Espectro clínico-mutacional y estudios de correlación genotipo-fenotipo en la población española afectada de lipofuscinosis neuronal ceroidea María del Socorro Pérez Poyato
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ESPECTRO CLÍNICO - MUTACIONAL Y ESTUDIOS DE CORRELACIÓN GENOTIPO - FENOTIPO EN LA POBLACIÓN ESPAÑOLA AFECTADA DE LIPOFUSCINOSIS NEURONAL CEROIDEA
María del Socorro Pérez Poyato
Progama de Doctorat Medicina Facultat de Medicina Universitat de Barcelona
Progama de Doctorat Medicina
ESPECTRO CLÍNICO - MUTACIONAL Y ESTUDIOS DE CORRELACIÓN GENOTIPO - FENOTIPO EN LA POBLACION ESPAÑOLA AFECTADA DE LIPOFUSCINOSIS NEURONAL CEROIDEA
Memoria presentada por María del Socorro Pérez Poyato para optar al grado de Doctora en Medicina y Cirugía por la Universidad de Barcelona
Realizada bajo la dirección de Prof.a Dra. Mercé Pineda Marfa Dra. Montserrat Milá Recasens
Barcelona, Julio de 2012 Programa de Doctorat Medicina Facultat de Medicina Universitat de Barcelona
Trabajo realizado en el Hospital Sant Joan de Déu y en el Hospital Clínic Barcelona España
La interesada
María del Socorro Pérez Poyato
A la memoria de mi padre y a mi madre, por su gran amor A Inés, el mejor regalo de mi vida A Regina, por compartir sus inquietudes y sueños conmigo A mi hermana, siempre a mi lado
Agradecimientos A todos los pacientes y sus familias por haber colaborado en este estudio.
A la Asociación Española de Ceroidolipofuscinosis, especialmente a Elena López Davadillo, por facilitarme la información y el contacto con las familias.
A los compañeros del Servicio de Neurología del Hospital Sant Joan de Déu de Barcelona, quienes me han aportado la mejor formación profesional y con quienes he compartido momentos inolvidables de mi vida personal.
A la Dra. Mª Josep Coll Rosell, por su colaboración en la realización de los estudios de las enzimas PPT1 y TPP1 en el Instituto de Bioquímica Clínica de Barcelona.
A la Dra. Judith Armstrong Moron, por su desinteresada dedicación y participación en los estudios de genética molecular.
Al Prof. Dr. Isidre Ferrer Abizanda, por sus siempre atentas y rápidas respuestas a las diferentes inquietudes surgidas durante el desarrollo de esta memoria. Su amabilidad, disponibilidad y generosidad han enriquecido el trabajo realizado.
A la Dra. Montserrat Milá Recasens, directora de esta tesis, por aportar a mi formación los conocimientos en genética molecular, por su apoyo y confianza en la realización de este trabajo.
A los Drs. Rafael Camino León y Eduardo López Laso, compañeros de la Unidad de Neuropediatría del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba, por el ánimo y la sincera amistad que siempre me han brindado. De forma muy especial, agradezco a la Prof.a Dra. Mercé Pineda Marfa los años de conocimiento y sabiduría empleados en mi formación asistencial e investigadora. Me ha distinguido al dirigir esta tesis y me ha dado la oportunidad de trabajar a su lado. Gracias por estimular vocaciones, por ser verdadera maestra.
ÍNDICE x
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….1 1. Las lipofuscinosis neuronal ceroidea………………………………………5 1.1. Concepto general 1.2. Perspectiva histórica 1.3. Clasificación y nomenclatura 1.4. Epidemiología 1.5. Anatomía patológica 2. Fenotipos clínicos en la edad pediátrica…………………………………….19 2.1. Forma infantil (CLN1) 2.2. Forma infantil tardía (CLN2) 2.3. Forma juvenil (CLN3) 2.4. Formas variantes infantil tardía 2.4.1. Variante finlandesa (CLN5) 2.4.2. Variante juvenil precoz (CLN6) 2.4.3. Variante turca (CLN7) 2.4.4. Epilepsia progresiva con retraso mental y variante (CLN8) 2.5. Forma congénita (CLN10) 3. Exámenes complementarios…………………………………………………31 3.1. Electroencefalograma 3.2. Potenciales evocados visuales y electrorretinograma 3.3. Resonancia nuclear magnética 3.3.1. Espectroscopía 4. Diagnóstico………………………………………………………………….37
5. Tratamiento…………………………………………………………………..43 5.1. Terapia de reemplazamiento enzimático 5.2. Terapia génica 5.3. Terapia farmacológica 5.3.1. Tratamiento antiepiléptico 5.3.2. Tratamiento de los síntomas extrapiramidales 5.3.3. Tratamiento nutricional x
JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA E HIPÓTESIS……………….47
x
OBJETIVOS……………………………………………………………………….51
x
PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………..55 1. Pacientes y diseño del estudio …………………..…………………………..57 2. Métodos para el estudio neuropatológico………………..…………………..60 3. Métodos bioquímicos………………………………...……………………...60 4. Métodos para el estudio molecular……..………………….………………..61 5. Aspectos éticos………………………………………..……………………..62 6. Análisis estadístico……………………………………..……………………62
x
RESULTADOS…………………………………………………………………….65 1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración clínica de una serie de pacientes españoles………….………….…….……...67 2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles…….…77 3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y estudios genéticos en pacientes españoles…..………….…………91
4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea………………………….107 5. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea……………119 x
DISCUSIÓN CONJUNTA …………………………………………………...…..123
x
CONCLUSIONES ……………………………………………………...………...131
x
BIBLIOGRAFÍA……………………….................................................................135
x ANEXO…………………………………………………………………………...171
ÍNDICE DE TABLAS Y/O FIGURAS x Figura 1. Localización de las proteínas en las lipofuscinosis neuronal ceroidea…....6 x Tabla 1. Características moleculares, enzimáticas y ultraestructurales de las diferentes formas clínicas de lipofuscinosis neuronal ceroidea………..…………...12
x Tabla 2. Resumen de la nueva y antigua nomenclatura de las lipofuscinosis neuronal eroidea………………………………..…………..……………………....14
x Figura 2. Biopsia muscular de un paciente con la forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea………………………………………….………...17
x Figuras 3, 4, 5, 6 y 7. Algoritmos para el diagnóstico de las lipofuscinosis neuronal ceroidea…………………………………………………...……………………..….39
x Tabla 3. Ítems de la base de datos clínica de las lipofuscinosis neuronal ceroidea...59 x Figura 8. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea………...121
ABREVIATURAS ABC
Actividad de base cerebral
ATP
Adenosina trifosfato
BHE
Barrera hemato encefálica
CBZ
Carbamacepina
CTSD
Catepsina D
CV
Cuerpos curvilíneos
CZP
Clonazepam
EEG
Electroencefalograma
EPMR
Forma epilepsia progresiva con retraso mental de lipofuscinosis neuronal ceroidea
ERG
Electroretinograma
ERT
Terapia de reemplazamiento enzimático
FAEs
Fármacos antiepilépticos
FP GROD
Finger print o huella dactilar Depósitos granulares osmofílicos
IAF
Idiocia amaurótica familiar
LNC
Lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCs
Lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCA
Forma del adulto de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCC
Forma congénita de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCI
Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCIT
Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea
LNCJ
Forma juvenil de lipofucinosis neuronal ceroidea
LTG
Lamotrigina
MFSD8
Superfamilia facilitadora principal de las proteínas de transporte lisosomal
NAA
N-acetil aspartato
PAS
Acido periódico de Schiff
PB PEG
Fenobarbital Gastrostomía endoscópica percutánea
PEV
Potencial evocado visual
PHT
Fenitoína
PPT1
Palmitoil protein tioesterasa 1
RL
Inclusiones o cuerpos rectilíneos
RNM
Resonancia nuclear magnética
RNMs
Resonancia nuclear magnética con espectroscopía
SAPs
Saposinas o proteínas activadoras de los esfingolípidos
SB
Sustancia blanca cerebral
SCMAS SNC
Subunidad c de adenosina trifosfato sintasa mitocondrial Sistema nervioso central
TC
Tomografía computarizada
TPP1
Tripeptidil peptidasa 1
vLNCIT Fin
Forma variante infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea (CLN8)
vLNCIT
Forma variante infantil tardía finlandesa de lipofuscinosis neuronal ceroidea
vLNCITJuv
Forma variante infantil tardía juvenil precoz de lipofuscinosis neuronal ceroidea
Tur
vLNCIT
vLNCJ
Forma variante infantil tardía turca de lipofuscinosis neuronal ceroidea Forma variante juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea
VGB
Vigabatrina
VPA
Ácido valproico
INTRODUCCIÓN 1.
Las lipofuscinosis neuronal ceroidea 1.1. Concepto general 1.2. Perspectiva histórica 1.3. Clasificación y nomenclatura 1.4. Epidemiología 1.5. Anatomía patológica
2.
Fenotipos clínicos en la edad pediátrica 2.1. Forma infantil (CLN1) 2.2. Forma infantil tardía (CLN2) 2.3. Forma juvenil (CLN3) 2.4. Formas variantes infantil tardía 2.4.1. Variante finlandesa (CLN5) 2.4.2. Variante juvenil precoz (CLN6) 2.4.3. Variante turca (CLN7) 2.4.4. Epilepsia progresiva con retraso mental y variante (CLN8) 2.5. Forma congénita (CLN10)
3.
Exámenes complementarios 3.1. Electroencefalograma 3.2. Potenciales evocados visuales y electrorretinograma 3.3. Resonancia nuclear magnética 3.3.1. Espectroscopía
4.
Diagnóstico
1
5.
Tratamiento 5.1. Terapia de reemplazamiento enzimático 5.2. Terapia génica 5.3. Terapia farmacológica 5.3.1. Tratamiento antiepiléptico 5.3.2. Tratamiento de los síntomas extrapiramidales 5.3.3. Tratamiento nutricional
2
Las enfermedades que se estudian en esta tesis doctoral constituyen uno de los grupos de patologías neurodegenerativas de herencia autosómica recesiva más frecuentes en la infancia. Presentan gran variabilidad en la edad de inicio y comparten amplio espectro fenotípico: epilepsia, déficit visual, deterioro motor y cognitivo progresivos
con
fallecimiento
a
edad
precoz.
Se
caracterizan
por
ser
ultraestructuralmente y genéticamente heterogéneas. En las dos últimas décadas, los importantes avances en la investigación genético-molecular han logrado la identificación de ocho genes responsables de las diferentes formas clínicas en la edad pediátrica (CLN10/CTSD, CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8) y actualmente el análisis mutacional proporciona el diagnóstico definitivo de cada una de estas entidades y permite establecer correlaciones genotipo-fenotipo. La baja prevalencia de este grupo de enfermedades junto con la heterogeneidad clínico-genética que las caracteriza hace que su diagnóstico plantee gran dificultad y, en ocasiones se realice en estadios avanzados de la enfermedad. El conocimiento detallado de la historia natural de la enfermedad ayuda a predecir el curso clínico y a seleccionar una estrategia diagnóstica adecuada para cada una de las formas clínicas. Estas consideraciones son prioritarias para evitar un retraso en el diagnóstico, permitir una intervención lo más precozmente posible, reducir la morbilidad, el grado de discapacidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes y sus familias. Actualmente al no existir tratamiento curativo para este grupo de enfermedades, el conocimiento de la historia natural de la enfermedad será fundamental para desarrollar una intervención terapeútica curativa en el futuro. Los estudios de correlación genotipo-fenotipo, imprescindibles para una correcta caracterización de los pacientes, son la base de un consejo genético adecuado.
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1. Las lipofuscinosis neuronal ceroidea 1.1. Concepto general Las lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCs), conocidas también como enfermedad
de
Batten,
constituyen
uno
de
los
grupos
de
enfermedades
neurodegenerativas de herencia autosómica recesiva más frecuentes en la infancia (Goebel y Sharp, 1998). Son enfermedades de depósito lisosomal, caracterizadas desde el punto de vista anatomopatológico por un acúmulo de ceroidolipofuscina (material de depósito autofluorescente) en diferentes células del organismo, principalmente del cerebro y la retina. Comparten características histopatológicas: gránulos PAS y Sudán negro B positivos, resistentes a los solventes lipídicos, acumulados en el citoplasma de las células nerviosas, y en menor extensión en otros tipos celulares, resultando en degeneración y pérdida neuronal selectiva (Haltia, 2006). Los síntomas comunes a los diferentes tipos de LNCs son: déficit visual, deterioro cognitivo y motor progresivo (ataxia, espasticidad), epilepsia y evolución a estado vegetativo con fallecimiento a edad precoz (Haltia, 2003). El examen oftalmológico pone de manifiesto degeneración macular, acúmulos de pigmentos en la retina periférica, estrechez del árbol vascular y atrofia óptica (Spalton et al. 1980, Hainsworth et al. 2009). Inicialmente, las LNCs fueron clasificadas en diferentes formas clínicas (infantil, infantil tardía, juvenil y de adulto) según la edad de inicio de la sintomatología, el orden de aparición de los síntomas y la morfología ultraestructural del material depositado en los diferentes tejidos analizados (Elleder et al. 1999, Santavouri et al. 2000, Haltia 2003). Posteriormente, a principios de los años 90, la descripción de las primeras formas variantes infantil tardía junto con la investigación en los campos de la
5
bioquímica y la genética molecular, permitieron la identificación de cinco genes asociados a cada forma clínica en la edad pediátrica (CLN1, infantil; CLN2, infantil tardía; CLN3, juvenil; CLN5 y CLN8, variantes infantil tardía) y el descubrimiento de las proteínas codificadas por los genes CLN1/PPT1 y CLN2/TPP1. En la última década del siglo XX y la primera del XXI, el espectro genéticomolecular de este grupo de enfermedades se ha ampliado con la identificación de los genes CLN6, CLN7 y CLN10 reconociéndose hasta el momento, ocho genes responsables de los diferentes fenotipos clínicos en la infancia: CLN10/CTSD, CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8 (Mole 2006, Siintola et al. 2006a, Williams et al. 2006, Siintola et al. 2007) y la localización celular de las proteínas alteradas en este grupo de enfermedades (Figura 1).
Figura 1. Localización de las proteínas en las LNCs. CLN1, CLN2, CLN3, CLN5, CLN7 y CLN10 están localizadas en los lisosomas, mientras que CLN6 y CLN8 se encuentran en el retículo endoplásmico. Dependiendo del nivel de expresión y el tipo celular, pequeñas cantidades de proteína pueden encontrarse en otros compartimentos como CLN8 en el complejo retículo endoplásmico-Golgi o CLN3 en los endosomas y membrana plasmática. e. E: endosoma precoz; I.E: endosoma tardío;
Jalanko and Braulke 2009 6
Actualmente el estudio genético basado en el análisis molecular proporciona el diagnóstico definitivo de las LNCs y ha permitido asociar el defecto genético a cada una de las formas clínicas: congénita, LNCC (CLN10); infantil, LNCI (CLN1); infantil tardía, LNCIT (CLN2); juvenil, LNCJ (CLN3); variante infantil tardía finlandesa, vLNCITFin (CLN5); variante infantil tardía juvenil precoz, vLNCITJuv (CLN6); variante infantil tardía turca, vLNCITTur (CLN7) y variante infantil tardía epilepsia del norte con retraso mental, EPMR - variante infantil tardía (CLN8) (Kousi et al. 2012). En las LNCs el depósito de material proteico en los lisosomas de los diferentes grupos celulares presenta un patrón característico que varía según la forma clínica. La ultraestructura de dicho material observado al microscopio electrónico se corresponde generalmente con depósitos granulares osmofílicos (GROD) en la LNCI y LNCC, cuerpos curvilíneos (CV) en la LNCIT, e inclusiones celulares tipo huella dactilar o “fingerprint” (FP) en la LNCJ (Goebel, 1996). Las inclusiones celulares suelen ser de tipo mixto (GROD, CV, RL, FP) en las formas variantes infantil tardía (CLN5, CLN6, CLN7, CLN8) (Mole et al. 2005). Las LNCs son enfermedades que presentan amplia variabilidad clínica y se caracterizan por ser genéticamente heterogéneas. Las mutaciones en un mismo gen originan fenotipos diferentes: mutaciones comunes se asocian a un fenotipo clásico, mientras que mutaciones menos frecuentes pueden originar un fenotipo variante. Además, existen mutaciones asociadas a familias de un área geográfica determinada. Por tanto, el espectro genético que caracteriza a este grupo de enfermedades comprende heterogeneidad clínica con fenotipos más graves y benignos en función de cómo el defecto genético afecte a la función de la proteína (Goebel y Wisniewski, 2004). Los estudios de correlación genotipo-fenotipo
permitirán profundizar en el
diagnóstico de este grupo de enfermedades mediante la identificación de las mutaciones
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y la realización de una adecuada caracterización clínica de los pacientes. Existe un registro internacional
de pacientes para el estudio de dicha correlación
(http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml). No existe tratamiento curativo en el momento actual, para este grupo de enfermedades. El tratamiento farmacológico, la rehabilitación, la fisioterapia y la terapia ocupacional pueden aliviar algunos síntomas de la enfermedad y son parte importante de las medidas paliativas. Aunque el tratamiento farmacológico es necesario, es primordial el soporte y la ayuda a las familias. 1.2. Perspectiva histórica La primera descripción de las LNCs corresponde al Dr. Otto Christian Stengel en 1826, médico noruego que identificó a cuatro hermanos (2 niños y 2 niñas) con epilepsia, pérdida de visión y deterioro mental progresivos a los 6 años de edad. En 1896 el Dr. Sachs, neurólogo americano, introdujo el término “idocia amaurótica familiar” (IAF) para referirse a un grupo de enfermedades de inicio en la infancia caracterizadas por ceguera, deterioro psicomotor y fallecimiento a edad precoz. Las observaciones más concretas fueron realizadas por Batten (1903) al identificar pacientes con “degeneración familiar cerebral y alteraciones maculares”, que presentaban un inicio más tardío y clínicamente diferente de los descritos con IAF. En 1905 esta distinción fue confirmada por Spielmeyer, al describir detalladamente tres hermanos con “una forma especial de IAF”, y por Vogt, que identificó pacientes con la “forma juvenil de IAF” (Spielmeyer, Vogt, 1905). A pesar de que los estudios emprendidos por Batten y Spielmeyer apuntaran a una clara distinción entre las formas de IAF y la enfermedad de Tay-Sachs, fueron consideradas como variantes de una misma entidad, apoyados por los estudios anatomopatológicos de Schaffer (1905) en los que el material lipídico acumulado fue
8
encontrado en las células nerviosas. En 1914, Batten describió las alteraciones en el sistema nervioso central de un niño afectado con IAF, correspondiéndose con una entidad clínica diferente. En los estudios de Batten (1903, 1914), IAF de inicio infantil tardío y juvenil aún no estaban diferenciadas. En 1908 Jansky describió una forma diferente de IAF con atrofia cerebelosa. En una publicación un año más tarde, Vogt observó que los hermanos con IAF de inicio tardío manifestaban los síntomas de la enfermedad en el mismo orden cronológico, pero existían diferencias en el curso clínico entre diferentes familias. Bielchowsky (1913) describió tres hermanos con crisis epilépticas a los 3.5 años, rápido deterioro mental y ceguera proponiendo que se trataba de un inicio infantil tardío de IAF, distinto de IAF con inicio juvenil. Los pacientes con IAF de inicio infantil fueron incluidos en el grupo de pacientes con IAF juvenil, y no fue hasta 1931 que Sjögren diferenció en 115 pacientes, según la clínica, el tipo infantil del juvenil. La distinción de IAF de inicio infantil de las formas de inicio infantil tardío ocurrió gracias al aislamiento de gangliósidos de los cerebros de pacientes con IAF de tipo infantil, conocido como enfermedad de TaySachs (Klenk, 1939). En 1962, Svennerholm identificó el gangliósido GM2 como la principal sustancia acumulada en la forma infantil de IAF y verificó su ausencia en la forma juvenil. Las investigaciones de Klenk y Svennerholm indicaban que el grupo de IAF era bioquímicamente heterogéneo. En 1963, Zeman y Alpert publicaron la existencia de lipopigmentos autofluorescentes en pacientes con IAF de inicio infantil tardío, lo que definitivamente diferenció a los pacientes con IAF de los pacientes con otras enfermedades de depósito, incluyendo la enfermedad de Tay-Sachs. Zeman y Dyken (1969) acuñaron el término de “neuronal ceroido lipofuscinosis”, basándose en las características histoquímicas y
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ultraestructurales del material depositado. Demostraron que este material, parecido al ceroide y a la lipofuscina, era resistente a los solventes lipídicos y mostraba un patrón característico curvilíneo (infantil tardío) o “firnger print” / huella dactilar (juvenil). Así se diferenciaron definitivamente este grupo de enfermedades de las gangliosidosis. Después de la descripción por Haltia y Santavuori en 1973 de un nuevo tipo infantil de LNC, caracterizado por la presencia de material de depósito granular osmofílico (GRODs), las LNCs fueron clasificadas en diferentes formas clínicas basadas en la edad de inicio y en la ultraestructura de los depósitos: forma infantil, infantil tardía y juvenil. Esta clasificación no tuvo en cuenta los escasos pacientes afectos de la forma congénita, descrita en 1941 por Norman y Wood. En los últimos años se han descrito nuevas formas “atípicas” o “variantes” ampliándose el espectro clínico de de las LNCs. Actualmente el término “lipofuscinosis neuronal ceroidea” es ampliamente utilizado aunque el término genérico “enfermedad de Batten” es común en USA. 1.3. Clasificación y nomenclatura Inicialmente las LNCs, al ser reconocidas como grupo de enfermedades, se clasificaron en tres formas clínicas principales, según la edad de inicio, el orden de aparición de los síntomas y el material depositado en diferentes tejidos celulares: infantil, infantil tardía y juvenil. En algunos países eran conocidas por sus epónimos: Haltia-Santavuori
(LNCI),
Jansky-Bielschowsky
(LNCIT),
Spielmeyer-Vogt
o
enfermedad de Batten (LNCJ). Al principio de la década de los 90, la identificación de los genes CLN1, CLN2, CLN3, CLN5 y CLN8 permitió su asociación con cada una de las tres formas clínicas principales (LNCI, LNCIT y LNCJ) y con las primeras formas variantes infantil tardía (vLNCITFin y EPMR) respectivamente.
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El uso de epónimos está siendo abandonado y la existencia de las formas variantes infantil tardía ha llegado a ser ampliamente reconocida, ya que la correlación entre el defecto genético y la edad de inicio no es absoluta. En los últimos años del siglo XX y primeros del XXI, la identificación de los genes CLN6, CLN7 y CLN10 ha permitido clasificar las LNCs en ocho enfermedades diferentes (Tabla 1).
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Santavuori
Haltia -
Epónimo
256730
OMIM
Nº
CLN1
Gen
1p32
Loci
(1991)
Järvelä et al
Referencia
Exón 4
Arg122Trp
Localización
Mutación común /
Arg208STOP
Intrón 5
Tahvanainen
(2007)
Siintöla et al
(1997)
Sharp et al
(1994)
Savukoski et al
Exón 2
Arg24Gly
Exón 10
Thr294Lys
Exón 3
E72X
Exón 4
Tyr392STOP
(1989)
Eiberg et al
Intrón 6-8
1.02kb delección
(2006)
Siintöla et al. CTSD
CLN3
CLN8
MFSD8
CLN6
CLN5
TPP1
PPT1
Enzima
lisosoma
Interior del
lisosomal
Membrana
Golgi
endoplásmico
Retículo
lisosomal
Membrana
endoplásmico
Retículo
Sistema lisosomal
lisosoma
Interior del
lisosoma
Interior del
Localización
GROD
SCMAS
SAPs
proteico
CV
SCMAS
Material
GROD,RL, CV, FP
SCMAS
Fenotipo
GROD,RL, CV, FP
SCMAS
FP
SAPs
SCMAS
SCMAS
GROD
FP, CV
GROD, CV
GROD,RL, CV, FP
ultraestructural
Tabla 1. Características moleculares, enzimáticas y ultraestructurales de las diferentes formas clínicas de lipofuscinosis neuronal ceroidea
Fenotipo clínico
INFANTIL (LNCI) Infantil Tardía (LNCIT)
(1997)
(1994)
Exón 6
Sharp et al
IVS5-1G>C
Exón 5
13q21.1-q32
11p15
CLN5
15q21-23
CLN2
256731
CLN6
204500
Arg151STOP
Jansky –
Juvenil (vLNCJ)
Bielschowsky
601780
4q28.1-28.2
8p23
CLN7
CLN8
610951
600143
16p12
(2004) CLN3
11p15.5
Topcu et al.
204200
CLN10
Variante
SpielmyerVogt- Sjögren Congénita
610127
Infantil Tardía
retraso mental
Progresiva con
Epilepsia
Variante Turca
Cavanagh
Lake-
Finlandesa
Variante
Clásica
(vLNCITJuv)
(vLNCITFin)
(LNCIT)
Adulto (LNCA)
INFANTIL TARDIA (vLNCITTur)
(EPMR)
(vLNCIT)
JUVENIL (LNCJ)
CONGENITA (LNCC)
12
Este grupo de enfermedades presenta heterogeneidad genética (mutaciones en diferentes genes pueden originar similares fenotipos clínicos: mutaciones en los genes CLN1 y CLN3 causan LNCJ), heterogeneidad alélica (diferentes mutaciones en el mismo gen pueden originar diferentes fenotipos clínicos: mutaciones en el gen CLN1 originan LNC con edad de inicio desde la infancia a la edad adulta) y, por último, pueden ser fenotípicamente heterogéneas incluso dentro de la misma familia (la misma mutación en el mismo gen puede originar diferentes síntomas y progresión de la enfermedad). Estos progresos y avances en el conocimiento de las LNCs han requerido una revisión del tradicional sistema de clasificación y en el año 2009 surge un cambio en la nomenclatura y una nueva clasificación de las LNCs. La nueva nomenclatura está basada en el genotipo y considera las características clínico-patológicas de la enfermedad (Tabla 2). La nueva clasificación utiliza un sistema axial en la que el gen mutado denota el subtipo de enfermedad, seguido de la presentación clínica y características ultraestructurales, como sigue: Eje 1: gen afectado (CLN1, CLN2..), Eje 2: análisis mutacional, Eje 3: fenotipo bioquímico, Eje 4: fenotipo clínico, Eje 5: estudio ultraestructural, Eje 6: capacidad funcional del paciente, Eje 7: otras consideraciones (factores genéticos o ambientales que pueden afectar al inicio o evolución de la enfermedad) http://www.ucl.ac.uk/ncl/newnomenclature.shtml
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Tabla 2. Resumen de la nueva y antigua nomenclatura de las lipofuscinosis neuronal ceroidea
GEN
OMIM
EPONIMO
ENFERMEDAD
NOMBRE ABREVIADO
PPT1/CLN1
256730
Haltia-Santavuori
CLN1, infantil
LNCI
CLN1, infantil tardía CLN1, juvenil CLN1, adulto
LNCJ / GROD
CLN2, infantil tardía
LNCIT
TPP1/CLN2
204500
Jansky-Bielschowsky
CLN2, juvenil CLN2, infantil CLN3
204200
Spielmeyer-Sjögren
CLN3, juvenil
LNCJ
CLN3, prolongada CLN3, infantil CLN5
256731
CLN6
601780
Variante infantil tardía Finlandesa
CLN5, variante infantil tardía
vLNCIT
CLN5, juvenil CLN5, adulto CLN5, infantil CLN6, variante infantil tardía
vLNCIT
CLN6, adulto
Kufs tipo A vLNCIT
Variante infantil tardía
CLN7, variante infantil tardía CLN7, juvenil CLN8, variante infantil tardía
Epilepsia del Norte con retraso mental
CLN8, EPMR
EPMR
CLN10, congénita
LNCC
Lake-Cavanagh variante juvenil precoz o variante infantil tardía india
MFSD8/CLN7
610951
CLN8
600143
CTSD/ CLN10
610127
Congénita
????
