Estudios estructurales y funcionales del receptor nicotínico de acetilcolina en distintos estados de agregación. Elena López Alonso

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996

Estudios estructurales y funcionales del receptor nicotínico de acetilcolina en distintos estados de agregación. Elena López Alonso

UNIVERSIDAD DE ALICANTE INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS

DEPARTAMENTO DE NEUROQUÍMICA

ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DEL RECEPTOR NICOTINICO DE ACETILCOLINA EN DISTINTOS ESTADOS DE AGREGACIÓN .

Director: Dr. José Manuel González Ros

TESIS DOCTORAL por

ELENA LÓPEZ ALONSO Alicante, julio de 1997

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996

Estudios estructurales y OJ~ funcionales del receptor nicotínico de acetilcolina en distintos estados de agregación. Elena López Alonso . ASCFiyD i~

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\ \,\ NEURÓMIÇ'.A DEPARTAMENTO DE NEUROQUIMICA

CAMPUS DE SAN JUAN Apartado 374 03080 ALICANTE (España) Nacional (96) 565 98 11 Internacional 34 - 6 - 565 98 11 Nacional (96) 565 85 57 Fax : Internacional 34 - 6 - 565 85 57 E -Mall ROS @ EALIUN 11 . BITNET

Prof. José M. González Ros

JOSÉ MANUEL GONZÁLEZ ROS, Doctor en Ciencias Biológicas y Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Alicante,

CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral que lleva por título : "Estudios estructurales y funcionales del receptor nicotínico de acetilcolina en distintos estados de agregación % presentada por Dña. Elena López Alonso, Licenciada en Ciencias Químicas, para optar al grado de Doctor, ha sido realizada bajo mi dirección y supervisión en el Departamento de Neuroquímica de la Universidad de Alicante, habiendo el que suscribe revisado el texto, y estando conforme con su presentación para ser juzgada ante el Tribunal que en su día se designe.

Y para que así conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, extiendo el presente certificado en Alicante, a 18 de octubre de 1997 .

Fdo : Dr. José Manuel González Ros

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"Nunca te conceden un deseo sin concederte también la facultad de convertirlo en realidad .

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Sin embargo, es posible que te cueste trabajo."

Richard Bach Ilusiones

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A mis padres A Álvaro, sin cuyas amables atenciones esta memoria se hubiese presentado hace ya algún tiempo Ypor supuesto, a Mariano

El presente trabajo se ha realizado en el Departamento de Neuroquímica de la Universidad de Alicante bajo la dirección del Dr. José Manuel González Ros, a quien deseo expresar mi más sincera gratitud por brindarme la oportunidad de comenzar esta andadura y por el apoyo constante proporcionado a lo largo de todos estos años . De igual forma, quiero agradecer al Dr. José Antonio Fèrragul si? cálida amistad así como la colaboración e interés demostrados día a día, y a la Dra. Gloria Riquelme la paciencia y comprensión con que

me ha guiado en el campo de la electrofisiología, así como su apoyo personal tanto aquí como allá. Al Dr. Luis Miguel García Segura del Instituto Cajal le agradezco su desinteresada ayuda en los estudios de Criofractura y al,

Dr. Francisco Gavilanes de la Universidad Complutense de Madrid la realización de los minuciosos análisis de aminoácidos. El haber trabajado junto a Flor¿ Jordi, Jaume, Ana, Montse, Mavi, Mardo, José y José Antonio ha representado para mi una experiencia inolvidable . F,n especial quiero agradecer a José Antonio la valiosa ayuda prestada tanto en los estudios de infrarrojo, como en mi lucha continua con el ordenador. A Gregorio, su cálido apoyo, su capacidad de desdramatizar. A Asia como compañera quiero

reconocerle su colaboración continua, como amiga, los buenos ratos compartidos, su comprensión, su compañía. A Rosa su insustituible amistad, que desde tan lejos ha estado muy muy cerca. En general, a todo el personal del Departamento de Neuroquímica y del Instituto de Neurociencias por haberme ayudado siempre que lo he necesitado.

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Por último quiero hacer constar un agradecimiento muy especial a mifamilia: A mis padres, mi madrina y mi hermano porque han entendido lo que este trabajo significaba para mi ofreciéndome toda su ayuda y

comprensión. A América por su dulzura, Patricia por sir entusiasmo, Laura por su ilusión, Carlos por su bondad y a Álvaro, simplemente por estar aquí. Para Mariano no encuentro palabras, simplemente gracias por TODO.

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Abreviaturas

a-Bgt: a-Bungarotoxina AeCh: Acetilcolina AeChR: Receptor nicotínico de acetilcolina ANTS : 8-Amino-1,3,6-naftaleno trisulfonato Asolectina: Extractos lipídicos de semillla de soja BNCs : Bloqueadores no competitivos BSA : Albúmina de suero bovino Ceh: Carbamilcolina CHAPS: 3-[(3-cholamidopropil)dimetil-amonio] 1 propano sulfonato CM-Sephadex: Carboximetil Sephadex CMC : Concentración micelar crítica Colato : 3a, 7a, 12a, trihidroxi 50-colanato sódico D-Tub : d- Tubocurarina DDF: p-(N,N)-Dimetil aminobenceno diazonio fluoroborato DEAE-Sephadex: Dietilaminoetil sephadex DSC: Calorimetria diferencial de barrido DTNB : Ácido 5-5' ditiobis (2-nitrobenzoico) DTT: 1, 4 Ditiotreitol EDTA: Ácido etilendiamino tetraacético FITC : Isotiocianato de fluoresceina FT-IR: Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier GABA: (Ácido y-aminobutírico Hepes : Ácido N-2- hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico . HPLC: Cromatografia líquida de alta resolución IMPs : Partículas intramembrana IR : Infrarrojo L/P: Relación molar lípido/proteína MBTA : 4-N-(maleimido) benciltrimetilamonio MIR: Región inmunogénica principal OG : Octilglucósido PAGE-SDS : Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS PC: Fosfatidilcolina de yema de huevo PL : Fosfolípido PMSF: Fenilmetilsulfonil fluoruro PTSA: Tetrasulfonato sódico de pireno RMN: Resonancia magnItica nuclear SDS: Dodecil sulfato sódico

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Abreviaturas

TEMED : N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamida TLC : Cromatografia en capa fina TMR-a-Bgt : a-Bgt marcada covalentemente con tetrametil rodamina TMRITC: Isotiocianato de tetrametilrodamina Tris : Tris (hidroximetil)-aminometano . Triton X-100: Octil fenoxi polietoxietanol TTX: Tetrodotoxina

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Índice , I INTRODUCCION

página

1. SINAPSIS Y CANALES IÓNICOS.

1

2. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL RECEPTOR NICOTÍNICO DEACETILCOLINA.

