ESTUDIO BIOLÓGICO DE LA INCORPORACIÓN DE UNA PREMEZCLA A BASE DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS

LUZ MARÍA ALZATE TAMAYO

Universidad de Antioquia Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias Doctorado en Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias Medellín Junio de 2016

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ESTUDIO BIOLÓGICO DE LA INCORPORACIÓN DE UNA PREMEZCLA A BASE DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS

LUZ MARÍA ALZATE TAMAYO

Tesis para optar al título de doctor en Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias:

COMITÉ TUTORIAL Tutor:

Julián Londoño-Londoño. Químico Doctor en Ciencias Químicas.

Farmacéutico,

Co-tutor:

Edison Osorio Durango Químico Farmacéutico. MSc en Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias. Doctor en Medicamentos, Alimentación y Salud.

Miembro comité:

Claudio Jiménez Cartagena. Químico Farmacéutico. MSc en Ciencias Básicas Biomédicas-Bioquímica. Doctor en Ingeniería-Ambiental.

Universidad de Antioquia Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias Doctorado en Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias Medellín Junio de 2016

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ESTUDIO BIOLÓGICO DE LA INCORPORACIÓN DE UNA PREMEZCLA A BASE DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS

LUZ MARÍA ALZATE TAMAYO

“Prohibida la reproducción sin la autorización expresa del autor”

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA Medellín 2016

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AGRADECIMIENTOS Gracias a todos quienes me acompañaron y apoyaron con mi Doctorado: A Mi familia, Raúl, María Clara y Sara María que lo vivieron conmigo directamente y fueron parte del equipo recolector de muestras. A mis papás que siempre han creído en mí. A Julián Londoño mi asesor que puedo decir que soy otra después de sus enseñanzas. A las agraciaditas María Victoria Álvarez, Sara Hincapié y Nataly Saavedra por su apoyo incondicional. A Dubán González que admiro muchísimo por esa inteligencia y paciencia. Al profesor Edison Osorio por adoptarme en su grupo de investigación GISB. A Claudio Jiménez porque sus observaciones siempre fueron certeras. A Jorge Bernal por su apoyo en avicultura A Blanca Cardona (Mrs White) por todo su apoyo y trasnocho conmigo. A Ana Muñoz, Sandra llano y Carito Bedoya por todo su apoyo en el laboratorio A Carlos Ramírez por todas las trasnochadas secando las toneladas de verduras. A la profesora Vania Lima y Renán Ferreira por todo su apoyo, enseñanzas y acompañamiento en mi paso por la FURG y a Agatha mi compañera gatubela de apartamento en Brasil y de trasnochos en Colombia.

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LISTA DE FIGURAS Figura 1. Modelo cromático CIE L*a*b* (“Color Coordinates,” 2015) .................... 18 Figura 2. Clasificación aproximada de los rangos de tolerancias de color (Ploumidis, 2008). ................................................................................................. 19 Figura 3. Curva típica de perdida de humedad en Alimentos. ............................... 21 Figura 4. Curvas de secado para los residuos. ..................................................... 22 Figura 5. Curva de desorción para los residuos. ................................................... 25 Figura 6. Isotermas de sorción de agua en alimentos. .......................................... 26 Figura 7. Perfiles cromatográficos de los componentes de la premezcla y algunas materias primas para el concentrado .................................................................... 33 Figura 8. Abanico de color DSM (Hamelin & Altemueller, 2012). .......................... 40 Figura 9. Valores de la Escala de Roche en yemas .............................................. 46 Figura 10. Representación gráfica de la escala CIE L*a*b* (Ploumidis, 2008)...... 47 Figura 11. Peso promedio en gramos de los huevos registrado durante el ensayo biológico. ............................................................................................................... 49 Figura 12. Grosor de las cáscaras de los huevos en cm de los huevos registrado durante el ensayo biológico ................................................................................... 50 Figura 13. Índice Morfológico en porcentaje, de los huevos registrado durante el ensayo biológico.................................................................................................... 50 Figura 14. Contenido de carotenos totales en la yema ......................................... 51 Figura 15. Capacidad Antioxidante (ORAC) en las yemas .................................... 53 Figura 16. Contenido de carotenos totales en músculo, piel, sangre y yemas en la última semana del ensayo biológico. ..................................................................... 54 Figura 17. Cromatograma representativo de carotenos en una muestra de sangre y yemas ................................................................................................................. 55 Figura 18. Contenido de Zeaxantina, β-caroteno y Luteína en sangre y yemas ... 58 Figura 19. Capacidad antioxidante (ORAC) en músculo, piel, sangre y yemas en la última semana del ensayo biológico. ..................................................................... 60 Figura 20. Proceso de preparación de Liposomas (Figura adaptada)(Ferreira Rodrigues Meneses, 2014) ................................................................................... 65 Figura 21. Comportamiento biofísico de membranas ............................................ 66 Figura 22. Representación esquemática del comportamiento de una membrana frente a la interacción con la luz (Londoño Londoño, 2010). ................................. 68 Figura 23. Representación esquemática del comportamiento de la merocianina 540 en membranas dependiendo del estado de fluidez. ....................................... 69 5

Figura 24. Representación esquemática de un espectro FT-IR de fosfolípidos, como el DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina) mostrando las señales correspondientes a los principales grupos funcionales. (Figura Adaptada) (Ferreira Rodrigues Meneses, 2014)..................................................................................................... 71 Figura 25. Parámetros evaluados en el espectro FT-IR (Ferreira Rodrigues Meneses, 2014)..................................................................................................... 71 Figura 26. a) Turbidez y b) Cambios en la turbidez de los liposomas con carotenos al 0,625 %M ............................................................. ¡Error! Marcador no definido. Figura 27. a) Turbidez y b) Cambios en la turbidez de los liposomas con carotenos al 1,25 %M ............................................................... ¡Error! Marcador no definido. Figura 28. a) Turbidez y b) Cambios en la turbidez de los liposomas con carotenos al 2,5 %M. ................................................................ ¡Error! Marcador no definido. Figura 29. Intensidad de fluorescencia en liposomas conteniendo Luteína, licopeno y β-caroteno a 1,25 %M. ...................................................................................... 73 Figura 30. Relación entre intensidad y tiempo para liposomas vacíos de DMPC y conteniendo Licopeno ........................................................................................... 75 Figura 31. Relación entre intensidad y tiempo para liposomas vacíos de DMPC y conteniendo β-Caroteno ........................................................................................ 75 Figura 32. Relación entre intensidad y tiempo para liposomas vacíos de DMPC y conteniendo Luteína. ............................................................................................. 75 Figura 33. Espectro FTIR de DMPC puro y β-caroteno a las diferentes concentraciones trabajadas................................................................................... 77 Figura 34. Espectro FTIR de DMPC puro y licopeno a las diferentes concentraciones trabajadas................................................................................... 77 Figura 35. Espectro FTIR de DMPC puro y luteína a las diferentes concentraciones trabajadas................................................................. ¡Error! Marcador no definido. Figura 36. Estiramientos axiales de los grupos lipídicos a 2,5, 1,25 y 0,625 %M de β- Caroteno. .......................................................................................................... 81 Figura 37. Estiramientos axiales de los grupos lipídicos a 2,5, 1,25 y 0,625 %M de licopeno. ................................................................................................................ 86 Figura 38. Estiramientos axiales de los grupos lipídicos a 2,5, 1,25 y 0,625 %M de luteína. .................................................................................................................. 91 Figura 41. Modelo propuesto de inserción del β-caroteno en membranas lipídicas. .............................................................................................................................. 93 Figura 40. Modelo propuesto de inserción del Licopeno en membranas lipídicas. 95 Figura 42. Modelo propuesto de inserción de la luteína en membranas lipídicas. 98

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LISTA DE FOTOGRAFÍAS Fotografía 1. Microscopia para muestras de repollo. ............................................ 27 Fotografía 2. Microscopia para muestras de lechuga. ........................................... 27 Fotografía 3. Microscopia para muestras de tomate. ............................................ 28 Fotografía 4. Microscopia para muestras de zanahoria. ....................................... 28 Fotografía 5. Microscopia para muestras de pimentón. ........................................ 28 Fotografía 6. Disposición de las aves en las jaulas ............................................... 39 Fotografía 7. Recolección de huevos. ................................................................... 39 Fotografía 8. Diferencia de color entre las yemas ................................................. 46