609055
Variante juvenil
Variante infantil tardía turca
vLNCIT
CLN10, juvenil CLN9, variante juvenil
vLNCJ
Kousi et al. 2012
14
1.4. Epidemiología Las lipofuscinosis neuronal ceroidea son enfermedades que presentan una distribución mundial y una incidencia de 1/12 500 nacimientos (Rider y Rider, 1988). En Newfoundland (Canadá), la incidencia es de 13.6/100 000 nacimientos, similar a la de Finlandia: 13/100 000 nacimientos vivos (Moore et al. 2008). En la República Checa la incidencia es de 1.3 / 100 000 (Elleder et al. 1997). La prevalencia puede variar dependiendo de la etnia o el país de procedencia siendo muy alta en Finlandia y en países del norte de Europa (Uvebrant y Hagberg, 1997). La LNCI predomina en Finlandia con una incidencia de 1/20 000 nacimientos vivos y una frecuencia de portadores 1/70 (Santavuori et al. 1993). La incidencia de la LNCIT ha sido calculada en diferentes poblaciones siendo la más alta la encontrada en Newfounland: 9/100 000 nacimientos vivos (Moore et al. 2008) mientras que en el Oeste de Alemania es de 0.46/100 000 nacimientos (Claussen et al. 1992). En países del norte de Europa como Suecia, se ha descrito una prevalencia es de 0.43/millón de habitantes (Uvebrant y Hagberg, 1997). La LNCJ es a nivel mundial la forma clínica más frecuente (Goebel y Wisniewski, 2004). La incidencia en el Oeste de Alemania es de 0.71/100 000 nacimientos (Claussen et al. 1992), en Italia es de 0.20/100 000 (Cardona y Rossati, 1995) y en países del norte de Europa como Suecia es de 2.2/100 000 nacimientos vivos (Uvebrant y Hagberg, 1997). La LNCJ es más frecuente que LNCIT en España (PérezPoyato et al. 2011) y Portugal (42,3% y 3.8% respectivamente) (Texeira et al. 2003a) y menos frecuente en la República Checa (Elleder et al. 1997). La vLNCITFin
fue inicialmente descrita en Finlandia, identificándose
posteriormente en familias procedentes de otros países como Colombia, Portugal, Italia o España (Pérez-Poyato et al. 2012b). La vLNCITJuv presenta una alta incidencia en
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familias procedentes de la República Checa de origen Romano (Elleder et al. 1997) y en familias de Costa Rica de descendencia española (Gao et al. 2002). 1.5. Anatomía patológica Las LNCs se caracterizan por un acúmulo intralisosomal de lipopigmentos autofluorescentes en el sistema nervioso central y en tejidos no neuronales, principalmente la retina. A nivel celular existe una activación de los astrocitos con pérdida neuronal en el sistema nervioso central (Cooper et al. 2006) y de las células de la retina lo que origina progresiva atrofia cerebral, cerebelosa y degeneración retiniana. El material acumulado corresponde a proteínas y otros compuestos como fosfolípidos, oligosacáridos dolicol y ubiquinona. El principal material de depósito está formado por proteínas activadoras de los esfingolípidos o saposinas (SAPs) (Tynelä et al. 1993) y por la subunidad c de ATP sintasa mitocondrial (SCMAS) (Hall et al. 1991, Palmer et al. 1992). Las SAPs se observan en la forma congénita e infantil, mientras que SCMAS se encuentran en las restantes formas clínicas de LNCs. El material depositado presenta una morfología característica a nivel ultraestructural: granular, curvilínea, rectilínea o de huella dactilar (Elleder et al.. 1999) que predomina en cada forma clínica pero no es específica, ya que pueden observarse diferentes inclusiones en una misma entidad. Para la visualización de dichas inclusiones mediante el estudio de microscopía electrónica es necesario realizar biopsia de tejidos como piel, conjuntiva, músculo esquelético, mucosa rectal o apendicular (Rapola y Haltia 1973, Rapola et al. 1984) (Figura 2).
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CLN2: late infantile NCL: Jansky-Bielchowsky disease
A
C Musc ular biopsy: curvilinear bodies (clb) englobed by a ly sosomal membrane (arrows ) in muscle fibres (A and C) and endothelial cells (B).mb: basal membrane
B
Figura 2. Biopsia muscular de un paciente con la forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea (cortesía del Prof. Dr. I. Ferrer Abizanda).
El examen ultraestructural permite la visualización de las inclusiones en los linfocitos de sangre periférica, pero al estar presentes sólo en una minoría de los linfocitos, es aconsejable confirmar el diagnóstico mediante la realización de una biopsia (piel, conjuntiva, apéndice, músculo, etc). La piel es el tejido más adecuado ya que es accesible y contiene la glándula sudorípara ecrina, cuyo tipo celular es el ideal para el diagnóstico anatomopatológico. La biopsia debe realizarse con una profundidad de 3 mm en un lugar donde abunden las glándulas sudoríparas como por ejemplo el antebrazo
o
la
parte
interna
del
brazo,
excluyendo
la
región
axilar
http://www.ucl.ac.uk/ncl/diagnostic_approach.shtml .
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2. Fenotipos clínicos en la edad pediátrica El espectro clínico-molecular de las LNCs, constituido inicialmente por las tres formas clínicas principales: LNCI (CLN1), LNCIT (CLN2) y LNCJ (CLN3), se ha ido ampliando en las dos últimas décadas con la descripción de las formas variantes infantil tardía: finlandesa, vLNCITFin (CLN5); juvenil precoz, vLNCITJuv (CLN6); turca vLNCITTur (CLN7); epilepsia del norte con retraso mental, EPMR, variante infantil tardía, (CLN8) y de la forma congénita, LNCC (CLN10). 2.1. Forma infantil (CLN1) La forma infantil (LNCI; enfermedad de Haltia-Santavuori) es frecuente en Finlandia donde presenta una incidencia de 1/20 000 nacimientos (Santavuori et al. 1993). Se inicia entre los 8-18 meses de edad (Santavuori et al. 1973, 1974) con retraso psicomotor y progresa con déficit visual y crisis epilépticas hacia el final del segundo año de vida. En la exploración neurológica los pacientes presentan irritabilidad, hipotonía generalizada, desaceleración del perímetro cefálico y en ocasiones, estereotipias manuales similares al Síndrome de Rett. El deterioro clínico es muy rápido y a los tres años de edad los niños están ciegos, espásticos y en estado vegetativo. El fallecimiento normalmente ocurre entre los 8-13 años de edad (Santavuori, 1988). La LNCI está causada por el déficit de la enzima lisosomal palmitoil-protein tioesterasa 1 (PPT1) (Vesa et al. 1995), hidrolasa ácida lisosomal con capacidad de hidrolizar las uniones covalentes entre los ácidos grasos (palmitato) y las proteínas Sacetiladas (Camp y Hofmann, 1993). La enzima PPT1 es codificada por el gen CLN1 (MIM #256730) que se localiza en el cromosoma 1p32 (Järvela et al. 1991) y contiene 9 exones.
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Las mutaciones en el gen CLN1/PPT1 están asociadas con un inicio de la enfermedad desde la infancia hasta la edad adulta (Hofmann et al. 1999a, Wisniewski et al. 2000, Mole et al. 2005), originando además de la forma infantil, los fenotipos infantil tardío (Wisniewski et al. 1998c, Waliany et al. 2000, Bonsignore et al. 2006, Simonati et al. 2009) y juvenil (Mitchinson et al. 1998).Todos los pacientes con mutaciones en el gen CLN1 presentan déficit de la enzima PPT1 y depósitos granulares osmofílicos (GROD) a nivel ultraestructural (Rapola y Haltia 1973, Hoffamn et al. 2002). La mayoría de las mutaciones identificadas en el gen CLN1 causan LNCI y el curso clínico de estos pacientes está relacionado con el tipo de mutación. Las mutaciones que originan pérdida de proteína o proteína truncante resultan en un inicio más precoz y más rápida progresión de la enfermedad (Das et al. 1998). Algunas mutaciones en el gen CLN1 son más frecuentes según el país de procedencia. En Finlandia, el 90% de los pacientes presentan la mutación missense c.364A>T p.R122W en homocigosis dando lugar a inactividad del enzima (Vesa et al. 1995; Mole, Williams y Goebel 2005) mientras que la mutación c.451C>T p.R151X es más frecuente en pacientes de diferentes orígenes étnicos y está asociada con un fenotipo severo cuando se presenta en estado homocigoto (Das et al. 1998, Munroe et al. 1998, Hofmann et al. 1999a). 2.2. Forma infantil tardía (CLN2) La forma infantil tardía (LNCIT; enfermedad de Jansky-Bielchowsky) fue descrita por Jansky (1908) y Bielchowsky (1913), es poco frecuente en Finlandia y predomina en otras poblaciones del norte de Europa (Williams et al. 1999a). La enfermedad se inicia entre los 2-4 años con cualquier tipo de crisis epilépticas (Lavrov et al. 2002), siendo las crisis mioclónicas las más características y refractarias al
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tratamiento. Algunas veces el retraso del lenguaje puede preceder a la epilepsia. La regresión del desarrollo psicomotor con pérdida de deambulación autónoma y del lenguaje
ocurre a los 4-5 años junto con ataxia, disartria y deterioro cognitivo
(Williams et al. 1999a). El déficit visual conduce a la ceguera a los 5-6 años de edad y los pacientes fallecen entre los 6-15 años (Wisniewski et al. 2001, Haltia 2003). Existen escalas de discapacidad diseñadas específicamente para valorar el progresivo deterioro clínico de estos enfermos (Steinfeld et al. 2002, Worgall et al. 2007). La LNCIT está producida por el déficit de
la enzima lisosomal tripeptidil
peptidasa 1 (TPP1) (Sleat et al. 1997), componente de una familia de serinacarboxylproteinasas, cuya función es eliminar el aminoácido terminal de las proteínas sometidas a degradación lysosomal (Vines y Warburton 1998) favoreciendo el acúmulo de la subunidad c de ATP sintasa mitocondrial (Ezaki et al. 2000). La enzima TPP1 es codificada por el gen CLN2 (MIM #204500) que se localiza en el cromosoma 11p15 (Sharp et al. 1997) y contiene 13 exones. La mayoría de las mutaciones en el gen CLN2/TPP1 originan pérdida total de actividad enzimática y están asociadas con el fenotipo clásico. Otros pacientes presentan un fenotipo juvenil con curso clínico más benigno (Hartikainen et al. 1999, Wisnieski et al. 1999, Bessa et al. 2008, Elleder et al. 2008, Kohan et al. 2009) y se han publicado tres pacientes que iniciaron la enfermedad en el primer año de vida (Simonati et al. 2000, Ju et al. 2002), así la heterogeneidad clínico-genética de esta enfermedad ha quedado demostrada (Zhong et al. 2000). El principal marcador ultraestructural de la LNCIT asociada a mutaciones en el gen CLN2 son los cuerpos curvilíneos (CV), aunque también se observan inclusiones de tipo mixto con CV y FP en la biopsia de algunos pacientes con fenotipo juvenil (Wisniewski et al. 1999).
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El espectro mutacional del gen CLN2 incluye dos mutaciones particularmente comunes a nivel mundial, la mutación que afecta al splicing c.509-1G>A y la mutación sin sentido c.622C>T p.R208X; ambas acontecen en heterocigosis con otras mutaciones en el 60-78% de los pacientes con LNCIT (Zhong et al. 1998a, Sleat et al. 1999). La mutación c.851G>T p.G284V es muy prevalente en la población
procedente de
Newfoundland (Moore et al. 2008) observándose en el 55% de las familias canadienses (Ju W et al. 2002). 2.3. Forma juvenil (CLN3) La forma Juvenil de LNC (LNCJ) es reconocida en las descripciones de Stengel (1826), Batten (1903), Spielmeyer (1905), Vogt (1909) y Sjögren (1931) y también se denomina enfermedad de Batten o Spielmeyer-Vogt-Sjögren. Es la más prevalente en Estados Unidos y en los países del norte de Europa (Uvebrant y Hagber 1997, Wisniewski et al. 1998b). Los pacientes con LNCJ inician la enfermedad entre los 4-7 años de edad con déficit visual (Marshall et al. 2005). El deterioro en las habilidades cognitivas y de lenguaje ocurre hacia los 10 años de edad, coincidiendo con el inicio de la epilepsia. Las crisis epilépticas más frecuentes son tónico-clónico generalizadas, aunque también se observan crisis mioclónicas y de tipo parcial (Aberg et al. 2000). Los signos piramidales, extrapiramidales y la ataxia aparecen en la adolescencia. Otros síntomas como labilidad emocional y los trastornos del sueño completan el cuadro clínico en la segunda década de la vida. La supervivencia es variable entre los 16-35 años de edad (Hofman et al. 1999b). La LNCJ está causada por mutaciones en el gen CLN3 (MIM #204200) que se localiza en el cromosoma 16p12 (Eiberg et al. 1989, Gardiner et al. 1990) y contiene 15 exones. La delección c.461-280_677+382del966 (deleción 1.02-kb) ocurre en el 80-
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85% de los alelos mutados del gen CLN3 (The International Batten Disease Consortium 1995) y origina una proteína truncada de 181 aminoácidos que elimina los exones 7-8, cuya función es actualmente desconocida (Järvelä et al. 1999). Los pacientes con mutaciones en el gen CLN3 presentan inclusiones FP o una combinación de FP y CV a nivel ultraestructural y, generalmente linfocitos vacuolados en el frotis de sangre periférica. El curso clínico y la gravedad de la LNCJ pueden ser diferentes dependiendo de la combinación entre las diferentes mutaciones y la delección 1.02-kb en el gen CLN3. Los pacientes homocigotos para la delección 1.02-kb presentan generalmente el fenotipo clásico de LNCJ (Munroe et al. 1997), mientras que los pacientes heterocigotos compuestos para la delección 1.02-kb y otra mutación en el gen CLN3 pueden presentar un fenotipo variante con una progresión más lenta y curso clínico más benigno de la enfermedad (Lauronen et al. 1999, Pérez-Poyato et al. 2011). Algunas mutaciones missense que acontecen en heterocigosis con la deleción 1.02-kb y que se asocian a un curso clínico prolongado LNCJ son: c.302T>C p.L101P, c.509T>C p.L170P (Munroe et al. 1997) y c.883G>A p.E295K, ésta última ha sido descrita en pacientes con déficit visual y que permanecen neurológicamente asintomáticos durante décadas de la vida (Wisniewski et al. 1998a, Zhong et al. 1998b Arberg et al. 2009). Se ha publicado un paciente heterocigoto compuesto para la delección 1.02-kb y otra mutación no identificada que inició la enfermedad a los 5 meses de edad (De los Reyes et al. 2004). Estos hallazgos sugieren que la mutación no identificada y / o factores genéticos podrían ser los responsables de este inicio de la enfermedad a edad tan precoz. Un estudio reciente compara las diferencias fenotípicas entre pacientes homocigotos, heterocigotos para la delección 1.02-kb y homocigotos para la mutación
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c.1001G>A p.R334H, asociada a ambos fenotipos clásico y variante (Munroe et al. 1997), no encontrando diferencias entre los tres grupos (Adams et al. 2010). Además, la mutación c.597C>A p.Y199X en homocigosis, identificada en una familia libanesa con cinco niños afectos, se ha descrito asociada a un curso clínico prolongado (Sarpong et al. 2009). La forma variante de LNCJ (vLNCJ) causada por mutaciones gen CLN1 es clínicamente muy similar a la forma LNCJ producida por mutaciones en el gen CLN3 (Mitchison et al. 1998) a excepción de que la vLNCJ generalmente se inicia con dificultades de aprendizaje en lugar de déficit visual, la regresión del desarrollo psicomotor ocurre a edad más precoz y no se observan linfocitos vacuolados en sangre periférica (Pérez-Poyato et al. 2011). Las mutaciones en el gen CLN1 de estos pacientes no eliminan completamente la función de la proteína (Mazzei et al. 2002) existiendo un déficit parcial de PPT1 (Kälviäinen et al. 2007) y GROD a nivel ultraestructural (Aberg et al. 1998). La mutación c. 223A>C p.T75P es muy común en poblaciones de Estados Unidos (Das et al. 1998) y Escocia (Munroe et al. 1998). 2.4. Formas variantes infantil tardía 2.4.1. Variante finlandesa (CLN5) La primera descripción clínica de la variante finlandesa (vLNCITFin) se debe a Santavuori et al. 1982 y corresponde a una serie de 16 pacientes de Finlandia. Posteriormente se han publicado otros pacientes procedentes de: The Netherlands (Holmberg et al. 2000), Colombia (Pineda-Trujillo et al. 2005), Portugal (Bessa et al. 2006), Italia (Cannelli et al. 2007), Afganistán – Pakistán (Lebrun et al. 2009), Qatar (Al-Kowari MK et al. 2011) y España (Pérez-Poyato et al. 2012b), por lo que podemos decir que la vLNCITFin presenta una amplia diversidad étnica y geográfica.
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Las primeras manifestaciones clínicas de la vLNCITFin, observadas en la etapa preescolar, son déficit de atención / dificultades de concentración (Holmberg et al. 2000). El déficit visual y la torpeza motora comienzan entre los 4.5-7 años de edad. A medida que la enfermedad progresa, se hace evidente el deterioro cognitivo a la edad de 7 años. La epilepsia, en forma de crisis generalizadas, parciales o secundariamente generalizadas, puede aparecer entre los 7-8 años, coincidiendo con la ataxia (7-10 años), pero las crisis mioclónicas ocurren algo más tarde (8-9 años) (Santavuori et al. 1991). Los pacientes pierden la deambulación autónoma entre los 9-11 años de edad, permaneciendo espásticos y en estado vegetativo hasta la edad del fallecimiento que puede variar entre los 14-21 años (Santavuori et al. 1982). El gen CLN5 (MIM #256731) se localiza en el cromosoma 13q21.1-q32 (Savukoski et al. 1994), contiene 4 exones y codifica para una glicoproteína soluble lisosomal de función desconocida y cuya expresión aumenta durante la neurogénesis cortical (Savukoski et al. 1998, Holmberg et al. 2004). La mutación sin sentido c.1175_1176delAT p.Y392X es muy prevalente en Finlandia y acontece en el 94% de los cromosomas (Savuvoski et al. 1998). Existe escasa variabilidad en el fenotipo de los pacientes en relación con las diferentes mutaciones en el gen CLN5, sin embargo la vLNCITFin se puede iniciar a edad juvenil (Pineda-Trujillo et al. 2005, Cannelli et al. 2007, Lebrun et al. 2009, Xin et al. 2010) y del adulto (Xin et al. 2010). 2.4.2. Variante juvenil precoz (CLN6) La forma variante juvenil precoz (vLNCITJuv) fue descrita por Lake y Cavanagh en 1978 y presenta una distribución mundial (Williams et al. 1999b). La primera y más amplia serie de pacientes publicada hasta ahora, incluyó 27 niños procedentes de 23 familias no relacionadas de la República Checa (Elleder et al. 1997).
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La edad de inicio de vLNCITJuv es discretamente más tardía que LNCIT y se sitúa entre los 3-8 años (Texeira et al. 2003a) aunque los primeros síntomas pueden aparecer desde los 18 meses de vida (Elleder et al. 1997). La enfermedad se manifiesta con crisis epilépticas y trastorno motor seguidos de ataxia, disartria, crisis mioclónicas y regresión cognitiva. El déficit visual aparece más tarde, entre los 4-10 años de edad junto con la pérdida de la deambulación y los pacientes pueden sobrevivir hasta la segunda década de la vida en estadío vegetativo (Texeira et al. 2003a). El gen CLN6 (MIM #601780) se localiza en el cromosoma 15q21-23 (Sharp et al. 1997), contiene 7 exones y codifica una proteína transmembrana localizada en el retículo endoplásmico, cuya función es actualmente desconocida (Gao et al. 2002, Wheeler et al. 2002, Mole et al. 2004). Las primeras mutaciones en el gen CLN6 fueron identificadas en pacientes procedentes de Venezuela y Costa Rica donde predomina la mutación nonsense c.214G>T p.E72X (Gao et al. 2002, Wheeler et al. 2002).Otras mutaciones se han descrito en pacientes procedentes de Turkía (Siintola et al. 2005) y de Arabia-saudí (AlMuhaizea et al. 2009). Mutaciones específicas se asocian a determinadas poblaciones como la c.460_462delATC p.I154del muy común en Portugal (Texeira et al. 2003b) y la c.268_271dupAACG p.Val91GlufsX42 que acontece en homocigosis en todos los pacientes de Newfounland (Moore et al. 2008). La mayoría de las mutaciones en el gen CLN6 causan la vLNCITJuv y recientemente se han descrito mutaciones que pueden originar variabilidad en el curso clínico inter e intra familiar (Cannelli et al. 2009), una progresión más lenta de la enfermedad (Sharp et al. 2003) y otras asociadas con la forma del adulto o enfermedad de Kufs tipo A (Arsov et al. 2011).
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2.4.3. Variante turca (CLN7) La forma variante turca (vLNCITTur) fue inicialmente descrita en seis familias, cinco de ellas consanguíneas, procedentes de Turkía (Wheeler et al. 1999). Posteriormente se publicaron pacientes procedentes de India (Siintola et al. 2007), Italia (Aiello et al. 2009), Arabia Saudí (Aldahmesh et al. 2009), República Checa (Kousi et al. 2009), Egipto (Stogmann et al. 2009) y España (Pérez-Poyato et al. 2012b) entre otros. La presentación clínica en estos pacientes es similar a la forma LNCIT. La vLNCITTur se inicia entre los 2-7 años con epilepsia refractaria aunque la ataxia y el déficit visual también pueden aparecer. La progresión de la enfermedad es rápida con deterioro motor y cognitivo, ceguera, ataxia y los pacientes pierden la deambulación autónoma a los 2 años del inicio de la enfermedad (Topcu et al. 2004, Pérez-Poyato et al. 2012b). El gen CLN7 (MIM #610951) se localiza en el cromosoma 4q28.1-q28.2 (Siintola et al. 2007), contiene 13 exones y codifica para una proteína de membrana perteneciente a la superfamilia facilitadora principal de proteínas de transporte lisosomal (MFSD8) de función desconocida. Las mutaciones en el gen CLN7/MFSD8 presentan amplia distribución geográfica y la mutación c.881C>A p.T294K es la más prevalente identificada en 14 pacientes pertenecientes a 12 familias procedentes de Roma originarias de la República Checa (Kousi et al. 2009). La vLNCITTur presenta un curso clínico homogéneo y solamente se ha descrito un paciente con fenotipo juvenil asociado a la mutación c.468_469delinsCC p.Thr156_Ala157delinsthr156_Pro157 (Kousi et al. 2009).