3

3. CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DEL AcChR 3.1 Forma y dimensiones de la molécula del AcChR. 3.2 Disposición de las subunidades del AcChR . 3.3 Composición polipeptidica. a. estructura primaria. h. estructura secundaria. c. estructura terciaria. 3.4 Topología transmembrana. 3.4.1 Modelos estructurales . 3.5 Formas moleculares del AcChR.

5 5 6

7

8 9 9 11 13

4. CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES DEL AcChR

17

5. DOMINIOS ESTRUCTURALES CON RELEVANCIA FUNCIONAL.

23

5.1 Sitios de unión de ligando. 5.2 Sitios de unión de bloqueadores no competitivos . 5.3 El canal iónico y su apertura. 5.4 Región inmunogénica principal (MIR) . 5.5 Otros lugares de relevanciafuncional . 5.5.1 Glicosilación . 5.5.2 Fosforilación . 5.5.3 Grupos sujfflidrilo

23 26 29 31 31 31 32 33

6. INTERACCIÓNDEL AcChR CON OTROS COMPONENTES DE MEMBRANA .

35

6.1 Proteínas.

35

7. RECONSTITUCIÓN

39

6.2 Lípidos.

7.1 Reconstitución del AcChR en vesículas lipídicas. 7.1.1 Uso de técnicas de congelación-descongelación para aumentar el tamaño de los liposomas 7.2 Reconstitución del AcChR en bicapas planas. 7.2.1 Bicapaformada a través de una apertura. 7.2.2 Reconstitución del AcChR en una Bicapa en la punta de una pipeta de patch .

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II OBJETIVOS

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III MA TERIALES YMÉTODOS

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1. PURIFICACIÓN DE a-BGTA PARTIR DEL VENENO DE LA SERPIENTE BUNGARUS MULTICINCTUS.

48

1.1 Cromatografía de intercambio fónico y filtración. 1.2 Cromatografía líquida de alta resolución. 1 .3 Marcaje de a-Bgt con isotiocianato de tetrametilrodamina . 1.4 Pretratamiento de la 125I-a-Bgt comercial para experimentos de unión de toxina al AcChR.

48 50 51 51

2 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS.

52

3. OBTENCIÓN DE MEMBRANAS ENRIQUECIDAS EN RECEPTOR DE ACETILCOLINA.

53

3.1 Obtención de membranas crudas. 3.2 Extracción alcalina. 3.2 Caracterización de las membranas. 3.4 Marcaje de las membranas con isotiocianato defluoresceina. 4. PURIFICACIÓN DEL AcChR MEDIANTE CROMA TOGRAFÍA DE AFINIDAD

53 54 54 55 56

4.1 Preparación de la matriz cromatogrdfca. 411.1 Síntesis de bromuro de bromoacetilcolina. 4.1.2 Derivatización de Afigel 401 con bromoacetilcolina . 4.1.3 Derivatización de Affgel 10 con bromoacetilcolina . 4.1.4 Determinación cualitativa de gnipos tioles .

56 56 56 57 57

4.2 Solubilización, purificación y caracterización del receptor purificado.

57

5. RECONSTITUCION DEI, AcC'hR EN VESÍCULAS LIPÍDICAS POR DIÁLISIS" DEL DETERGENTE. 5.1 Preparación de vesículas lipídicas a partir de lípidos de .semilla de soja. 5.2 Procedimiento de reconstitución. 5.3 Determinación de la relación AcChRfosfolípido. 6. RECONSTITUCIÓN DEI. AeChR EN LIPOSOMAS GIGANTES 6.1 .Formación de liposomas Sfigantes. 6.2 Fraccionamiento de los liposomas gigantes en gradiente de sacarosa.

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Índice 7. OBTENCIÓNDE LAS FORMAS MONOMERICA YDIMERICA DEL AcChR.

7.1 Reducción de laforma nativa del AcChR. 7.2 Determinación del número de puentes disufuro afectados. 7.2.1 Preparación de las muestras . 7.2.2 Análisis de aminoácidos.

8. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRIOFRACTURA. 8.1 Preparación de los liposomas para la criofractura. Fijación, crioprotección y congelación. 8.2 Procedimiento de fractura y replicación de la muestra. 8.3 Cuantificación de las IMPs.

iii 65 65 65 66 67

68 69 69 70

9. ESPECTROSCOPIA IR POR TRANSFORMADA DE FOURIER.

71

10. ESTUDIOS DE UNIÓN DE 1251-a-BGTAL AcChR. 10.1 Determinación del número de sitios de unión de 1251 a_Bgt al AcChR. 10.2. Análisis de las transiciones entre los distintos estados de afinidad por agonistas delAcChR.

72

11. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DEL AcChR MEDIANTE TÉCNICAS DE CINÉTICA RÁPIDA. 11.1 Preparación de vesículas cargadas con fluoróforo para medidas de actividad deflujo iónico. 11.2 Preparación de la columna de cromatografia de exclusión 11.3 Adquisición y tratamiento de datos. 12. ESTUDIOS DE LA ACTIVIDAD DEL AcChR A NIVEL DE CANAL ÚNICO MEDIANTE LA TÉCNICA DE PATCH-CLAMP. 12.1 Fundamento de la técnica. 12.2 Preparación de las muestras. 12.3 Registro de la actividad eléctrica. 12.4 Análisis de los registros obtenidos.

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IVRESULTADOS 1. OBTENCIÓN DE MEMBRANAS NATIVAS Y VESÍCULAS

RECONSTITUIDAS CONAcChR.

1.1 Membranas alcalinas. 1.2 AcChR solubilizado y purificado. 1.3 Reconstitución en vesículas lipidicas. 1.4. Reconstitución en liposomas gigantes. 1.4.1 Factores determinantes.

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1.4.2 Estudio de la relación AcChR fosfolípido en los liposomas gigantes. 1.4.3 Mecanismo deformación de los liposomas gigantes. 1.4.3 a Estudio de la distribución del material de partida . 1.4.3 b Estudio de la redistribución del AcChR . 1.4.4 Caracterización funcional de membranas nativas de Torpedo reconstituidas en liposomas gigantes. 1.4.4 a Actividad del AcChR en liposomas gigantes . 1.4.4 b Orientación del AcChR en los liposomas gigantes.

88 88 88 90 90 90 95

2. OBTENCIÓNDE LAS FORMAS MONOMÉRICA YDIMÉRICA DEL AcChR.

95

3. ESTUDIO DE LAS FORMAS MONOMÉRICA Y DIMERICA DEL RECEPTOR PURIFICADO MEDIANTE CRIOFRACTURA.

97

4. IRREVERSIBILIDAD ESPONTANEA DE LA REDUCCION DEL PUENTE DISULFURO RESPONSABLE DE LA FORMA DIMÉRICA DEL RECEPTOR.

101

S. ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA SECUNDARLA DEL AcChR PURIFICADO Y RECONSTITUIDO EN SUS DOS FORMAS MOLECULARES.

