ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de pollo PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

Las proteínas se purifican mediante métodos de fraccionamiento que son una serie de etapas independientes basadas en las diversas propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés y que se usan para separarlas de manera progresiva de otras moléculas.

¿Para qué queremos purificar proteínas?  Conocer secuencias de aminoácidos.

 Establecer relaciones evolutivas.  Investigar la función biológica.

Establecer relaciones estructura-función.

Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas

GUÍA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA • Definir los objetivos de la purificación Pureza, actividad y cantidad. •Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas. PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar a las proteínas (ej proteasas). • Seleccionar la fuente de proteína. Organismo, tejido, localización celular. • Desarrollar una técnica de análisis. Para una detección rápida de la pureza, actividad y/ o contenido total de la proteína de interés.

•Minimizar el manejo de la muestra. Evitar procedimientos largos para evitar perder actividad biológica. • Minimizar el uso de aditivos. Usar lo mínimo necesario.

• Eliminar los contaminantes. Por ejemplo, las proteasas. • Usar una técnica diferente en cada paso. Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra en el proceso de separación.

•Reducir el número de pasos. Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de purificación.

Seleccionar la fuente de proteína La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como: a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína b) la cantidad de la proteína de interés en el tejido y c) cualquier propiedad peculiar de la proteína de interés, que ayudará en su estabilización y su aislamiento.

Definir las Propiedades de la Proteína de Interés Masa Molecular

• La información es útil para detectar la proteína a través de SDSPAGE, también es importante cuando seleccionamos un método de filtración en gel.

Punto Isoeléctrico

• El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes propósitos: precipitación isoeléctrica, selección de columna de intercambio iónico, pH de trabajo.

Solubilidad

• Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína. También útil para separación.

Polaridad

• Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una columna de interacción hidrofóbica.

Unión Específica

• Ligandos útiles para separar la proteína por cromatografía de afinidad.

Estabilidad

• En términos de actividad, agregación y composición de subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína son importantes a lo largo del proceso.

Técnicas de purificación/separación de acuerdo a las propiedades de las proteínas Características

Solubilidad Carga iónica

Polaridad

Tamaño molecular Especificidad de unión

Procedimiento 1. Salting in 2. Salting out 1. Cromatografia de intercambio iónico 2. Electroforesis 1. Cromatografía de adsorción 2. Cromatografía en papel 3. Cromatografía en fase reversa 4. Cromatografía interacción hidrófoba 1. Dialisis y ultrafiltración 2. Electroforesis en gel 3. Cromatografía de filtración en gel 4. Ultracentrifugación 1. Cromatografía de afinidad

Fases de la Purificación 1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína. (Homogenización, centrifugación) 2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus. (Precipitación selectiva) 3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible. (Métodos cromatográficos)

FASE I. Métodos de baja resolución

FASE II. Métodos de baja resolución

Homogenización, filtración, centrifugación

Precipitación con sales, solventes, temperatura o pH

Métodos cromatográficos: FASE III. Métodos de alta resolución

filtración en gel, intercambio iónico, afinidad

Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante

Ruptura de la Célula ¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD Las proteínas se desnaturalizan fácilmente a temperaturas elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0°C o temperaturas cercanas.

MÉTODOS •Suaves: Lisis celular (choque osmótico) Digestión enzimática (lisozima) Lisis química (detergentes) Homogenización manual Molienda

Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular.

Ruptura de la Célula ¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD MÉTODOS •Moderados: Homogenización con cuchillas Molienda abrasiva Congelamiento

•Vigorosos: Ultrasonicación Homogenizador Manton-Gaulin Prensa francesa Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.

Buffer de Lisis

Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la estabilidad de la proteína. pH

Fuerza Iónica

Aditivos

Mantener un pH en el cual la proteína es estable y se previene la precipitación isoeléctrica.

Mantener una concentración de sales adecuada para reducir las pérdidas por precipitación

Son componentes que previenen la degradación y mejoran la estabilidad. Se deben agregar solo si es necesario.

Aditivos

Fraccionamiento Celular: Centrifugación Diferencial • Eliminar contaminantes o clarificar la muestra • Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. • Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.

Centrifugación Diferencial

Homogenización del tejido

Baja decentrifugación centrifugación Baja velocidad velocidad de (1 000 000g,g,10’) 10’) (1

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación media (20 000 g, 20’)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación alta (80 000 g, 1 h)

Tejido homogenado

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación muy alta (150 000 g, 3 h)

Pellet, contiene células completas, núcleos, membranas plasmáticas

Pellet, contiene mitocondrias, lisosomas, peroxisomas

Sobrenadante contiene proteínas solubles

Pellet, contiene microsomas (fragmentos de RE), vesículas pequeñas

Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas grandes

Remover contaminantes y/o concentrar la muestra Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos:

Ultrafiltración

Precipitación selectiva

Precipitación selectiva ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD • Debido a que la proteína contiene varios grupos cargados, la solubilidad es sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica. • Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína. • El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. Sin embargo, también hay otros métodos Precipitación con solventes orgánicos. Precipitación isoeléctrica. Precipitación térmica.

Log (S/S’)

Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

Fuerza Iónica

Precipitación por salado Solubilidad

Capa de Hidratación

Salting in Salting out Concentración de sal

Precipitación por salado Salting in: La solubilidad de una proteína, a una concentración baja de iones, aumenta a medida que se incrementa la concentración de la sal. Salting out: Las interacciones proteína-proteína se hacen más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la proteína precipita. La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto de salting out varía de acuerdo a las características de la proteína

Precipitación por salado

Concentración inicial de sulfato de amonio (%)

Concentración final de sulfato de amonio (%)

Gramos de sulfato de amonio que hay que añadir a 1 L de solución

En la práctica Purificación de la lactato deshidrogenasa 1.1.1.27

Investigar: Propiedades de LDH de Gallus gallus LDH A Número de aminoácidos Peso molecular (Da) Punto isoeléctrico Promedio general de hidropaticidad (GRAVY) Localización celular Forma activa Superfamilia Tipo de enzima Cofactor

LDH B

¿Cómo vamos a purificar a la LDH de Gallus gallus?

Importante: Anotar los volúmenes de las fracciones

Homogenización 1) 2) 3) 4) 5) 6)

100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo) Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0) Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min. Decantar sobrenadante y tomar fracción 1 mL (F1) Guardar fracciones a -20°C Precipitación por salado

1) 25 mL del sobrenadante en vaso de pp. 2) Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de saturación) 3) Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min. 4) Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C 5) Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3 6) Descartar el sobrenadante 7) Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua 8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C