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2.4.4. Epilepsia progresiva con retraso mental y variante (CLN8) Las mutaciones en el gen CLN8 causan dos fenotipos diferentes de enfermedad: la epilepsia del norte, conocida como epilepsia progresiva con retraso mental (EPMR) y una forma variante de inicio infantil tardío descrita en familias de origen turco (vLNCIT). La EPMR fue inicialmente descrita en pacientes de Finlandia (Hirvasniemi et al. 1994) y reconocida como una forma de LNC mediante los estudios neuropatológicos realizados por Herva et al. (2000). La sintomatología se inicia entre los 5-10 años (media 6.7) generalmente con crisis generalizadas tónico-clónicas y crisis parciales complejas en algunos niños (Hirvasniemi et al. 1994) que aumentan en frecuencia en la pubertad y son refractarias a tratamiento. Progresivamente disminuye la frecuencia de las crisis, sin observarse remisión completa de las mismas en la edad adulta. A diferencia de otras formas de LNC, las crisis mioclónicas no son un hallazgo común. Después de 2-5 años del inicio de la epilepsia se instaura el deterioro cognitivo que llega a ser moderado a la edad de 11-13 años y, a pesar de la disminución de la frecuencia de las crisis epilépticas, conduce a retraso mental entre los 30-40 años. Pueden aparecer trastornos de comportamiento como irritabilidad, inquietud e inatención y a diferencia de otras formas de LNC, el déficit visual no es un hallazgo característico. Los pacientes padecen alteraciones de la marcha a los 20-30 años de edad, y desarrollan ataxia posteriormente, falleciendo después de la quinta década de la vida (Ranta y Lehesjoki, 2000). El curso clínico de EPMR ha sido dividido en tres estadios sucesivos (Hirvasniemi et al. 1995): el primero (desde el inicio hasta la pubertad) se caracteriza por un aumento en la frecuencia de las crisis tónico-clónicas generalizadas (4-10 / mes) y rápido deterioro cognitivo. Durante el segundo estadio (juventud) la frecuencia de las
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crisis disminuye y aparece torpeza motora y ataxia. En la última etapa (adulto) apenas se observan crisis epilépticas pero el deterioro cognitivo continúa, evidenciándose el retraso mental a los 40 años de edad. La forma variante (vLNCIT) fue descrita inicialmente en Turkía, donde existe un alto índice de consanguindad (Mitchell et al. 2001). Recientemente se han identificado otros pacientes en Italia (Cannelli et al. 2006, Vantaggiato et al. 2009) e Israel (Zelnik et al. 2007). Esta forma clínica presenta un inicio más precoz y rápidamente progresivo que la EPMR. Se inicia entre los 2-7 años de edad, con crisis mioclónicas y marcha inestable; otros síntomas como el progresivo déficit visual, epilepsia y ataxia son comunes. La progresión de la enfermedad es tan rápida que a los dos años del inicio de la sintomatología los pacientes presentan deterioro cognitivo y, alrededor de los 10 años de edad desarrollan espasticidad, distonía, temblor y otros signos extrapiramidales. La supervivencia de los pacientes con esta forma clínica no es aún bien conocida y algunos han sobrevivido hasta la segunda década de la vida. En el examen ultraestructural predominan los depósitos mixtos FP y CV (Williams et al. 1999c, Topcu et al. 2004), a diferencia de los pacientes con EPMR que presentan principalmente GROD y CV (Herva et al. 2000). El gen CLN8 (MIM #600143) se localiza en el cromosoma 8p23 (Tahvanainen et al. 1994), contiene 3 exones y codifica para una proteína de membrana, localizada en el retículo endoplásmico, de función desconocida (Ranta et al. 1999). Esta proteína pertenece a la familia TLC (TRAM-LAG1-CLN8) y su función tiene importancia en el metabolismo lipídico (Winter y Ponting, 2002). La mutación missense c.70C>G p.R24G causa EPMR en la mayoría de los pacientes finlandeses (Ranta et al. 1999) y en homocigosis está asociada con un curso clínico atípico y prolongado de la enfermedad (Ranta et al. 2004). Se ha descrito un 29
curso clínico aún más benigno en un paciente de Finlandia, heterocigoto para las mutaciones missense c.70C>G p.R24G y c.709G>A p.Gly237Arg (Siintola et al. 2006a). Las mutaciones c.88delG p.Val29fs y c.544-2566_590del p.Ala182AspfsX49 se asocian con un inicio más precoz y un curso clínico más progresivo, pero cuando se encuentran en homocigosis con cambios no truncantes, se asocian a un fenotipo más benigno de enfermedad (Reinhardt et al. 2010). 2.5. Forma congénita (CLN10) La forma congénita (LNCC) fue descrita por Norman y Wood en 1941 y es la más grave de todas las LNCs. Se han publicado, hasta ahora, 10 pacientes en la literatura (Norman y Wood 1941, Brown et al. 1954, Sandbank 1968, Garborg et al. 1987, Barohn et al. 1992, Siintola et al. 2006b, Fritchie et al. 2009). Los enfermos presentan microcefalia, convulsiones neonatales (incluso intrauterinas), apneas de origen central y fallecimiento en las primeras horas o semanas de vida. Estudios neuropatológicos postmortem han confirmado la existencia de atrofia cerebral (Fritchie et al. 2009) y la presencia de GROD a nivel ultraestructural (Garborg et al. 1987, Barohn et al. 1992, Steinfeld 2006, Fritchie et al. 2009). Se ha descrito un paciente con fenotipo juvenil caracterizado por déficit visual y ataxia en edad escolar, deterioro cognitivo progresivo y ceguera (Steinfeld et al. 2006). La LNCC está producida por mutaciones en el gen CLN10 (MIM #610127), que se localiza en el cromosoma 11p15.5 y contiene 9 exones. El gen CLN10 codifica para la enzima catepsina D (CTSD), proteasa aspártico lisosomal que pertenece a la familia de las pepsinas (Siintola et al. 2006b). Todas las mutaciones que eliminan completamente la actividad de la enzima CTSD se asocian con la forma congénita (Siintola et al. 2006b) mientras que las que mantienen actividad enzimática residual se asocian con el fenotipo más leve de enfermedad (Steinfeld et al. 2006).
30
3. Exámenes complementarios 3.1. Electroencefalograma El hallazgo electroencefalográfico característico de las LNCs es el enlentecemiento progresivo de la actividad de base junto con la presencia de actividad paroxística focal o generalizada (Sainio, 1997). En los pacientes con LNCI, el electroencefalograma (EEG) es el primer examen neurofisiológico que presenta alteraciones (Santavuori et al. 1973) y consisten en una reacción atenuada a la apertura y cierre ocular alrededor del año de edad y desaparición de las spindles o husos de sueño a la edad de 2 años (Vanhanen et al. 1997). Además, se observa un descenso de la amplitud en regiones posteriores a la edad de 1.5-2 años con evolución a un patrón isoeléctrico entre los 3-4 años de edad (Pampiglione y Harden 1977). En el EEG de los pacientes con LNCIT se observan característicamente complejos punta y punta onda en regiones posteriores durante la estimulación luminosa a bajas frecuencias (1-2 Hz) (Pampiglione y Harden 1973). Este fenómeno puede estar presente al inicio de la enfermedad, se hace evidente a los a los 3 años de edad y persiste hasta estadíos avanzados. Los registros EEG de los pacientes con LNCJ pueden ser normales hasta la edad de 9 años. Posteriormente, muestran un trazado de base desorganizado, de baja amplitud y un aumento en la actividad paroxística en forma de complejos puntas y ondas lentas (Larsen et al. 2001). El hallazgo electroencefalográfico descrito por Pampiglione y Harden (1973) se observa a edad más tardía en los pacientes con vLNCITFin
(7-8 años) y puede
desaparecer después de los 10 años de edad (Santavuori et al. 1991). Sin embargo, en los pacientes con la vLNCITJuv este fenómeno puede aparecer entre los 2-4 años y es
31
transitorio (Elleder et al. 1997). En los pacientes con EPMR, el progresivo enlentecimiento de la actividad de base en los registros EEG es constante durante la pubertad y la actividad epileptiforme presenta una localización variable en forma de puntas y ondas agudas (Lang et al. 1997). 3.2. Potenciales evocados visuales (PEV) y electrorretinograma (ERG) En los pacientes con LNCI, las primeras alteraciones en el PEV se observan alrededor de los 20 meses y el signo más precoz es la atenuación de las ondas corticales seguido de un retraso progresivo de las latencias que condiciona ausencia de respuestas entre los 2-5 años de edad (Vanhanen et al. 1997). Cuando el ERG es realizado con electrodos corneales, la ausencia de respuestas puede observarse desde los 11 meses de edad (Raitta y Santavuori 1973) mientras que si el ERG se realiza con estímulo flash, las respuestas se muestran ausentes entre los 2-5 años de edad (Santavuori et al. 1992). En fases precoces de la enfermedad, el PEV de los pacientes con LNCIT presenta característicamente respuestas gigantes (amplitud de 355-375 micV) en respuesta a la estimulación luminosa intermitente. Este hallazgo es tan llamativo que cada respuesta del potencial se registra a modo de una gran punta polifásica en regiones posteriores en el EEG. Se observa, además que el ERG se extingue precozmente, sin embargo, el déficit visual ocurre en estadíos más avanzados de la enfermedad por lo que este hallazgo no implica necesariamente pérdida completa de la función de la retina (Harden et al. 1973). No se han publicado hallazgos neurofisiológicos característicos en los pacientes con LNCJ, aunque las alteraciones en el PEV y las respuestas abolidas en el ERG pueden observarse precozmente, antes incluso del inicio del déficit visual (Raitta y Santavuori 1981).
32
En los pacientes con vLNCITFin también se registran respuestas gigantes en el PEV pero a una edad más tardía (7-9.5 años) que en los pacientes con LNCIT y el ERG puede estar abolido entre los 8-9.5 años de edad (Santavuori et al. 1999). 3.3. Resonancia nuclear magnética Los hallazgos neuroradiológicos característicos de las LNCs son la presencia de atrofia cerebral y cerebelosa, leve hiperintensidad de la sustancia blanca en T2 y adelgazamiento del córtex. Estas alteraciones no son específicas y generalmente se correlacionan con la duración de la enfermedad (D’Incerti, 2000). En los pacientes con LNCI las alteraciones en la RNM pueden aparecer antes del inicio de la sintomatología y varían con la evolución de la enfermedad (Vanhanen et al. 1995a). En los estadíos iniciales (7-11meses de edad) los tálamos aparecen hipointesos comparados con la sustancia blanca y los ganglios basales en las imágenes T2 y, se aprecia hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular. La atrofia cerebral es progresiva, más llamativa que la atrofia cerebelosa y se puede poner de manifiesto desde los 13 meses de edad (Santavuori et al. 2000). En los primeros 4 años de la vida estas alteraciones progresan tan rápidamente que la grave atrofia cerebral incluye tálamos y ganglios basales. A partir de los 4 años los hallazgos descritos anteriormente se estabilizan al igual que la sintomatología y el córtex cerebral se hace tan delgado que es difícil diferenciarlo de la sustancia blanca, la cual aparece muy hiperintensa (Vanhanen et al. 2004). A diferencia de la LNCI, las alteraciones en la RNM de los pacientes con LNCIT pueden aparecer un año después del inicio de la sintomatología (Seitz et al. 1998). Los hallazgos neuroradiológicos más característicos de la LNCIT son la progresiva atrofia cerebral, de predominio infratentorial con afectación cerebelosa, así
33
como la hiperintensidad de la sustancia blanca en T2 con normalidad del tálamo y de los ganglios basales (Petersen et al. 1996, Seitz et al. 1998). La RNM puede ser normal antes de los 10 años de edad en pacientes con LNCJ (Santavouri et al. 2001) y la atrofia cerebelosa aparece precozmente con progresión más lenta que en los pacientes con LNCIT (Autti et al. 2008). La hipointensidad del tálamo en T2 es un hallazgo frecuente y la hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular puede estar presente, aunque no de forma tan pronunciada como en LNCI y LCNIT (D’Incerti 2000, Barkhof et al. 2005). En los pacientes con vLNCITFin destaca la atrofia cerebelosa que aparece a edad más precoz que en los pacientes con LNCJ (Autti et al. 1992). Las imágenes de RNM en T2 muestran hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular y del brazo posterior de la cápsula interna y se observa característicamente hipointensidad del tálamo respecto a otros ganglios de la base (Autti et al. 1992, Holmberg et al. 2000). Las alteraciones descritas en la RNM de pacientes con vLNCITJuv son muy similares a la vLNCITFin y consisten en atrofia cerebral generalizada principalmente a nivel infratentorial, hipointensidad del tálamo y putamen e hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular (Peña et al. 2001). La atrofia cerebelosa y de tronco del encéfalo se describen a edad juvenil como signos iniciales observados en la RNM de pacientes con EPMR. La atrofia cerebral es de aparición más tardía y se relaciona con el deterioro cognitivo y la duración de la epilepsia (Hirvasniemi y Karumo, 1994). No se han descrito alteraciones en la intensidad de la señal en T2 en pacientes con EPMR (Lauronen et al. 2001). Sin embargo, en los pacientes con la forma variante (vLNCIT) destaca además de la atrofia cerebral generalizada, un aumento de la señal de la sustancia blanca periventricular y
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del brazo posterior de la cápsula interna en imágenes T2 (Striano et al. 2007, Reinhart et al. 2010). Existen publicaciones que correlacionan las alteraciones neuroradiológicas postmorten y las características histopatológicas del material de necropsia. En pacientes con LNCI, la extrema atrofia cerebral y la hipointensidad de sustancia gris en relación a la sustancia blanca observadas en imágenes T2 de la RNM postmorten, se corresponden a nivel histopatológico con pérdida completa neuronal cortical y desaparición de los axones y las vainas de mielina en la sustancia blanca (Vanhanen et al. 1995b). En pacientes con LNCJ, las imágenes de hiperintensidad de la sustancia blanca periventricular observadas en imágenes T2 de la RNM postmorten, se corresponden a nivel histológico con una importante pérdida de mielina y gliosis (Autti et al. 1997). 3.3.1. Espectroscopía En la RNM con espectroscopía (RNMs) realizada a pacientes con LNCI entre los 3-5 meses de edad, la concentración de N-acetil-aspartato (NAA) presenta un ligero descenso y la relación colina /creatinina está aumentada. A partir de la edad de 17 meses se puede apreciar un moderado descenso del NAA y la colina permanece aumentada como signo de demielinización progresiva. En el estadío final (6 años de edad) existe una desaparición casi completa de los niveles de NAA, colina y creatina lo que indica pérdida neuroaxonal, demielinización progresiva y gliosis (Vanhanen et al. 2004). Las concentraciones de mioinositol y lactato permanecen discretamente elevadas en sustancia blanca y gris (Brockmann et al. 1996). Existen escasos trabajos publicados respecto a los hallazgos de espectroscopía en pacientes con LNCIT. El descenso de la concentración de NAA, un aumento de mioinositol, y la ausencia de lactato se han descrito en esta forma clínica (Seitz et al.
35
1998) aunque se ha publicado un paciente con aumento de lactato en la sustancia blanca y gris (Brockmann et al. 1996). A diferencia de la LNCI y LNCIT, la espectroscopía de los pacientes con LNCJ presenta niveles normales de metabolitos y la progresión de la enfermedad refleja un descenso del NAA y de la creatina en la sustancia gris cerebral (Brockmann et al. 1996).
36
4. Diagnóstico El proceso de diagnóstico de las LCNs es una tarea complicada debido a que son enfermedades neurodegenerativas poco frecuentes, poco conocidas, con amplia variabilidad clínica y heterogeneidad genética. El diagnóstico clínico de cada una de estas enfermedades está basado en la combinación de hallazgos clínicos (edad de presentación e índice de progresión de la enfermedad) y exámenes complementarios. Ante un paciente con sospecha clínica de lipofuscinosis neuronal ceroidea el método de screening más efectivo es la identificación de las inclusiones mediante la visualización al microscopio óptico de leucocitos o al microscopio electrónico de los tejidos biopsiados por un profesional anatomopatólogo experto. Sin embargo, un resultado negativo no excluye el diagnóstico y la morfología del material depositado puede variar dependiendo del tejido examinado. En este sentido, los estudios de actividad enzimática (PPT1, TPP1 y CTSD) preceden al estudio de microscopía electrónica, cuando existe alta sospecha de enfermedad producida por mutación en los genes CLN1, CLN2 y CLN10 respectivamente. Ante la sospecha clínica de LNC en un niño menor de 4 años el diagnóstico clínico más probable es LNCI y/o LNCIT. La determinación enzimática PPT1 y TPP1 confirman el diagnóstico junto con el análisis molecular de los genes CLN1 y CLN2 respectivamente. Los estudios de microscopía electrónica están indicados cuando la actividad enzimática es normal y es necesario considerar las formas variantes infantil tardía de LNC (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8). Si la enfermedad comienza en un niño en edad escolar con progresivo déficit visual, debe sospecharse la LNCJ como diagnóstico más probable. En ese caso, la presencia de linfocitos vacuolados en sangre periférica junto con la identificación de la
37
delección común 1.02-kb en el gen CLN3 y / o la secuenciación completa del gen CLN3 deben ser investigados con el fin establecer el diagnóstico definitivo. Las formas variantes infantil tardía de lipofuscinosis (vLNCITFin, vLNCITJuv, vLNCITTur, EPMR, vLNCIT) son muy parecidas clínicamente y las inclusiones son de tipo mixto, por tanto el único modo de diferenciar definitivamente cada una de estas entidades y clasificar a los pacientes en la forma clínica correspondiente es el análisis genético-molecular de cada uno de los genes (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8) respectivamente. Sin embargo, el estudio de mutaciones específicas puede ser prioritario en ciertas poblaciones donde éstas son muy frecuentes: CLN6 (p.E72X) en pacientes de Costa Rica, CLN7 (p.T294K) en familias gitanas romanas procedentes de la antigua Checoslovaquia y CLN8 (p.R24G) en pacientes de Finlandia con EPMR. En aquellas familias con mutación en los genes CLN1, CLN2 ó CLN10 identificada previamente, el diagnóstico prenatal está disponible mediante los estudios enzimáticos y de genética molecular (Berry-Kravis et al. 2000). En el resto de las familias estos estudios requieren previa detección de inclusiones en las vellosidades coriónicas e identificación de las mismas mediante microscopía electrónica. En el proceso diagnóstico de las LNCs es fundamental la presencia de un equipo multidisciplinar formado por neuropediatras, neurofisiólogos, neurorradiólogos, anatomopatólogos, genetistas y bioquímicos, con el fin de diferenciar cada forma clínica y diagnosticar de modo preciso a cada paciente. Existen en la literatura publicados diversos algoritmos diagnósticos que facilitan el
diagnóstico de las diferentes formas clínicas de LNC y que se muestran a
continuación:
38
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1428 Figura 3. Algoritmo para el diagnóstico de las lipofuscinosis neuronal ceroidea.
Newborn Microcephaly Seizures
Young child Seizures, developmental standstill Enzyme activities
Cathepsin D Absent
PPT1 absent
TPP1 absent
School child Retinopaty (dementia) Lymphocyte vacuoles
all normal
Absent
present
Electron microscopy
CLN10
CLN1
CLN2
CLN5, 6,7, 8
CLN3
Kohlschütter A. y Schulz A. 2009 Figura 4. Algoritmo para el diagnóstico de las lipofuscinosis neuronal ceroidea.
39
Suspected NCL on basis of clinical features, ophthalmology assessment and neurophysiology findings. No other diagnosis identified.
High index of suspicion
CTSD, TPP1, PPT1 activities, vacuolated lymphocytes, skin biopsy or buffy coat for EM, DNA save
Negative enzyme analysis Review clinical diagnosis; complete other neuro-metabolic investigations Lymphocytes or skin biopsy for ultra structural analysis (and fibroblast culture)
CTSD deficiency
CLN10 mutation analysis
PPT1 deficiency
CLN1 mutation analysis
TTP1 deficiency
CLN2 mutation analysis
Vacuolated lymphocytes positive
CLN3 mutation analysis
Other diagnosis confirmed NCL confirmed
Mutation analysis CLN3 CLN5 CLN6 CLN7/MFSD CLN8 Priority dependent on ethnic origin, clinical features, and ultraestructural features
No positive results NCL like syndrome
Kohan R et al. 2011 Figura 5. Estrategia para el estudio de lipofuscinosis neuronal ceroidea. Conseso del 12th Congreso de LNC celebrado en Hamburgo – Alemania (2009). Coordinado por Dr. R. Williams.
40
no CLN5, CLN6, MFSD8, CLN8 mutations
CLN5,CLN6,MFSD8, CLN8 mutation analysis
normal CTSD levels
CTSD enzyme analysis
normal PPT1 levels
PPT1 enzyme analysis
normal TPP1 levels
TTP1 enzyme analysis
Screening for novel NCL genes that remain to be identified
no CLN3 mutations
CLN3 mutation analysis
no CLN5, CLN6, MFSD8, CLN8 mutations
CLN5,CLN6,MFSD8, CLN8 mutation analysis
normal CTSD levels
CTSD enzyme analysis
normal PPT1 levels
PPT1 enzyme analysis
CLN3 mutation analysis
CTSD deficiency
Kousi et al. 2012
no CLN3 mutations
no CLN5,MFSD8, CLN8 mutations
normal CTSD levels
CTSD enzyme analysis
CLN5,CLN6,MFSD8, CLN8 mutation analysis
TTP1 deficiency normal TPP1 levels
TTP1 enzyme analysis
PPT1 deficiency
no CLN6 mutations PPT1 enzyme analysis
Figura 6. Resumen del protocolo para el diagnóstico de lipofuscinosis neuronal ceroidea.
no CLN3 mutations
CLN3 mutation analysis
no CLN5, CLN6, MFSD8, CLN8 mutations
CLN5,CLN6,MFSD8, CLN8 mutation analysis
normal CTSD levels
CTSD enzyme analysis
normal TPP1 levels
TTP1 enzyme analysis
no CLN3 mutations
CLN6 mutation analysis
CLN3 mutation analysis
TTP1 enzyme analysis
PPT1 enzyme analysis normal TPP1 levels
Disease onset in adulthood (>30 yr)
Disease onset in childhood (5-10yr) and/or vacuoles in peripheral blood
Disease onset in late infancy (2-4 yr)
Disease onset in infancy (6-18 mo)
normal PPT1 levels
Fingerprint (FP), curvilinear (CL) and/or rectilinear (RL) profiles
GROD
Typical storage material = Confirmation of NCL
EM analysis
Clinical suspicion of NCL
CTSD mutation analysis
ysis TTP1 mutation analysis
PPT1 mutation analysis
41
School child Rapid visual loss with retinopathy, perhaps dementia Lymphocyte vacuoles absent
Newborn Microcephaly, seizures
CTSD absent
CLN10
EM
all normal
Young child Seizures, developmental standstill Enzymes
CLN2
PPT1 TPP1 absent absent
CLN1
CLN11, CLN12
CLN4
Inheritance
Teenage / Adult Myoclonic epilepsy (type A) or behavioural changes and dementia (type B)
Recessive
CLN13
Dominant
Present
CLN3
CLN6
Type B
42
Figura 7. 13th International Conference on Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (Batten Disease) & Patient Organisation Meeting. London 2012.
CLN5, CLN6, CLN7, CLN8, CLN14
Type A
5. Tratamiento El tratamiento de un paciente con LNC exige un amplio conocimiento de la enfermedad y destreza por parte del clínico ya que actualmente no existe un tratamiento curativo y el deterioro neurológico del paciente puede ser relativamente rápido con fallecimiento a edad precoz. El verdadero desafío es prevenir la neurodegeneración, restauraurando la funcionalidad del sistema nervioso central. En este sentido, actualmente se están realizando
estrategias
terapeúticas
y
diferentes
ensayos
http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=neuronal+ceroid+lipofuscinosis
clínicos en
pacientes con LNCI, LNCIT y LNCJ. Algunas de estas terapias se describen de forma sucinta a continuación. 5.1. Terapia de reemplazamiento enzimático La terapia de reemplazamiento enzimático (ERT) ha obtenido resultados satisfactorios en enfermedades lisosomales con afectación visceral. En las enfermedades con afectación del sistema nervioso central (SNC) su efectividad es menor debido a la existencia de la barrera hematoencefálica (BHE) que no permite el paso de ciertos compuestos o sustancias. Las formas clínicas de LNCs producidas por mutaciones en los genes CLN1, CLN2 y CLN10 son enfermedades caracterizadas por déficit parcial o ausencia total de las enzimas PPT1, TPP1 y CTSD respectivamente. El primer estudio con ERT para CLN1 fue publicado por Lu et al. (2010) quienes diseñaron una enzima PPT1 recombinante humana en una línea celular de ovario en un hamster chino. Tras la inyección por vía intravenosa de la enzima PPT1 en el hamster, se observó incremento de los niveles en riñón, hígado, corazón, pulmón y bazo, pero mínimamente en cerebro. La efectividad de la ERT en esta forma clínica y en la LNCIT es un campo de investigación en la actualidad.
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5.2.- Terapia génica La terapia génica implica la introducción de una copia del gen normal y funcionante mediante la infección directa de células in vivo a través de un virus vector, el cual es modificado para reducir su virulencia y evitar patogenicidad. Los virus se utilizan para distribuir una copia normal del gen defectuoso. El gen normal transportado por el virus vector posee la capacidad de sintetizar y segregar proteína normal. Algunas células somáticas internalizan la proteína, sin embargo debido a la dificultad para atravesar la BHE la proteína presenta dificultad para distribuirse en el
SNC. La
inyección del virus vector directamente en SNC de pacientes con mutaciones en los genes CLN2 es una opción terapeútica que está en fase de ensayo clínico en EEUU. 5.3.- Terapia farmacológica El tratamiento paliativo y sintomático del que pueden beneficiarse los pacientes con LNC incluye, entre otros: tratamiento de la epilepsia, de las manifestaciones extrapiramidales y del estado nutricional. Además, es necesario considerar las interacciones farmacológicas y la susceptibilidad por parte de estos pacientes para desarrollar reacciones adversas. También hay que tener en cuenta el estado general de estos pacientes en caso de ser sometidos a procedimientos quirúrgicos que precisen de anestesia general. 5.3.1.- Tratamiento antiepiléptico Los fármacos antiepilépticos (FAEs) desempeñan un papel muy importante en el control de las crisis epilépticas, y deben seleccionarse teniendo en cuenta el tipo de crisis, el estado clínico del paciente y los efectos secundarios. Con frecuencia son necesarios varios fármacos para conseguir un adecuado control crítico, difícil de alcanzar en la mayoría de los pacientes.
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El Valproato (VPA) es uno de los FAEs básicos en el tratamiento de la epilepsia de los pacientes con LNC. Es eficaz en las convulsiones generalizadas primarias y parciales secundariamente generalizadas. Es bien tolerado, sin efectos secundarios importantes. La combinación de Fenobarbital (PB) y VPA fue utilizada durante muchos años, pero desde 1990 la Lamotrigina (LTG) ha reemplazado al PB debido a que posee efectos secundarios menos importantes y ha demostrado su eficacia en las crisis parciales y generalizadas. La Carbamacepina (CBZ), la Fenitoína (PHT) y la Vigabatrina (VGB) pueden empeorar las crisis epilépticas mioclónicas por lo que están contraindicados (Aberg et al. 1999). El Clonacepam (CZP) es el FAE más efectivo en pacientes con EPMR y cuando se administra en la pubertad puede normalizar las alteraciones electroencefalográficas (Lang et al. 1997). 5.3.2.- Tratamiento de los síntomas extrapiramidales Existen pocos estudios controlados que avalen la eficacia de los fármacos antiparkinsonianos. En un estudio de Aberg et al. (2001) la Levo-dopa demostró un efecto beneficioso en pacientes con LNCJ, revelando resultados alentadores, mientras que la Selegilina demostró mínima eficacia. 5.3.3.- Tratamiento nutricional En las fases iniciales de la enfermedad, en que la deglución está preservada, es importante mantener una dieta rica en fibra para evitar el estreñimiento. En etapas avanzadas, cuando los pacientes desarrollan disfagia, la realización de una gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) puede contribuir decisivamente no sólo a una adecuada nutrición e hidratación sino también, a un adecuado aporte calórico. Además, esta técnica minimiza los posibles episodios de aspiración pulmonar y facilita la administración de la medicación, mejorando la calidad de vida del paciente.
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JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA E HIPÓTESIS 1.
Justificación de la unidad temática
2.