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LISTA DE TABLAS Tabla 1. Cálculos para la formulación de la premezcla de acuerdo a parámetros de volumen y contenido de carotenoides ................................................................... 20 Tabla 2. Parámetros de color para los residuos. ................................................... 31 Tabla 3. Carotenos encontrados y Contenido de carotenos totales en los componentes de la premezcla (Alzate T., 2013). .................................................. 32 Tabla 4. Presencia de Zeaxantina en materias primas empleadas en la elaboración de los concentrados para gallinas ponedoras (Alzate T., 2013) ............................ 32 Tabla 5. Dietas suministradas durante el ensayo biológico ................................... 38 Tabla 6. Cálculo para la inclusión de la premezcla en el alimento. ....................... 44 Tabla 7. Formulación para gallinas ponedoras empleada con la premezcla ......... 45 Tabla 8. Coordenadas de color L*a*b* para las yemas de huevo durante las cuatro semanas del ensayo biológico .............................................................................. 48 Tabla 9. Parámetros evaluados para la caracterización de membranas. ............. 67 Tabla 10. Valores de T1 para los liposomas vacíos y conteniendo carotenos ....... 76 Tabla 11. Variación de los anchos de banda de los principales estiramientos lipídicos en ausencia y presencia de β-caroteno. .................................................. 78 Tabla 12. Variación en los desplazamientos de la frecuencia de los principales estiramientos lipídicos en ausencia y presencia de β-caroteno ............................ 80 Tabla 13. Variación de los anchos de banda de los principales estiramientos lipídicos en ausencia y presencia de licopeno....................................................... 84 Tabla 14. Variación en los desplazamientos de la frecuencia de los principales estiramientos lipídicos en ausencia y presencia de licopeno ................................ 85 Tabla 15. Variación de los anchos de banda de los principales estiramientos lipídicos en ausencia y presencia de luteína ......................................................... 89 Tabla 16. Variación en los desplazamientos de la frecuencia de los principales estiramientos lipídicos en ausencia y presencia de luteína. .................................. 90

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ABREVIATURAS a*: Cambio de rojo a verde α: alfa. AAPH: 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro AUC: Área Bajo la Curva, del inglés Area Under the Curve. Aw: Actividad acuosa, del inglés activity wáter b*: Cambio de azul a amarillo β: beta. CIELAB ó CIEL*a*b*: Comisión Internacional de la Iluminación, del francés, Commission Internationale d'Eclairage. C=O: Carbonilo cm: centímetros. N+(CH3)3 : Colina. Δ: Cambio. ΔE:Cambio en el color DMPC: Dimiristoilfosfatidilcolina, por su nombre en inglés Dimyristoylphosphatidylcholine. DSM, YCF: Abanico de DSM, del inglés DSM products Yolk Color Fan. PO2-: Fosfato. FT-IR: Espectroscopia infraroja con transformada de Fourier, por su nombre en inglés, Fourier transform infrared spectroscopy °C: grados Celsius 1H: Hidrógeno uno. HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia, por su nombre en inglés High Performance Liquid Chromatography. H-RMN: Resonancia Magnética Nuclear ICONTEC: Instituto Colombiano de Normas Técnicas L: Luminosidad LDL: Lipoproteína de Baja Densidad, por su nombre en inglés Low Density Lipoprotein. MC540: Merocianina 540. CH2: metilenos. mg: miligramos. mL: mililitros MLV: Vesículas Multilamelares Grandes, del inglés Multi Lamellar Vesicles. nm: nanómetros. NTC: Norma Técnica Colombiana. ppm: partes por millón 9

%M: porcentaje molar. ORAC: Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno, del inglés Oxygen Radical Absorbance Capacity RMCD: Ciclodextrina Metilada al Azar, del inglés Randomly methylated cyclodextrin RGB: escala de color Rojo, Verde y Azul, del inglés Red, Green and Blue RYCF: abanico de Roche, del inglés Roche Yolk Color Fan. SEM: Microscopia Electrónica de Barrido, del inglés Scanning Electron Microscopy. TEAC: Capacidad Antioxidante Equivalente a Trolox, por su nombre en inglés, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity. T1: Tiempo de relajación µg: microgramos. URF: Unidades Relativas de Fluorescencia V: Estiramiento. VS: Estiramiento Axial Simétrico Vas: Estiramiento Axial Asimétrico

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TABLA DE CONTENIDO AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. 4 LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... 5 LISTA DE FOTOGRAFÍAS ...................................................................................... 7 LISTA DE TABLAS.................................................................................................. 8 ABREVIATURAS..................................................................................................... 9 TABLA DE CONTENIDO....................................................................................... 11 1. PREPARACIÓN DE UNA PREMEZCLA A BASE DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA INCORPORARLA EN LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS. .................................................................................... 14 1.1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 14 1.2.

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 16

1.2.1. Formulación y preparación de la premezcla ...................................... 16 1.2.2. Construcción de las curva de desorción y pérdida de humedad ....... 16 1.2.3. Estructura microscópica de los residuos ........................................... 17 1.2.4. Análisis de color................................................................................. 17 1.3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 19

1.3.1. Formulación de la premezcla ............................................................. 19 1.3.2. Curvas de pérdida de humedad......................................................... 20 1.3.3. Curvas de desorción .......................................................................... 23 1.3.4. Efectos del secado sobre los residuos .............................................. 26 1.3.4.1.

Efectos del secado en la microestructura de los residuos. ............. 27

1.3.4.2.

Efectos del secado en el color de los residuos. .............................. 30

1.3.5. Perfil de carotenos de los componentes de la premezcla y de algunas materias primas del concentrado ................................................................... 31 1.4.

CONCLUSIONES..................................................................................... 34

2. ESTUDIO BIOLÓGICO DE LA INCORPORACIÓN DE UNA PREMEZCLA DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES RICA EN CAROTENOS EN LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS ................................................... 35 2.1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 35 2.2.

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 37

2.2.1. Inclusión de carotenos en la premezcla ............................................. 37 2.2.2. Ensayo Biológico ............................................................................... 38 2.2.3. Determinación del color de las yemas por la escala de Roche ......... 40 2.2.4. Determinación del color de las yemas por RGB y CIE L*a*b* ........... 40 11

2.2.5. Determinación de parámetros morfológicos del huevo ...................... 41 2.2.6. Extracción de carotenoides totales y antioxidantes piel, músculo, yemas y sangre .............................................................................................. 41 2.2.7. Determinación Carotenos en piel, músculo, yemas y sangre ............ 41 2.2.8. Determinación Capacidad antioxidante en piel, músculo, yemas y sangre 42 2.2.9. Análisis de carotenos mediante HPLC en yemas y sangre ............... 43 2.3.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................ 44

2.4.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 44

2.4.1. Inclusión de carotenos en la premezcla ............................................. 44 2.4.2. Color de las yemas por la escala de Roche ...................................... 45 2.4.3. Color de las yemas por RGB y CIE L*a*b* ........................................ 46 2.4.4. Parámetros morfológicos de los huevos ............................................ 48 2.4.5. Contenido carotenos totales en las yemas ........................................ 51 2.4.6. Capacidad antioxidante (ORAC) en las yemas ................................. 52 2.4.7. Contenido de carotenos totales en músculo, piel, sangre y yemas en la última semana del ensayo biológico ........................................................... 53 2.4.8. Perfil de carotenoides totales en yemas y sangre ............................. 54 2.4.9. Capacidad antioxidante (ORAC) en músculo, piel, sangre y yemas en la última semana del ensayo biológico ........................................................... 59 2.5.

CONCLUSIONES..................................................................................... 60

3. EVALUACIÓN DE LA INTERACCIÓN DE CAROTENOIDES EN MEMBRANAS: UN APORTE AL ENTENDIMIENTO DE LA ABSORCIÓN Y BIODISPONIBILIDAD. .......................................................................................... 62 3.1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 62 3.2.

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 64

3.2.1. Preparación de Liposomas ................................................................ 64 3.2.2. Comportamiento biofísico de membranas ......................................... 65 3.2.3. Técnicas para caracterización de membranas .................................. 66 3.2.3.1.

Determinación de la turbidez de los liposomas .............................. 67

3.2.3.2.

Espectrofluorometría ...................................................................... 68

3.2.3.3. Estudio de tiempos de relajación (T1) de los liposomas mediante Resonancia Magnética nuclear (H-RMN) ....................................................... 69 3.2.3.4. 3.3.

Ensayo de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier 70

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 72

3.3.1. Turbidez de los liposomas conteniendo los carotenos ...................... 72 12

3.3.2. Resultados de Espectrofluorometría.................................................. 73 3.3.3. Tiempos de relajación (T1) de los liposomas mediante H-RMN ........ 74 3.3.4. Influencia de los carotenos en la dinámica lipídica ............................ 76 3.3.4.1. Variaciones en los desplazamientos de las frecuencias y en los anchos de banda con β-caroteno ................................................................... 76 3.3.4.2. Variaciones en los desplazamientos de las frecuencias y en los anchos de banda con licopeno ....................................................................... 82 3.3.4.3. Variaciones en los desplazamientos de las frecuencias y en los anchos de banda con luteína ......................................................................... 87 3.3.5. Modelos propuestos de incorporación de los carotenos en los liposomas ....................................................................................................... 92 3.3.5.1.

Modelo propuesto de acomodación entre lípidos para el β-caroteno 92

3.3.5.2.

Modelo propuesto de acomodación entre lípidos para el licopeno . 93

3.3.5.3.

Modelo propuesto de acomodación entre lípidos para la Luteína .. 95

3.4.

CONCLUSIONES..................................................................................... 98

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 100

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1. PREPARACIÓN DE UNA PREMEZCLA A BASE DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES PARA INCORPORARLA EN LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS.