102

6. ESTUDIO DE LAS TRANSICIONES ENTRE LOS DISTINTOS ESTADOS DE AFINIDAD INDUCIDAS POR AGONISTA EN EL RECEPTOR EN FORMA NATIVA Y TRATADO CON EL AGENTE REDUCTOR.

107

6.1 Análisis de las transiciones entre los distintos estados de afinidad inducidas por agonista en membranas de Torpedo alcalinas. 6.2 Análisis de las transiciones entre los distintos estados de afinidad inducidas por agonista en AcChR purificado y reconstituido. 7. MEDIDAS DE LAS ACTIVIDAD DEL CANAL IÓNICO DEL AcChR A NIVEL DE FL UJO TOTAL DE IONES. 7.1 Encapsulamiento delfluoróforo en las vesículas y separación del PTSA externo. 7.2 Permeación no selectiva de iones Tl+ a través de las vesículas de membrana. 7.3 Permeación de iones mediada por agonista a través del canal iónico en membranas de Torpedo alcalinas. 7.4 Flujo de iones Tl+ en membranas de Torpedo nativas y tratadas con agente reductor. 7.5 Flujos de iones TI-1- en vesículas con el AcChR reconstituido en forma dimérica y monomérica.

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Índice S. ESTUDIOS DE LA ACTIVIDAD DEL CANAL TÓNICO ASOCIADO AL AcChR MEDIANTE LA TÉCNICA DE PA TCH-CLAMP EN LIPOSOMAS GIGANTES. S.1 Actividad de lasformas monomérica y dimérica del receptor purificado, reconstituido en liposomas gigantes. 8.1.1. Comportamiento del AcChR en estado nativo . 8.1.2 Comportamiento del AcChR tratado con DTT. 8.1.3 Comportamiento del receptor nativo, en presencia de agente reductor añadido durante el experimento.

127 127 127 129 130

VDISCUSIÓN

134

1. RECONSTITUCIÓN DEL AcChR EN LIPOSOMAS GIGANTES. UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE CANALES TÓNICOS

135

2. ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LAS FORMAS MONOMERICA YDIMÉRICA DEL AcChR.

139

3. ESTUDIO FUNCIONAL DE LAS FORMAS MONOMÉRICA YDIMÉRICA DEL AcChR.

143

VI CONCL USIONES

156

VII BIBLIOGRAFIA

159

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Introducción

I INTRODUCCION

1. SINAPSIS Y CANALES IONICOS.

El sistema nervioso es una estructura modular, cuyas unidades son las neuronas, o células nerviosas. Las neuronas se diferencian de otras células del organismo en que son capaces de comunicarse rápidamente unas con otras a corta y larga distancia y con gran precisión. Esta comunicación intercelular se lleva a cabo en zonas de contacto especializadas denominadas sinapsis . Teniendo en cuenta la morfología de estas zonas de unión, existen dos tipos de sinapsis : unas en las que existe un puente que permite el contacto directo entre los medios intracelulares de las neuronas pre y postsinápticas, y otras en las que las neuronas están separadas por una hendidura (Kuffler, 1976). Estas sinapsis se conocen como eléctricas y químicas respectivamente. En las sinapsis químicas, la transmisión del impulso nervioso se lleva a cabo mediante la liberación de un compuesto químico denominado neurotransmisor, que pone en contacto zonas especializadas en las membranas pre y postsinápticas, separadas 30-50 nm entre sí (Kandel y Siegelbaum, 1985) . Desde un punto de vista fisiológico, la transmisión química tiene lugar mediante dos procesos i) liberación del neurotransmisor desde la membrana presináptica hacia la hendidura sináptica, y ii) interacción entre el neurotransmisor y la molécula receptora, que se encuentra en la membrana

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Introducción

postsináptica. Esta interacción dará lugar a la apertura o cierre de canales iónicos específicos. Los mecanismos sinápticos mejor conocidos son aquellos que median la excitación del músculo esquelético por neuronas motoras, en las sinapsis periféricas. Las neuronas motoras, utilizando acetilcolina (AcCh) como neurotransmisor, inervan zonas altamente especializadas de la membrana muscular, llamadas placas motoras. Así, la estimulación de la neurona ocasiona la liberación de AcCh al espacio sináptico, que a su vez interacciona con los receptores de acetilcolina situados en la membrana muscular y provoca el potencial excitatorio sináptico (Kandel, y Siegelbaum, 1985). La membrana postsináptica de la unión neuromuscular se caracteriza por tener una intrincada estructura con pliegues donde se concentran localmente gran número de receptores de acetilcolina (McCarthy y col ., 1986) . Este empaquetamiento se determina durante la embriogénesis, donde los receptores que se encuentran dispersos por toda la membrana comienzan a acumularse tras el contacto entre nervio y músculo. En el órgano eléctrico de Torpedo californica los receptores se encuentran tanto en las crestas como en los valles de los pliegues, a una densidad de 10.000 por pm2 . En vertebrados superiores se concentran principalmente en las crestas y a una densidad de 20.000-30 .000 por pLm2 (Conti-Tronconi y Raflery, 1982 ; McCarthy y col., 1986). La acetilcolina actúa como neurotransmisor en el sistema nervioso autónomo, en la sinapsis neuromuscular y en las terminaciones nerviosas que se establecen en el órgano eléctrico de ciertas especies de peces (Torpedo marmorata, Torpedo californica, Electrophorus electricus); su mecanismo de acción ha sido ampliamente estudiado (Katz, 1966) . Tras la liberación de acetilcolina por la terminación nerviosa se alcanza una concentración en el espacio sináptico entre 0.1 y 1 mM, produciéndose una rápida difusión a través de la hendidura sináptica. En la membrana postsináptica, la acetilcolina se une a su receptor específico y da lugar a la apertura del canal iónico asociado al mismo, permitiendo el paso de cationes monovalentes a favor de su gradiente electroquímico. Esta traslocación de iones provoca una despolarización de la membrana que puede llevar en último término a la contracción muscular o a la transmisión de la señal nerviosa, dependiendo del tipo de tejido que se encuentre implicado (Donant e Israel, 1985) . Durante muchos años los neurobiólogos han considerado que la acetilcolina se liberaba en orgánulos esféricos de pequeño tamaño localizados en el interior de las terminales nerviosas mediante la fusión de estos con la membrana celular (Reichardt y Kelly, 1983). Estos orgánulos denominados