Hipótesis
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1. Justificación de la unidad temática En los últimos 15 años se han producido avances muy importantes en las bases moleculares de las lipofuscinosis neuronal ceroidea, un grupo de enfermedades que comparten un amplio e inespecífico espectro de síntomas y que en la infancia, están causadas por las mutaciones identificadas en los siguientes genes: CLN10/CTSD, CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8 y CLN8. El propósito de esta tesis es el estudio de este grupo de enfermedades en la población pediátrica española obedeciendo a dos motivos principales: 1) Las lipofuscinosis neuronal ceroidea constituyen uno de los grupos de enfermedades neurometabólicas hereditarias más frecuentes en la infancia y su estudio podría contribuir a encontrar nuevos pacientes al ser enfermedades que probablemente se encuentren infradiagnosticadas en la población pediátrica española 2) La baja prevalencia de las diferentes formas clínicas de lipofuscinosis neuronal ceroidea ha determinado que aún existan múltiples aspectos clínicos y genéticos que deberían ser investigados en mayor profundidad para mejorar el conocimiento de estas enfermedades. Con este trabajo se pretende avanzar en el estudio de las LNCs, determinar la distribución de cada forma clínica dentro de la población española y realizar una adecuada correlación clínico-molecular. El conjunto de trabajos que forman parte de esta tesis doctoral pretenden dar a conocer la historia natural de la enfermedad y profundizar en el conocimiento de cada forma clínica de LNC. El diseño de una adecuada estrategia de diagnóstico clínico, bioquímico, anatomopatológico y molecular permitirá una mejor caracterización clínica de los pacientes y el abordaje de los estudios de correlación genotipo-fenotipo en este grupo de enfermedades poco prevalentes. Este estudio parte de una base clínica, la actividad asistencial de los neuropediatras de diferentes hospitales de la geografía
49
española que atienden a pacientes con regresión del desarrollo psicomotor, epilepsia y déficit visual, y se ha desarrollado a través de un trabajo coordinado con profesionales del campo de las neurociencias, incluyendo bioquímicos clínicos, anatomopatólogos y genetistas de la provincia de Barcelona para tratar de avanzar en el conocimiento de las lipofuscinosis
neuronal
ceroidea
en
sus
aspectos
clínicos,
bioquímicos,
anatomopatológicos y genéticos. Este abordaje multidisciplinar es hoy en día esencial para un estudio adecuado de las enfermedades metabólicas neurodegenerativas ya que permite mejorar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de la enfermedad y futuros tratamientos a aplicar en nuestros pacientes. Dado que las LNCs son enfermedades para las que no se dispone de tratamiento curativo en la actualidad, consideramos que el conocimiento de la historia natural de la enfermedad será de vital importancia para aplicar futuras terapias, establecer un pronóstico y valorar los efectos del tratamiento que tratan de enlentecer la progresión de la enfermedad. 2. Hipótesis El estudio en profundidad de una amplia serie de pacientes españoles diagnosticados de LNC en los últimos 37 años y el análisis molecular de la mayoría de ellos, caracterizará de forma adecuada las diferentes formas clínicas de LNC en España. La elaboración de una base de datos clínica nos permitirá recopilar los datos clínicos, bioquímicos, anatomopatológicos y moleculares de los pacientes pediátricos con diagnóstico probable y confirmado de LNC. El análisis detallado de estos datos nos ha de permitir describir el espectro clínico y mutacional de la población española con LNC, elaborar un protocolo de estudio para este grupo de enfermedades y realizar una adecuada correlación genotipo-fenotipo.
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OBJETIVOS 1.
Objetivo principal
2.
Objetivos específicos
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1. Objetivo principal Nos proponemos, a través de los estudios realizados en los pacientes españoles con lipofuscinosis neuronal ceroidea, profundizar en el conocimiento de los aspectos clínicos y moleculares de este grupo de enfermedades, determinar el espectro mutacional de los genes CLN1, CLN2, CLN3, CLN5 y CLN7 y establecer una adecuada correlación genotipo-fenotipo en la población pediátrica de nuestro país.
2. Objetivos específicos x
Valorar la evolución cronológica y severidad de la forma infantil precoz de lipofuscinosis neuronal ceroidea y describir el espectro mutacional del gen CLN1.
x
Estudiar la progresión de la enfermedad y su correlación con el genotipo en pacientes con la forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea y mutaciones en el gen CLN2.
x
Avanzar en el estudio de la historia natural de la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea y diferenciar el curso clínico de la enfermedad en los pacientes que presentan el fenotipo clásico (cLNCJ) de aquellos con el fenotipo variante (vLNCJ). Establecer correlaciones genotipo-fenotipo mediante la descripción del curso clínico y los resultados de los estudios bioquímicos, anatomopatológicos y moleculares de los genes CLN1 y CLN3.
x
Realizar un estudio detallado de la sintomatología que caracteriza a las formas variantes infantil tardía finlandesa y turca y describir el análisis mutacional de los genes CLN5 y CLN7 respectivamente.
x
Elaborar un protocolo de estudio que facilite el proceso diagnóstico en el conjunto de las lipofuscinosis neuronal ceroidea y que contribuya a encontrar nuevos pacientes con las diferentes formas clínicas de LNC en España.
53
PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS 1.
Pacientes y diseño del estudio
2.
Métodos para el estudio neuropatológico
3.
Métodos bioquímicos
4.
Métodos para el estudio molecular
5.
Aspectos éticos
6.
Análisis estadístico
55
1. Pacientes y diseño del estudio 1.1. Para el estudio de la forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCI) se estudiaron desde el año 1974 a 2011 un total de 6 pacientes (3 varones y 3 mujeres) de edades entre los 3 y 12 años pertenecientes a 5 núcleos familiares y que presentaron mutaciones en el gen CLN1 y /o déficit de PPT1 y / o GROD a nivel ultraestructural. 1.2. Para el estudio de la forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCIT) se estudiaron desde el año 1979 a 2011 un total de 12 pacientes (8 varones y 4 mujeres) de edad media de 7.4 años (rango 4-14) pertenecientes a 10 núcleos familiares y que presentaron mutaciones en el gen CLN2 y /o déficit de TPP1 y / o CV a nivel ultraestructural. 1.3. Para el estudio de la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCJ) se estudiaron desde el año 1975 a 2010 un total de 24 pacientes españoles (11 varones y 13 mujeres) de edad mediana de 18.3 años (rango 10-33) pertenecientes a 18 núcleos familiares. Los pacientes se dividieron en dos grupos: variante (vLNCJ) que incluyó 11 pacientes (edad mediana 18 años, rango 10-23) con mutaciones en el gen CLN1 y / o GROD a nivel ultraestructural y grupo clásico (cLNCJ) que incluyó 13 pacientes (edad mediana 18 años, rango 10-33) con mutaciones en el gen CLN3 y / o FP a nivel ultraestructural. 1.4. Se describieron las características clínicas, anatomopatológicas y moleculares de 3 pacientes con la forma variante infantil tardía finlandesa
(vLNCITFin) y
mutaciones en el gen CLN5 y, de un paciente con la forma variante infantil tardía turca (vLNCITTur) y mutaciones en el gen CLN7, procedentes de diferentes núcleos familiares.
57
Los datos de cada paciente fueron recogidos mediante la revisión retrospectiva y prospectiva de las historias clínicas correspondientes y la realización de entrevistas a los familiares y / o profesionales neuropediatras referentes de los pacientes. Para la recopilación y posterior análisis detallado de dichos datos, fue necesario crear una base de datos clínica con 50 ítems (Pérez -Poyato et al. 2011) (Tabla 3).
58
Tabla 3. Ítems de la base de datos clínica de las lipofuscinosis neuronal ceroidea Ítem#
Descripción
Ítem#
Descripción
1
Fecha exploración
26
Trastorno de aprendizaje
2
Nombre y apellidos paciente
27
Retraso mental
3
Fecha y lugar de nacimiento
28
Bradipsiquia
4
Nombre del medico referente
29
Conducta autista
5
Edad actual del paciente
30
Trastorno de comportamiento
6
Edad al diagnóstico clínico
31
Epilepsia
7
Edad al diagnóstico ultraestructural
32
Tipo de crisis epilépticas
8
Edad al diagnóstico molecular
33
FAE y respuesta al tratamiento
9
Consanguinidad
34
Déficit visual
10
Otros miembros familiares con LNC
35
Ceguera
11
Embarazo
36
Marcha apráxica
12
Parto
37
Ataxia
13
Peso al nacimiento
38
Signos piramidales
14
Hitos del desarrollo psicomotor
39
Espasticidad y contracturas de las extremidades
15
Edad de inicio de la sintomatología
40
Hallazgos en el electroencefalograma
16
Síntoma inicial
41
Atrofia cerebral / cerebelosa (MRI/TC)
17
Edad de la pérdida de la deambulación
42
Hallazgos oftalmológicos
18
Edad de utilizar silla de ruedas
43
Hallazgos en el electrorretinograma
19
Edad de la pérdida de la sedestación
44
Potenciales evocados visuales
20
Edad de la pérdida de la manipulación
45
Linfocitos vacuolados
21
Edad de la pérdida de las frases
46
Estudios enzimáticos
22
Edad de ausencia comunicación verbal
47
Estudios de microscopía electrónica
23
Disfagia
48
Estudios moleculares
24
Sonda nasogástrica / PEG
49
Forma clínica de LNC
25
Edad de la incontinencia urinaria
50
Edad del fallecimiento
59
2. Métodos para el estudio neuropatológico Las muestras de piel, conjuntiva, apéndice y músculo obtenidas por biopsia fueron procesadas para estudio con microscopio electrónico. Las muestras se fijaron en glutaraldehído al 2.5 % en tampón fofato, postfijadas en tetróxido de osmio al 2%, deshidratadas en gradientes de acetona o alcohol, e incluidas en resinas de epóxido. Las secciones semifinas fueron teñidas con azul de toluidina y las secciones ultrafinas con acetato de uranio y citrato de plomo. Para realizar el estudio neuropatológico cerebral procedente de necropsia de un paciente con LNCI, el cerebro fue fijado en formalina tamponada al 4% durante 4 semanas y, posteriormente, cortado en secciones coronales. Las secciones hemisféricas de las diferentes regiones del cerebro, cerebelo y tronco del encéfalo fueron incluidas en parafina. Las secciones de 4 micras de espesor fueron obtenidas con un microtomo de deslizamiento,
y
teñidas
con
hematoxilina-eosina,
Klüver
Barrera,
PAS
e
immunohistoquímica para la proteína glial fibrilar acídica para astrocitos y lectinas para microglia. Además, otras secciones desparafinas y sin teñir fueron visualizadas con microscopio de fluorescencia.
3. Métodos bioquímicos La actividad de las enzimas PPT1 y TPP1 fue medida en muestras de leucocitos o fibroblastos cultivados. Los análisis enzimáticos fluorométricos fueron realizados utilizando 4-metillumbeliferil-6-tiopalmitoil –D-glucosido (Moscerdam Substrates, Rotterdam, Holland) como sustrato para la enzima PPT1 y Ala-Ala-Phe-7-amido-4metilcoumarina (Sigma®) como sustrato para la enzima TPP1. Las mediciones proteicas se realizaron según el método de Lowry et al. (1951)
60
4. Métodos para el estudio molecular El estudio molecular de las muestras de los pacientes de esta tesis ha sido realizado en el Servicio de Bioquímica y Genética Molecular del Hospital Clinic de Barcelona, a excepción de las muestras en las que se estudiaron los genes CLN5 y CLN7 que se derivaron a un centro externo. Dado que se trata de una enfermedad muy heterogénea desde el punto vista genético con 8 genes implicados, la elección del gen a estudiar se ha realizado en base a la sospecha clínica y a los resultados del estudio de la proteína cuando se ha dispuesto de ellos. En primer lugar, se ha realizado una extracción de DNA mediante método manual de Salting out o mediante un extractor automático Magnapure de Roche. Se ha partido siempre de muestra de sangre total con un volumen mínimo de 1ml. Se ha realizado el estudio de la región codificante de los genes CLN1, CLN2 y CLN3 utilizando los primers previamente descritos (Goebel y Wisniewski 2004; Mole 2004; Taschner et al. 2005) mediante SSCPs (single Strand Conformation Polymorphism) en los casos anteriores al año 2008 y, posteriormente el estudio se realizó por secuenciación directa bidireccional de las regiones codificantes y límites exon-intron (50bp). La mutación recurrente de CLN3 (1.02-kb que contiene los exones 7 y 8) (GenBank X99832) fue estudiada mediante unos primers diseñados específicamente (Munroe et al. 1997) y analizada en agarosa. Las referencias de los genes utilizados para la nomenclatura de las mutaciones ha sido la siguiente: gen CLN1 (ENSG00000131238), gen CLN2 (ENSG00000166340) y gen CLN3 (ENSG00000188603).
61
Cundo se encontró un cambio en la secuencia de cualquiera de los genes, se revisaron bases de datos para ver si estaba descrito previamente: HGMD® Human Gene Mutation Database – BioBase: www.biobase-international.com/product/hgmd y Batten disease Resource www.ucl.ac.uk/ncl/. Si no ha sido descrita previamente se ha utilizado el programa de predicción de patogenicidad Polyphen 2: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/ Una vez confirmada que se trata de una mutación responsable de enfermedad, está ha sido estudiada en sus padres (portadores obligados) antes de ofrecer consejo genético.
5. Aspectos éticos Todos los padres o tutores legales de los pacientes que participaron en los diferentes estudios firmaron un consentimiento informado, de acuerdo con la Declaración de Helsinki de 1964, revisada en Edimburgo en el año 2000. Los diferentes estudios cuentan con la aprobación del comité de ética y de investigación del Hospital Sant Joan de Déu y del Hospital Clínic.
6. Análisis estadístico Las variables clínicas fueron recogidas en una base de datos (Microsoft Excel). Para los estudios estadísticos se han aplicado las siguientes pruebas:
62
x
Análisis de supervivencia: prueba de Kaplan – Meier
x
Ajuste para comparaciones múltiples: prueba de corrección de Bonferroni
Los detalles de estas pruebas figuran en cada uno de los artículos publicados. Los cálculos estadísticos se realizaron con el programa SPSS 17.0. Las pruebas estadísticas se consideraron significativas para una p< 0.05.
63
RESULTADOS 1.
Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración clínica de una serie de pacientes españoles
2.
Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
3.
Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y estudios genéticos en pacientes españoles
4.
Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea
5.
Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea
65
1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración clínica de una serie de pacientes españoles
Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: Follow-up on a Spanish series María del Socorro Pérez-Poyato, Montserrat Milá Recasens, Isidre Ferrer Abizanda, Rosario Domingo Jiménez, Amparo López Lafuente, Victoria Cusí Sánchez, Laia Rodriguez-Revenga, M Josep Coll Rosell, Laura Gort, Pilar Póo Argüelles, Mercé Pineda Marfa. Gene 2012; 499: 297-302.
Las manifestaciones clínicas de la forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCI) han sido ampliamente estudiadas en la población finlandesa (Santavuori et al. 1973, 1974) y existen publicadas pocas series de pacientes procedentes de los países del sur de Europa. Se han identificado varias mutaciones en el gen CLN1 que causan LNCI en determinados países asociadas a un fenotipo severo de enfermedad. Describimos de forma detallada las características clínicas, el seguimiento y la evolución cronológica de la enfermedad en una serie de seis pacientes españoles con LNCI. Este trabajo contribuye al estudio de la correlación genotipo-fenotipo en pacientes con LNCI procedentes de países del área Mediterránea y confirma que la mutación V181M en el gen CLN1 está clínicamente asociada con el fenotipo severo de esta enfermedad.
67
Gene 499 (2012) 297–302
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Gene journal homepage: www.elsevier.com/locate/gene
Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: Follow-up on a Spanish series Maria Socorro Pérez Poyato a,⁎, Montserrat Milá Recansens c, d, Isidre Ferrer Abizanda e, Rosario Domingo Jiménez f, Amparo López Lafuente g, Victoria Cusí Sánchez b, Laia Rodriguez-Revenga c, d, M. Josep Coll Rosell c, d, h, Laura Gort c, d, h, Pilar Póo Argüelles a, Mercé Pineda Marfa a, c a
Department of Pediatric Neurology, Hospital de Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain Service of Anatomical Pathology, Hospital de Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Spain d IDIBAPS, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain e Institute of Neuropathology, Service of Anatomical Pathology, IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge, Barcelona, CIBERNED, Spain f Department of Pediatric Neurology, Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia, Spain g Department of Pediatric Neurology, Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres, Spain h Inborn Errors of Metabolism (IBC) - Biochemical and Molecular Genetics Department, Hospital Clínic, Barcelona, Spain b c
a r t i c l e
i n f o
Article history: Accepted 9 February 2012 Available online 22 February 2012 Keywords: Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis Follow-up CLN1/PPT gene
a b s t r a c t Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (INCL; NCL1, Haltia-Santavuori disease) is caused by mutations in the CLN1/PPT gene which are associated with an early onset INCL phenotype. The most detailed descriptions of INCL have come from Finland and a few series have been reported from southern European countries. Clinical course and follow-up of six Spanish patients with INCL are reported with the aim of assessing the chronological evolution and severity of this disease. The age at disease onset ranged from 8 to 15 months. Delayed motor skills were the initial symptom when the disease began before 12 months of age, and ataxia was the first sign when the disease began later. Cognitive decline, which is described between 12 and 18 months of age, occurred from 16 to 20 months of age. In our series early stage is characterized by motor impairment, cognitive decline and autistic features. Visual failure may appear simultaneously with the neurological symptoms, leading quickly to blindness. As reported, psychomotor regression appeared between 2 and 3 years of age. Myoclonic jerks occurred after 24 months of age and epilepsy was the last symptom of the disease. We report two novel mutations in a patient without epilepsy to date and describe the features of two siblings homozygous for the V181M (c.541 G > A) mutation, associated with the most severe INCL phenotype. The clinical evolution might be helpful to identify patients affected by this rare disease. Early diagnosis is essential in order to provide genetic counselling to affected families. Our series may contribute to the study of the genotype–phenotype INCL correlation in the Mediterranean countries. © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction Neuronal ceroid lipofuscinosis (NCLs) is one of the most common groups of progressive neurodegenerative diseases in childhood (Goebel and Sharp, 1998). The global incidence has been reported to be 1/
Abbreviation: CT, computed tomography; CZP, Clonazepam; CLB, Clobazam; EEG, Electroencephalography; ERG, Electroretinography; GROD, granular osmophilic depòsit; INCL, NCL1, Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; JNCL, Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis; LINCL, Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; MRI, Magnetic resonance imaging; NCL, Neuronal ceroid lipofuscinosis; PPT, Palmitoyl-protein thioesterase; PB., Phenobarbital; PAS, Periodic acid Schiff; TPM, Topiramate; VPA, Valproic acid; VEP, Visual evoked potential. ⁎ Corresponding author at: Hospital Sant Joan de Déu, Passeig de Sant Joan de Déu No. 2, Esplugues, Barcelona 8950, Spain. Tel.: + 34 93 280 4000x2448; fax: + 34 93 203 3959. E-mail address:
[email protected] (M.S. Pérez Poyato).
12,500 live births (Vesa et al., 1995) and the prevalence varies depending upon ethnicity and country of origin (Cardona and Rosati, 1995; Uvebrant and Hagberg, 1997). NCLs are characterized by accumulation of autofluorescent lipopigments in neural and non-neural tissues. The NCLs are defined by the astrocytic activation and progressive neuronal loss within the central nervous system (Cooper et al., 2006). Phenotypes have been classified, considering age of onset, clinical course, and ultrastructural morphology, into infantile, late-infantile, juvenile, and adult forms (Goebel et al., 1999). Infantile NCL (INCL; NCL1, Haltia-Santavuori disease) is characterized by granular osmophilic deposits (GROD) on ultrastructure (Rapola and Haltia, 1973) and is caused by deficiency of the lysosomal enzyme palmitoyl-protein thioesterase (PPT) (Vesa et al., 1995) which is encoded by the CLN1 gene (Jarvela et al., 1991). Severe phenotype in INCL is usually associated with mutations in the CLN1 gene, which are likely to abolish the enzymatic activity of PPT (Das et al., 1998). Mutations in the CLN1/PPT gene have been reported to cause
0378-1119/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.gene.2012.02.013
69
70 nd
nd
⁎Died; aPatients 3 and 4 are siblings; M: male; F: female; nd: not done.
Abolished (3 years 4 months) GROD (skin)/ nd
Abolished (3 years 6 months) GROD (brain)/ nd
+/− (19) Normal (2 years 4 months)
+/+ (42) Papillary pallor (2 years 10 months)
Electroretinography (ERG) (Age) Electron Microscopy (Biopsied tissue)/ PPT1 activity nmol/h/mg (control) CLN1 mutational analysis Mutation Amino acid change/predicted consequence Status
M/11* Delayed sitting (8) 5 19 1 year 10 months Refractory 1 Year 10 months Generalized (3 years 4 months) Slow activity (19)
F/12* Delayed sitting (10) 12 20 2 years 10 months Refractory 2 Years 5 months Generalized (3 years 6 months) Slow activity (20)
Sex/current age (years) Initial symptom (Age, months) Age at diagnosis (years) Age Cognitive decline (months) Age Spasticity Epilepsy Age Myoclonic jerks Seizures (Age) Interictal video—EEG background (Age, months) Cerebral/cerebellar atrophy (Age, months) Ophthalmologic findings (Age)
Patient 2
Patient 1
Data
Table 1 Summary of clinical, biochemical, ultrastructural and molecular data in Spanish patients with INCL.
c.541 G > A Missense p.Val 181Met Homozygous
nd/ 0.78 (59,4)
+/− (29) Papillary pallor (2 years 5 months) /Optic atrophy (3 years 5 months nd
F/11* Unsteady gait (14) 10 19 3 years 5 months Refractory 3 Years 5 months Generalized, partial (4 years 5 months) Slow activity (29)
Patient 3a
c.541 G > A Missense p.Val 181Met Homozygous
+/− (21) Normal (1 years 10 months) Papillary pallor (2 years 9 months) ↓ ↓amplitude/ (2 years 9 months) GROD (Skin)/ Undetectable (35)
F/9 Unsteady gait (13) 3 19 2 years 9 months Refractory 2 Years 9 months Generalized, partial (4 years 5 months) Slow activity (21)
Patient 4a Patient 5
nd
+/− (15) Normal (1 year 7 months) Optic atrophy (2 years 4 months) ↓↓amplitude (2 years 4 months) GROD (Muscle)/ Undetectable (30.4)
M/12* Unsteady gait (15) 10 19 2 years 4 months Refractory 3 Years 3 months Generalized (3 years 3 months) Slow activity (19)
Patient 6
c.533A > T + c.722 C > T Splicing/missense p.Glu 178Val + p.Ser241Leu Compound heterozygous
↓↓amplitude (2 years 4 months) nd/ 0.74 (54,8)
Slow activity spike – slow wave complexes (16) +/− (16) Normal (2 years 4 months)
M/3 Delayed sitting (12) 2 16 2 years 5 months No No No
298 M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
INCL in families from specific countries. Mutational spectrum in the CLN1/PPT gene causing INCL has not been reported in Spain. The clinical manifestations of INCL have been widely studied in the Finnish population (Santavuori et al., 1973, 1974). To date, very few reported case series have come from the Mediterranean area. We report the clinical course and the results of biochemical, neuropathological and molecular studies carried out in six Spanish patients with INCL with the aim of assessing the chronological evolution and severity of this disease.
299
to routine methods. The histological examination was carried out in four patients, including biopsies of different tissues such as brain (one patient, taken on necropsy), skin (two patients) and muscle (one patient). The brain was processed for neuropathological studies following fixation in 4% buffered formalin, and electron microscopic examination after fixation of fresh samples in 2% glutaraldehyde in phosphate buffer and post-fixation in 0.1% osmium tetroxide. 3. Results
2. Patients and methods
3.1. Clinical evaluation
From 1974 to 2011, six Spanish patients (3 males, 3 females) from 5 unrelated families were diagnosed with INCL. Data from each patient were collected from the patient's medical record and completed with information provided by the physicians in charge and parents. Data were entered into a previously created database (Perez-Poyato et al., 2011). The study was approved by the Ethics Committee of Hospital Sant Joan de Déu in Barcelona, which was the reference hospital for the study. Written informed consent was obtained from all parents or legal guardians. Electroencephalography, neuroimaging (brain MRI, CT scan), and ophthalmologic studies were available for all patients. Electroretinography was performed in five patients at least once during the course of the disease. Palmitoyl-protein thioesterase (PPT-1) activity was measured in samples of leukocytes or fibroblasts from four patients. Protein measurements were performed according to the method of Lowry et al. (1951). Comprehensive mutation analysis of the PPT1 gene (ENSG00000131238) was undertaken by bidirectional sequencing of coding and exon–intron boundaries region. Genetic studies were carried out in three patients. DNA was not available in the remaining 3 patients. Two patients died before genetic studies were available (patients 1 and 2) and the third family did not approve this study (patient 5). Electron microscope examination of biopsied tissues was the main morphological diagnostic technique; tissues were obtained according
Table 1 summarizes the clinical, enzymatic and ultrastructural data as well as CLN1 mutations identified in our patients. The age at onset of clinical signs and symptoms is shown in Fig. 1. 3.1.1. Family 1 Patient 1 was born to unrelated, healthy Caucasian parents in 1974. Delivery and neonatal period were normal. She was able to sit at 10 months but never learned to walk unaided due to spontaneous falls from the age of 14 months. At 20 months of age her speech gradually deteriorated to unintelligible syllables, her motor abilities seemed to slow down and she showed poor visual contact. EEG revealed slowing of the rhythmic activity. At the age 2 y, 5 m her psychomotor development had markedly regressed: the girl could not sit up by her, or grasp objects, and had lost the ability to speak. Her autistic behavior was evident and she showed erratic eye movements. Myoclonic jerks in both arms were observed. In the following months, she presented continuous myoclonic seizures. Physical examination showed axial hypotonia and lower limb spasticity. Fundoscopic exam revealed papillary pallor. At the age of 3 years, she become dysphagic, blind, wheelchair bound and without any voluntary movements. Six months later, she developed tonic–clonic generalised seizures which were not controlled with phenobarbital (PB) and valproic acid (VPA). EEG showed generalized spike-wave complexes. ERG was abolished. CT scan demonstrated severe cerebral and cerebellar atrophy as well
Fig. 1. Age of Spanish patients with INCL at time of appearance of clinical signs and symptoms.