1.1. INTRODUCCIÓN En los últimos años el consumo y comercialización de frutas y verduras se ha venido incrementando debido a sus atractivas propiedades sensoriales y al reconocimiento de su valor nutricional (Ayala-Zavala et al., 2011,Silva et al., 2014). Sin embargo dichas actividades de comercialización y transformación de frutas y vegetales generan gran cantidad de residuos y excedentes poscosecha y de transformación que representan un problema debido a su facilidad de descomposición (Schieber, Stintzing, & Carle, 2001), representando un problema de salud pública para los centros de distribución incrementando también los costos de disposición de los mismos. A pesar de ello estos residuos y excedentes poscosecha representan una oportunidad única para explorar su potencial uso en la extracción de fitoquímicos para ser usados en suplementos nutracéuticos, aditivos dietarios, alimentos y productos farmacéuticos y de esta manera disminuir su impacto en el medio ambiente. Sin embargo, estos residuos aún no han sido aprovechados eficientemente en nuestro país, en parte, porque su valor es aún desconocido y, sobretodo, por la falta de métodos apropiados para la preparación y caracterización de sustancias de mayor valor agregado con la suficiente calidad e inocuidad. Específicamente, los costos de secado, almacenamiento y transporte son factores que limitan económicamente su aplicación industrial y por lo tanto son a menudo utilizados con un escaso tratamiento como alimento para animales, como fertilizantes o simplemente se convierten en focos de contaminación para las fuentes de agua, los mismos cultivos o peor aún son un problema de salud pública en centros de abastecimiento urbanos, en donde su disposición final genera costos cada vez más insostenibles (Alzate-T, Jimenez-Cartagena, & Londoño-Londoño, 2011) (Alzate T., 2013). Se estima que en Colombia se generan alrededor de 25.079 toneladas de residuos de origen orgánico por día, de esas 25.079 toneladas, 3.713 son generadas por el departamento de Antioquia y 1795 por la ciudad de Medellín (Superservicios, 2008). Puntualizando más el problema, solo en la Central Mayorista de Antioquia se generan diariamente 83 m3 de residuos, siendo el 40% de éstos residuos orgánicos, procedentes de las labores de clasificación de los locales de comercialización de frutas y verduras (Antioquia, 2010). Por ejemplo diariamente se generan 8,17 m3 de residuos de lechuga y 3,69 m3 de repollo, principalmente las hojas externas que son retiradas para la comercialización de estos vegetales; de tomate de aliño se generan 6,57, de pimentón 2,57 y 14

zanahoria 0,31 m3, respectivamente, los cuales corresponden a los productos que son desechados por su tamaño, por heridas, magulladuras y por excedentes de inventario (Antioquia, 2010). Dada la gran cantidad de residuos y excedentes poscosecha generados en Colombia, una alternativa al uso de dichos residuos es estudiarlos para elaborar una premezcla que pueda ser suministrada junto con el alimento para gallinas ponedoras, ya que estos son considerados una fuente importante de carotenoides que pueden mejorar el color y el contenido nutricional de la yema del huevo, siendo el color una de las características de calidad más importantes para el consumidor, ya que una yema de huevo pálida es asociada con poco sabor y escaso valor nutricional (Hasin, Ferdaus, Islam, Uddin, & Islam, 2006). Por este motivo, los productores de huevo incorporan pigmentos sintéticos para mejorar esta característica pero sin ningún beneficio nutricional, de ahí la importancia de agregar pigmentos naturales con los cuales se obtengan resultados similares y si un mayor aporte de sustancias bioactivas (Alzate T., 2013). Los residuos deben estar deshidratados para ser incorporados en el concentrado del animal, por tal razón es importante estudiar sus características como Aw, color y estructura con el fin de tener un producto en una forma más conveniente para su incorporación en el alimento concentrado, que además le da cualidades especiales como sabor, textura y color, además por la disminución de la actividad acuosa, aumenta su estabilidad porque la probabilidad de crecimiento microbiano será menor (Berk, 2009). El introducir esta premezcla en el alimento para las gallinas facilita el uso de la misma pues no se hace necesario suministrarlo aparte de la alimentación regular. La actividad acuosa se define como la relación que existe entre la presión de vapor de un alimento con la presión de vapor del agua pura a la misma a la misma temperatura, siendo un parámetro estrechamente relacionado con el contenido de humedad que permite inferir la capacidad de conservación del alimento y su susceptibilidad a la proliferación microbiana (Damodaran, Parkin, & Fennema, 2007). En por ello que en la deshidratación se debe estudiar la forma en que el agua está contenida en el alimento, si está libre, débilmente ligada o fuertemente ligada, pues ello determinará la facilidad con que se podrá retirar el agua del alimento y el punto hasta el cual se puede sacar la mayor cantidad de agua posible (Mauthlouthi, 2001). Por lo anterior es importante determinar la curva desorción, en la cual se compara la humedad en base seca (eje Y) contra la actividad acuosa (eje X), esta debe tener una forma sigmoidea evidenciando la forma en que está el agua unida al alimento (Colina Irezabal, 2010). Los tejidos vegetales poseen una estructura porosa, con estrechos conductos llamados capilares, al comienzo de la deshidratación el agua sale por capilaridad causando la disminución del diámetro de los capilares, provocando el encogimiento del alimento por la salida del agua a través de estos, hasta que ya no puede salir de esta manera. Así, los elementos estructurales se van deformando reduciendo los espacios libres, que hacen que el agua se desplace 15

por difusividad hacia la superficie del alimento que tiene menos concentración de agua. En estudios anteriores vegetales como lechuga, repollo, tomate, pimentón y zanahoria acopiados en la Central Mayorista de Antioquia y procedentes de diferentes regiones de Colombia, como fuentes prometedoras de carotenoides. Los contenidos de carotenoides reportados en mg de β-caroteno/100 g de muestra, en dicho estudio, corresponden a 16,6 para pimentón, 10,36 para zanahoria, 8,37 para tomate de aliño, 7,36 para repollo y 4,41 para lechuga; cabe anotar que estos contenidos pueden variar de acuerdo al cultivar, grado de madurez, año de la cosecha, condiciones edafoclimáticas entre otras de dichos vegetales (Alzate T., 2013). Por esta razón estos vegetales pueden ser utilizados en la preparación de una premezcla para ser incorporada en los concentrados de gallinas ponedoras.

1.2. MATERIALES Y MÉTODOS 1.2.1.

Formulación y preparación de la premezcla

Para elaborar la premezcla cada residuo fue deshidratado y molido. Para ello primero fueron lavados y desinfectados con una solución de ácido peracético a razón de 1,3 mL por litro de agua, durante 20 minutos. Luego dependiendo del producto se cortó en trozos o en rodajas de grosor uniforme, usando un procesador de alimentos (Modelo PA7, Brasil) y nuevamente se desinfectaron como se describió anteriormente. El material se escurrió y se deshidrató en un secador de lecho fluidizado (Model 0193, Series 002, ACTUM, Rionegro, Antioquia, Colombia), a 50 °C hasta alcanzar una humedad del 12%. La temperatura se escogió a fin de evitar pérdida de compuestos bioactivos por la influencia del calor (Alzate T., 2013). Por último los residuos se molieron y se empacaron al vacío para su uso posterior. Una vez realizado el cálculo de la cantidad de residuos deshidratados y molidos a combinar, estos fueron entregados a una empresa fabricante de concentrados para animales donde fueron mezclados para luego ser incorporado en el alimento de gallinas ponedoras.

1.2.2.

Construcción de las curva de desorción y pérdida de humedad

Para construir las curvas los residuos fueron lavados y desinfectados con una solución de ácido peracético a razón de 1,3 mL por litro de agua, durante 20 minutos. Luego dependiendo del producto se cortó en trozos o en rodajas de grosor uniforme. Se reservó una muestra para tomar humedad inicial. Los residuos fueron secados en un horno de convección forzada (Memmert®, Alemania), a 50ºC. Cada 10 minutos durante las primeras dos horas se tomaron medidas de 16

masa, Aw y color; pasadas las dos horas las mediciones se realizaron cada 20 minutos hasta llegar una masa constante. Para la determinación del Aw se utilizó un medidor de actividad acuosa Aqualab Series 3 (Decagon devices, USA). Con los datos de masa se calculó la humedad en base seca, como se muestra en la Ecuación 1, se graficó la curva de desorción con respecto a humedad en base seca en el eje Y y el Aw en el eje X y para la de pérdida de humedad se graficó igual para el eje Y (Aw) y para el eje X tiempo. Ecuación 1: Humedad en base seca. X= X= (Humedad en base seca) m= masa de la muestra húmeda

mss= masa de sólido seco 1.2.3.

Estructura microscópica de los residuos

Para analizar la estructura de los residuos húmedos se utilizó un microscopio de barrido electrónico JEOL JSM 6490 LV. Las muestras fueron analizadas en bajo vacío a 50 pascales y depositadas en una placa de enfriamiento a – 15°C. Los residuos deshidratados fueron analizados utilizando el mismo microscopio, fijándolos en una cinta de grafito, a los cuales se les realizó un recubrimiento delgado en oro (Au) utilizando un equipo DENTON VACUUM Desk IV. Luego éstas se analizaron en el microscopio electrónico de barrido en alto vacío con el fin de obtener imágenes en alta resolución. Se empleó el detector de electrones secundarios para evaluar la morfología y topografía de las muestras (Kuo, 2008).

1.2.4.

Análisis de color.

