10−6 M concentraciones de los compuestos orgánicos probados. Las muestras se dividen luego en dos alícuotas: (1) no tratada, que contiene 1% Sarcosilo y designada “nativa”; (2) mezclada con 4M Gdn HCl/1% Sarcosilo final y calentada durante 5 min a 100ºC, designada “desnaturalizada”. Ambas muestras se diluyen 20 veces con H2 O y las alícuotas se cargan en una placa de poliestireno activada con glutaraldehído. Las placas, incubadas toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con 26

ES 2 218 807 T3 anticuerpo anti-TTR policlonal (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) y luego anticuerpo anti-conejo marcado con Eu. Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de contraste y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia). 5

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El grado de conversión de conformación normal a amiloide de TTR se calcula a partir del “índice amiloide” (Figura 18) o alternativamente a partir de la fórmula (Figura 19). Cualquier compuesto que inhibe la conversión estabilizando la conformación normal de TTR puede tener potencial terapéutico in vivo, previniendo la formación de amiloide madura. Ejemplo 18 Tipificación de aislamientos (cepas) de prión en hámster sirio

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Se infectaron hámsteres sirio (LVG/LAK) mediante inyección intracerebral de los siguientes aislamientos de scrapie adaptados a hámster, es decir, se infectaron diferentes grupos de hámsteres con cepas individuales de priones, de la siguiente manera: Drowsy (Dy), 139H, Hyper (Hy), Me7, MT-C5 y Sc237. Se aplicó eutanasia a los animales en estadios terminales de enfermedad y sus cerebros se congelaron y almacenaron inmediatamente a -70ºC. Los cerebros se homogeneizaron en hielo con 3 golpes de 30 seg en un homogeneizador PowerGen (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) en PBS, pH 7,4, que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa (PMSF 5mM, Aprotinina y Leupeptina 4 µg/ml). 10% (p/v) de los homogeneizados resultantes se centrifugó durante 5 min a 500 g en una máquina centrífuga de escritorio. El sobrenadante se mezcló 1:1 con 4% Sarcosilo en PBS, pH 7,4 y se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada y designada nativa; (2) mezclada con una concentración final 4M Gdn Hcl y calentada durante 5 min a 80100ºC y designada desnaturalizada. Ambas muestras se diluyeron 20 veces con H2 O y las alícuotas se cargaron en una placa de poliestireno activada durante 1 h con 0,2% glutaraldehído en PBS. Las placas, incubadas toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía 0,05% (v/v) de Tween 20 y se incubaron durante 2 hs con anticuerpo 3F4 monoclonal marcado con Europio. Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de contraste proporcionada por el proveedor del marcador de Europio (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turki, Finlandia). El contenido de PrPSc y el “índice de prión” (relación de unión de anticuerpo a proteína PrP desnaturalizada-nativa) se calcularon como se describe en los Ejemplos 11 y 8 y se registraron en coordenadas xy, como se muestra en la Figura 25. Se presume que otras muestras probadas y que resultaron en los mismos cálculos podrían tener la misma cepa de prión. La presente invención se muestra y describe aquí en lo que se considera las realizaciones más prácticas y preferidas. Se reconoce, no obstante, que se pueden efectuar desviaciones, las cuales estarán dentro del alcance de la invención y que las modificaciones serán obvias para aquellas personas con experiencia en la técnica al leer la presente descripción.

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ES 2 218 807 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un método para determinar la presencia de una forma patogénica de una proteína seleccionada en una muestra que comprende una primera conformación no patogénica de la proteína y una segunda conformación patogénica de la proteína, comprendiendo el método: poner en contacto una primera porción de la muestra con un elemento enlazante, teniendo dicho elemento enlazante una afinidad mayor hacia la primera conformación que hacia la segunda conformación y determinar una primera concentración; tratar una segunda porción de la muestra para cambiar la segunda conformación a una conformación que tiene una afinidad de unión superior hacia el elemento enlazante;

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poner en contacto la segunda porción tratada de la muestra con el elemento enlazante para determinar una segunda concentración; ajustar la segunda concentración para proveer una concentración ajustada, cuyo ajuste compensa la afinidad incrementada de la proteína en la primera conformación hacia el elemento enlazante resultante del tratamiento; y

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comparar la primera concentración con la concentración ajustada para determinar la presencia de proteína en la segunda conformación patogénica. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se obtiene de un animal que no exhibe síntomas de enfermedad; en el que la primera concentración y la segunda concentración se determinan utilizando fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo;

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en el que además la segunda conformación patogénica de la proteína está presente en la muestra en una concentración de 1 x 103 partículas/ml o menos; en el que dicha proteína se selecciona entre el grupo que consiste en proteína βA4; proteína PrP y transtiretina.