71
300
M.S. Pérez Poyato et al. / Gene 499 (2012) 297–302
as hypodensity in the gray-matter structures. The patient died at 12 years of age due to respiratory infection. 3.1.2. Family 2 Patient 2 is the second child born to non-consanguineous Caucasian parents in 1983. The neonatal period was unremarkable. He could not sit unaided until he was 8 months. He was able to walk with support but never achieved independent walking. He was admitted to hospital at 19 months of age because he could not sit unaided and had lost the purposeful hand use and speech, as well as the ability to maintain eye contact. He showed characteristic knitting hyperkinesias of the upper limbs and his head circumference was 46 cm (−2 SD). EEG was abnormal with slowing of the rhythmic activity. CT scan showed mild generalized cortical atrophy. Three months later the myoclonic jerks appeared in the upper part of the body; he showed erratic eye movements, axial hypotonia and high extensor tone of the lower extremities. At the age of 2 y, 4 m he presented massive myoclonic seizures and did not respond to any visual stimuli. Head circumference was 46 cm (−3 SD). Fundoscopic examination was normal. By the age of 3 y, 4 m he was tetraplegic, without response to environmental stimuli, and his head circumference was 47 cm (−3 SD). He developed generalized seizures that were resistant to therapy with VPA, PB and clobazam (CLB). EEG showed very low voltage, loss of rhythmic components, irregular discharges of sharp waves, and spike-wave complexes in different locations. ERG was abolished. VEP evidenced decreased amplitudes and delayed latencies. At 5 years of age, head circumference remained at 47 cm (−4 SD), EEG was completely hypoactive and brain MRI showed severe cortical cerebral atrophy involving cerebellum and the entire brain stem. The entire white matter was extremely hyperintense, suggesting demyelinitation. The patient died at 11 years of age in a vegetative state due to recurrent pneumonia. 3.1.3. Family 3 Patient 3 was born in 1994 after an uneventful pregnancy. The patient was the second daughter of healthy, unrelated Caucasian parents. Her older sister was diagnosed with Edward syndrome and her younger sister suffers from INCL (patient 4). At the age of 14 months the patient was able to walk unaided but had frequent falls and an unsteady gait. She showed normal eye contact. At 19 months of age she showed continuous irritability and impaired social interaction. Two months later, she lost the ability to walk and began to lose her previously acquired speech. She was referred to hospital at 2 y, 5 m, of age because she could not grasp objects and could not sit without support. She showed absence of verbal communication and impaired social interaction. Her head circumference was 47 cm (−1 SD). EEG showed slowing and poorly structured cerebral activity. MRI showed cortico-subcortical atrophy, thinning of the corpus callosum, and abnormal increased T2 signal intensity in the white matter. Fundoscopic exam showed bilateral papillary pallor and VEP was normal. At 3 y, 5 m of age, she was blind, had difficulty swallowing, and sporadic myoclonic jerks in upper limbs. Physical examination revealed poor head control and generalized spasticity with spontaneous ankle clonus. Fundoscopic examination showed optic nerve atrophy. MRI demonstrated progressive cerebral and cerebellar atrophy. Over the following year, she developed refractory tonic–clonic generalized and partial seizures. She was treated with PB and gabapentine. EEG background was undifferentiated and severely depressed. Head circumference remained at 47 cm (−2 SD). At the age of 7 years, she was tetraplegic and blind. MRI abnormalities included severe progression of the supra and infra-tentorial brain atrophy. The patient became bedridden and died at the age of 11 years. Patient 4 was born in 2001 and she is the younger sister of patient 3. She began to walk at 13 months of age with unsteady gait and frequent falls. At the age of 19 months she was unable to walk unaided, lost previously acquired speech and showed poor visual contact. She suffered from continuous irritability and insomnia. Two moths later,
72
she was unable to support herself sitting and had no grasping ability. Neurological examination showed brisk deep tendon reflexes and head circumference was 47 cm (0.0 SD). Fundoscopic examination was normal. EEG revealed abnormally slow background activity. MRI brain imaging showed diffuse cortico-subcortical cerebral atrophy. At the age of 2 y, 9 m, she lost head control, and sporadic myoclonic jerks were observed. She had spasticity of the limbs and head circumference remained at 47 cm (− 1 SD). EEG showed diffuse, irregular high-voltage slow waves as well as a progressive attenuation of amplitude in background activity. Fundoscopic exam revealed bilateral papillary pallor. ERG showed decreased amplitude. At 4 y, 6 m of age she developed generalized myoclonic and partial seizures that were refractory to lamotrigine, phenobarbital and levetiracetam combination therapy. EEG was isoelectric. She became tetraplegic, blind and dysphagic; head circumference remained at 47 cm (− 2 SD). The patient is now 9 years old. She is bedridden with poor response to environmental stimuli and survives in a vegetative state. 3.1.4. Family 4 Patient 5 was born to consanguineous Caucasian parents in 1997; his mother suffers from mental retardation. Pregnancy, delivery and neonatal period were uneventful. Initial psychomotor development was normal up to the age of 12 months. The development stopped and 3 months later he had an unsteady gait with frequent falls. EEG was normal. CT scan showed mild generalized cortical atrophy and transfontanelar ultrasonography revealed enlargement of the frontal horns of the lateral ventricles. At 19 months of age, psychomotor development was markedly regressed: he could not sit unaided and had lost acquired hand skills and speech, as well as the ability to maintain eye contact. He showed stereotypical hand-washing movements. EEG was abnormal with slowing of the rhythmic activity. Fundoscopic examination was normal. MRI showed widespread supratentorial atrophy, enlargement of the ventricles and abnormal increased T2 signal intensity in the subcortical and deep white matter. At 2 y, 4 m of age he had lost head control and did not respond to any visual stimuli. Neurological examination showed brisk tendon reflexes in the lower extremities. Fundoscopic examination showed atrophy and narrowing of the retinal vessels and ERG was abnormal. He was admitted to a Catholic institution. When he was 3 y, 3 m old, he developed myoclonic jerks and, a few months later, sporadic tonic–clonic generalized seizures that were resistant to therapy with VPA, PB, CLB, clonazepam (CZP) and topiramate (TPM). EEG showed very low voltage and irregular discharges of sharp waves in different locations. By this time he was blind, dysphagic and tetraplegic. The patient died at 12 y, 6 m of age in a vegetative state. 3.1.5. Family 5 Patient 6 is the first child born to unrelated Caucasian parents in 2008. Sitting unaided was delayed until 12 months of age. At the age of 16 months he had an unsteady gait and was able to take only a few steps unaided. He had monosyllabic speech but never was able to respond to his name and showed limited interest in his surroundings. Head circumference was 46.5 cm (− 1 SD). EEG showed bilateral slow theta-delta activity as well as spike-slow wave complexes in the right temporal region. MRI brain imaging revealed corticosubcortical atrophy and T2 hypointensity in the thalami when compared to the striatum. Two months later he lost the ability to walk, and tremor of the upper limbs was observed. He also began to sleep poorly. At two years of age he had no voluntary hand use or speech. He showed intermittent hand-to-mouth stereotypy and brisk deep tendon reflexes; head circumference was 47.5 cm (−1 SD). MRI findings showed progression of the cortico subcortical cerebral atrophy. Five months later neurological examination showed spasticity with spontaneous ankle clonus. ERG evidenced cone amplitude and implicit time delay in both eyes. VEP and fundoscopic examination were normal. He is presently 3 years old and has not developed seizures to date.
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3.2. Enzymatic and molecular studies
4. Discussion
Partial deficiency of PPT1 activity was found in patients 3 and 6; levels were undetectable in patients 4 and 5. Mutations in the CLN1 gene were identified in two families: two patients harbor the c.541 G > A (p.Val 181Met) mutation in homozygosis (family 3, patients 3 and 4) and the third patient is a heterozygous compound for two novel mutations, c.533A > T (p.Glu 178Val) and c.722 C > T (p.Ser241Leu) (family 5, patient 6). In the remaining two patients, data on PPT1 activity were not assessed and DNA was not available at that time. The diagnosis was made based on a typical clinical course compatible with ICNL and ultrastructural studies that showed mixed profiles, predominantly GROD.
INCL has been widely studied in Finland and it seems to be much less frequent compared to JNCL in Spain (Perez-Poyato et al., 2011). Our series of six patients with INCL is in agreement with other published cases from southern European countries and USA (Baumann and Markesbery, 1982; Cardona and Rosati, 1995; Santorelli et al., 1998; Teixeira et al., 2003; Veneselli et al., 2000). In this study, the age at disease onset ranged from 8 to 15 months as previously described (Santavuori et al., 1973, 1992; Takano et al., 2008) while other authors found it ranged up to 18 months (Oishi et al., 1999; Santavuori et al., 1974; Topcu et al., 2004). Delayed motor skills (Baumann and Markesbery, 1982; Santavuori et al., 1974, 1992) and an unsteady gait were observed as initial symptoms of the disease. We observed delayed motor development as the first symptom when the disease began before 12 months of age, while motor impairment manifested mainly by ataxia was the leading sign when the disease began later. Cognitive decline was observed between 16 and 20 months of age (Santavuori et al., 1992; Santorelli et al., 1998) and has been reported at 12–18 m or even at an earlier age (Baumann and Markesbery, 1982; Santavuori et al., 1973, 1974) (mean, 15 months) (Santavuori, 1988). Careful clinical assessment regarding the developmental skills in our patients allowed us to observe that it is characterized by motor impairment, cognitive decline and autistic features. We were not able to apply the Weill Cornell LINCL scale (Worgall et al., 2007) in our series because most patients never acquired language and motor deterioration was much faster than in LINCL patients. In our series, patients 4 and 6 showed decreased amplitude of ERG as well as slight or no abnormality on fundoscopy as described by Takano et al. (2008). Also, ERG was abolished at the age of 3 years,
3.3. Neuropathological examination (patient 1) Severe atrophy involved the grey and white matter of the cerebrum, cerebellum and brain stem (Fig. 2A). Marked loss of neurons occurred in the cerebral and cerebellar cortices, striatum and thalamus, and less severely in the nuclei of the brain stem, accompanied by reactive astrocytes, microglia and macrophages filled with lipid droplets. Remaining neurons showed a granular cytoplasm with autofluorescent, PASpositive and sudanophilic deposits (Fig. 2B and C). Electron microscopic examination revealed the presence of membrane-bound fine granular dense osmiophilic deposits (GRODs) (Fig. 2D and E). 3.4. Biopsy (patients 2, 4 and 5) GRODs deposits were seen in endothelial cells, pericytes and fibroblasts in patients 2 and 4 as well as in muscle in patient 5.
Fig. 2. Neuropathological findings in patient 1. Legend: A. Coronal section of the brain showing severe atrophy of the cerebral cortex, basal ganglia and white matter, together with moderate enlargement of the lateral ventricles due to generalized brain loss. B. Preserved neurons in the thalamus are filled with PAS positive material, × 200. C. Neurons also show massive autofluorescent intracytoplasmic material × 400. D and E. Electron microscopic examination shows abundant GRODs in remaining cells × 20,000.
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as previously reported (Arsenio-Nunes and Goutieres, 1975; Haltia, 2003; Santavuori et al., 2000; Vanhanen et al., 1997). Our results suggest that visual failure may appear in the early stages of the disease, simultaneously with the neurological symptoms leading quickly to blindness. Ophthalmological findings are not found at the earlier stage of the disease whereas ERG abnormalities, especially a marked loss in amplitude, are early findings. Psychomotor regression was evident between 2 and 3 years of age. All patients showed loss of sitting ability, purposeful hand use and head control. Most authors reported myoclonic jerks between 16 and 24 months of age (Santavuori, 1988; Santavuori et al., 1973, 1974; Santorelli et al., 1998; Takano et al., 2008) which occurred at a later age in our series. Epilepsy was the last symptom of the disease; even patient 6 has not developed seizures to date. We think that epilepsy can appear at any time during the course of the disease. EEG was the first abnormal neurophysiologic test which showed slowing of the rhythmic activity in most patients (Santavuori et al., 1973, 1974; Takano et al., 2008). Regarding brain MRI, our patients showed similar findings to what has previously been reported by other authors (Santavuori et al., 1992, 2000; Vanhanen et al., 1995, 2004). A relationship between the absence of PPT1 activity and GROD (Das et al., 1998) and mutations in CLN1 gene and GROD has been reported (Mole et al., 2005; Wisniewski et al., 2000). The present results confirm that mutations in PPT1/CLN1 gene are associated with reduced PPT1 activity in INCL, as previously reported (Vesa et al., 1995). Most of the identified mutations cause a severe early onset INCL phenotype, although mutations in PPT1/CLN1 gene may have a milder course of the disease (Bonsignore et al., 2006; Das et al., 2001; Simonati et al., 2009; Waliany et al., 2000) including juvenileonset phenotype in Latin American patients (Kohan et al., 2009). There is at present a strategy for the diagnosis of the NCLs (Kohan et al., 2009) and an international online clinical registry for genotype/phenotype correlation: http://www.ucl.ac.uk/ncl. The p.Val181Met mutation in CLN1 gene which has been previously described (Das et al., 2001; Teixeira et al., 2003) was found in homozygosis in family 3. Moreover, the clinical features and the evolution of the disease in our patients confirm that p.Val181Met mutation is associated with the most severe INCL phenotype when present in the homozygous state. Regarding the two novel mutations, c.533A > T (p.Glu178Val) is predicted to affect the donor splice site for intron 5 (NetGene2 software) and c.722 C > T (p.Ser241Leu) is predicted to affect protein function (classified as probably damaging by Polyphen2 software). Patient 6, who was found to harbor these mutations, is characterized by a milder course of the disease without epilepsy to date In summary, INCL is characterized by a severe progressive clinical course. The characteristic clinical findings as well as their chronological evolution might be helpful to identify patients affected by this rare disease. Early diagnosis is essential in order to provide genetic counselling to affected families. Our series might contribute to the study of the genotype–phenotype correlation in patients with INCL in the Mediterranean area. Acknowledgements We thank Dra. M. Rebollo and Dra I. Alonso Colmenero for the valuable support and we acknowledge the indispensable cooperation of the families of the patients for participating in this study. References Arsenio-Nunes, M.L., Goutieres, F., 1975. An ultramicroscopic study of the skin in the diagnosis of the infantile and late infantile types of ceroid-lipofuscinosis. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 38, 994–999.
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Síntesis de los resultados x
La enfermedad se inició entre los 8 y 15 meses con retraso en el desarrollo motor y marcha inestable.
x
El retraso en el desarrollo motor ocurrió en los pacientes que iniciaron la enfermedad antes de la edad de 12 meses, mientras que la ataxia se observó en aquellos pacientes que iniciaron la enfermedad a una edad más tardía.
x
El deterioro cognitivo apareció entre los 16 y 20 meses de edad.
x
Los pacientes 4 y 6 presentaron un fondo de ojo normal a la misma edad que el ERG mostró un descenso de la amplitud. Se observaron respuestas abolidas en el ERG de todos los pacientes a los 3 años de edad.
x
Las crisis mioclónicas aparecieron a partir de la edad de 2 años y la epilepsia caracterizada por crisis generalizadas y parciales, fue el último síntoma de la enfermedad, incluso el paciente 6 no ha presentado epilepsia a los 3 años de edad. El EEG mostró un enlentecimiento de la actividad de base entre los 16 y 20 meses de edad en la mayoría de los pacientes.
x
La pérdida de la sedestación, manipulación y del control cefálico ocurrió entre los 2 y 3 años de edad.
x
La mutación V181M en el gen CLN1 fue identificada en homocigosis en la familia 3. Las 2 nuevas mutaciones en el gen CLN1 identificadas en este estudio corresponden al paciente que en el momento actual no ha desarrollado epilepsia.
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2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: mutations in the CLN2 gene and clinical course in Spanish patients María del Socorro Pérez-Poyato, Mercé Pineda Marfa, Isidre Ferrer Abizanda, Laia Rodriguez-Revenga, Victoria Cusí Sánchez, Maria J Martínez González, Jesús Eiris Puñal, Alfonso Verdú Pérez, M Mar García González, Antonio Martínez Bermejo, Elena Martín Hernández, M Josep Coll Rosell, Laura Gort, Montserrat Milá Recansens. Journal of Child Neurology (aceptado, pendiente de publicación)
La forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea es la segunda forma clínica más frecuente de las LNCs. Las mutaciones en el gen CLN2 pueden causar además del fenotipo clásico, otros con inicio de la enfermedad en edad juvenil y un curso clínico más benigno e incluso se han descrito pacientes con inicio de la sintomatología en el primer año de vida (Simonati et al. 2000, Ju et al. 2002). Las dos mutaciones más comunes en el gen CLN2, la mutación de splicing c.509-1G>A y la mutación sin sentido c.622 C>T, se observan en el 60-78% de los pacientes con LNCIT (Zhong et al. 1998, Sleat et al. 1999). Este estudio da a conocer la historia natural y progresión de la enfermedad en 12 pacientes con LNCIT mediante la evaluación de la regresión del desarrollo psicomotor (edad a la que se inicia la pérdida de los hitos del desarrollo psicomotor previamente adquiridos), la epilepsia (edad de inicio de las crisis epilépticas) y la edad de inicio de los principales síntomas y signos. Describimos la correlación con el genotipo y el espectro mutacional del gen CLN2 en la población española.
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Original Article
Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis: Mutations in the CLN2 Gene and Clinical Course in Spanish Patients
AQ 2
Journal of Child Neurology 00(0) 1-9 ª The Author(s) 2012 Reprints and permission: sagepub.com/journalsPermissions.nav DOI: 10.1177/0883073812448459 http://jcn.sagepub.com
Marı´a S. Pe´rez-Poyato, MD1, Merce´ Pineda Marfa, MD, PhD1,2, Isidre Ferrer Abizanda, MD, PhD3, Laia Rodriguez-Revenga, BS, PhD2,4, Victoria Cusı´ Sa´nchez, MD, PhD5, Marı´a J Martı´nez Gonza´lez, MD6, Jesu´s Eiris Pun˜al, MD7, Alfonso Verdu´ Pe´rez, MD, PhD8, M Mar Garcı´a Gonza´lez, MD9, Antonio Martı´nez Bermejo, MD, PhD10, Elena Martı´n Herna´ndez, MD, PhD11, M Josep Coll Rosell, PhD12, Laura Gort, PhD2,12, and Montserrat Mila´ Recansens, PhD2,4
Abstract Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (Jansky-Bielchowsky disease) is a rare disease caused by mutations in the CLN2 gene. We report the clinical outcome and correlate with genotype in 12 Spanish patients with this disease. Psychomotor regression, epilepsy, and other clinical symptoms/signs were assessed. Age at onset of clinical symptoms ranged from 18 months to 3.7 years, and they included delayed speech and simple febrile seizures followed by epilepsy. Partial seizures and myoclonic jerks occurred at an earlier age (median 3.4 and 3.7 years, respectively) than ataxia and cognitive decline (median 4 years). Clinical regression was initiated by loss of sentences (median 3.7 years) followed by loss of walking ability and absence of language (median 4.5 years). Patients showed blindness and lost sitting ability at similar age (median 5 years). We report 4 novel mutations in the CLN2 gene. This study provides detailed information about the natural history of this disease. Keywords clinical outcome, CLN2 gene, Jansky-Bielschowsky disease, late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, tripeptidyl peptidase 1 Received February 24, 2012. Accepted for publication April 22, 2012.
Neuronal ceroid lipofuscinosis is one of the most common groups of progressive neurodegenerative diseases in childhood.1 Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
(Jansky-Bielchowsky disease) is the second most frequent form of the 8 neuronal ceroid lipofuscinosis lysosomal storage disorders2 all of which are genetically determined diseases.3
1
Department of Pediatric Neurology, Hospital Sant Joan de De´u, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Spain 3 Institute of Neuropathology, Service of Anatomical Pathology, IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge, Barcelona, CIBERNED, Spain 4 Biochemical and Molecular Genetics Department, IDIBAPS, Hospital Clı´nic, Universitat de Barcelona, Spain 5 Service of Anatomical Pathology, Hospital Sant Joan de De´u, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain 6 Department of Pediatric Neurology, Hospital Cruces, Baracaldo, Bizkaia, Spain 7 Department of Pediatric Neurology, Hospital Clı´nico Santiago de Compostela, Spain 8 Department of Pediatric Neurology, Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain 9 Department of Pediatric Neurology, Hospital de Figueras, Girona, Spain 10 Department of Pediatric Neurology, Hospital La Paz, Madrid, Spain 11 Department of Pediatric Neurology, Pediatric Unit of rare disease, Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain 12 Biochemical and Molecular Genetics Department, Inborn Errors of Metabolism (IBC), Hospital Clı´nic, Barcelona, Spain 2
Corresponding Author: Montserrat Mila´ Recasens, PhD, Biochemical and Molecular Genetics Department, IDIBAPS, Hospital Clinic, Universitat de Barcelona, Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Carrer Villarroel, 170, Barcelona 08036, Spain Email:
[email protected]
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Journal of Child Neurology 00(0)
Eight causal genes, CLN10/CTSD, CLN1/PPT, CLN2/TTP1, CLN3, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8, CLN8, have been identified in childhood (http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml). Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis is rare with an incidence of 0.46 per 100 000 live births in West Germany4 and an estimated prevalence of 0.6 to 0.7 per 1000 000 in Northern Europe.5 It is caused by mutations in the CLN2 gene, located on chromosome 11q15,6 which encodes the lysosomal enzyme tripeptidyl peptidase 1.7 Ultrastructural examination of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis storage bodies reveals curvilinear bodies (CV) in cells of affected individuals.8 Clinically, late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis is characterized by epilepsy at the age of 2 to 4 years, which may be manifested by partial or secondary generalized seizures as well as generalized tonic-clonic or absence seizures, but myoclonus is the most characteristic feature. Sometimes delayed speech may precede epilepsy. Regression of acquired skills becomes evident soon thereafter, followed by ataxia, extrapyramidal, and pyramidal signs. Visual failure leads to blindness by 5 or 6 years of age. The patients usually die between 6 and 15 years of age.9,10 Mutations in the CLN2 gene may give rise not only to classical late-infantile but also to juvenile onset of the disease with a milder clinical course.3,11–15 Furthermore, patients with onset of the disease in the first year of life have been reported.16,17 Two common mutations, the splicing mutation c.509-1G>A and the nonsense mutation c.622 C>T, account for approximately 60% to 78% of patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.18,19 The clinical features of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis are clearly defined and the progressive deteriorating course of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis has been assessed by clinical rating scores (modified Hamburg Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale, Weill Cornell Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale).20,21 In this study, we report the clinical outcome and correlate with genotype in 12 Spanish patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.
Patients and Methods From 1979 to 2011, a total of 12 Spanish patients (8 males, 4 females) with a mean age of 7.4 years (range 4-14) from 10 unrelated families were diagnosed with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. The study was approved by the Ethics Committee of Hospital Sant Joan de De´u in Barcelona, which was the reference hospital for the study. Written informed consent was obtained from all patients, parents, or legal guardians. Data from each patient were collected from the patient’s medical record and completed by information provided by the physicians in charge and parents. The review of the medical records and the interviews was conducted by a single investigator. Data were entered into a database previously reported22 with 50 items that included age at diagnosis; initial symptom; age at regression of acquired skills; type of seizures (myoclonic, myoclonic-atonic, partial, generalized tonic-clonic, secondarily generalized, atypical absence); main signs and symptoms; electroencephalographic findings; ophthalmologic
80
data; electroretinographic findings; visual evoked potentials; enzymatic assays (tripeptidyl peptidase 1); ultrastructural data and molecular studies. Neurophysiological (electroretinography, visual evoked potentials), neuroimaging (brain magnetic resonance imaging [MRI], computed tomography scanner), and ophthalmologic studies were available for all patients. Electroretinography was performed in 9 patients at least once during the course of the disease. Visual evoked potentials were performed in 7 patients and ophthalmologic evaluations in 11. All patients underwent neuroimaging studies. Electron microscope examinations of biopsied tissues were the main morphological diagnostic technique being obtained according to routine methods. The histologic examination of biopsy samples was carried out in 9 patients, including biopsies of the skin (4 patients), conjunctiva (2 patients), appendix (2 patients), and muscle (1 patient). The tissue samples were fixed in 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated through graded ethanol and embedded in epoxy resin. Semithin sections were stained with toluidine blue and selected ultra-thin sections with uranyl acetate and lead citrate. Tripeptidyl peptidase 1 activity was measured in samples of leukocytes or fibroblasts of 8 patients. The fluorometric enzymatic analyses were performed using Ala-Ala-Phe-7-amido-4-metilcoumarina (Sigma ) as substrate. Protein measurement was performed according to the method of Lowry et al (1951).23 Molecular genetics studies were carried out in 9 patients. DNA was not available in 3 patients, as 1 patient died before genetic studies were available (case 1) and 1 family did not approve this study (cases 4a and 4b). DNA extraction from whole blood was performed using an automatic MagnaPure system (Roche Diagnostics ) according to the manufacturer’s instructions. The presence of mutations was assessed by direct sequencing of the 13 exons of the CLN2 gene using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) and an ABI3130 automatic sequencer (Applied Biosystems). The primary endpoints of the study were the assessment of psychomotor regression (time to reach regression of acquired skills), epilepsy (age at onset of seizures), and the age at onset of main clinical symptoms/signs of the disease. Nonparametrical survival estimation was performed by means of a Kaplan-Meier analysis. The time variable was computed as the time interval from birth to the onset of psychomotor regression, epilepsy, and clinical symptoms/ signs of the disease. In the absence of this information, the followup time was censured at the last visit. Data were analyzed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) computer program (version 17.0).
Results Enzymatic, Molecular Studies, and Ultrastructural Findings Partial deficiency of tripeptidyl peptidase 1 activity was found in 8 patients, 6 of them also showed mutations in the CLN2 gene (cases 5, 6, 7, 8a, 8b, and 9). In the remaining 4 patients, data on tripeptidyl peptidase 1 activity were not assessed; 3 of these patients belonged to 3 unrelated families harboring mutations in the CLN2 gene (cases 2, 3, and 10) and in the remaining patient the diagnosis was made by a typical clinical course compatible with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
AQ 3
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Pe´rez-Poyato et al
3 (95% CI 3.5-4.7) and generalized tonic-clonic seizures appeared in 58% of patients at a median age of 4 years (95% CI 3.3-4.6). Continuous myoclonus was observed in 92% of patients at a median of 4.7 years (95% CI 4.2-5.2). KaplanMeier estimates of the age of the patients at the time of appearance of seizures are shown in Figure 2B.