Para la medición del color se utilizó un analizador de color de Saturación y Luminancia, modelo RGB-1002 (Lutron Electronics, Taiwan). Los datos obtenidos en la escala RGB fueron convertidos al modelo CIE L*a*b*, utilizando el software CIE Color Calculator (Lindbloom, 2012). El CIEL*a*b* (CIELAB) es el modelo cromático usado normalmente para describir todos los colores que puede percibir el ojo humano. Fue desarrollado específicamente con este propósito por la Commission Internationale d'Eclairage (Comisión Internacional de la Iluminación), razón por la cual se abrevia CIE. Los asteriscos (*) que siguen a cada letra forman parte del nombre, ya que representan L*, a* y b*, de L, a y b (Hoffmann, 2013). 17

Los tres parámetros en el modelo CIE L*a*b* representan la luminosidad de color (L*, L*=0 indica negro y L*=100 indica blanco), su posición entre rojo y verde (a*, valores negativos indican verde mientras valores positivos indican rojo) y su posición entre amarillo y azul (b*, valores negativos indican azul y valores positivos indican amarillo) como se aprecia en la Figura 1 (ColorCodeHex, 2014).

Figura 1. Modelo cromático CIE L*a*b* (“Color Coordinates,” 2015)

Para el cálculo del cambio en el color se utilizó la siguiente ecuación: Ecuación 2. Cambio de color

Dónde: Cambio en el color

L: Luminosidad (0=Negro y 100=Blanco) a: Cambio de rojo a verde (-60=Verde y 60=Rojo) b: Cambio de azul a amarillo (-60=Azul y 60=Amarillo) (Chong, Law, Figiel, Wojdyło, & Oziembłowski, 2013). El cambio de color puede analizarse mediante un rango de tolerancia como se aprecia en Figura 2.

18

Sin diferencia Apenas notable

Notable

Fuerte diferencia

Figura 2. Clasificación aproximada de los rangos de tolerancias de color (Ploumidis, 2008).

1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1.3.1.

Formulación de la premezcla

Para la formulación de la premezcla se utilizó pimentón, zanahoria, tomate de aliño, repollo y lechuga, caracterizados en una investigación anterior a la presente. Para calcular la cantidad de cada residuo seco se emplearon dos factores ponderantes, la abundancia del residuo y su contenido de carotenos. El primero, obedece a una lógica de aprovechamiento de aquellos residuos que generan un mayor problema de disposición por su alto volumen de producción, lo cual garantizará también la sostenibilidad en la generación de materia prima. El segundo factor, responde a la necesidad de incorporar residuos que aporten un alto contenido de carotenos como sustancias de interés (Alzate T., 2013). En la Tabla 1 se puede apreciar el cálculo para obtener 38,808 Kg de la premezcla, necesaria para preparar las formulaciones del ensayo biológico y en la Tabla 6 el cálculo para la inclusión de la premezcla en el alimento, teniendo en cuenta el contenido de carotenos, trabajo realizado en una etapa anterior a esta investigación, sin embargo solo por razones de facilidad en la comprensión del presente trabajo se hizo este breve resumen (Alzate T., 2013).

19

Tabla 1. Cálculos para la formulación de la premezcla de acuerdo a parámetros de volumen y contenido de carotenoides Residuo

Volumen (Tm)

Factor 1

% C F1

Carotenos totales (mg/100 g)

Factor 2

%CF2

Premezcla (csp harina)

Lechuga

10,95

0,23

90

927,68

0,23

10

8,90

Tomate

5,9

0,12

90

864,73

0,21

10

5,14

Repollo

12

0,25

90

569,86

0,14

10

9,33

Pimentón

13,85

0,29

90

1098,86

0,27

10

11,19

Zanahoria

5

0,10

90

617,89

0,15

10

4,25

Total

47,7

1

4079,02

1

38,808

Promedio ponderado 848,75 Tm: Tonelada métrica, Factor 1: Abundancia, Factor 2: Contenido de carotenos, Porcentaje de contribución Factor 1: % C F1, Porcentaje de contribución Factor 2: %CF2, csp: cantidad suficiente para.

1.3.2.

Curvas de pérdida de humedad

En la Figura 3 se pueden apreciar las diferentes etapas del proceso de deshidratación. Entre A y B hay un período de estabilización de condiciones en la cual la superficie del sólido se equilibra con el aire de secado y se llega a la temperatura de evaporación del agua a las condiciones del secado, esta etapa es imperceptible en algunos productos dependiendo de la forma en que esté localiza el agua dentro del alimento. La etapa B-C corresponde a la evaporación del agua libre, durante la cual la superficie del producto se mantiene saturada de agua, en este caso la deshidratación se logra por evaporación del agua desde la superficie del producto hacia la corriente de aire, aquí la temperatura del agua en la superficie corresponde a la de bulbo húmedo del aire de secado. Entre C y D se da la remoción del agua que está débilmente ligada en el alimento y entre D y E, se remueve el agua que está más hacia el interior de la matriz alimentaria; en estas dos últimas etapas la superficie del alimento comienza a resecarse y la temperatura de la superficie del producto aumenta hasta llegar a la de bulbo seco del aire de secado (Colina Irezabal, 2010).

20

Humedad del producto X (gw/gss)

40 A

35 30

B

25 20 15

C

10 5

D

E

0 0

50

100

150

200

250

Tiempo Figura 3. Curva típica de perdida de humedad en Alimentos.

Relacionando la Figura 6 y la Figura 3 la zona comprendida entre A y C de la Figura 3, corresponde a la Zona A de la Figura 5, de C a D a la Zona B y de D a E a la Zona E. Según esto las curvas de la Figura 4 del secado de los productos corresponden con estos modelos teóricos anteriormente planteados y con seguridad se puede afirmar que se logró eliminar de los alimentos deshidratados el agua libre, la débilmente ligada inhibiéndose las reacciones químicas y enzimáticas además del crecimiento microbiano.

21

40

14

Repollo

30

10

X (gw/gss)

X (gw/gss)

Lechuga

35

12

8 6

25 20 15

4

10

2

5 0

0 0

60

120

180

240

300

360

420

0

480

50

100

Tiempo 10

12

Zanahoria

250

Pimentón

10 8

X (gw/gss)

X (gw/gss)

200

Tiempo

8 6 4

6 4

2

2

0

0 0

30

60

90

120

150

180

0

Tiempo

20

20

40

60

80

100

120

Tiempo

Tomate

16

X (gw/gss)

150

Curvas de pérdida de humedad de los residuos

12 8 4 0 0

40

80

120

160

200

240

Tiempo

Figura 4. Curvas de secado para los residuos.

Comparando con otros estudios de secado para los productos trabajados, en el caso del repollo la actividad acuosa obtenida al final del tratamiento fue de 0,27 con un tiempo de secado de 420 minutos, y valores similares a los obtenidos Phungamngoen y colaboradores, coincidiendo también la curva de perdida de humedad obtenida comparando con el ensayo realizado por dichos investigadores con secado por aire caliente. Igualmente reportan un oscurecimiento del repollo después de secado (Phungamngoen, Chiewchan, & Devahastin, 2013). 22

Para el caso de la lechuga comparado con el estudio realizado de liofilización en microondas con corazones de lechuga, la gráfica de pérdida de humedad sigue la misma tendencia, los autores también obtuvieron cambios similares en la microestructura y el color después del secado, con la diferencia de que los corazones de lechuga estaban congelados por lo que tomaron más tiempo en el secado que las hojas de lechuga usadas en este estudio (Wang, Zhang, Mujumdar, Mothibe, & Roknul Azam, 2012). En el proceso de secado de zanahoria realizado por Zielinska, se obtuvo un valor en el delta de color de 9,57, más alto que el obtenido en el presente trabajo, que fue de 7,12. En cuanto a la actividad acuosa ellos obtuvieron un cambio desde 0,98 a 0,58, mientras que el nuestro estuvo entre 0,98 y 0,338, a las mismas condiciones de temperatura (Zielinska & Markowski, 2010). En cuanto al cambio de color obtenido en la deshidratación del pimentón como se dijo anteriormente se logró conservar su coloración rojiza, cosa que no sucedió en el proceso de secado realizado por Arslan, ya que su proceso de secado de 100 gramos del producto sobrepaso las treinta horas mientras que el nuestro con 43 gramos estuvo alrededor de 110 minutos (Arslan & Özcan, 2011). En el secado convectivo de tomates realizado por Lewicki, tuvieron un tiempo de secado de 650 minutos superior al nuestro que estuvo alrededor de 240 minutos, diferencia que radica en la geometría del producto a secar, ya que ellos tajaron los tomates en cuatro pedazos, mientras en nuestro caso fue en tajadas de aproximadamente 2 mm de espesor (Lewicki, Vu Le, & Pomarańska-Łazuka, 2002).

1.3.3.