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Introducción vesículas presinápticas, que pueden ser observadas por microscopía electrónica, contienen acetilcolina (Whittaker y col., 1964); descubrimiento que sirve de base a la hipótesis vesicular (Katz, 1962) y da una posible explicación a la liberación cuantal de acetilcolina (Kuffer y Yoshikami, 1975 ; Almers y Tse, 1990). La fusión de las vesículas con la membrana presináptica se produce por la entrada de Cal+ a través de canales de calcio sensibles a voltaje. Este flujo es debido al cambio de potencial producido por la onda de despolarización a lo largo del axón, mediado por canales de sodio dependientes de voltaje . Además de la hipótesis vesicular hay alternativas que sugieren que la acetilcolina que libera la terminación nerviosa no procede de las vesículas sino directamente del citoplasma, que constituye el material fundamental interno de la neurona. La liberación se debería a la existencia de una proteína transportadora activada por Cae+ (Cooper y Meyer, 1984 ; Dunant e Israel, 1985 ; López-Alonso y col., 1995). Según esta hipótesis, las vesículas que se observan al microscopio electrónico, tendrían como función principal el almacenamiento de acetilcolina, sin estar implicadas en su liberación( Bajjalieh y Schelller, 1995).

2. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL RECEPTOR NICOTINICO DE ACETILCOLINA .

La molécula transductora de la señal química en eléctrica en la unión neuromuscular y en algunas sinapsis del sistema nervioso central es el receptor nicotínico de acetilcolina (AcChR). Esta proteína ha sido el primer receptor para neurotransmisores que se ha definido como una entidad molecular, se ha aislado y purificado en forma activa y se ha reconstituido en sistemas artificiales de membrana con retención cuantitativa de sus propiedades fisiológicas . El AcChR es, por lo tanto, una de las proteínas integrales de membrana de las que se dispone actualmente de abundante información estructural y funcional, por lo que sirve como modelo para el estudio de tales componentes biológicos y es, además, susceptible de estudio a niveles de organización muy diferentes, desde técnicas de secuenciación con proteína purificada y registros electrofisiológicos a técnicas de clonaje del DNA correspondiente (Popot y Changeux, 1984; Stroud y Finer-More, 1985 ; Numa y col., 1983, Conti-Tronconi y col., 1982 ; Karlin, 1983). El hecho de que el AcChR sea el receptor de superficie celular mejor conocido se debe a varios factores : 1 .- La existencia de una fuente abundante de este receptor, como es el órgano eléctrico de ciertas especies marinas: Torpedo marmorata, Torpedo californica, Electrophorus electricus, etc.

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4

La presencia de a-neurotoxinas en veneno de serpiente, que se unen con alta afinidad y especificidad al AcChR (Whittaker y col., 1990) y que han aportado un modo fácil de realizar determinaciones cuantitativas mediante ensayos de unión a equilibrio . 3 .- La posibilidad de estudiar su estructura y función con una amplia variedad de técnicas bioquímicas, biológicas, electrofisiológicas, genéticas, biofisicas y estructurales (McNamee y col., 1986). Los peces eléctricos de agua salada de los géneros Torpedo y Electrophorus constituyen un material experimental idóneo para los estudios de la sinapsis de acetilcolina debido a la elevada abundancia de terminaciones nerviosas que se establecen en el órgano eléctrico. Dicho órgano es un sistema neuromuscular altamente especializado cuyo mecanismo de transmisión del estímulo nervioso es muy similar al mecanismo presente en la unión neuromuscular, presentando la ventaja de carecer de la complicada estructura contractil de la célula muscular, del complejo sistema de circuitos de una neurona y del conjunto heterogéneo de neurotransmisores del sistema nervioso central. La posibilidad de obtener membranas ricas en AcChR procedentes del órgano eléctrico de Torpedo marmorata en grandes cantidades, y el alto grado de homología que este receptor tiene con el receptor nicotínico de músculo esquelético (Stroud y Finer-Moore, 1985), hacen de esta proteína uno de los mejores sistemas modelo para estudiar la estructura y función de proteínas transmembrana. Un ejemplar típico de Torpedo marmorata, la especie mediterránea, vive en aguas costeras poco profundas, mide unos 40 cm de longitud y pesa alrededor de 2 Kg. Los órganos eléctricos están situados a ambos lados del cuerpo y representan aproximadamente una quinta parte del peso del mismo. Cada órgano consta de unos 400 prismas cuyos ejes van de la cara ventral a la dorsal, siendo cada prisma un apilamiento de células planas llamadas electrocitos que presentan una resistencia eléctrica alta en su membrana ventral y baja en la dorsal. Las sinapsis se realizan exclusivamente en la membrana ventral de cada célula y en total existen más de 500 .000 millones de terminaciones en cada órgano eléctrico que segregan simultáneamente acetilcolina en respuesta a la llegada de un estímulo. La acetilcolina se une a sus receptores específicos situados en la cara ventral de la célula postsináptica, produciendo la apertura de los mismos y la entrada masiva de iones sodio a su través (104 Na+/ms), como consecuencia se establece una corriente eléctrica que se propaga por el agua del mar. En un Torpedo de tamaño medio, la 2.-

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Introducción

corriente producida por los dos órganos eléctricos puede llegar a ser de mas de siete amperios (Dunant e Israel, 1985).

3. CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DEL AcChR. 3.1 Forma y dimensiones de la molécula del AcChR.

La forma de la molécula del AcChR se ha analizado mediante diversas técnicas como el marcaje con anticuerpos, microscopía electrónica, difracción

de rayos X de bajo ángulo y técnicas de criofractura . En las imágenes de microscopía electrónica de membranas enriquecidas en AcChR procedentes de

órgano eléctrico de Torpedo se observan partículas con estructura anular de 8590 A de diámetro externo. Estas partículas presentan un poro central de aproximadamente 30

A de diámetro

en el extremo más externo y de 7

A a nivel

de la superficie de membrana, rodeado de cinco regiones densas a los electrones y que se asocian con las cinco subunidades del AcChP, dispuestas

alrededor de un eje de pseudosimetría perpendicular al plano de la membrana (Kubalek y col ., 1987, Toyoshima y Unwin, 1990 ; Unwin y col ., 1993), (Figura l). En dirección normal al plano de la membrana, la longitud media es de 110 extendiéndose entre 55 y 65 A por fuera de la bicapa en el lado

A en el 40 A que

extracitoplasmático y 15-20 zona transmembrana de

lado intracitoplasmático quedando una coincide con el grosor de la bicapa

(Changeux y col., 1984 ; Stroud y Finner-Moore, 1985).

3 .2 Disposición de las subunidades del AcChR.