Clinical Signs and Symptoms
AQ 1
Figure 1. Curvilinear inclusions in fibroblasts in one case of CLN2 mutation (ultrathin section stained with uranyl acetate and lead citrate, 42 000).
and ultrastructural studies that showed curvilinear bodies inclusions (case 1). Mutations in the CLN2 gene were present in 10 cases (8 unrelated) (Table 2). The nonsense mutation c.622 C>T leading to R208stop accounted for 20% of the CLN2 mutated chromosomes and the splicing mutation (IVS5-1G>C) for a 6%. Electron microscopy examination of biopsies revealed the presence of membrane-bound curvilinear inclusions in various cell types including endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, fibroblasts, Schwann cells, and glands depending on the tissue available for study. Curvilinear inclusions in fibroblast in a case of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis are shown in Figure 1. Individualized clinical, enzymatic, and ultrastructural data are shown in Table 1.
Regression of Acquired Skills As shown in Table 3, at the time of the study all patients had lost the ability to speak in full sentences at a median age of 3.7 years (95% CI 3.1-4.3). Loss of walking ability and complete absence of language appeared in 92% of patients at a median age of 4.5 years (95% CI 4.3-4.6 vs 95% CI 4.1-4.8). The median age at which patients became wheelchair bound was quite similar to that which they lost their sitting ability, purposeful hand use and urinary sphincter control. Dysphagia was observed at a median age of 5.4 years (95% CI 4.4-6.3). Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of regression of acquired skills are shown in Figure 2A.
Epilepsy Myoclonic jerks were observed in all patients at a median age of 3.7 years (95% CI 3.4-4) and partial seizures with secondary generalization were reported in 83% of patients at a median of 3.4 years (95% CI 2.9-3.8). Myoclonic-atonic seizures were observed in 75% of patients at a median age of 4.1years
The presenting symptoms included seizures (6 patients), delayed speech (5 patients), and clumsiness (1 patient); they were observed between 18 months and 3.7 years of age (mean 2.2 years). Initial seizures were partial status epilepticus (case 4a), partial (case 4b) and simple febrile that were followed by myoclonic-atonic seizures (cases 1, 9), myoclonic jerks (case2), and generalized seizures (case5) (Table 1). All patients developed ataxia at a median age of 4 years (95% CI 3.9-4.1), and cognitive decline was observed in 92% of patients at a similar age (median 4 years, 95% CI 3.5-4.4) whereas visual failure appeared at an earlier age (median 3.8 years, 95% CI 3.2-4.4). Tremor occurred in 92% of patients earlier than both spasticity (median age 4.9 years; 95% CI 3.8 - 5.9) and blindness (median age 5.1 years; 95% CI 4.65.6). Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of appearance of clinical signs and symptoms are shown in Figure 2C. The MRI abnormalities in a patient with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis are shown in Figure 3.
Discussion Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis occurs worldwide and it seems to be less frequent compared to the juvenile form in Spain.22 The main clinical features and ultrastructural data of this disease have been previously described.8,24 However, there have been no reports of the rate of disease progression and its correlation with mutations in the CLN2 gene in our country. Our series was quite homogeneous both clinically and pathologically whereas clinical heterogeneity in late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis has been previously described.25 The age at onset of the disease ranged between 18 months and 3.7 years (mean 2.2 years), similar to what has been previously described by Topcu et al26 and other authors have reported onset between 2 and 3.5 years27 and up to 4 years.14,28 Careful clinical assessment regarding the regression of acquired skills allowed us to observe that it may be initiated by the onset of loss of sentences by 3 years of age. During the second stage of the disease, patients lost their walking ability and showed nonverbal communication. Finally, patients lost their sitting ability, purposeful hand use, and urinary control sphincter and became wheelchair-bound at a median age of 5 years2 followed by dysphagia within a few months. The initial manifestations of the disease were delayed speech development in patients who never completely acquired language capacity2,8,29 and simple febrile seizures followed by epilepsy as reported occasionally.12,28 An initial diagnosis of
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4
82
M
F
M
F
8a
8b
9
10
4
7
6*
6
*
11
6*
No
No
No
No
No
No
No
No
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14
No
6*
*
No
Yes
7*
Yes
9*
10*
Consanguinity
Age (y)
Simple febrile seizures Delayed speech
Delayed speech
Clumsiness
Delayed speech
Simple febrile seizures Delayed speech
Partial status epilepticus Partial seizures
Simple febrile seizures Delayed speech
Simple febrile seizures
Presenting symptom
2/4
2. 5 / 3
2/2
2/6
2/7
2/4
1. 6 / 7
3/4
3.4 / 5
2/7
3.7 / 6
2/6
Myoclonic-atonic (2 y 6 mo) Partial (3 y 3 mo)
Partial (3 y 5 mo)
Generalized (3 y 4 mo) Partial (3 y 8 mo)
Partial (2 y 11 mo)
Generalized (4 y)
Partial status epilepticus Partial seizures
Myoclonic-atonic (4 y 9 mo) Generalized/Partial (3 y 7 mo)
Myoclonic-atonic (3 y 7 mo)
Seizures (age, y/mo)
3 y 9 mo/4 y
2 y 6 mo/3 y 6 mo
3 y 7 mo/5 y
4 y 3 mo/6 y
3 y 10 mo/6 y
3 y 7 mo/4 y
3 y 9 mo/3 y 11 mo 5 y/7 y
3 y 7 mo/4 y 3 mo
3 y 10 mo/5 y 6 mo 3 y/5 y
4 y 4 mo/4 y 9 mo
Myoclonus jerks/ continuous myoclonus (age, y/mo)
4y
3 y 6 mo
4 y 10 mo
4 y 3 mo
4y
3 y 3 mo
5 y 6 mo
3 y 6 mo
3 y 7 mo
3 y 6 mo
4y
4y
Cognitive decline (age, y/mo)
3 y 9 mo
4y
4y
4 y 6 mo
4y
3 y 7 mo
5 y 5 mo
4y
4 y 2 mo
3 y 9 mo
3 y 10 mo
4y
Ataxia (age, y/mo)
Papillary pallor (3 y 10 mo)
Peripheral pigmentary clumping (5 y) Peripheral pigmentary clumping (5 y) Normal (3 y)
Normal (3 y 4 mo)
Normal (3 y 9 mo)
Normal (6 y)
ND
Papillary pallor (5 y) Optic nerve atrophy (7 y) Papillary pallor (5 y 6 mo) Papillary pallor (3 y) Optic nerve atrophy (5 y) Papillary pallor (5 y)
Ophthalmologic findings (age, y/mo)
# voltage (3 y 9 mo)
ND
ND
Giant responses (3 y 4 mo) Normal (4 y 6 mo)
ND
ND
Delayed latency (4 y) ND
Giant responses (5 y 3 mo) Abolished (5 y 6 mo)
Normal (4 y 9 mo)
VEP (age, y/mo)
Normal (3 y 7 mo) # voltage (3 y 9 mo)
ND
Normal (3 y 7 mo) Normal (4 y 5 mo) ND
Normal (3 y 5 mo) ND
Abolished (4 y)
Decreased amplitude (4 y 9 mo) #voltage, (5 y 3 mo) Abolished (5 y 6 mo)
ERG (age, y/mo)
0.8 (125.1) 9,8 (403) 1.7 (223)
þ/þ (4 y) þ/þ (4 y 9 mo) þ/þ (3y 3 mo)
–/þ (3 y 4 mo)
Normal (3 y)
–/þ (3 y 5 mo)
–/þ (3 y 8 mo)
ND
13.10 (674)
11.3 (1003.1)
4.7 (1003.1)
21.20 (788.90)
2.9 (125.1)
þ/þ (5 y)
–/þ (3 y 4 mo)
ND
ND
ND
TPP1 activity nmol/h/mg (control)
-/þ (3 y 6mo)
- /þ (3y 10mo)
þ/þ (5 y)
Cerebral/ cerebellar atrophy (age, y/mo)
Abbreviations: CV, curvilinear bodies; (*), died; ERG, electroretinography; F, female; M, male; ND, not done or unknown; TPP1, Tripeptidyl peptidase 1; VEP, visual evoked potentials.
F
F
4b
7
M
4a
M
M
3
M
M
2
5
M
1
6
Sex
Case number
Age at first symptom/ age at diagnosis (y)
Table 1. Clinical features, enzymatic and ultrastructural studies in Spanish patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis
CV (skin)
ND
ND
CV (conjunctive)
CV (skin)
CV (skin)
CV (muscle)
ND
CV (skin)
CV (appendix)
CV (appendix)
CV (conjunctive)
Electron microscopy (biopsied tissue)
Pe´rez-Poyato et al
5
Table 2. Mutations in the CLN2 gene identified in Spanish patients
Case Nucleotide number Change 2
Mutation
6
c.797G>A c.1016G>A
Nonsense Del 3 p.R208X bp Frameshift after S408 Splice site Missense p.S293N 2nd mutation not found Missense p.R266Q Missense p.R339Q
7
c.509-1G>A c.165 C>T c.622C>T c.616C>T c.1506G>C c.827A>T
Splice site Missense Nonsense Missense Splice site Missense
3 5
8 9 10
c.622C>T c.12221224del c.17þ1G>T c.880G>A
Amino acid change/ predicted consequence Status
p.Q56X p.R208X p.R206C p.D276V
Compound heterozygous
Exon 6 Exon 8
1
Sleat et al 1997 This study
Homozygous Compound heterozygous
Intron 1 Exon 7
1 1
Kousi et al 2009 This study
Compound Heterozygous
Exon 7 Exon 8
1
Compound heterozygous Homozygous Compound heterozygous Homozygous
Intron 5 Exon 3
1
Exon 6 Exon 6 Intron 6
2 1
Exon 7
1
Mila`, personal communication Pal et al 2009 Sleat et al 1997 This study Sleat et al 1997 Mole et al 1999 This study Kohan et al 2009
Table 3. Age at the time of psychomotor regression, epilepsy, and clinical signs and symptoms Patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (n ¼ 12) Age, years median No impairment (95% CI) % patients Regression acquired skills Loss of walking ability Becoming wheelchair-bound Loss of sitting ability Loss of purposeful hand use Loss sentences No language Dysphagia Urinary incontinence Epilepsy Myoclonic-atonic seizures Myoclonic jerks Continuous myoclonus Partial seizures Generalized tonic-clonic Atypical absence seizures Clinical signs and symptoms Cognitive decline Visual failure Blindness Tremor Ataxia Spasticity
4.5 (4.3-4.6) 5 (4-5.9) 5 (4.7-5.2) 5 (4.4-5.5) 3.7 (3.1-4.3) 4.5 (4.1-4.8) 5.4 (4.4-6.3) 5 (3.1-6.8)
8.3 16.7 33.3 25 0 8.3 25 41.7
4.1 (3.5-4.7) 3.7 (3.4-4) 4.7 (4.2-5.2) 3.4 (2.9-3.8) 4 (3.3-4.6) 4.3 (3.1-5.4)
25 0 8.3 16.7 41.7 33.3
4 (3.5-4.4) 3.8 (3.2-4.4) 5.1 (4.6-5.6) 4.2 (3.4-5) 4 (3.9-4.1) 4.9 (3.8-5.9)
8.3 16.7 8.3 8.3 0 16.7
Location
Number of individuals with mutation in the family Reference
late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis patients may be suspected in the presence of regression or delayed speech. Most authors have described epilepsy, which may be manifested by any type of seizures as the presenting symptom
between 2 and 4 years of age10,14,26,30–34 (median 3 years).35 The estimated median age at onset of partial seizures by age 3.4 years, followed by myoclonic jerks that occurred between 3 and 4 years of age in our patients, was similar to what previously has been reported. The clinical course of progressive myoclonic epilepsy became evident in our series during follow-up. Generalized tonic-clonic seizures have been reported as the most prominent seizure type of the disease26 and may be preceded by simple febrile seizures.12,28 In contrast, in our series generalized tonic-clonic seizures were less frequent. Epileptic seizures were absent in one late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis patient with protracted clinical course.13 All these data suggest that the spectrum of epilepsy in patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis may be surprisingly broad. Electroencephalographic findings in most patients showed spikes and slow waves superimposed on irregular slow background activity on both hemispheres, mostly in the posterior regions, during the course of the disease.36 In contrast to other authors, polyphasic high-voltage posterior spikes when photic stimulation was performed at low frequency were not observed in our series.30,37,38 In the present study, visual failure appeared after the onset of epilepsy32,35 and it has been reported at a median age of 4 years35 leading to blindness by 5 or 6 years.10,24 Ataxia was the third symptom of the disease after the onset of epilepsy38 and visual failure in our series, and it occurred at a similar median age as that of cognitive decline (4 years) although it may appear earlier (median 3.5 years, range 2.54.6) in patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.2 Severe motor impairment with hand tremor and spasticity was observed at advanced stages of the disease in our patients. We were not able to apply the rating scales of disease severity (scale developed by Steinfeld et al 2002; modified Hamburg
83
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Figure 2. Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of regression of acquired skills (A), epilepsy (B), and main signs and symptoms of the disease (C) among 12 Spanish patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.
Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale and Weill Cornell Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis Scale)20,21 because most patients had died and the remaining 3 patients were in an advanced stage of the disease at the time we undertook this study. Only a few studies have described neuroradiologic imaging in living patients with late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, demonstrating progressive gray matter atrophy prominent in the infratentorial regions. Brain MRI findings in our series were similar to previous reports.31,33,39 The relationship between the absence of tripeptidyl peptidase 1 activity and curvilinear bodies9,19,40 and mutations in CLN2 gene and curvilinear bodies has been reported.3,8 The present results confirm that mutations in the CLN2 gene are associated with reduced tripeptidyl peptidase 1 activity in late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, as previously reported.19 According to the present results, 2 of the CLN2 mutations identified by Sleat et al (1997)7 were less frequent (78% vs 26%) than previously reported in other studies.18–21 This may be due to the higher genetic heterogeneity present in the Spanish population, which is well known in other recessive diseases. On the other hand, in agreement with Kohan et al (2009)14 the presence of the p.D276V missense mutation was found in
84
homozygosis in 1 Paraguayan patient, in agreement with other cases of Latin American origin. In summary, the clinical progression of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis in our study population was relatively homogeneous. Genetic heterogeneity of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis was demonstrated in the 10 families studied. The knowledge of the natural history of the disease can provide basic information for designing health care plans and to prepare for future clinical trials. Acknowledgments This work has been approved by the responsible authorities of Hospital Sant Joan de De´u, which was the reference hospital for the study. The authors are grateful to Drs M. Rebollo and MI. Alonso Colmenero and the Spanish Association of Families Affected by NCL for the valuable support and indispensable cooperation. Statistical support was provided by Raquel Iniesta (Fundacio´ Sant Joan de De´u, ISCIII CA08/00151).
Author Contributions MSP-P contributed to the design of the study, reviewed the medical records, took part in the analysis and interpretation the data, wrote the first draft, and prepared the final draft of the manuscript. She had full
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7
Figure 3. Patient 8a at 3 years 8 months (A-B) and 4 years 6 months of age (C-D). Sagittal T1(A) and axial fluid-attenuated inversion recovery sections (B) showing mild cerebellar atrophy and a subtle increase in the periventricular white matter signal intensity. Sagittal T1(C) and axial fluid-attenuated inversion recovery sections (D) showing progression of the cerebellar and the supratentorial atrophy. The abnormal periventricular white matter signal intensity becomes more obvious.
access to study data and takes responsibility for the integrity of the study. MPM contributed to the design of the study and acquisition of data, participated in the statistical analysis, interpretation of data, writing of the manuscript, and approved the final draft. IFA performed histopathologic studies, contributed to analysis of data and drafting, reviewed the manuscript for intellectual content, and approved the final draft. LRR contributed to genetic studies and approved the final draft. VCS performed histopathologic studies and approved the final draft. MJMG, JEP, AVP, MMGG, AMB, and EMH provided case histories for the study, acquired data, reviewed the manuscript for intellectual content, and approved the final draft. MJCR and LG performed enzymatic studies, reviewed the manuscript for intellectual content, and approved the final draft. MMR was the principal investigator, performed the genetic studies, contributed to the design of the study and acquisition of data, participated in writing of the manuscript and approved the final draft. She had full access to study data and takes responsibility for the integrity of the study, and controlled the decision to publish.
Declaration of Conflicting Interests The authors declared no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article.
AQ 5
Funding The authors received no financial support for the research, authorship, and/or publication of this article.
Patient consent: Obtained
Ethical Approval The study was approved by the Ethics Committee of Hospital Sant Joan de De´u in Barcelona.
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8
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87
Síntesis de resultados x
La enfermedad se inició entre los 18 meses y los 3.7 años con crisis epilépticas (6 pacientes), retraso del lenguaje (5 pacientes) y torpeza motora (1 paciente). Las convulsiones febriles simples se observaron inicialmente seguidas de crisis mioclónicas, mioclono-atónicas, generalizadas y crisis de tipo parcial, incluyendo un caso de estatus epiléptico.
x
La pérdida de la capacidad para construir frases se observó en todos los pacientes a los 3.7 años de edad mediana y la pérdida de la deambulación y ausencia del lenguaje se observaron en el 92% de los pacientes a la edad mediana de 4.5 años. La edad a la que los pacientes fueron dependientes de silla de ruedas fue muy similar a la de la pérdida de la sedestación, manipulación y control de esfínteres (edad mediana 5 años).
x
Las crisis mioclónicas aparecieron en todos los pacientes a la edad mediana de 3.7 años y las crisis parciales se observaron en el 83% de los pacientes a los 3.4 años de edad mediana. Las crisis mioclono-atónicas ocurrieron en el 75% de los pacientes a los 4.1 años de edad mediana y las crisis tónico-clónicas generalizadas se observaron en el 58% de los pacientes a la edad mediana de 4 años. Las crisis mioclónicas continuas ocurrieron en el 92% de los pacientes a los 4.7 años de edad mediana.
x
El déficit visual ocurrió a la edad mediana de 3.8 años, después del inicio de la epilepsia, la ataxia se observó a los 4 años de edad mediana junto con el deterioro cognitivo y la ceguera ocurrió a la edad mediana de 5.1 años en el 92% de los pacientes.
x
La mutación c.622 C>T se identificó en el 20% de los cromosomas y la c.5091G>A en el 6%. Este trabajo aporta 4 nuevas mutaciones en el gen CLN2.
89
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y estudios genéticos en pacientes españoles
Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical course and genetic Studies in Spanish patients María del Socorro Pérez-Poyato, Montserrat Milá Recasens, Isidre Ferrer Abizanda, Raquel Montero Sánchez, Laia Rodríguez Revenga, Victoria Cusí Sánchez, Mª Mar García González, Rosario Domingo Jiménez, Rafael Camino León, Ramón Velázquez Fragua, Antonio Martínez-Bermejo, Mercé Pineda Marfa. Journal of inherited Metabolic Disease 2011; 34:1083-1093
La mayoría de los pacientes con la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea (LNCJ) son homocigotos para la deleción 1.02-kb en el gen CLN3 y presentan el fenotipo clásico, mientras que los pacientes heterocigotos compuestos para esta deleción pueden presentar fenotipos atípicos y un curso clínico más benigno de la enfermedad. La forma variante de LNCJ causada por mutaciones en el gen CLN1 es clínicamente muy similar a la producida por mutaciones en el gen CLN3. En este trabajo se establecen correlaciones genotipo-fenotipo en 24 pacientes con LNCJ divididos en dos grupos: aquellos con mutaciones en el gen CLN1 y / o GROD a nivel ultraesructural (grupo vLNCJ) y los que presentan mutaciones el gen CLN3 y / o FP a nivel ultraestructual (grupo cLNCJ). Se describe la historia natural de la enfermedad en ambos grupos de pacientes mediante la valoración del deterioro psicomotor considerando la edad a la que se inicia la regresión de los diferentes hitos del desarrollo psicomotor previamente adquiridos, la edad de aparición del deterioro cognitivo y la edad de inicio de los principales síntomas y signos de la enfermedad.
91
J Inherit Metab Dis DOI 10.1007/s10545-011-9323-7
ORIGINAL ARTICLE
Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical course and genetic studies in Spanish patients María-Socorro Pérez-Poyato & Montserrat Milà Recansens & Isidre Ferrer Abizanda & Raquel Montero Sánchez & Laia Rodríguez-Revenga & Victoria Cusí Sánchez & M. Mar García González & Rosario Domingo Jiménez & Rafael Camino León & Ramón Velázquez Fragua & Antonio Martínez-Bermejo & Mercè Pineda Marfà
Received: 6 January 2011 / Revised: 17 March 2011 / Accepted: 21 March 2011 # SSIEM and Springer 2011
Abstract Background Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis (JNCL, NCL3, Batten disease) is usually caused by a 1.02-kb deletion in the CLN3 gene. Mutations in the CLN1 gene may be associated with a variant form of JNCL (vJNCL). We report the clinical course and molecular studies in 24 patients with JNCL collected from 1975 to 2010 with the aim of assessing the natural history of the disorder and phenotype/genotype correlations. Patients and methods Patients were classified into the
groups of vJNCL with mutations in the CLN1 gene and/or granular osmiophilic deposit (GROD) inclusion bodies (n= 11) and classic JNCL (cJNCL) with mutations in the CLN3 gene and/or fingerprint (FP) profiles (n=13). Psychomotor impairment included regression of acquired skills, cognitive decline, and clinical manifestations of the disease. We used Kaplan-Meier analyses to estimate the age of onset of psychomotor impairment. Results Patients with vJNCL showed learning delay at an earlier age (median 4 years, 95% confidence interval [CI]
Communicated by: Sedel Frederic Competing interest: None declared. M.-S. Pérez-Poyato : R. Montero Sánchez : M. Pineda Marfà Departments of Pediatric Neurology and Clinical Biochemistry and Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBERER), Instituto de Salud Carlos III, Hospital de Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain M. Milà Recansens : L. Rodríguez-Revenga Biochemical and Molecular Genetics Department and Centre for Biomedical Research on Rare Diseases (CIBER-ER), Instituto de Salud Carlos III, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain M. Milà Recansens IDIBAPS, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain I. Ferrer Abizanda Department of Pathology, Hospital Universitari de Bellvitge, L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain V. Cusí Sánchez Department of Pathology, Hospital de Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain
M. M. García González Unit of Pediatric Neurology, Hospital de Figueres, Girona, Spain
R. Domingo Jiménez Unit of Pediatric Neurology, Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia, Spain
R. Camino León Unit of Pediatric Neurology, Hospital Reina Sofía, Córdoba, Spain R. Velázquez Fragua : A. Martínez-Bermejo Service of Pediatric Neurology, Hospital La Paz, Madrid, Spain
M. Pineda Marfà (*) Department of Pediatric Neurology, Hospital Sant Joan de Déu, Passeig de Sant Joan de Déu 2, E-08950 Esplugues de Llobregat, Barcelona, Spain e-mail:
[email protected]
93
J Inherit Metab Dis
3.1–4.8) than those in the cJNCL group (median 8 years, 95% CI 6.2–9.7) (P=0.001) and regression of acquired skills at a younger age. Patients with vJNCL showed a more severe and progressive clinical course than those with cJNCL. There may be a Gypsy ancestry for V181L missense mutation in the CLN1 gene. Conclusions The rate of disease progression may be useful to diagnose vJNCL or cJNCL, which should be confirmed by molecular studies in CLN1/CLN3 genes. Further studies of genotype/phenotype correlation will be helpful for understanding the pathogenesis of this disease.