Curvas de desorción

Las curvas de desorción representan la pérdida de humedad con respecto a la disminución de la actividad acuosa, relacionada con la forma en que está distribuida el agua en la matriz alimentaria (Damodaran et al., 2007). En la Figura 6, se observan tres zonas; la zona C representa el agua libre en el alimento que es fácilmente removida en el proceso de deshidratación y es la que propicia el crecimiento de microorganismos y reacciones químicas y enzimáticas y es donde se percibe que grandes cambios en el contenido de humedad produce pequeños cambios en el Aw, de manera general cuando se ha eliminado todo el agua tipo C, el contenido de humedad del alimento puede estar entre 15 y 35% y la actividad del agua mayor de 0.8, valores que dependen del tipo de alimento y la temperatura de secado. La Zona B representa el agua débilmente ligada y se desarrollan las reacciones de oxidación lipídica y de oscurecimiento no enzimático, en este caso una pequeña eliminación de agua reduce de modo notable el Aw; cuando se ha eliminado el agua de esta zona el alimento contiene de 3 a 15% de humedad. La Zona A corresponde al agua fuertemente ligada y su eliminación es muy difícil, por lo que en la mayoría de los alimentos esta agua no se elimina ya que al tratar de eliminarla se produce un deterioro irreversible en características 23

físicas, químicas y sensoriales, aún con la presencia de esta agua se logra la conservación del alimento, ya que desde el final de la etapa B se ha inhibido el crecimiento microbiano y la mayoría de las reacciones químicas y enzimáticas, pero todavía se puede presentar oxidación lipídica (Colina Irezabal, 2010). Cabe anotar que es importante tener en cuenta las Aw a las cuales se pueden desarrollar los microorganismos para poder definir hasta qué punto puede bajarse el Aw para evitar el deterioro por microorganismos y así prolongar la vida útil de los alimentos. Por ejemplo las bacterias alterantes pueden multiplicarse a valores de Aw superiores a 0,9, las levaduras arriba de 0,88 y por último los mohos alteradores que crecen por encima de 0,8. Sin embargo hay que tener presente que existen ciertos grupos de microorganismos que soportan valores inferiores de Aw como bacterias halófilas que pueden crecer a Aw superiores y mohos xerofílicos y levaduras osmófilas a valores superiores a 0,61 respectivamente. Es por ello que un Aw de 0,6 o inferior se considera como un valor seguro para la conservación de los alimentos sin peligro de deterioro microbiano (Jay, James M., Loessner, Martin J., Golden, 2005).

24

40

Repollo

14

30

10

X (gw/gss)

X (gw/gss)

12

8 6

25 20 15

4

10

2

5

0 0.0

Lechuga

35

0.2

0.4

0.6

0.8

0 0.0

1.0

0.2

0.4

Aw

10

Zanahoria

7

X (gw/gss)

X (gw/gss)

8 6 5 4 3 2 1 0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0.0

Aw

20

0.8

1.0

0.8

1.0

Aw

9

0 0.0

0.6

Pimentón

0.2

0.4

0.6

Aw

Tomate

18

X (gw/gss)

16 14 12 10 8

Curvas de Desorción para los residuos

6 4 2 0 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Aw

Figura 5. Curva de desorción para los residuos. De acuerdo a lo anterior, las curvas de sorción obtenidas para los residuos de la Figura 5, coinciden con el modelo teórico mostrado en la Figura 6 b, ya que estos alimentos tienen altos contenidos de humedad. La mayoría terminó con una actividad acuosa alrededor de 0,4, excepto para el repollo que disminuyó hasta 0,3, en este punto hay seguridad que se han inhibido las reacciones químicas y enzimáticas, así como el crecimiento de microorganismos, como ningunos de los alimentos secados tiene alto contenido de grasa no hay peligro de reacciones de oxidación lipídica que puedan ocasionar problemas durante el almacenamiento de la premezcla. 25

a)

b)

10 9

9 8 Zona A

Zona B

Zona C

X (gw/gss)

X (gw/gss)

8 7

10

6 5 4 3

7 6

Zona B

Zona C

0.8

1.0

4 3

2

2

1

1

0 0.0

Zona A

5

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Aw

0 0.0

0.2

0.4

0.6

Aw

Figura 6. Isotermas de sorción de agua en alimentos. a) con bajo contenido de agua. b) con alto contenido de agua.

1.3.4.

Efectos del secado sobre los residuos

Los procesos de secado inducen una gran variedad de cambios en los alimentos que incluyen cambios físicos, químicos o fisicoquímicos. Sin embargo únicamente los cambios físicos están más directamente relacionados a los cambios en la microestructura de los materiales, aunque los cambios microestructurales también afectan otros tipos de cambios bien sea químicos o bioquímicos, debido a que pueden afectar la vía por la cual el calor y la masa se deben transferir (Niamnuy, Devahastin, & Soponronnarit, 2014).

26

1.3.4.1. Efectos del secado en la microestructura de los residuos. A continuación se presenta la estructura microscópica de los residuos húmedos y secos observados en SEM, en las fotografías 1 a la 5.

a)

b)

Fotografía 1. Microscopia para muestras de repollo. a) Microfotografía SEM de repollo fresco a 200x b) Microfotografía SEM de repollo deshidratado a 200x

a)

b)

Fotografía 2. Microscopia para muestras de lechuga. a) Microfotografía SEM de lechuga fresca a 200x.b) Microfotografía SEM de la lechuga deshidratada a 200x

27

Fotografía 3. Microscopia para muestras de tomate. a) Micrografía SEM de tomate fresco a 100X c) Micrografía SEM de tomate deshidratado a 200X.

a)

b)

Fotografía 4. Microscopia para muestras de zanahoria. a) Micrografía SEM de zanahoria fresca a 200X b) Micrografía SEM de zanahoria deshidratada a 200X.

a)

oriab)

Fotografía 5. Microscopia para muestras de pimentón. a) Micrografía SEM de pimentón fresco a 200X c) Micrografía SEM de pimentón deshidratado a 100X.

28

Las condiciones de secado afectan la microestructura y otras propiedades en los alimentos deshidratados, como el color, razón por la cual se tomaron las fotografías antes y después del proceso de deshidratación y las coordenadas de color (Niamnuy et al., 2014). Con las micrografías tomadas en el microscopio electrónico para el producto fresco y seco se analizaron los cambios estructurales en cuanto a preservación de la pared celular y cambio en las celdas. Aunque el tamaño de las celdas en todo el vegetal no es uniforme, si puede dar una idea de cómo el secado provoca el encogimiento y disminución en el tamaño de estas. Para el repollo se puede observar en la Fotografía 1 a y b el cambio sufrido por la estructura durante el secado. En el producto fresco se observan células hidratadas, mientras que en el seco se observa un encogimiento y aplanamiento de las celdas aún la forma geométrica. Similares observaciones en cuanto a la estructura hicieron Laurienzo y colaboradores al deshidratar manzanas con aire caliente (Laurienzo et al., 2013). La lechuga presenta una estructura similar al repollo cuando está fresco, pues también se observa celdas hidratadas un poco más pequeñas y mientras que cuando está deshidratada presenta colapsamiento de las paredes celulares, pues no se observan estructuras geométricas definidas, probablemente porque el tejido de la lechuga es más delgado y frágil que el repollo (Fotografías 2a y 2b). En cuanto al tomate cuando es deshidratado pierde completamente la integridad del tejido, observándose totalmente liso similar al repollo y la lechuga (Fotografías 3a y 3b). En la zanahoria fresca se observan celdas de forma geométrica definida y a diferencia de los anteriores luego del proceso de secado, sigue conservando una perfecta organización de su tejido, con células de forma polihédrica de tamaño uniforme, distribuidas a través de la matriz, con un ligero arrugamiento en las paredes (Fotografías 4a y 4b). Las estructuras que se observan en las micrografías de SEM son similares a las obtenidas en un estudio de parámetros de calidad de zanahorias deshidratadas por ultrasonido y convección forzada (Gamboa-Santos, Soria, Villamiel, & Montilla, 2013). El pimentón presenta una estructura organizada de tamaño poco uniforme con celdas de conservadas y una vez deshidratado sigue conservando su forma al igual que se observó con la zanahoria (Fotografías 5a y 5b). Relacionando los fenómenos de secado explicados en los numerales 1.3.2 y 1.3.3, con los cambios microestructurales revelados por las micrografías SEM, se puede decir que para todos los residuos en gran parte del proceso de secado la remoción del agua libre del interior a la superficie se da por capilaridad cuando el Aw está por encima de 0,7; después de la pérdida del agua débilmente ligada se da alrededor de valores de Aw de 0,6 y menores precisamente cuando se va 29

perdiendo la integridad de la estructura, por lo que el paso del agua de la parte interna a la superficie se da por el fenómeno de difusividad. Como en efecto se observaron cambios en la estructura de los residuos después del secado, es necesario determinar si el secado también provoca cambios en cuanto al color, como se evalúa en el siguiente numeral.

1.3.4.2.

Efectos del secado en el color de los residuos.

El color es uno de los más importantes indicadores de calidad en los alimentos y en los productos agrícolas, por eso cambios indeseables en el color pueden hacer que estos pierdan calidad y valor en el mercado. Los cambios en el color durante y después de las operaciones de secado pueden ser producidos por reacciones enzimáticas y no enzimáticas como la reacción de Maillard y la caramelización (Adiletta, Russo, Senadeera, & Di Matteo, 2015). En la Tabla 2 se presentan los valores de color obtenidos antes y después del secado de los residuos. Los resultados muestran que el proceso de secado produjo cambios significativos en los valores de color. Todos los productos secados tuvieron una disminución en el valor de L, lo que significa que tendieron a oscurecerse, siendo más notorio en el repollo. En los valores de a* se encontró un aumento en la escala, para todos los productos, excepto en la lechuga que es muy bajo, mientras que en la zanahoria es más pronunciado, lo que indica una tendencia hacia la tonalidad roja. Para los valores de b* se encontró una tendencia hacia el amarillo por el aumento en dicha escala para todos los vegetales, excepto para el repollo, que disminuyó hacia el azul. De acuerdo al cambio del color, como se mencionó anterioremente, este fue mas notorio para el repollo, seguido en orden de la lechuga, el pimentón la zanahoria y el tomate, donde los cambios fueron menores, debido a la cantidad de carotenos presentes en ellos, como se evidenció en investigaciones previas a este trabajo (Alzate T., 2013). Como en el repollo y la lechuga el contenido de carotenos es mucho menor, se evidencian mas los procesos de oscurecimento debido probablemente a la presencia de clorofilas, las cuales, durante los procesos de calentamiento sufren una reación química en la cual la se transforma en otro compuesto coloreado de color verde oliva, denominado feofitina (Damodaran et al., 2007).