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3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína está unida a una superficie sólida y en el que el tratamiento comprende someter dicha segunda porción de la muestra a un tratamiento seleccionado entre el grupo que consiste en calor, presión y desnaturalización química, suficiente como para convertir al menos 2% de cualquier proteína en dicha segunda forma, a dicha forma enlazante; en el que dicho elemento enlazante comprende un anticuerpo marcado que tiene una afinidad hacia dicha primera conformación por lo menos cuatro veces superior a su afinidad hacia dicha segunda conformación. 4. Un método para determinar la presencia de una forma patogénica de una proteína seleccionada en una muestra que comprende una primera conformación no patogénica de la proteína y una segunda conformación patogénica de la proteína, comprendiendo el método: tratar la muestra para convertir la segunda conformación de la proteína en una conformación enlazante que tiene una afinidad hacia un elemento enlazante superior a la segunda conformación;

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poner en contacto la muestra tratada con el elemento enlazante para determinar una concentración; ajustar la concentración para proveer una concentración ajustada que compensa la afinidad incrementada de la primera conformación de la proteína al elemento enlazante resultante del tratamiento; y

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comparar dicha primera concentración ajustada con una concentración conocida seleccionada entre el grupo que consiste en una concentración de control y una concentración estándar predeterminada para determinar la presencia de la proteína en la segunda conformación en la muestra. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho elemento enlazante comprende un anticuerpo marcado y en el que la concentración se determina utilizando citometría de flujo; en el que la concentración ajustada se compara con una concentración conocida determinada de una muestra de control no infectada tratada o se compara con una concentración conocida predeterminada de una muestra tratada de una población no infectada;

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en el que además el anticuerpo es 3F4; en el que también la proteína en la segunda conformación está presente en la muestra en una concentración de 1 28

ES 2 218 807 T3 x 103 moléculas de proteína o menos por ml, y en el que la proteína en la primera conformación está presente en la muestra en una concentración de 1 x 106 moléculas de proteína o más por ml. 5

6. Un método para identificar un compuesto que tiene una actividad terapéutica contra una enfermedad mediada por priones, donde dicha enfermedad mediada por priones está caracterizada por una proteína que tiene una primera forma y una segunda forma que difieren en conformación, estando una de dichas formas asociada con dicha enfermedad mediada por priones, comprendiendo dicho método: proveer un animal susceptible a una enfermedad mediada por priones;

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administrar un compuesto de prueba a dicho animal; inducir dicha enfermedad mediada por priones; 15

obtener una muestra de dicho animal; poner en contacto una primera porción de muestra que contiene dicha proteína con un elemento enlazante, teniendo dicho elemento enlazante una afinidad mayor hacia dicha primera forma de dicha proteína que dicha segunda forma, y determinar una primera concentración;

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tratar una segunda porción de la muestra para convertir dicha segunda forma en una forma enlazante que tenga una afinidad mayor hacia dicho elemento enlazante; poner en contacto la segunda porción tratada con el elemento enlazante para determinar una segunda concentración; 25

ajustar la segunda concentración para proveer una concentración ajustada que compensa la afinidad incrementada de la proteína en la primera forma hacia el elemento enlazante resultante del tratamiento; y 30

comparar la primera concentración con la concentración ajustada para determinar la concentración de la proteína en la segunda forma y deducir el efecto del compuesto de prueba sobre la concentración de proteína en la segunda forma. 7. Un método para determinar una cepa de una proteína patogénica en una muestra que comprende:

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determinar la concentración de una conformación patogénica de una proteína en una muestra; tratar la muestra en un modo tal como para cambiar la conformación patogénica de la proteína a una conformación que tiene una afinidad de unión mayor hacia un elemento enlazante que la conformación patogénica;

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determinar el efecto del tratamiento de la proteína en la conformación patogénica; y comparar el efecto determinado con un efecto estándar conocido para una cepa conocida a una concentración conocida y deducir de este modo la cepa de la conformación patogénica de la proteína en la muestra.

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8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la concentración de la conformación patogénica y el efecto por el tratamiento se determinan utilizando un anticuerpo marcado como el elemento enlazante y utilizando fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo; en el que la conformación patogénica de la proteína es PrPSc y la PrPSc se trata con proteinasa K.

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9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6 y 7, en el que el elemento enlazante es un anticuerpo. 55

10. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera conformación al menos diez veces mayor que su afinidad hacia dicha segunda conformación. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera conformación al menos treinta veces mayor que su afinidad hacia dicha segunda conformación.

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12. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera conformación al menos cuatro veces mayor que su afinidad hacia dicha segunda conformación. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera conformación al menos treinta veces mayor que su afinidad hacia dicha segunda conformación.

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