JNCL due to mutations in CLN3 (Mitchison et al. 1998; Mazzei et al. 2002). The variation of distribution of different phenotypes of JNCL in various countries may be due to genetic differences and to date several disease point mutations have been identified (Hofmann et al. 1999) (http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml). This study was conducted to describe the clinical course and the results of neuropathological and molecular studies carried out in 24 Spanish patients with JNCL with the aim of assessing the natural history of the disease and to establish genotype/phenotype correlations. Subjects and methods
Introduction Neuronal ceroid lipofuscinosis (NCLs) is one of the most common groups of progressive neurodegenerative diseases in childhood (Goebel and Sharp 1998). The NCLs are autosomal recessive lysosomal-storage disorders characterized by a diffuse accumulation of lipofuscin and ceroid in neural and nonneural tissues. Electron microscopy studies remain essential to identify granular osmiophilic deposits (GROD), curvilinear profiles (CV), fingerprint profiles (FP) or mixedtype inclusions (Goebel 1996). Clinically, NCLs are characterized by seizures, progressive deterioration of cognition, motor function impairment (ataxia, spasticity), and vision loss. Phenotypes have been classified considering age of onset, clinical course, and ultrastructural morphology into infantile, late-infantile, juvenile, and adult forms (Goebel et al. 1999; Santavouri et al. 2000; Haltia 2003) The current genetic classification encompasses clinical heterogeneity with more severe and more benign phenotypes, depending mostly on how profoundly the genetic defect affects the function of the encoded protein (Goebel and Wisniewski 2004). To date ten forms with nine disease genes causing human NCL have been identified: CLN10/CTSD, CLN1/PPT, CLN2/TTP1, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8, CLN8, and CLCN6 (Siintola et al. 2006; Mole 2006). Juvenile NCL (JNCL; NCL3, Batten’s disease or Spielmeyer-Vogt-Sjögren’s disease) is the most common form in the United States and Europe (Wisniewski et al. 1998b). The most frequent mutation causing JNCL is a 1.02-kb deletion in the CLN3 gene on chromosome 16p12.1–11.2, accounting for about 80–85% of mutated alleles (The International Batten Disease Consortium 1995; Mole et al. 2005). Two different disease courses have been distinguished in JNCL patients. Most homozygous patients for the 1.02-kb deletion show classic JNCL (cJNCL). However, patients who are compound heterozygotes for this deletion may have atypical phenotypes, including a milder course of the disease (Lauronen et al. 1999). Mutations in the CLN1 gene produce a variant form of JNCL (vJNCL) which is characterized by the presence of GROD and which is clinically similar to
94
From 1975 to 2010, a total of 24 Spanish patients (11 males, 13 females) with a mean age 18.3 years (range 10–33) and from 18 unrelated families were diagnosed with JNCL. Eleven patients (median age 18 years, range 10–23) presented mutations in the CLN1 gene and/or GROD inclusion bodies (vJNCL group) and 13 patients (median age 18 years, range 10–33) harbored mutations in the CLN3 gene and/or FP profiles (cJNCL group). The study was approved by the Ethics Committee of Hospital Sant Joan de Déu in Barcelona, which was the reference hospital for the study. Written informed consent was obtained from all patients, parents, or legal guardians. Data from each patient were collected from the patient’s medical records and completed by information provided by the physicians in charge and the parents when necessary. The review of the medical records and the interviews were conducted by a single investigator (M.S.P-P.). A database with 50 items was developed to enter the data (Table 1), which included demographics; age at diagnosis; first symptom (delayed sitting /walking, seizures, visual failure, autistic behavior, attention deficit, delayed speech, learning delay, clumsiness, loss of speech); type of seizures (myoclonic, myoclonic-atonic, partial, generalized tonic-clonic, secondarily generalized, atypical absence); age at regression of acquired skills; cognitive decline; salient signs and symptoms; electroencephalographic findings (background abnormality, generalized and focal paroxysmal activity, atypical high voltage slow spikes and waves to low frequency photic stimulation in the posterior regions, vanishing EEG); ophthalmologic data (maculopathy, vessels attenuation, peripheral pigmentary clumping, optic nerve pallor/atrophy); electroretinographic findings (decreased amplitude, delayed latency, attenuation of cortical waves, extinguished); visual evoked potentials (VEP) (decreased amplitude, delayed latency, attenuation of cortical waves, abolished VEP, giant VEP); enzymatic assays (palmitoyl-protein thioesterase 1 [PPT1), tripeptidyl peptidase 1 [TTP1]); electron microscopy data; and molecular studies. Neurophysiological (electroretinography, VEP), neuroimaging (brain MRI, CT scan), and ophthalmologic studies
J Inherit Metab Dis Table 1 Items of the clinical database
Item#
Description
Item#
Description
1 2
Examination data Name and surname
26 27
Learning delay Mental retardation
3 4 5 6
Date and birth place Name of attending physician Age at examination Age at clinical diagnosis
28 29 30 31
Bradypsychia Autistic behavior Behavior disturbances Epilepsy
7 8
Age at structural diagnosis Age at molecular diagnosis
32 33
Type of seizures Anticonvulsants and response to treatment
9 10 11 12 13
Consanguinity Other family members with NCL Pregnancy Delivery Weight at birth
34 35 36 37 38
Visual failure Blindness Apraxic gait Ataxia Pyramidal signs
14 15
Early psychomotor development Age at onset of symptoms
39 40
Spasticity and retraction of limbs Electroencephalographic findings
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
First symptom Age at loss of walking ability Age at wheelchair-bound Age at loss of sitting ability Age at loss of purposeful hand use Age at loss of sentence Age at nonverbal communication Dysphagia Nasogastric tube/feeding button Age at urinary incontinence
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
Brain/cerebellar atrophy (MRI/CT) Ophthalmologic findings Electroretinographic data Visual evoked potentials Vacuolated lymphocytes Enzymatic assays Electron microscopic features Molecular studies Clinical form Age of death
were available for 22 of the 24 patients. Electroretinography was performed in 21 patients at least once during the course of the disease. All patients underwent EEG. Brain imaging studies were performed in 19 of 24 patients, and ophthalmologic evaluations in 18. Electron microscope examinations of biopsied tissues were the main morphological diagnostic technique being obtained according to routine methods. The histological examination of biopsy samples was carried out in 16 patients, including biopsies of the skin (nine patients), conjunctive (two patients), appendix (three patients), and muscle (two patients). The samples were fixed in 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer, post-fixed in osmium tetroxide, dehydrated through graded acetone or alcohol and embedded in epoxy resins. Semi-thin sections were stained with toluidine blue and selected ultra-thin sections with uranyl acetate and lead citrate. Palmitoyl-protein thioesterase (PPT-1) activity was measured in samples of leukocytes or fibroblasts of eight patients. The fluorimetric enzymatic analyses were performed using 4-methylumbelliferyl-6-thiopalmitoil β-Dglucoside (Moscerdam Substrates, Rotterdam, Holland) as substrate. Protein measurements were performed according to the method of Lowry et al. (1951).
In all patients, peripheral blood DNA samples were studied for the entire open reading frame and splice site (50 bp exon-intron boundaries) of the CLN1 and CLN3 genes. The only large deletion studied was 1.02-kb in the CLN3 gene. Molecular studies were performed by singlestrand conformation polymorphism analysis and sequencing of abnormal patterns in the CLN1 and CLN3 genes. Genetics studies were carried out on the most patients. DNA was not available in two patients. One patient died prior genetic studies were available (case 1) and the second family did not approve this study (case 8). The primary endpoint of the study was the assessment of psychomotor impairment (time to reach regression of acquired skills, cognitive decline, and clinical symptoms/ signs of the disease) in the groups of vJNCL and cJNCL. The age of onset of psychomotor impairment was taken as survival data (i.e., time interval from birth to the onset of psychomotor impairment). In the absence of this information, data were censored at the age at the last visit. Estimates were made using the Kaplan-Meier survival analysis and survival curves were compared using the logrank test. Adjustment for multiple comparisons was made using Bonferroni’s correction. Data were analyzed with the SPSS computer program (version 17.0).
95
96
a
a
F
M
F M
F
F
11a
12 13
14
15
F M
M
M
F
F F M F
M
M
10
9
8
a
7b
7a
6
a
4c 4d 4e 5
4b
4a
F
3a
a
F F
2a 2ba
13
14
19 17
18
24
26 25
29
33
17
12 12 10 23
18
19
20
23 17
18
No
Yes
No No
Yes
No
No No
No
No
Yes
Yes Yes Yes Yes
Yes
Yes
No
Yes Yes
Yes
/ / / /
7 2 1 8
7 / 10
4/6 5 / 13
2/7
7/7
4 / 18 5 / 15
6/6
6 / 18
6/8
3 4 2 4
4/6
2/9
2 / 11
3/8 4/7
Delayed walking 2 / 9
Learning delay
Loss of speech Visual failure
Delayed speech
Visual failure
Seizures Visual failure
Visual failure
Visual failure
Learning delay
Learning delay Clumsiness Delayed speech Learning delay
Learning delay
Delayed speech
Delayed speech
Delayed speech Loss of speech
Visual failure
Refractory
++/−
−/++
Controlled
Controlled
+++++/+++ Refractory −/++ Controlled
+++++/++
Controlled
−/++
Refractory
−/+++ Refractory Controlled
Refractory
−/+++
++/+++ −/++
Controlled
Controlled Controlled Controlled Refractory
Controlled
Controlled
Refractory
Refractory Refractory
Refractory
+++/−
+++/− +++++/− +++++/− +++++/++
++++/−
++++/−
+++/++
++++/− ++++/−
+++++/++
Peripheral pigmentary clumping / (10) Papillary pallor/ (10)
Papillary pallor/ (7) Normal / (7) NA/ (9)
Optic nerve atrophy/ (6) NA Papillary pallor/ (12) Optic nerve atrophy/ (17)
Papillary pallor / (16) NA Optic nerve pallor / (7) Papillary pallor / (11) Optic nerve atrophy/ (9) Optic nerve atrophy/ (8) NA / (7) NA / (7) NA / (7) Optic nerve atrophy/ (8) Optic nerve atrophy/NA Optic nerve atrophy/ (6)
6 / 11
M
1a
a
Age at first Myoclonic/ Response to Ophthalmologic symptom/ age generalized antiepileptic findings / extinguished at diagnosis tonic-clonic treatment ERG (age, years) seizures
Case Sex Age Consanguinity Presenting number years symptom
Table 2 Clinical features, enzymatic, and ultrastructural studies in JNCL Spanish patients
Normal NA
NA
Normal
−/− (7) −/− (9)
NA
NA
NA NA
NA
NA
+/+ (5) −/− (7)
+/− (7)
−/− (9)
NA +/− (15)
−/+ (15)
−/− (7)
vJNCL
Group
GROD, FP (appendix)
NA NA NA
GROD (skin)
GROD (appendix)
GROD (conjunctiva)
FP, GROD (skin)
FP, CV (appendix) Intracytoplasmic inclusions consistent with NCL (skin) FP, CV (skin)
Intracytoplasmic inclusions consistent with NCL (skin) FP (conjunctiva)
FP (skin) NA
Intracytoplasmic inclusions consistent with NCL (muscle) NA
cJNCL
cJNCL
cJNCL cJNCL
cJNCL
cJNCL
cJNCL cJNCL
cJNCL
cJNCL
vJNCL
vJNCL
vJNCL vJNCL vJNCL
vJNCL
vJNCL
vJNCL
NA vJNCL GROD, RL, CV (skin) vJNCL
GROD, RL (skin)
Electron microscopy (biopsied tissue)
2.4 (control 114) NA
0.45 (6–38)
+/+ (8) +/+ (7)
NA 1.6 (6–38) 1.8 (6–38)
NA
NA
NA
NA NA
NA
+/+ (7) NA NA
NA
+/+ (9)
+/− (9)
NA +/− (7)
+/+ (11)
Cerebral/ PPT1 activity cerebellar nmol/h/mg atrophy (control range) (age, yrs)
J Inherit Metab Dis
cJNCL
cJNCL
Results Enzymatic and molecular studies
Died; M: male; F: female; NA: not assessed; CV: curvilinear inclusions; RL: rectilinear complex. a
F 18
10
No
Visual failure
Papillary pallor / Low amplitude (7)
−/− (7)
Normal Controlled −/++ 6/8
Intracytoplasmic inclusions consistent with NCL (skin) Intracytoplasmic inclusions consistent with NCL (muscle) Learning delay No M 17
12
M 16
12
Yes
Visual failure
Papillary pallor / Low amplitude (9) Papillary pallor / Low amplitude (7)
−/− (8)
NA NA −/− 6/8
cJNCL NA −/− (11) Controlled ++/− 8 / 10
Normal
Electron microscopy (biopsied tissue) Cerebral/ PPT1 activity cerebellar nmol/h/mg atrophy (control range) (age, yrs) Case Sex Age Consanguinity Presenting number years symptom
Myoclonic/ Response to Ophthalmologic Age at first symptom/ age generalized antiepileptic findings / extinguished ERG (age, years) tonic-clonic treatment at diagnosis seizures
Group
J Inherit Metab Dis
In the group of 11 patients with vJNCL, a partial deficiency of PPT1 activity was found in four patients (cases #4d, #4e, #5, and #6) who also showed mutations in the CLN1 gene. In the remaining seven patients, data on PPT1 activity were not assessed; five of these patients belonged to two unrelated families harboring mutations in the CLN1 gene (cases #2a, #2b, #4a, #4b, and #4c) and the remaining two patients were included in the vJNCL group because of a typical clinical course compatible with vJNCL and ultrastructural studies that showed mixed profiles, predominantly GROD. In the group of 13 patients with cJNCL, mutations in the CLN3 gene were identified in 12 (92.3%). Five patients (41.7%) were found to have the 1.02-kb deletion on both chromosomes, whereas three patients were compound heterozygotes for the 1.02-kb deletion. The remaining four patients showed different mutations in the CLN3 gene. One patient (case #8) was included in the cJNCL group due to typical clinical course compatible with JNCL and ultrastructural studies showing FP inclusions. Vacuolated lymphocytes in peripheral blood were present in three cJNCL patients (cases #9, #11, and #15). In the remaining cJNCL patients, this study was not performed. Individualized clinical, enzymatic, and ultrastructural data as well as CLN1 and CLN3 allele mutations are shown in Tables 2 and 3. GROD inclusions in the blood vessel wall in a case of vJNCL are shown in Fig. 1, and FP inclusions in endothelial cells in two different CLN3 cases are shown in Fig. 2. Regression of acquired skills As shown in Table 4, regression of acquired skills occurred at an earlier age in patients with vJNCL than in those with cJNCL, with statistically significant differences for all comparisons. On the other hand, the percentage of patients who did not show psychomotor impairment was higher in the cJNCL group than in the vJNCL group. At the time of the study, all patients with vJNCL had lost their walking and sitting abilities, as well as to speak in full sentences, and urinary sphincter control. Loss of sentences was observed at a median age of 8 years (95% CI 6.4–9.8) among vJNCL patients as compared with a median of 20 years (95% CI 10.4–29.5) among those with cJNCL (PT
Missense
V181L
Homozygous
Exon 6
2
4
c.541 G>T
Missense
V181L
Homozygous
Exon 6
5
5
c.541 G>T
Missense
V181L
Homozygous
Exon 6
1
6
c.541 G>T
Missense
V181L
Homozygous
Exon 6
1
c.462-677del (g.60607025del) c.374 G>A c.462-677del (g.6060-7025del) c.462-677del (g.6060-7025del) c.622-623insT
1.02-kb deletion Missence/Splice site 1.02-kb deletion
Frameshift after C153 S125N Frameshift after C153
Compound heterozygous Homozygous
Intron 6–8 Exon 5
2
Intron 6–8
1 1
Mutations in the CLN3 gene 7 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
1.02-kb deletion
Frameshift after C153
Homozygous
Intron 6–8
1 bp insertion
Frameshift after L207
Homozygous
Exon 8
1
c.462-677del (g.6060-7025del) Not found c.462-677del (g.6060-7025del) c.462-677del (g.6060-7025del) c.575 G>A c.622623instT c.265 C>T
1.02-kb deletion
Frameshift after C153
Compound heterozygous
Intron 6–8
1
1.02-kb deletion
Frameshift after C153
Homozygous
Intron 6–8
1
1.02-kb deletion
Frameshift after C153
Homozygous
Intron 6–8
1
Missense 1 bp insertion Nonsense
G192E Frameshift after L207 R89X
Compound heterozygous Homozygous
Exon 8 Exon 8
1
Exon 4
1
c.462-677del (g.6060-7025del) c.370insT c.1001 G>A
1.02-kb deletion
Frameshift after C153
Homozygous
Intron 6–8
1
1 bp insertion Missense
Frameshift after C153 R334H
Compound heterozygous
Exon 5 Exon 13
1
References: M. Milà and J. Mallolas, personal communication (cases 2, 4, 5, and 6); The International Batten Disease Consortium, 1995 (cases 7, 9, 10, 12, 13, 14, and 17); M. Milà, personal communication (case 11); M. Milà, personal communication and Taschner et al., unpublished results (case 15); Sims, personal communication and Munroe et al. 1997 (case 18); the present study (cases 7 and 16).
purposeful hand use few years after loss of sentences. Sitting ability was lost during adolescence in the vJNCL group and in adulthood in cJNCL patients (12 vs 31 years, P= 0.001). Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of regression of acquired skills are shown in Fig. 3A and B. Cognitive decline Except for behavior disturbances, all parameters of cognitive decline (learning delay, mental retardation, bradypsychia, and autistic behavior) appeared at an earlier age in the vJNCL group as compared with the cJNCL group, and all differences were statistically significant (Table 4). Learning delay and mental retardation were observed in all vJNCL patients and in 92% of cJNCL patients. Learning delay occurred at a median age of 4 years among vJNCL patients and mental retardation at a median age of 5 years. However, in the cJNCL group learning delay and mental retardation occurred later and at a more variable age. Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of regression of acquired skills are shown in Fig. 3 C and D.
98
Fig. 1 GROD inclusions in the blood vessel wall in a case of vJNCL (ultrathin section stained with uranyl acetate and lead citrate x 12,000)
J Inherit Metab Dis
occurred before than blindness both vJNCL (median 7 years, 95% CI 5.9–8) and cJNCL patients (median 10 years, 95% CI 7–12.9). The vJNCL patients had mainly myoclonic seizures whereas the cJNCL patients showed predominantly generalized tonic-clonic seizures. Pharmacological control of seizures with anticonvulsant drugs was more satisfactory in cJNCL patients than in vJNCL (Table 2). Optimal seizure control was found in patients on valproic acid monotherapy, combination of valproic acid and carbamazepine, or combination of valproic acid and clobazam. Kaplan-Meier estimates of the age of the patients at the time of appearance of clinical signs and symptoms are shown in Fig. 3E and F.
Discussion
Fig. 2 A and B. Fingerprint inclusions in endothelial cells in two different cases of CLN3 mutations (ultrathin section stained with uranyl acetate and lead citrate x 42,000)
Clinical signs and symptoms Presenting symptoms of learning delay and delayed and loss of speech were observed predominantly in vJNCL (8 of 11 patients) compared to cJNCL (4 of 13 patients) group. Visual failure was more common as initial symptom in cJNCL than vJNCL patients (Table 2). The median age at which visual failure appeared in the two groups of patients was quite similar (P=0.088) (Table 4). Significant differences were found for the age at which vJNCL patients were blind (median 8 years, 95% CI, 6.8–9.1) compared to cJNCL (median 12 years, 95% CI 11.2–12.7) (PA (p.T294K) en homocigosis se ha asociado a este fenotipo en pacientes procedentes de Turquía, República Checa [21] e Italia [22]. Las LNC presentan heterogeneidad genética (mutaciones en diferentes genes pueden originar similares fenotipos clínicos), heterogeneidad alélica (diferentes mutaciones en el mismo gen pueden originar diferentes fenotipos clínicos) y, por último, pueden ser fenotípicamente heterogéneas incluso
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M.S. Pérez-Poyato, et al
Tabla II. Datos clínicos, anatomopatológicos y moleculares en pacientes con mutaciones en los genes CLN5 y CLN7. Caso 1
Caso 2
Caso 3
Caso 4
Mujer / 15 años (fallecida)
Mujer / 11 años (fallecida)
Mujer / 11 años
Varón / 11 años
No
Sí
No
Sí
Síntoma inicial (edad)
Trastorno de la conducta/dislalias (2 años y 6 meses)
Trastorno de la conducta (4 años y 6 meses)
Dislalias (3 años y 6 meses)
Crisis epilépticas (2 años)
Edad en el momento del diagnóstico
15 años
11 años
9 años
10 años
Edad de inicio del trastorno de aprendizaje
4 años
4 años
5 años
–
6 años y 10 meses
7 años y 5 meses
6 años
4 años y 6 meses
Sexo / Edad actual Consanguinidad
Edad de inicio de la regresión cognitiva Edad de inicio de la ataxia
8 años
7 años y 5 meses
8 años y 10 meses
4 años y 6 meses
Refractaria
Refractaria
Refractaria
Refractaria
Generalizada, parcial (7 años y 5 meses)
Mioclonoatónica, parcial (7 años y 4 meses)
Mioclonoatónica (7 años y 6 meses)
Mioclonoatónica, parcial (2 años)
Edad de inicio de las crisis mioclónicas
8 años
7 años y 5 meses
8 años y 10 meses
4 años y 6 meses
Edad de inicio de las mioclonías continuas
9 años
8 años y 9 meses
9 años
8 años
Atrofia cerebral/cerebelosa (edad)
–/+ (6 años y 10 meses) +/+ (7 años y 5 meses)
–/+ (7 años y 5 meses)
–/– (7 años y 6 meses)
–/+ (4 años y 6 meses)
Fondo de ojo (edad)
Atrofia papilar bilateral (8 años)
Atrofia papilar bilateral (8 años y 9 meses)
Palidez papilar (7 años y 6 meses)
Normal (4 años y 6 meses)
Potenciales evocados visuales (edad)
Respuesta cortical gigante (8 años)
Respuesta cortical gigante (10 años)
Aumento de latencias (7 años y 4 meses)
Respuesta ausente (8 años)
Electrorretinograma (edad)
Latencias retrasadas, voltaje ↓ (8 años)
No realizado
Abolido (7 años y 10 meses)
Abolido (8 años)
Inclusiones curvilíneas (piel)
Depósitos granulares osmofílicos (apéndice)
Finger print (apéndice)
Inclusiones curvilíneas (piel y músculo)
CLN5
CLN5
CLN5
CLN7
c.1002-1006del AACA
c.1116_1140dup25nt
c.507delT/c.924_925delAT
c.881C>A
p.Lys368SerfsX15
p.L381fs
p.I169fs/p.F309fs
p.T294K
Homocigosis
Homocigosis
Heterocigosis
Homocigosis
Kohan et al (2008)
Este estudio
Este estudio
Aiello et al (2009)
Epilepsia Crisis epilépticas (edad)
Microscopía electrónica (tejido biopsiado) Gen identificado Análisis mutacional Cambio de aminoácido Estado Referencia bibliográfica
dentro de la misma familia. Además, la vLNCIT es el grupo más heterogéneo de las LNC [4,6], con mutaciones en cuatro genes conocidos y con gran
548
variabilidad fenotípica, lo que complica el diagnóstico en estos pacientes. Se conocen diversos algoritmos para el estudio de las LNC [23]. Basándonos en
www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
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Lipofuscinosis neuronal ceroidea: variantes infantil tardía finlandesa y turca
Figura 2. Algoritmo diagnóstico en los estudios de correlación genotipo-fenotipo de las lipofuscinosis neuronales ceroideas.
lo publicado en la bibliografía y en la experiencia diagnóstica de nuestros pacientes, proponemos una estrategia de actuación que pueda ser de utilidad en los estudios de correlación genotipo-fenotipo de este grupo de enfermedades (Fig. 2). En la mayoría de los pacientes la determinación PPT1 orientará el diagnóstico, ya que las mutaciones en el gen CLN1 pueden originar fenotipos con edad de inicio en la infancia hasta la edad adulta. La deficiencia de TPP1 puede orientar en fenotipos infantil tardía clásica y juvenil. Cuando los resultados de las determinaciones enzimáticas sean normales, debemos considerar el diagnóstico de las formas variantes de la LNCIT (vLNCITFin, vLNCITJuv, vLNCITTur, epilepsia progresiva con retraso mental).
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Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
Dado que los estudios genéticos en estas formas clínicas pueden ser laboriosos, es aconsejable comprobar la existencia de inclusiones típicas de LNC mediante estudios de microscopía electrónica, antes de proceder al análisis mutacional (CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8). Es imprescindible la existencia de profesionales con experiencia en microscopía electrónica, dada la importancia del diagnóstico y la dificultad de la técnica. En conclusión, nuestro estudio añade información clínica y aporta tres nuevas mutaciones al espectro de las formas variantes de las LNC, que presentan una distribución geográfica cada vez más amplia. Establecemos un protocolo de actuación que ayude
549
M.S. Pérez-Poyato, et al
a realizar estudios de correlación genotipo-fenotipo mediante la identificación de las mutaciones y la realización de una adecuada caracterización clínica de los pacientes. Bibliografía 1.
Goebel HH, Sharp JD. The neuronal ceroid-lipofuscinoses. Recent advances. Brain Pathol 1998; 8: 151-62. 2. Wisniewski KE, Kida E, Connell F, Zhong N. Neuronal ceroid lipofuscinoses: research update. Neurol Sci 2000; 21 (Suppl): S49-56. 3. Mole SE. Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCL). Eur J Paediatr Neurol 2006; 10: 255-7. 4. Siintola E, Lehesjoki AE, Mole SE. Molecular genetics of the NCLs –status and perspectives. Biochim Biophys Acta 2006; 1762: 857-64. 5. Williams RE, Aberg L, Autti T, Goebel HH, Kohlschutter A, Lonnqvist T. Diagnosis of the neuronal ceroid lipofuscinoses: an update. Biochim Biophys Acta 2006; 1762: 865-72. 6. Mole SE, Williams RE, Goebel HH. Correlations between genotype, ultrastructural morphology and clinical phenotype in the neuronal ceroid lipofuscinoses. Neurogenetics 2005; 6: 107-26. 7. [No authors listed]. Novel human pathological mutations. Hum Genet 2008; 123: 537-55. 8. Santavuori P, Rapola J, Sainio K, Raitta C. A variant of JanskyBielschowsky disease. Neuropediatrics 1982; 13: 135-41. 9. Santavuori P, Rapola J, Nuutila A, Raininko R, Lappi M, Launes J, et al. The spectrum of Jansky-Bielschowsky disease. Neuropediatrics 1991; 22: 92-6. 10. Holmberg V, Lauronen L, Autti T, Santavuori P, Savukoski M, Uvebrant P, et al. Phenotype-genotype correlation in eight patients with Finnish variant late infantile NCL (CLN5). Neurology 2000; 55: 579-81. 11. Pérez-Poyato MS, Milá-Recansens M, Ferrer-Abizanda I, Montero-Sánchez R, Rodríguez-Revenga L, Cusí-Sanchez V, et al. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical course and genetic studies in Spanish patients. J Inherit Metab Dis 2011; 34: 1083-93. 12. Goebel HH, Wisniewski KE. Current state of clinical and morphological features in human NCL. Brain Pathol 2004; 14: 61-9.
13. Pineda-Trujillo N, Cornejo W, Carrizosa J, Wheeler RB, Munera S, Valencia A, et al. A CLN5 mutation causing an atypical neuronal ceroid lipofuscinosis of juvenile onset. Neurology 2005; 64: 740-2. 14. Bessa C, Teixeira CA, Mangas M, Dias A, Sa Miranda MC, Guimaraes A, et al. Two novel CLN5 mutations in a Portuguese patient with vLINCL: insights into molecular mechanisms of CLN5 deficiency. Mol Genet Metab 2006; 89: 245-53. 15. Cannelli N, Nardocci N, Cassandrini D, Morbin M, Aiello C, Bugiani M, et al. Revelation of a novel CLN5 mutation in early juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis. Neuropediatrics 2007; 38: 46-9. 16. Lebrun AH, Storch S, Ruschendorf F, Schmiedt ML, Kyttala A, Mole SE, et al. Retention of lysosomal protein CLN5 in the endoplasmic reticulum causes neuronal ceroid lipofuscinosis in Asian sibship. Hum Mutat 2009; 30: E651-61. 17. Al-Kowari MK, Hassan S, El-Said MF, Ben-Omran T, Hedin L, Mole SE, et al. Neuronal ceroid lipofuscinosis in Qatar: report of a novel mutation in ceroid-lipofuscinosis, neuronal 5 in the Arab population. J Child Neurol 2011; 26: 625-9. 18. Vistorte A, Sardiñas N, Esteban EM, Vargas-Díaz J, NovoaLópez L, Rojas-Massippe E, et al. Epilepsia mioclónica progresiva: caracterización clínica de 18 pacientes. Rev Neurol 1999; 29: 102-4. 19. Xin W, Mullen TE, Kiely R, Min J, Feng X, Cao Y, et al. CLN5 mutations are frequent in juvenile and late-onset non-Finnish patients with NCL. Neurology 2010; 74: 565-71. 20. Topcu M, Tan H, Yalnizoglu D, Usubutun A, Saatci I, Aynaci M, et al. Evaluation of 36 patients from Turkey with neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical, neurophysiological, neuroradiological and histopathologic studies. Turk J Pediatr 2004; 46: 1-10. 21. Kousi M, Siintola E, Dvorakova L, Vlaskova H, Turnbull J, Topcu M, et al. Mutations in CLN7/MFSD8 are a common cause of variant late-infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Brain 2009; 132: 810-9. 22. Aiello C, Terracciano A, Simonati A, Discepoli G, Cannelli N, Claps D, et al. Mutations in MFSD8/CLN7 are a frequent cause of variant-late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Hum Mutat 2009; 30: E530-40. 23. Kohan R, Cismondi IA, Oller-Ramírez AM, Guelbert N, Anzolini TV, Alonso G, et al. Therapeutic approaches to the challenge of neuronal ceroid lipofuscinoses. Curr Pharm Biotechnol 2011; 12: 867-83.