30

Tabla 2. Parámetros de color para los residuos. Residuo Repollo Lechuga Zanahoria Pimentón Tomate

1.3.5.

Estado

L

a

b

Fresco

56,12

-54,73

15,66

Deshidratado

10,88

-2,05

7,19

Fresco

34

-4

9

Deshidratado

24

-5

16

33,49655

-28,3891

11,42285

18

11

16

4,92

7,65

4,7

8

13

8

Fresco

5,46

4,32

3,11

Deshidratado

6,14

7,47

6,05

Fresco Deshidratado Fresco Deshidratado

∆E 69,95 12,48 5,81 7,12 4,36

Perfil de carotenos de los componentes de la premezcla y de algunas materias primas del concentrado

De acuerdo a los perfiles cromatográficos, Figura 7, realizados a los componentes de la premezcla en un estudio previo se evaluó la presencia de carotenos de importancia para la coloración de la yema de los huevos y con características antioxidantes. Además se determinó la presencia de Zeaxantina en algunas de las materias primas usadas en la formulación para la alimentación de gallinas ponedoras pues este caroteno también aporta color a la yema de huevo (Hamelin & Altemueller, 2012). En la Tabla 3 se presentan el perfil de carotenos y el valor de carotenos totales de cada ingrediente de la premezcla y la Tabla 4 muestra la presencia de zeaxantina en las demás materias primas de la formulación para gallinas ponedoras.

31

Tabla 3. Carotenos encontrados y Contenido de carotenos totales en los componentes de la premezcla (Alzate T., 2013). Muestra fresca Residuo

Pimentón

Zanahoria

Tomate de aliño

Repollo

Lechuga

Muestra Deshidratada

Carotenoide encontrado β-caroteno

Cantidad mg/100g 1,465

Carotenoides totales mg β-caroteno/100g

Luteína

-

16,16

Licopeno

-

β-caroteno

1,465

Luteína

0,406

Licopeno

-

β-caroteno

0,355

Luteína

0,631

Licopeno

2,261

β-caroteno

0,029

Luteína

0,23

Licopeno

-

β-caroteno

0,014

Luteína Licopeno

0,814

10,36

8,37

7,36

4,41

-

Tabla 4. Presencia de Zeaxantina en materias primas empleadas en la elaboración de los concentrados para gallinas ponedoras (Alzate T., 2013) MUESTRA Torta de soya importada Sorgo Harina de trigo de tercera Harina de carne y hueso Harina de pollo Maíz amarillo

Presencia de zeaxantina Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente

32

DAD1A,Sig=452,4Ref=off(CAROTENOS\041-0101.D)

DAD1A,Sig=452,4Ref=off(CAROTENOS\043-0301.D) mAU

29.508

Tomate

10

30

Licopeno

25

11.014

mAU

Zanahoria

Luteina

8 6

β-caroteno

22.332

20

6.000

4

15

2

5.650 6.005

5

0

24.077

11.035

10

-2

0

-4

-5 5

10

15

20

25

30

35

min

5

DAD1A,Sig=452,4Ref=off(CAROTENOS\050-1001.D)

25

30

35

min

10.988

10.985

Repollo

25

Luteina

20

11.141

8.716

20

mAU

Lechuga uce

Luteina

20

15

15

DAD1A,Sig=452,4Ref=off(CAROTENOS\049-0901.D)

mAU 25

10

β-caroteno

β-caroteno

15

10

0

-5

22.269 10.039

5.995 7.046

5

0

8.727

22.267

5

9.9 .71 60 8

5.990 7.035

10

-5 5

10

15

20

25

30

35

min

5

mAU

Pimentón

9.528

50

10

15

20

*DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\041-0101.D) *DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\042-0201.D) *DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\043-0301.D) *DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\044-0401.D) *DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\045-0501.D) *DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\046-0601.D) *DAD1A, Sig=452,4Ref=off (CAROTENOSHARINAS2013-04-2014-57-17\047-0701.D)

DAD1A,Sig=452,4Ref=off(CAROTENOS\042-0201.D)

25

30

35

min

Materias primas

mAU

40

Zeaxantina

5

30

3

28.799 29.645

26.278 26.966

22.684

2

24.847

7.086 7.489 8.136 8.542 9.024 8.816

5.66 7.0 306

10

9.942 90.168 10.50210.321 11.106 10.857 11.280

4

20

1

0 0

5

10

15

20

25

30

35

min

5

10

15

20

25

30

35

min

Figura 7. Perfiles cromatográficos de los componentes de la premezcla y algunas materias primas para el concentrado Como se puede observar en la Tabla 4 y la Figura 7 solo en el maíz se encontró zeaxantina, mientras que en los componentes de la premezcla no se encontraron, lo cual permitirá determinar con mayor claridad que carotenos son los responsables de la pigmentación de la piel de las aves y la yema, en el ensayo biológico que se propone en el siguiente capítulo. La zeaxantina ha sido reportada como uno de los carotenoides importantes en el maíz amarillo (Primo Yufera, 1998), por ejemplo Moros y colaboradores encontraron 5.7 µg/g de zeaxantina en maíz amarillo (Moros, Darnoko, Cheryan, Perkins, & Jerrell, 2002), mientras que Scott y Eldridge encontraron en dos variedades de maíz amarillo fresco WS y WSK GWK cultivados en Glencoe, Minnessota, 0.285 y 2.09 µg/g respectivamente. Una vez obtenidos las cantidades de residuos secos para la premezcla se pasa a la siguiente etapa donde se harán los cálculos respectivos para la inclusión de la 33

premezcla en una dieta comercial para gallinas ponedoras y evaluar su efecto sobre la piel, el músculo, la sangre y las yemas, mediante un ensayo biológico.

1.4. CONCLUSIONES Las curvas de desorción y pérdida de humedad se relacionaron perfectamente, coincidiendo además con los modelos teóricos y demuestran que la premezcla elaborada a partir de estos residuos deshidratados tendrá una excelente estabilidad en el almacenamiento, pues se obtuvieron actividades acuosas por debajo de 0,4 que permiten inhibición de los procesos enzimáticos, de las reacciones químicas y del crecimiento microbiano. Las diferencias en los tiempos de secado pudieron ser esclarecidos con los cambios estructurales observados en las micrografías SEM antes y después del secado, confirmando los resultados obtenidos en las curvas de sorción y perdida de humedad con los cambios de color. Los datos obtenidos en las mediciones de color mostraron la influencia que tiene el proceso de secado sobre éstos, siendo más notorio el oscurecimiento producido después del secado, en especial para el repollo y lechuga, debido al cambio inducido en la clorofila por la temperatura. Los que más retuvieron su color fueron el tomate y el pimentón gracias a su contenido de carotenos.

34

2. ESTUDIO BIOLÓGICO DE LA INCORPORACIÓN DE UNA PREMEZCLA DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES RICA EN CAROTENOS EN LA ALIMENTACIÓN DE GALLINAS PONEDORAS

2.1. INTRODUCCIÓN El huevo de gallina ha sido usado por el ser humano como alimento desde la antigüedad. Su popularidad es justificada no solo porque es fácil de producir y por sus muchos usos culinarios, sino también por su valor nutricional ya que es rico en proteínas, vitaminas y minerales, ácidos grasos saturados e insaturados, junto con otras sustancias como la luteína y la colina (Surai & Sparks, 2001) (Carranco et al., 2003). Recientes investigaciones han permitido concluir que los huevos suplen los requerimientos de un alimento funcional. Por ejemplo los niveles de ciertos nutrientes como vitamina E y DHA, pueden ser incrementados a tal punto que un solo huevo puede proporcionar estos nutrientes en cantidades comparables a los requerimientos diarios (Surai & Sparks, 2001). Al ser el estado nutricional de las personas uno de los aspectos más importantes en salud pública, generalmente involucrado en las políticas gubernamentales de muchos países, podría considerarse al huevo como un alimento que puede intervenirse para mitigar deficiencias específicas en una población, ya que es considerado un alimento de consumo masivo. Esta intervención se puede lograr a través de la dieta suministrada a las aves, pues se ha demostrado que la incorporación de antioxidantes en su alimentación, no solo aumenta el contenido de estas sustancias en los productos derivados, sino que también mejoran considerablemente la salud animal. Es por esta razón que los productos avícolas representan una ventaja adicional para la salud humana debido a la capacidad que tienen las aves de almacenar compuestos bioactivos en formas altamente disponibles, como se ha demostrado por ejemplo las ventajas de la suplementación con selenio en dietas para reproductoras y pollo de engorde, con los subsecuentes efectos benéficos sobre la salud humana del selenio (Surai & Sparks, 2001). Los carotenoides son ingredientes esenciales en la alimentación animal, tanto por su función pigmentaria como por su papel en la promoción de la salud, ya que presentan propiedades antioxidantes y son precursores de la vitamina A. Se ha demostrado la presencia de carotenoides como luteína y zeaxantina en la yema de huevo (Ribaya Mercado JD, 2004), además se ha podido establecer que a pesar de que su contenido es inferior al de algunas fuentes de origen vegetal, la biodisponibilidad es superior. De esta manera la presencia de sustancias bioactivas en el huevo dependen exclusivamente de la dieta suministrada al animal, generando no solo la aceptación sensorial en el consumidor de un huevo con alto nivel de pigmentación en la yema, sino también efectos biológicos que 35