Los mapas tridimensionales obtenidos a partir de vesículas ricas en AcChR, mediante análisis de imágenes procedentes de microscopía electrónica de alta resolución, han demostrado que el receptor es una molécula cilíndrica que se sitúa perpendicularmente al plano de la membrana postsináptica y cuyas

subunidades se encuentran dispuestas simétricamente alrededor de un poro central, presumiblemente el canal iónico (Toyoshima y Unwin, 1990 ; Hucho y col., 1996) . La utilización de fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales frente a la subunidad a (Kistler y col., 1982), junto con técnicas de microscopía electrónica, ha puesto de manifiesto la posición relativa que mantienen entre sí las dos subunidades a presentes en cada molécula de AeChR. Estas

subunidades forman entre sí un ángulo de 144±4° (Fairelough y col., 1983), estando separadas por alguna otra subunidad y por lo tanto están en entornos

intrínsecamente diferentes dentro del complejo ensamblado (Stroud y FinnerMoore, 1985). Karlin y col., (1983) establecieron una disposición de subunidades de a, Y, a,

R,

S, mientras que otros autores utilizando técnicas de

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entrecruzamiento y/o técnicas de resolución de imágenes han llegado a la conclusión de que es la subunidad P y no la y que se encuentra entre las dos subunidades a, en contradicción con lo anteriormente expuesto (Kistler y col., 1982 ; Hamilton y col., 1985 ; Kubalek y col., 1987). Las subunidades se disocian sólo en presencia de agentes desnaturalizantes como SDS; no se disocian en presencia de Tritón, colato, cloruro de guanidinio 6M o urea 8M. .+-.---

0

S S A --- l

ESPACIO

EXTRACELULAR

110 A

BICAPA LIPIDICA

1r ~r

COLESTEROL --t~

ti

1

aa

gó á

n

40 A

J

A

CITOPLASMA CANAL IONICO~.

as

B y Figura 1. Modelo tridimensional de la molécula del AeChR. (A) Según este modelo, el AeChR es una estructura cilíndrica que atraviesa la membrana celular, en donde las cinco subunidades se encuentran dispuestas alrededor de un poro central formando el canal iónico . Las a-hélices(de 80 A de longitud) se disponen perpendicularmente al plano de la bicapa formando el canal iónico . (B) Disposición de las subunidades en el monómero del AcChR, la ordenación que presentan las mismas en este esquema se corresponde con la propuesta por Karlin y col., 1981 . Figura tomada de McNamee y Ochoa, 1982 .

3.3 Composición polipeptídica. El AcChR es una glicoproteína transmembrana con un peso molecular de aproximadamente 270.000 Da (Martinez- Carrión y col., 1975) y consta de 4 tipos de subunidades polipeptídicas con pesos moleculares aparentes, determinados por su movilidad electroforética en gel de poliacrilamida con

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dodecilsulfato sódico (PACE-SDS), de 40.000 (a), 50.000 (R), 60 .000 (y) y 65 .000 (S), en una relación estequiométrica 2 :1 :1 :1 (Reynolds y Karlin, 1978 ; Lindstrom y col ., 1980), como se demuestra por microsecuenciación aminoterminal y por secuenciación cuantitativa determinada directamente en la mezcla de polipéptidos obtenidos por desnaturalización con SDS del AcChR purificado (ver Tabla I). Tabla 1. Propiedades fisicas y químicas del receptor nicotínico de acetilcolina de Torpedo californica. Tabla tomada de Hucho, 1986. Propiedad Peso molecular : Proteína Glicoproteina

Valor 267.980 290.000

Coeficientes de sedimentación: Monómero Dímero

9S 13S

Radio de Stokes (monómero)

7.0 nm

PI

4.9

Estructura cuaternaria

a20YY8

Peso molecular de las cadenas polipeptídicas deducidas a partir de las secuencias de cDNA (peso molecular aparente obtenido con PAGE-SDS, entre paréntesis)

a 50.2 x 103 (40 x 103) R 53 .7 x 103 (48 x 103) y 56.3 x 10 3 (60 x 103) 8 57.6 x 10 3 (68 x 103)

Lugares de unión: Para agonistas y antagonistas Para inhibidos no competitivos

2 1

Componentes no proteicos Grupos fosfato Carbohidratos Residuos de ácido siálico Cae+ ácidos grasos

7 residuos por monómero 75 residuos por molécula 9 Muchos

a. Estructura primaria. El análisis de las secuencias N-terminales (Raftery y col., 1980) pone de manifiesto la alta homología existente entre las subunidades que componen el AcChR; hasta el residuo 54, once posiciones están ocupadas por residuos

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idénticos y prácticamente el resto tienen residuos relacionados ; solo cuatro posiciones aparecen sustituidas por aminoácidos no relacionados entre sí. Con la aparición de las técnicas de DNA recombinante fue posible conocer la secuencia aminoacídica completa de cada una de las subunidades del AcChR procedente de Torpedo californica (Moda y col., 1983) y la subunidad a de Torpedo marmorata (Devillers Thiéry y col., 1983). A partir del estudio de las secuencias se puede establecer la alta homología encontrada (40%) entre a y R, y entre y y S, siendo algo menor cuando se comparan estos dos grupos de subunidades. Las secuencias precursoras de las cuatro cadenas polipeptídicas comienzan con una secuencia líder de 17 a 24 aminoácidos hidrofóbicos, confirmando que cada subunidad es el producto de un gen individual y no de un gran precursor cuya proteólisis da lugar a las diferentes subunidades. Ademas, el análisis de hidrofobicidad general de las secuencias es menor de lo esperado para una proteína de membrana, aunque la distribución de los restos hidrofóbicos es la adecuada para producir regiones transmembrana. b. Estructura secundaria.

Debido a la dificultad de cristalizar las proteínas de membrana, la estructura secundaria del AcChR es poco conocida experimentalmente, y por lo tanto, se halla mas sujeta a predicciones teóricas . Solo ha sido posible conocer algunos datos relativamente imprecisos de contenidos en a-hélice y hojas R, existiendo bastante disparidad entre los distintos autores y entre las distintas técnicas utilizadas para la determinación. Se ha postulado que el extremo amino terminal de las cadenas peptídicas forma principalmente estructuras tipo R (Stroud y Finner-Moore, 1985), corroborado por la espectroscopia Raman, que predice un 34% total de estructura R para el AcChR (Yager et al 1984), un 25% de hélices ordenadas, y un 10% para estructura indefinida . Con dicroïsmo circular (DC) se ha postulado un contenido de 34% de a-hélices y un 29% de estructuras (3 (Moore et al, 1974) . Mediante FTIR se revela un contenido en estructuras a del 20% y P del 24% (Fong y McNamee, 1987 ; Butler y col ., 1993 ; Naumann y col ., 1993). Las predicciones estadísticas a partir de secuencia primaria ofrecen 44% de a-hélices y 27% de hojas (3 (Finner-Moore y Stroud, 1984). Para conciliar la disparidad existente entre las predicciones teóricas y las observaciones experimentales sobre la estructura secundaria del AcChR sería necesaria la obtención de estructuras tridimensionales de alta resolución . Mediante microscopía infrarroja, se ha comprobado que la interacción del agonista colinérgico Cch, con el AcChR produce cambios pequeños, aunque reproducibles, en el contorno de la banda amida 1, que sugieren que el AcChR