Neuronal ceroid lipofuscinosis: diagnostic algorithm and clinical description of the Finnish (CLN5) and Turkish (CLN7) variants late infantile Introduction. The neuronal ceroid lipofuscinosis are classified based on age at onset into four main clinical forms in childhood: infantile, late infantile, juvenile and congenital (CLN1, CLN2, CLN3 and CLN10). The variant late infantile forms (CLN5, CLN6, CLN7 and CLN8) are characterized by a wide variability of the clinical phenotypes and the most patients are originated from Finland and Turkey (Finnish, CLN5, and Turkish, CLN7 variants). Case reports. We describe three unrelated patients with Finnish variant and another patient with Turkish variant. We describe an algorithm to facility the diagnosis of these low prevalence diseases. Patients with Finnish variant started with behaviour disorder between 2.6 and 4.6 years of age followed by learning difficulties and visual failure at an age of 6 years. Generalised tonic-clonic and myoclonic seizures were observed at 7 years of age with myoclonic jerks later on. Patients developed ataxia and blindness within 9 years and increasingly disability at 11 years of age. The patient with Turkish variant started with refractory epilepsy at age of 2, followed by a severe neurodegeneration manifested by ataxia, loss of walking ability within 2-3 years and vegetative state at 11 years of age. Conclusions. The clinical spectrum of the variant late infantile forms shows a wide geographical distribution. We report three novel mutations in the CLN5 gene and a diagnostic algorithm to facility the correlation genotype-phenotype studies. Key words. Algorithm. Clinical course. CLN5. CLN7. Finnish and Turkish variants. Neuronal ceroid lipofuscinosis.
550
www.neurologia.com Rev Neurol 2012; 54 (9): 544-550
115
Síntesis de los resultados x
Los tres pacientes con vLNCITFin, procedentes de diferentes familias y Comunidades Autónomas de la geografía española, presentaron un fenotipo similar a las series de pacientes finlandeses (Santavuori et al. 1982, 1991) y de origen árabe (Holmberg et al. 2000) previamente publicadas.
x
La sintomatología se inició con trastorno de conducta y / o atención deficiente entre los 2.6 y 4.6 años de edad seguidos de trastorno de aprendizaje y déficit visual vs torpeza motora alrededor de la edad de 6 años. Las crisis epilépticas generalizadas y mioclono-atónicas aparecieron un año más tarde y fueron seguidas de crisis mioclónicas. Coincidiendo con el debut de la epilepsia y años después de la regresión cognitiva, los pacientes presentaron ataxia, generalmente entre los 7-9 años de edad y severa discapacidad antes de la edad de 11 años.
x
Observamos la presencia de linfocitos vacuolados en un paciente con vLNCITFin y mutación en el gen CLN5 y confirmamos la existencia de diferentes inclusiones celulares en cada uno de los pacientes con vLNCITFin.
x
Este trabajo aporta 3 mutaciones nuevas en el gen CLN5, expandiendo así el espectro mutacional de esta forma clínica de lipofuscinosis neuronal ceroidea.
x
Describimos el primer paciente español con vLNCITTur cuyo fenotipo fue similar a la serie original de pacientes de origen turco (Topcu et al. 2004) y se caracterizó por epilepsia, como síntoma inicial, seguida de un rápido deterioro con ataxia, pérdida de la deambulación entre los 2-3 años siguientes y posterior déficit visual.
117
5. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea Las LNCs presentan heterogeneidad genética (mutaciones en diferentes genes pueden originar similares fenotipos clínicos), heterogeneidad alélica (diferentes mutaciones en el mismo gen pueden originar similares fenotipos clínicos) y, por último, pueden ser fenotípicamente heterogéneas incluso dentro del mismo núcleo familiar. Basándonos en los algoritmos previamente publicados en la literatura y en nuestra experiencia en el diagnóstico de pacientes con LNC, establecemos un protocolo de estudio para este grupo de enfermedades que por un lado, ayude a realizar adecuadas correlaciones genotipo-fenotipo mediante la identificación de las mutaciones y la realización de una adecuada caracterización clínica de los pacientes y por otro, contribuya a encontrar nuevos pacientes con LNC en nuestra población (Figura 8).
119
EEG: inespecífico RNM: normal / atrofia cerebral PEV / ERG: alterados
Linoficitos vacuolados en frotis sangre periférica
EEG: enlentecimiento ABC RNM: atrofia cerebral
EEG: fotosensibilidad 12 Hz región occipital RM: dilatación IV ventrículo, megacisterna magna, atrofia cerebelosa PEV: gigante ERG: alterado Normal
Ausentes
Presentes
Déficit
Normal
GROD CV
Actividad PPT1 / TPP1/ CTSD
Pérez-Poyato y cols. 2012b
Normal
Déficit
Déficit
Normal
Mutac. CLN10
Mutac. CLN2 TPP1
CTSD
Mutac. CLN1
Normal
FP
CLN3 Negativo
Ausentes
Mutac. CLN10
Normal
CV RL FP
vLNCJ
vLNCITTur
vLNCITJuv
vLNCITFin
Revisar datos clínicos
Mutac. CLN5
121
LNCJ
Mutac. CLN7
Mutac. CLN6
Mutac. CLN5
Revisar datos clínicos
Delec 1.02 kb CLN3
M. electrónico
LNCJ
Revisar datos clínicos
Linfocitos vacuolados
LNCI
Presentes
Normal
Déficit
Revisar anatomía patológica
Mutac. CLN1
Revisar datos clínicos
Normal
Déficit
Revisar datos clínicos
Actividad PPT1
Mutación CLN3
PPT1
M.Electrónico
Secuenciación directa gen CLN3
LNCJ
Normal
CV RL FP
Actividad CTSD
EPMR
M. electrónico
LNCC
Mutac. CLN1
Mutac. CLN1
Revisar datos clínicos
Negativo
GROD
Normal
LNCIT
Normal
Déficit
M. electrónico
Mutac. CLN10
Mutac. CLN8
Positivo
Actividad PPT1
Mutac CLN2
Actividad PPT1
Normal
Delec. 1.02 kb CLN3
M. electrónico
Actividad TPP1
Déficit
EEG: enlentecimiento ABC. RNM: atrofia cerebral, hipointensidad talámica, hiperintensidad SB periventricular
RNM: atrofia cerebral
Actividad CTSD
Figura 8. Protocolo de estudio para las lipofuscinosis neuronal ceroidea
Edad 5-12 años, AP: retraso del lenguaje, trastorno del aprendizaje escolar, epilepsia, con déficit visual, marcha atáxica
Edad 5-12 años, epilepsia refractaria, deterioro cognitivo, sin déficit visual
Edad 2-4 años, retraso del lenguaje, dificultades atención / inquietud, ataxia, mioclonias, crisis epilépticas refractarias
Edad < 1 año, retraso sedestación, irritabilidad, microcefalia adquirida, marcha atáxica
Recién nacido, convulsiones neonatales refractarias, microcefalia
DISCUSIÓN CONJUNTA 1.
Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración clínica de una serie de pacientes españoles
2.
Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles
3.
Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y estudios genéticos en pacientes españoles
4.
Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea
123
Las lipofuscinosis neuronal ceroidea son uno de los grupos más frecuentes de enfermedades progresivas neurodegenerativas de la infancia (Goebel and Sharp, 1998). Clínicamente se caracterizan por crisis epilépticas, deterioro cognitivo, trastorno motor (ataxia y espasticidad) y déficit visual. Los diferentes fenotipos clínicos se han asociado a mutaciones en los ocho genes responsables de las diferentes formas clínicas en la edad pediátrica
(CLN10/CTSD,
CLN1/PPT1,
CLN2/TPP1,
CLN3,
CLN5,
CLN6,
CLN7/MFSD8 y CLN8). Esta tesis versa sobre el estudio de la historia natural de la enfermedad en cada una de las formas clínicas principales de LNC debido, por un lado, a que en la mayoría de las ocasiones el diagnóstico se realiza de forma tardía al ser enfermedades poco conocidas y de baja prevalencia; y por otro, porque es de vital importancia la aplicación de escalas de valoración clínica para el desarrollo de futuras terapias y participación de pacientes en ensayos clínicos, al ser enfermedades para las que no se dispone de tratamiento curativo en la actualidad. En este trabajo hemos ampliado el espectro clínico-mutacional de las lipofuscinosis neuronal ceroidea en la población española, mediante la caracterización clínica de pacientes y la identificación de nuevas mutaciones en los genes CLN1, CLN2, CLN3, CLN5 y CLN7 y, hemos dado a conocer la distribución de las diferentes formas clínicas de LNC en España. Este estudio ha sido el primer paso dentro de la creación de un protocolo diagnóstico para la identificación de pacientes con lipofuscinosis neuronal ceroidea en nuestro país y la realización de correlaciones genotipo-fenotipo.
125
1. Forma infantil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: seguimiento y valoración clínica de una serie de pacientes españoles Las series más amplias de pacientes con LNCI proceden de Finlandia (Santavuori et al. 1973, 1974) y las descripciones publicadas de pacientes procedentes de los países del sur de Europa (Baumann y Markesbery, 1982, Cardona y Rosati 1995, Santorelli et al. 1998, Veneselli et al. 2000, Texeira et al. 2003) son similares a nuestra casuística de seis pacientes en España. Según nuestros resultados, la enfermedad se inició entre los 8 y los 15 meses de edad aunque puede ocurrir hasta los 18 meses (Santavuori et al. 1974, Oishi et al. 1999, Topcu et al. 2004) y se caracterizó por un trastorno motor (retraso motor o ataxia), deterioro cognitivo y rasgos autistas. La observación de que a la misma edad los pacientes presenten fondo de ojo normal y alteraciones en el ERG, nos sugiere que el déficit visual puede aparecer en estadíos precoces de la enfermedad, simultáneamente con los síntomas neurológicos, conduciendo rápidamente a la ceguera. A diferencia de la mayoría de autores que observan las crisis mioclónicas entre los 16 y 24 meses de edad (Santavuori et al. 1973, 1974, 1988, Santorelli et al. 1998, Takano et al. 2008), en nuestra serie ocurrieron más tarde, entre los 2 y 3 años de edad y, la epilepsia fue el último síntoma, incluso un paciente no ha desarrollado epilepsia a la edad de 3 años. Estos hallazgos dan idea del espectro tan amplio de la epilepsia en la LNCI pudiendo aparecer en cualquier momento durante el curso de la enfermedad. El EEG es el primer examen neurofisiológico alterado en los pacientes con LNCI, antes incluso del inicio de la epilepsia, y muestra un enlentecimiento de la actividad rítmica de base (Santavuori et al. 1973, 1974, Takano et al. 2008), lo que nos sugiere la posibilidad de solicitar este examen complementario como herramienta útil en la práctica clínica diaria, ante el inicio de la sintomatología neurológica. Todos los
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pacientes se mantienen en estado vegetativo desde aproximadamente la edad de cuatro años hasta el fallecimiento que suele ocurrir en la primera década de la vida, lo que confirma la severidad y agresividad de esta forma clínica. Nuestros resultados han confirmado que la mutación p.Val181Met en el gen CLN1, previamente descrita por Das et al. 2001 y Texeira et al. 2003, está asociada con el fenotipo severo de LNCI cuando se presenta en homocigosis.
2. Forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea: análisis mutacional del gen CLN2 y descripción del curso clínico en pacientes españoles La forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea presenta una distribución mundial y tanto sus características clínicas como los hallazgos ultraestructurales están claramente definidos en la literatura (Mole et al. 2005). Sin embargo, el índice de progresión de la enfermedad y su correlación con las mutaciones en el gen CLN2 no habían sido descritos previamente. La mayoría de los autores describen la epilepsia, manifestada por cualquier tipo de crisis, como el síntoma inicial de la enfermedad entre los 2 y 4 años. Destacamos como manifestaciones iniciales de la enfermedad el retraso del lenguaje, en aquellos pacientes que no llegaron a adquirir esta capacidad completamente, y las crisis febriles simples seguidas de epilepsia, lo cual ha sido publicado en muy pocos pacientes (Hartikainen et al. 1999, Barisic et al. 2003). Por otro lado, el disponer de una serie de 12 pacientes nos ha permitido valorar por primera vez la regresión del desarrollo psicomotor que se inicia con la pérdida de la capacidad para construir frases alrededor de los 3 años de edad. Durante el segundo estadio de la enfermedad los pacientes pierden la deambulación y presentan ausencia de comunicación verbal. Finalmente, la
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pérdida de la sedestación, manipulación y del control de esfínteres ocurre alrededor de los 5 años seguido de disfagia, tan sólo unos meses más tarde. Las crisis epilépticas tónico-clónicas generalizadas han sido descritas como el tipo más frecuente (Topcu et al. 2004). Sin embargo, en nuestra serie la epilepsia se inició con crisis parciales a la edad mediana de 3.4 años seguidas de crisis mioclónicas que originaron el desarrollo posterior de una epilepsia mioclónica progresiva en todos los pacientes. El déficit visual ocurrió después de la epilepsia y la ataxia fue el tercer síntoma de la enfermedad apareciendo a los 4 años junto con el inicio del deterioro cognitivo. Los pacientes presentaron temblor y espasticidad en los estadíos avanzados de la enfermedad. Según nuestros resultados, los pacientes presentaron un fenotipo similar, a diferencia de otras series que describen heterogeneidad clínica (Zhong et al. 2000). Las dos mutaciones más comunes identificadas en el gen CLN2 por Sleat et al. (1997) fueron menos frecuentes (78% vs 26%) que en otros estudios, lo que confirma la amplia heterogeneidad genética en la población española observada también en otras enfermedades de herencia autosómica recesiva.
3. Forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea: descripción del curso clínico y estudios genéticos en pacientes españoles El estudio en profundidad de una amplia serie de pacientes españoles con la forma juvenil de lipofuscionosis neuronal ceroidea ha permitido ampliar el conocimiento sobre la historia natural de la enfermedad en pacientes con fenotipo LNCJ y mutaciones en los genes CLN1 y CLN3. Destacamos el curso clínico más severo y progresivo en los pacientes con mutaciones en el gen CLN1 considerando que en estos pacientes la regresión del desarrollo psicomotor ocurre a edad más precoz que en los
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que presentan mutaciones en el gen CLN3. Describimos por primera vez dicha regresión en ambos grupos de pacientes iniciada con la pérdida de la capacidad para construir frases, seguido por la pérdida de la deambulación. Durante el segundo estadio de la enfermedad los pacientes pierden la manipulación y finalmente, la sedestación. Antes de la realización de este trabajo, el déficit visual era considerado generalmente el síntoma inicial en los pacientes con LNCJ independientemente del gen responsable de la enfermedad. Aportamos que en pacientes con mutaciones en el gen CLN1 la enfermedad generalmente se inicia con trastornos de aprendizaje o retraso / regresión del lenguaje, mientras que en los pacientes con mutaciones en el gen CLN3 suele ser el déficit visual el síntoma inicial más común, seguido por las dificultades de aprendizaje. Confirmamos la existencia de un fenotipo caracterizado por déficit visual y mayor supervivencia en pacientes heterocigotos para la deleción 1.02-kb en el gen CLN3 los cuales presentan deterioro cognitivo a edad más tardía y de forma más progresiva que los pacientes homocigotos para dicha deleción (Wisniewski et al. 1998a, Lauronen et al. 1999, Aberg et al. 2009). Hemos descrito la epilepsia como el tercer síntoma en los pacientes con LNCJ, después del trastorno de aprendizaje y el déficit visual. La ceguera ocurrió varios años después de la epilepsia y el deterioro motor manifestado por ataxia y espasticidad ocurrió en estadíos avanzados de la enfermedad. La identificación de la mutación V181L en homocigosis en el gen CLN1 en nueve pacientes pertenecientes a cuatro familias diferentes, consanguíneas, de etnia gitana hace intuir que en pacientes originarios de dicha etnia, la identificación de esta mutación sea prioritaria.
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4. Descripción clínica de las formas variantes infantil tardía finlandesa (CLN5) y turca (CLN7) de lipofuscinosis neuronal ceroidea En este trabajo se realiza por primera vez la descripción de tres pacientes con vLNCITFin y mutaciones en el gen CLN5 y se confirma la escasa variabilidad en el fenotipo de estos pacientes en relación con las diferentes mutaciones en el gen CLN5. Coincidiendo con publicaciones anteriores, queda constatado que la vLNCITFin es menos frecuente que la LNCJ en España (Pérez-Poyato et al. 2011) y en el resto del mundo (Goebel y Wisniewski, 2004) y que nuestra casuística es similar a la de otras series previamente publicadas en los países del área Mediterránea (Bessa et al. 2006, Cannelli et al. 2007). Destacamos las dislalias como síntoma de presentación, no descrito previamente, a diferencia del retraso en la adquisición del lenguaje (Lebrum et al. 2009). Aunque las dislalias son consideradas fisiológicas antes de los 4 años de edad, podrían orientar, según la evolución de la enfermedad, sobre esta forma clínica. Describimos por primera vez la presencia de linfocitos vacuolados en un paciente con vLNCITFin. La sospecha diagnóstica inicial en este paciente fue de LNCJ ante la similitud en el fenotipo y la presencia característica de este hallazgo en los pacientes con mutaciones en el gen CLN3. Este hecho, nos sugiere que el análisis mutacional del gen CLN5 debería ampliarse a pacientes con fenotipo juvenil, actividad enzimática PPT1 y TPP1 normal y análisis mutacional del gen CLN3 negativo. Dada la reciente descripción del gen CLN7 como causante de vLNCITTur (Siintola et al. 2007) y la progresiva identificación de nuevas mutaciones en la actualidad, la descripción de este primer paciente nos hace sospechar de la probable existencia de otros casos infradiagnosticados en España y nos alienta a descubrir la existencia de otros nuevos pacientes.
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CONCLUSIONES
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1.
Se confirma que la forma infantil precoz de lipofuscinosis neuronal ceroidea se caracteriza por un severo y progresivo curso clínico. Se ha demostrado que en nuestra población, la mutación V181M del gen CLN1 está asociada con el fenotipo más severo de la enfermedad.
2.
La forma infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea presenta un curso clínico muy homogéneo en la población española. Se demuestra la existencia de heterogeneidad genética en las 10 familias estudiadas con LNCIT.
3.
Se ha diferenciado detalladamente el curso clínico de la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea en los pacientes españoles con los fenotipos clásico (cLNCJ) y variante (vLNCJ) y se han establecido correlaciones genotipo-fenotipo. Se considera la posibilidad de realizar un diagnóstico precoz de LNCJ en base a la sintomatología inicial y la edad de inicio. El índice de progresión de la enfermedad orienta hacia los fenotipos causados por mutaciones en los genes CLN1 / CLN3 y el diagnóstico definitivo deberá confirmarse mediante el análisis mutacional de dichos genes.
4.
Se ha ampliado la distribución geográfica de las formas variante infantil tardía de lipofuscinosis neuronal ceroidea y se ha descrito el espectro clínicomutacional de las formas variantes infantil tardía finlandesa y turca en España.
5.
Los trabajos que conforman esta tesis doctoral han sido fundamentales para la elaboración de un protocolo diagnóstico el cual permite realizar estudios de correlación genotipo-fenotipo y amplía el espectro clínico-mutacional en la población española afectada de lipofuscinosis neuronal ceroidea.
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Z Zelnik N, Mahaina M, Iancu TC, Sharony R, Zeigler M. A novel mutation of the CLN8 gene: is there a Mediterranean phenotype? Pediatr Neurol 2007; 36:411-413
Zeman W, Alpert M. On the nature of the “stored” lipid substances in juvenile amaurotic idiocy (Batten-Spielmeyer-Vogt). Ann Histochem 1963; 8: 255-257
167
Zeman W, Dyken P. Neuronal ceroid-lipofuscinosis (Batten’s disease): relationship to amaurotic familial idiocy? Pediatrics 1969; 44:570-583
Zhong N, Wisniewski KE, Hartikainen J, Ju W, Moroziewicz DN, McLendon L, Sklower Brooks SS, Brown WT. Two common mutations in the CLN2 gene underlie late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Clin Genet 1998a; 54:234-238
Zhong N, Wisniewski KE, Kaczmarski AL, Ju W, Xu WM, Xu WW, Mclendon L, Liu B, Kaczmarski W, Sklower Brooks SS, Brown WT. Molecular screening of Batten disease: identification of a missense mutation (E295K) in the CLN3 gene. Hum Genet 1998b; 102: 57-62
Zhong N, Moroziewicz DN, Ju W, Jurkiewicz A, Johnston L, Wisniewski KE, Brown WT. Heterogeneity of late-infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Genet Med 2000; 2:312-318
168
ANEXO 1.
Comunicaciones científicas a congresos relacionadas con el tema
2.
Otras publicaciones
171
1. Comunicaciones científicas a congresos relacionadas con el tema x
Neuronal ceroid lipofuscinosis from our children’s hospital. Pérez Poyato MS, Pineda Marfa M, Cusí Sánchez V, Ferrer Abizanda I, Milá Recasens M. Póster. Annual Symposium of the Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism (SSIEM). Lisboa, Portugal. 2-5 Septiembre 2008.
x
Lipofuscinosis neuronal ceroidea en la edad pediátrica. Pérez Poyato MS, M. Pineda Marfa, V. Cussí, I. Ferrer, M. Milá. Comunicación oral. XXXIII Reunión Anual de la Sociedad Española de Neurología Pediátrica. Zaragoza. 18-19 Septiembre 2008.
x
Lipofuscinosis neuronal ceroidea. Ponencia. Reunión Anual de la Sociedad Aragonesa de Neurofisiología Clínica. Zaragoza. 20 Mayo 2009.
x
Neuronal ceroid lipofuscinosis from our children’s hospital. Pérez Poyato MS, Pineda Marfa M, Cusí Sánchez V, Ferrer Abizanda I, Milá Recasens M. Póster. 12th International Congress on Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (NCL). Hamburgo, Alemania. 3-6 Junio 2009.
x
Lipofuscinosis neuronal ceroidea en un hospital de referencia pediátrico. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Póster. VIII Congreso Nacional de Errores Congénitos del Metabolismo (AECOM). Bilbao. 22-23 Octubre 2009.
x
Neuronal ceroid lipofuscinoses from our Spanish children’s hospital. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Póster. 11th International Child Neurology Congress. El Cairo, Egipto. 2-7 Mayo 2010.
173
x
The natural history and genotype-phenotype correlations in Spanish patients with Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis. Pérez Poyato MS, Montero Sánchez R, Milá Recasens M, Cusí Sánchez V, Ferrer Abizanda I, Coll MJ, Domingo Jiménez R, Pineda Marfa M. Póster. Annual Symposium of the Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism (SSIEM). Póster. Estambul, Turquía. 31 Agosto - 3 Septiembre 2010.
x
Historia natural y correlación genotipo-fenotipo en pacientes españoles con la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Montero Sánchez R, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Comunicación oral premiada. VIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Neurología Pediátrica. Córdoba. 20-23 Octubre 2010.
x
Historia natural y correlación genotipo-fenotipo en pacientes españoles con la forma juvenil de lipofuscinosis neuronal ceroidea. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Montero Sánchez R, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Comunicación oral. LXII Reunión Anual de la Sociedad Española de Neurología. Barcelona. 18 Noviembre 2010.
x
Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis: clinical evolution and genetic Studies in Spanish patients. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Montero Sánchez R, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Póster. 9th Congress of the European Paediatric Neurology Society. Cavtat, Dubrovnik, Croacia. 11-14 Mayo 2011.
x
Lipofuscinosis neuronal ceroidea forma infantil precoz: descripción clínica de la primera serie de pacientes españoles. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Domingo Jiménez R, López Lafuente A, Póo Argüelles P, Pineda Marfa M. Comunicación oral premiada. XXXV Reunión Anual de la Sociedad Española de Neurología Pediátrica. Granada. 16-18 Junio 2011
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x
Lipofuscinosis Neuronal Ceroidea forma Infantil Precoz: descripción clínica de la primera serie de pacientes españoles. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Coll Rosell MJ, Domingo Jiménez R, López LafuenteA, Póo Argüelles P, Pineda Marfa M. Comunicación oral. LXIII Reunión Anual de la Sociedad Española de Neurología. Barcelona. 15-19 Noviembre 2011.
x
Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis: mutation in the CLN2 gene and clinical course in Spanish patients. Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Pineda Marfa M. Póster. 13th International Congress on Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (NCL). Londres. 28-31 Marzo 2012
x
Lipofuscinosis neuronal ceroidea infantil tardía: descripción clínica de la forma clásica (CLN2) y las variantes finlandesa (CLN5), juvenil precoz (CLN6) y turca (CLN7). Pérez Poyato MS, Milá Recasens M, Ferrer Abizanda I, Cusí Sánchez V, Coll Rosell MJ, Pineda Marfa M. Comunicación oral premiada. XXXVI Reunión Anual de la Sociedad Española de Neurología Pediátrica. Santander. 31 Mayo-2 Junio 2012
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2. Otras publicaciones x
Pérez-Poyato MS, O’Callaghan M, Pineda Marfa M. Initiation and discontinuation of substrate inhibitor treatment in patients with Niemann-Pick type C disease. Gene 2012 (aceptado, in press).
x
Pérez-Poyato MS, Pineda Marfa M. New agents and approaches to treatment in Niemann-Pick type C disease. Curr Pharm Biotechnol 2011; 12: 897-901.
x
Pineda M, Pérez-Poyato MS, O’Callaghan M, Vilaseca MA, Pocovi M, Domingo R, Portal LR, Pérez AV, Temudo T, Gaspar A, Peñas JJ, Roldán S, Fumero LM, de la Barca OB, Silva MT, Macías-Vidal J, Coll MJ. Clinical experience with miglustat therapy in pediatric patients with Niemann-Pick disease type C: a case series. Mol Genet Metab 2010; 99: 358-366.
176