mejoran considerablemente la salud del animal (Chung, Rasmussen, & Johnson, 2004). El color de la yema del huevo, un factor cultural diferencial en las preferencias de los consumidores, sólo puede ser controlado mediante el manejo del contenido en carotenoides en el alimento de las gallinas (Schweigert, Hurtinne, Mothes, & Schierle, 2011). Estas preferencias de color son subjetivas y varían ampliamente de un país a otro (Chukwuka et al., 2011), por ejemplo, en Colombia los consumidores, tanto a escala industrial como individual, tienen la tendencia de preferir productos de colores vivos; en el caso de los huevos se observa una mayor demanda por aquellos que poseen yemas de color amarillo-anaranjado. Por este motivo, en explotaciones avícolas dedicadas a producir huevo, se ha tornado como una práctica normal la adición de pigmentos (carotenoides o xantófilas) en cantidades adecuadas a las dietas de gallinas ponedoras para colorear la yema del huevo, la grasa subcutánea y la piel de las aves (Hernández Gimeno, 2003). El determinante primario del color de la yema de huevo son las xantofilas procedentes de fuentes vegetales incluidas en el alimento de las gallinas, por lo que es posible manipular el color de las yemas adicionando xantofilas naturales o sintéticas (Chukwuka et al., 2011). El aumento relativo de las proporciones de xantofilas productoras de rojo o anaranjado a expensas de las amarillas realzan la pigmentación. Para ello se utilizan ingredientes como maíz amarillo, gluten de maíz, que contienen xantofilas rojas; y la alfalfa que aporta principalmente xantofilas amarillas. Sin embargo, cuando el suministro de xantofilas aportadas por las materias primas es insuficiente, se incluyen pigmentos naturales o artificiales en la formulación de las dietas para gallinas ponedoras (Hernández Gimeno, 2003). En los últimos años se han venido buscando otras alternativas de colorantes, por lo que se han evaluado algas, pastos, crustáceos y pigmentos naturales que se puedan producir sintéticamente o extraerse y saponificarse (Carranco et al., 2003). Sin embargo otras fuentes como residuos o excedentes de cosecha de frutas y verduras no han sido ampliamente estudiadas. Los estudios epidemiológicos han señalado que el consumo de frutas y hortalizas confiere beneficios para la salud, como disminución en el riesgo de enfermedad coronaria y accidentes cerebrovasculares y ciertos tipos de cáncer. Estos beneficios para la salud se atribuyen principalmente a micronutrientes orgánicos, tales como los carotenoides, polifenoles, tocoferoles, vitamina C entre otros (Gilbert, 1997). Como se ha demostrado en estudios anteriores las verduras como repollo, lechuga, pimentón, tomate y zanahoria contienen carotenoides (Alzate T., 2013). Los carotenoides son pigmentos liposolubles responsables del color rojo, amarillo, naranjado y purpura de frutas y vegetales que se dividen en xantofilas y carotenos (Rodríguez-Bernaldo de Quirós & Costa, 2006). Los carotenos en particular el βcaroteno y el α-caroteno y la xantofila β-criptoxantina son precursores de Vitamina A (O’Connell, Ryan, & O’Brien, 2007), que en países subdesarrollados como 36

Colombia su deficiencia en la población infantil es hoy día un motivo de preocupación para el gobierno nacional (Profamilia, 2010). Como antioxidantes, los carotenoides son capaces de inactivar especies reactivas de oxígeno que ayudan a retrasar el daño oxidativo, además este efecto antioxidante se ha asociado con la reducción del riesgo de desarrollar enfermedades crónicas como las cardiovasculares, cáncer y osteoporosis. Además de estos importantes efectos se ha identificado el importante el papel que cumplen xantofilas como la luteína y la zeaxantina, que puden ser encontrados en vegetales verdes y amarillos, en la salud ocular(O’Connell et al., 2007). Estas dos xantofilas se acumulan en la mácula de ojo, para actuar como poderosos filtros de luz azul, papel atribuido directamente a su función como antioxidante que pueden atrpar y secuestrar especies reactivas de oxígeno fotoinducidas. Es por ello que su ingesta está relacionada con prevención de la aparición de cataratas y la degeneración macular asociada con la edad (Nwachukwu, Udenigwe, & Aluko, 2016; Perry, Rasmussen, & Johnson, 2009). Por todo lo anterior y dada la gran cantidad de residuos y excedentes poscosecha generados en Colombia y considerando que el huevo es un alimento de gran valor nutritivo y que el consumo per cápita para el año 2015 fue 252 unidades (FENAVI, 2015)., se decidió buscar una alternativa al uso a dichos residuos, por lo que se propuso estudiarlos para elaborar una premezcla rica en carotenoides para intervenir la alimentación de gallinas ponedoras a fin de evaluar el efecto de esta sobre la calidad nutricional de la carne y huevos.

2.2. MATERIALES Y MÉTODOS Todos los reactivos utilizados en los diferentes ensayos fueron grado analítico 2,2'Azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH), fluoresceína y la ciclodextrina (Randomly methylated cyclodextrin ,RMCD) fueron comprados a la empresa Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Los estándares de luteína, zeaxantina, licopeno y β-caroteno fueron comprados en ChromaDex (Irvine, CA, USA). El hexano y el diclorometano, fueron grado analítico y comprados a la empresa Merck (Alemania), mientras que la acetona y el metanol fue grado HPLC adquiridos también en Merck.

2.2.1.

Inclusión de carotenos en la premezcla

Para la formulación de la premezcla como se explicó anteriormente, se escogieron los cinco residuos que presentaron el mayor contenido de carotenos, pues este es el parámetro más importante a tener en cuenta para formular el concentrado para gallinas ponedoras, pues los carotenos pasan a través del metabolismo de la gallina a la yema de huevo dándole su color característico, siendo este parámetro hoy en día una de las características de calidad más importantes para el consumidor, ya que una yema de huevo pálida es asociada con poco sabor y 37

escaso valor nutricional (Hasin, Ferdaus, Islam, Uddin, & Islam, 2006). Por este motivo, los productores de huevo incorporan pigmentos sintéticos para mejorar esta característica pero sin ningún beneficio nutricional, de ahí la importancia de agregar pigmentos naturales con los cuales se obtengan resultados similares y si un mayor aporte de sustancias bioactivas. De esta manera se formuló una premezcla para compararla con dos controles, el primero no tiene incorporado ningún pigmento y el segundo contiene pigmento sintético mediante un ensayo biológico con gallinas ponedoras que se explica a continuación.

2.2.2.

Ensayo Biológico

Se utilizaron 180 gallinas de la raza Lohman Brown, raza más frecuentemente utilizada en explotaciones avícolas en Antioquia. Las gallinas procedieron de distribuidores locales certificados y con las vacunas exigidas por ICA. Las aves fueron distribuidas aleatoriamente en 6 tratamientos con 10 animales y 3 repeticiones cada uno. Los 6 tratamientos se organizaron de tal manera que se pudiera comparar los efectos de la premezcla en diferentes concentraciones, preparada como se describió en el numeral anterior, e incorporada en el alimento para gallinas ponedoras descrito en la Tabla 7, con un concentrado que emplea un colorante comercial y con uno libre de colorantes, así, los grupos se distribuyeron como se describe en la Tabla 5. Tabla 5. Dietas suministradas durante el ensayo biológico Grupo 1 2 3 4 5 6

Tratamiento Dieta comercial con pigmento comercial Dieta comercial sin pigmento Dieta comercial sin pigmento + premezcla 5 % de inclusión Dieta comercial sin pigmento + premezcla 10% de inclusión Dieta comercial sin pigmento + premezcla 15% de inclusión Dieta comercial sin pigmento + premezcla 20% de inclusión.

El pigmento comercial empleado fue Carofil® rojo y amarillo de la empresa DSM en una dosificación recomendada por el asesor avícola de 60 mg/kg, compuestos de cantaxantina y Apo-Ester respectivamente (DSM, 2005). Las aves se alojaron en jaulas individuales para gallinas ponedoras, y ubicadas en la granja experimental Santa Inés de la Corporación Universitaria Lasallista (Caldas-Antioquia), dicho espacio contó con condiciones higiénico-sanitarias de una granja comercial de gallinas ponedoras tal como se observa en la Fotografía 6. El alimento se suministró a razón de 105 gramos/animal/día, tanto el agua como el alimento fueron suministradas a libre acceso durante el ensayo. Durante dos semanas las aves fueron alimentadas con una dieta libre de colorantes artificiales 38

a fin de remover todo color de las yemas que procediera de la alimentación que venían consumiendo las gallinas antes de suministrar las formulaciones propuestas para el ensayo biológico. Una vez se verificó la disminución en el color de las yemas se procedió a suministrar los tratamientos respectivos durante cuatro semanas.