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en estado desensibilizado adopta un estructura secundaria distinta de la correspondiente al receptor en estado de reposo. Estos cambios dependientes de la concentración del agonista se acompañan además de un aumento en la estabilidad térmica del AcChR, produciéndose un desplazamiento en la temperatura de desnaturalización de 2-3 °C, que se ha documentado tanto a partir de la dependencia del espectro infrarrojo con la temperatura, como mediante técnicas de calorimetria diferencial de barrido. La presencia del antagonista competitivo d-tubocurarina no produce efecto alguno ni sobre la forma del espectro ni sobre la estabilización térmica del AcChR (FernandezBallester y col., 1994) . c. Estructura terciaria.

Mediante el análisis de los perfiles de hidrofobicidad de las secuencias polipeptídicas se ha podido determinar que las cuatro subunidades tienen cuatro segmentos hidrofóbicos de aproximadamente la misma longitud que los segmentos de (x-hélice caracterizados en la bacteriorodopsina, incluso son más hidrofóbicos . Estos segmentos atravesarían la membrana como cc-hélices y, por lo tanto, podrían contribuir al empaquetamiento orientado hélice-hélice observado por rayos X en patrones de membrana. Tres segmentos hidrofóbicos estarían situados hacia la mitad de la cadena, separados unos de otros por tan sólo cortas regiones que las unen, mientras que el cuarto segmento quedaría cerca del carboxilo terminal (Anand y col., 1993 ; Le¡ y col., 1993 ; Unwin y col ., 1993) . 3.4 Topología transmembrana .

La primera prueba de que el AeChR es una proteína integral de membrana y la atraviesa de parte a parte se ha obtenido examinando al microscopio electrónico vesículas ricas en AcChR, intactas o sonicadas, enfrentadas con anticuerpos anti-receptor, observándose que los anticuerpos se unen al AcChR tanto desde la cara interna como desde la cara externa. A la misma conclusión se ha llegado comparando los efectos que las proteasas ejercen sobre el AcChR solubilizado, y sobre el receptor incorporado en vesículas impermeables cuando actúan desde la cara interna o desde la cara externa de las vesículas. Se ha demostrado así que en todos los casos se produce degradación de las cuatro subunidades; por análisis de los productos de degradación, se ha concluido que todas ellas atraviesan la membrana y que sobresalen por fuera de ella en la misma cantidad en cada subunidad hacia el lado citoplasmático, de forma proporcional a su peso molecular (Conti-Tronconi y col., 1982; Raftery y col., 1983).

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La disposición transmembrana del AcChR muestra cierta asimetría entre las regiones citoplasmática y extracelular, tal como se deduce mediante los diversos experimentos electrofisiológicos en los que se demuestra que: 1 . La acetilcolina produce la apertura del canal iónico asociado al AcChR únicamente cuando se une por la superficie extracelular del mismo (Chavez y

col., 1991) . 2. El canal iónico presenta diferente afinidad por ligandos farmacológicos dependiendo del lugar por donde estos ligandos interaccionen con el AcChR. 3 . Cada subunidad presenta restos de azúcares hacia el lado extracelular y sitios de fosforilación en el lado citoplasmático .

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figura 2. Modelo de estructura cuaternaria del AcChIL Las cinco cadenas polipeptídicas atraviesan la membrana celular y se hallan dispuestas alrededor de un poro central. Todas las subunidades son glicoproteínas (lineas en zig-zag en la zona sináptica), y presentan un alto grado de homologïa. Las subunidades S de dos moléculas del AcChR contiguas se unen mediante un puente disulfuro formando estructuras diméricas. Los dos sitios de unión de agonistas y antagonistas están localizados en la subunidad a. En el dominio citoplasmático se muestra la proteína 43 1cDa que aparece formando puentes que conectan el AcChR con el citoesqueleto. Figura tomada de Hucho y col., 1986 .

A partir de la reciente determinación de la secuencia aminoacídica completa de cada una de las subunidades del AcChR, y de la comprobación de la existencia de un alto grado de homologia entre todas ellas, se ha sugerido un modelo estructural común que supone una contribución similar de cada subunidad a la estructura global del AcChR (Fairclough y col., 1983 ; Kosower,

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1987 ; Hucho y col ., 1996). El análisis de la distribución de las hidrofobicidades medías de un corto número de aminoácidos a lo largo de cada cadena polipeptídica del receptor conduce a la división de las subunidades en 4 regiones:

1- Un dominio hidrofilico situado en el extremo amino terminal

compuesto por 210-220 aminoácidos.

2- Una región muy hidrofóbica compuesta por 70 residuos y dividida en tres segmentos de 19 a 27 aminoácidos no cargados (MI, MII, MIII). 3- Un segundo dominio hidrofilico de longitud variable . 4- Una región formada por 20 residuos hidrofóbicos situada en el extremo

carboxi terminal (MIM

3.4.1 Modelos estructurales. Se han propuesto varios modelos estructurales de la disposición de cada

subunidad en la membrana plasmática (Popot y Changeux, 1984 ; Noda et al, 1983 ; Devillers-Thiery y col., 1983; Guy, 1984 ; Finer-Moore y Stroud, 1984 ;

Devillers-Thiery y col ., 1993 ; Hucho y col., 1996). Todos ellos tienen en común tres características principales : a-

La

orientación

del

extremo

amino

extracitoplasmático.

terminal

hacia

el

lado

b- La orientación de un pequeño dominio hidrofilico hacia el interior celular. c- La asignación de cuatro fragmentos hidrofóbicos que formarían hélices a atravesando la membrana (MI-MIS. Todos los modelos propuestos asumen que el sitio de unión de la acetilcolina se encuentra en el dominio hidrofilico de la subunidad a y que las paredes del canal iónico rodean al eje de simetría de la proteína, estando constituido por porciones homólogas de cada subunidad. Los distintos modelos se diferencian en el número, la orientación y la identidad de los segmentos transmembrana.

Uno de los modelos propone que cada subunidad contiene cuatro regiones

o segmentos transmembrana (MI-MIV) que pueden estar implicados en la formación del poro iónico, y que el extremo carboxi terminal se encuentra orientado hacia el espacio sináptico . Se postula además un posible lugar de interacción de la acetilcolina y de la región inmunogénica principal (Moda et al,

1983 ; Devillers-Thiery y col ., 1983 ; Chavez y Hall, 1992) (Figura 3, Modelo 1) .

Otro de los modelos propuestos, basado en el estudio de los perfiles de

hidrofobicidad y empliQándo técnicas de análisis de Fourier (Finer-Moore,

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1984) o cálculos de transferencia de energía (Guy y col., 1984), sugiere la existencia de un segmento transmembrana adicional que sería una a-hélice de carácter anfipático (MA), donde se alternan aminoácidos polares y apolares . La cara hidrofóbica de esta hélice podría interactuar con los lípidos de la bicapa y la cara hidrofílica podría contribuir a la formación del canal iónico. Así cada cadena atravesaría cinco veces la membrana, y cada segmento transmembrana estaría unido por pequeños fragmentos en ambas caras; el extremo amino terminal estaría en la cara extracelular y el carboxilo terminal en la citoplasmática (Mishina y col., 1985) (Figura 3, Modelo 2). Un tercer modelo, basado en estudios inmunológicos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra dominios específicos de los polipéptidos ha permitido estudiar la localización de los mismos en las zonas intracelular, extracelular y transmembrana. Los resultados obtenidos indican que algunos anticuerpos dirigidos contra regiones supuestamente extracelulares se unirían solo cuando se permeabilizan las membranas con detergente, indicando que son regiones citoplasmáticas.(Ratman y col., 1986b). N H2

NH2 COOH

EXTERIOR

E

rp~~ EXTERIOR M

INTERIOR

2-3-

INTERIOR

COON

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MODELO 1

MODELO 2

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INTERIOR

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COON MODELO 3

MODELO 4

Figura 3. Modelos de la estructura terciaria del AcChR. Los modelos que se presentan han sido propuestos por diferentes autores y están basados en los perfiles de hidrofobicidad de las diferentes subunidades junto con el empleo de anticuerpos dirigidos contra secuencias específicas de la subunidad a.(1) Modelo de Noda y col., 1983 . (2) Modelo de Finer-Moore y Stroud, 1984 . P, B y N indican los lugares en donde se han inducido mutagénesis dirigida . (3) Modelo de Ratman y col., 1986. Los símbolos @ representan las regiones de unión de anticuerpos. (4) Modelo de Criado y col., 1985 . Los cilindros representan las ochélices y las figuras en zigzag las hojas 13.

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Por todo ello se postuló otro modelo, (Figura 3, Modelo 4) que contiene siete segmentos transmembrana (Criado y col., 1985), donde se obliga a los fragmentos MVI y MVII a que sean transmembrana, para que el fragmento polipeptídico que los une sea citoplasmático . En la Figura 3 se resumen esquemáticamente los diferentes modelos propuestos . Hasta que todas las ambigüedades anteriormente descritas se resuelvan, no se debe aceptar al pie de la letra ninguno de los modelos propuestos, teniendo además muy presente que las predicciones de estructura terciaria a partir de la secuencia primaria son solo aproximaciones teóricas . Por ello, los "modelos" que se predicen deben ser tomados en cuenta como tales, y no como conformaciones establecidas experimentalmente . Todos estos modelos necesitan, por tanto, ser comprobados para aceptarlos o rechazarlos definitivamente. 3.5 Formas moleculares del AcChR. El AcChR extraído de órgano eléctrico de T. californica contiene dos especies moleculares diferentes . Estas se han separado mediante gradiente de sacarosa obteniéndose coeficientes de sedimentación de 9 y 13S (Gibson y col., 1976). La forma cuyo coeficiente de sedimentación es 9S, posee un peso molecular de 250 kDa y se denominó L; la forma cuyo coeficiente de sedimentación es 13S posee un peso molecular de 500 kDa y se denominó H. Ambas formas poseen el mismo número de sitios de unión de ce-toxinas/mg de proteína y presentan igual patrón electroforético en gel de poliacrilamida en presencia de SDS en condiciones reductoras y desnaturalizantes . La forma H se convierte en la forma L en presencia de agentes reductores de enlaces disulfuro tales como DTT (80%) o R-mercaptoetanol (95%) ; esta situación llevo a interpretar que la forma H procede de la asociación de dos moléculas de la forma L (Hamilton y col., 1977 ; Hamilton et al, 1979). Mediante técnicas electroforéticas (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras, se observa que en la forma H las subunidades 8 de dos receptores adyacentes se encuentran unidas mediante un puente disulfuro (Hucho y col., 1978; Witzeman y Raftery, 1978), produciéndose la forma L, al reducir ese puente. De este modo se ha identificado la forma H como dimérica y la forma L como monomérica. En el órgano eléctrico de Torpedo en estado nativo, el AcChR se encuentra predominantemente en forma dimérica (H), esto es dos moléculas de receptor están unidas covalentemente mediante un puente disulfuro entre las subunidades 8 de dos monomeros (L) adyacentes . La relación entre las dos formas moleculares que se obtiene al purificarlo depende del procedimiento

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empleado. Se ha demostrado que la presencia de un agente alquilante durante la homogeneización del tejido eléctrico previene la formación de la forma monomérica, dando lugar a preparaciones mayoritariamente (80%) diméricas, probablemente debido a la presencia en la membrana de una proteína cercana al AeChR que contiene grupos sulthidrilo con potenciales redox muy bajos . La presencia de agentes alquilantes durante la homogeneización inicial del tejido impide la actuación de esta proteína, conservando la mayoría de los receptores en forma dimérica (Chang y Bock, 1977) . Se ha estudiado la subunidad S (PM: 66 kDa) del AcChR, responsable de la dimerización fragmentándola con concentraciones crecientes de tripsina (Wennogle y col., 1981) . Se obtienen fragmentos sucesivos de peso molecular 50 kDa y 47 kDa; este último no es sensible a la Tripsina, permanece glicosilado y contiene el extremo aminoterminal de la cadena polipeptídica . Asimismo, se ha identificado un fragmento de 16 kDa, no asociado al resto de la molécula tras la tripsinización, y que contiene el extremo C-terminal y el puente disulfuro responsable de la forma dimérica del AcChR. Cuando el tratamiento con tripsina se realiza partiendo de la subunidad S en forma dimérica (8-8, PM: 132 kDa), se obtiene un fragmento de 82 kDa que contiene una subunidad S intacta (66 kDa) unida mediante un puente disulfuro a un péptido de 16 kDa procedente de la otra, este puente se forma entre las cisteinas 500 de dos monómeros adyacentes (Wennogle y col., 1981). Basándose en estos resultados Wennogle y col., (1981), propusieron el modelo de la estructura transmembrana de la subunidad S del AcChR que se presenta en la Figura 4 .