Fotografía 6. Disposición de las aves en las jaulas Los huevos fueron recolectados diariamente en canastillas y al finalizar cada semana del ensayo, como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de l a referencia., se llevaron al laboratorio para realizar los respectivos análisis.

Fotografía 7. Recolección de huevos. 39

Al finalizar las cuatro semanas del ensayo se sacrificaron tres gallinas por grupo y se tomaron muestras de sangre, piel y carne para los respectivos análisis.

2.2.3.

Determinación del color de las yemas por la escala de Roche

El color de la yema se comparó con un patrón de color, desarrollado por la empresa Roche en 1969, denominado en ese entonces, abanico de Roche, en inglés Roche yolk color fan (RYCF), que hoy en día se le conoce con el nombre de abanico de DSM en inglés DSM yolk color fan (DSM, YCF), debido al cambio de nombre de la empresa Roche por DSM (DSM, n.d.). El abanico consta de 15 tirillas que van desde amarillo pálido hasta naranjado rojizo y una escala de 1 a 15. Esta escala está basada en la medida de diferentes yemas de huevo y la determinación de su posición en el triángulo de color CIE (Comission internationali de l´Eclairage). En la ¡Error! No se encuentra el origen d e la referencia.se observa el abanico de color de DSM (DSM, n.d.).

Figura 8. Abanico de color DSM (Hamelin & Altemueller, 2012).

2.2.4.

Determinación del color de las yemas por RGB y CIE L*a*b*

Para la medición del color por RGB se utilizó un analizador de color de Saturación y Luminancia, modelo RGB-1002 (Lutron Electronics, Taiwan). Los datos obtenidos en la escala RGB fueron convertidos al modelo CIE L*a*b*, utilizando el software CIE Color Calculator (Lindbloom, 2012). Los datos fueron analizados de acuerdo a lo explicado en el numeral 1.2.4.

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2.2.5.

Determinación de parámetros morfológicos del huevo

Se evaluaron parámetros como el peso, grosor de cáscara e índice morfológico. Para el cálculo del índice morfológico se midió el ancho y la longitud del huevo y se aplicó la siguiente fórmula:

Ecuación 3. Índice Morfológico para huevos

2.2.6.

Extracción de carotenoides totales y antioxidantes piel, músculo, yemas y sangre

Los extractos para la determinación de carotenoides totales, y capacidad antioxidante, se prepararon modificando el método empleado por Sales y Resurrección (2010) para lo cual se adicionaron 0,1 g de la muestra molida en un tubo para microcentrífuga Eppendorf® de 2 mL al cual se le agregó 1.5 mL de una mezcla de hexano y diclorometano (1:1), se llevó al agitador vórtex KMC 1300v (Vision Scientific, korea) durante un minuto. Luego se sometió a sonicación por 10 minutos a 25°C, y se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se separó en un tubo de ensayo, considerando este como la primera extracción. (Sales & Resurreccion, 2010). El residuo fue sometido nuevamente a una segunda extracción tal como fue descrito anteriormente; el sobrenadante se unió con el primer extracto y fue sometido a secado bajo una corriente de nitrógeno hasta evaporación completa del extractante, constituyéndose este en la fase lipofílica para el análisis de ORAC y de carotenoides totales, estos se conservaron a – 20°C y en oscuridad hasta su análisis.

2.2.7.

Determinación Carotenos en piel, músculo, yemas y sangre

El contenido total de carotenoides fue determinado por medio del espectrofotómetro, para lo cual se utilizó el extracto lipofílico reconstituido en acetona. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de placas Synergy HT (Biotek Instruments Inc, USA); utilizando un plato de cuarzo de 96 pozos de 300 µL de capacidad (Hellma Analytics, USA). Las curvas de calibración se prepararon usando β-caroteno en concentraciones desde 0,10 a 3,50 µg/mL. Se graficaron cinco curvas usando el método de mínimos cuadrados que resulta de la ecuación y = (0.262x ± 0.007) - (0.0042 ± 0.0026), R2 = 0.9999, RSD pendiente = 0.85% (n = 5). El resultado final se expresó como mg de β-caroteno por 100 g de muestra (Szydlowska-Czerniak, Trokowski, Karlovits, & Szlyk, 2011).

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2.2.8.

Determinación Capacidad antioxidante en piel, músculo, yemas y sangre

La capacidad antioxidante fue determinada usando el método capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC por sus siglas en inglés). Para ello se midió la disminución en la fluorescencia de la fluoresceína como resultado del daño oxidativo causado por el AAPH como fuente de radicales peróxido (ROO) (Ou, Hampsch-Woodill, & Prior, 2001). De esta manera se midió la capacidad de los antioxidantes presentes en las muestras para proteger la fluoresceína del daño oxidativo, midiendo la intensidad de fluorescencia en un lector de placas Synergy HT (Biotek Instruments Inc, USA). Para la curva de calibración se utilizó el análogo soluble en agua del tocoferol conocido como Trolox en concentraciones de 5,10, 25, 50, 100, 150, 200 µM, en buffer de fosfato 10Mm a pH 7,4. La muestra utilizada fue el extracto lipofílico reconstituido, siguiendo el método modificado de Sales y Resurrección (2010) con acetona; esta solución se mezcló con una solución de β ciclo dextrina metilada al azar (RMCD, de sus siglas en inglés). En una microplaca de 96 pozos (Costar, USA) se adicionaron en estricto orden fluoresceína, buffer fosfato (B), la dilución respectiva de trolox (5,10, 25, 50, 100, 150, 200 µM) y la muestra. Se llevó el plato al lector de placas donde se preincubó durante 30 min a 37°C. Pasado este tiempo se le adicionó a cada pozo la solución de AAPH y se procedió a la medición por triplicado de la intensidad de la fluorescencia cada 2 min durante 2 horas con una longitud de onda de excitación y emisión de 485 y 520 nm respectivamente. La protección del antioxidante se midió a partir del área de fluorescencia bajo la curva (AUC, del inglés area under the curve) de la muestra en comparación con la AUC del blanco, donde el antioxidante no está presente. La AUC se calculó mediante la siguiente expresión:

Dónde: I = número de ciclos F = unidades de fluorescencia CT = tiempo de cada ciclo en minutos. En este caso, CT=2 El área limpia bajo la curva (AUC limpia) se encontró por diferencia entre el AUC de la muestra y el AUC del blanco. Esta AUC limpia (y) se representó delante de la concentración de Trolox como patrón (X) obteniendo la recta de regresión lineal; a partir de aquí, se calcularon las moles equivalentes de Trolox (ET) por litro de muestra.

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Dónde: ABC AH: ABC Trolox: [Trolox]: [AH]:

2.2.9.

Área bajo la curva en presencia de antioxidante. Área bajo la curva de Trolox. Concentración de Trolox. Concentración de Antioxidante.

Análisis de carotenos mediante HPLC en yemas y sangre

Se pesaron 200 mg de la muestra en un tubo para microcentrífuga Eppendorf® de 2 mL al cual se le agregó 1.5 mL de una mezcla de hexano y diclorometano (5:1), se llevó al agitador Vortex Mixer, (Fisher Scientific, USA) durante tres minutos a 3000 rpm. Luego se sometió a centrifugación en una microcentrífuga (MIkro 120, Hettich, Alemania) durante 20 minutos a 14000 rpm a temperatura ambiente. El sobrenadante se separó en un tubo Eppendorf®, considerando este como la primera extracción. El residuo fue sometido nuevamente a tres extracciones más tal como fue descrito anteriormente; todos los sobrenadantes se unieron con el primer extracto. Las dos últimas extracciones se sometieron a sonicación a 25 MHz por 10 minutos a 25°C en baño de ultrasonido (Serie DT4, Scientz, Ningbo, China). Luego de las extracciones el sobrenadante recolectado fue sometido a secado bajo una corriente de nitrógeno hasta evaporación completa del extractante y conservado a -20°C hasta su análisis. Los análisis fueron realizados por triplicado en un HPLC UltiMate™ 3000 y los resultados procesados con el software Chromeleon 7.2. (Dionex, thermo scientific, United States), equipado con una bomba cuaternaria, un sistema desagasificador, automuestreador y un detector DAD. Previo a la inyección las muestras fueron rehidratadas con acetona grado HPLC. Para el análisis se utilizó una columna YMC-Carotenoid™ (5 µm, 150 x 4.6 mm) (allentown, PA, USA), un volumen de inyección de 10 µL y una velocidad de flujo de 1 mL/min a 20 °C. La fase móvil usada fue metanol (A) y acetona (B). La fase A se mantuvo al 100% durante los primeros 30 segundos y después la fase B se incrementó hasta el 100% durante 13 minutos, para regresar a un 100% de A. Los compuestos separados fueron monitoreados a 450 nm (Znidarčič, Ban, & Sircelj, 2011) e identificados comparando el tiempo de retención y los espectros de los estándares, método previamente estandarizado en el Laboratorio de Trazabilidad y Residualidad de la Corporación Universitaria Lasallista (Álvarez et al., 2015).

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2.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO La diferencias significativas (p