DOMINIO CITOPLASMATICO 474950

N

DOMINIO RESISTENTE A PROTEASAS figura 4. Modelo de la subunidad S del AeChR. N: extremo n-terninal . C: extremo cterminal . Los pesos moleculares de los fragmentos obtenidos tras la tripsinización indicados con flechas, se han expresado en kDa. Figura tomada de Wennogle y col., 1981 .

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Estudios ultraestructurales del AcChR conteniendo las formas dimérica o monomérica, realizados mediante microscopía electrónica con tinción negativa y difracción de neutrones llevan a identificar en la forma dimérica "dobletes" coplanares de las "rosetas" típicas del AcChR en preparaciones de la forma monomérica. La distancia entre los centros de dos rosetas adyacentes es de 9±2 nm (Cartaud y col., 1980; Wise y col. 1981). Partiendo de estos estudios Wise y col. (1981) propusieron el modelo que muestra la Figura 5.

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v 9.0

40

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1

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¡ 301,

Figura 5. Modelo hipotético del damero del AeChR. Las dimensiones que se indican están expresadas en A y tienen un error de 5 A. El modelo tiene un radio de giro de 66 A, y un volumen molecular de 6 105 A3, correspondiente al peso molecular de dímero; una distancia de 95 A separa los dos monómeros . Figura tomada de Wise y col., (1981) .

En el órgano eléctrico de Torpedo se ha descrito que el AcChR cristaliza con simetría dimérica (Brisson y Unwin, 1984; Dipaola y col., 1989), siendo las subunidades a y 8 las que se hallan implicadas en las asociaciones entre receptores (Toyoshina y Unwin, 1990). Los contactos (x-ce y 8-8 se realizan sobre la membrana dando lugar a un patrón de interacciones que parece responsable de la forma dimérica. Así las subunidades 8 pertenecientes a receptores vecinos se hallan unidas mediante puentes disufuro . Asimismo tanto en músculo como en E. el receptor se encuentra en forma monomérica en la naturaleza (Lindstrom y Patrick, 1974; Froehner y Raflos, 1979). La forma monomérica del receptor se entrecruza en presencia de agentes oxidantes dando lugar a dímeros y oligómeros de mayor orden; la unión se electricus

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realiza a través de puentes disulfuro simétricos entre cadenas idénticas de monómeros distintos . En la subunidad S, los grupos sulfhidrilo responsables de la unión, se obtienen tras la reducción del disulfuro responsable del dímero. La subunidad a en forma nativa contiene grupos sulfhidrilo libres que reaccionan en presencia de agentes oxidantes, como diamida o cobre fenantrolina . El agente oxidante diamida, que oxida grupos sulfhidrilo a disulfuros, produce el entrecruzamiento entre cadenas Í1, la cobre fenantrolina que oxida en presencia de oxigeno, une los monómeros mediante cadenas S o R . Las cadenas R reaccionan solo con cadenas Íl y las cadenas S solo con cadenas 8 (Hamilton y

col., 1979). Anholt y col. (1980) demostraron que tanto los sitios de unión a ligando como el canal iónico están contenidos en la unidad estructural a2Ry8 del monómero, descartando la posibilidad de que el canal iónico se forme mediante la interacción entre dos monómeros en el dímero . Ambas formas moleculares muestran idéntico comportamiento dosis-respuesta cuando se mide la cantidad de 22 Na+ acumulado en vesículas tras un periodo de incubación de 1 Os; en ambos casos esta entrada de 22Na+ se bloquea mediante l Os de preincubación con carbamilcolina, indicando que tanto monómeros como dímeros muestran desensibilización, cerrando el canal en presencia continua de agonista. Mediante estudios de cinética rápida del transporte iónico del receptor se ha comprobado que ambas formas moleculares responden al agonista, transportando iones en una escala de tiempo de milisegundos, ambos flujos se bloquean con histrionicotoxina (10 p.M) y ambos se desensibilizan en presencia continuada de agonista (Wu y col., 1981). En esta misma época Boheim y col . estudiaron el AcChR procedente del órgano eléctrico de Torpedo reconstituido en bicapas planas indicando que tanto si se utilizan mezclas monómero/dímero como sólo monómeros, el canal observado presenta un valor de conductancia de 95 pS a 1 M de NaCI. De acuerdo a estos resultados, los autores concluyen que el monómero asociado al AcChR contiene la estructura de canal iónico, aunque no pueden asegurar que el dímero posea las misma propiedades que el monómero ((Boheim y col., 1981). Posteriormente y en contraposición a estos resultados Schindler y col. (1984) propusieron que las estructuras monomérica y dimérica del AcChR reconstituido en bicapas planas son funcionalmente diferentes, indicando que la conductancia observada en el dímero (39.5 pS en 0.5 M NaCI) es doble que el monómero (20 pS en 0.5 M NaCI). De acuerdo a estos resultados, los autores concluyen que la actividad de canal único encontrada en el dímero representa la apertura sincronizada de los dos monómeros que lo constituyen.

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Introducci6n

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4. CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES DEL AeChR. Como consecuencia de la unión de acetilcolina el AcChR responde con un cambio conformacional que afecta a todas las subunidades (Witzeman y Raftery, 1978; Lindstrorn y col., 1979 ; Kistler y col., 1982; Unwin, 1993 ; Unwin, 1995 ; Unwin, 1996), llevando a la apertura de un canal conductor de iones a través de la membrana plasmática. En condiciones fisiológicas este canal conduce iones Na+, que son continuamente bombeados al espacio sináptico por la Na+/K+ ATPasa. Cada molécula de AcChR conduce aproximadamente 104 iones/mseg (Popot y Changeux, 1984). El flujo neto de iones sodio al interior celular produce una alteración del gradiente iónico que conduce a la despolarización de la membrana . De esta forma, la membrana celular que, normalmente, posee un gradiente de potencial de 100.000 Vcm-1 se transforma, en aproximadamente 50 p.seg, en un estado de alta conductancia (Stroud y Finer-Moore, 1985), traduciendo una señal química en una señal eléctrica que provoca la contracción del músculo en la unión neuromuscular . En el sistema nervioso central el AcChR es responsable de la transmisión nerviosa excitatoria (Popot y Changeux, 1985) . La respuesta del AcChR al agonista incluye los siguientes procesos : a) reconocimiento y unión de ligandos ; b) acoplamiento entre la unión del ligando y el canal fónico; c) permeación de iones y d) desensibilización . Hay cuatro clases principales de moléculas efectoras colinérgicas (Tabla 11): agonistas, catíones orgánicos pequeños y flexibles, similares a AcCh, que activan y desensibilizan el canal iónico (Rucho, 1986 ; Ochoa y col., 1989) ; entre los más conocidos están la carbamilcolina y la suberildicolina. Antagonistas competitivos, que desplazan competitivamente a los agonistas; destacan especialmente la d-tubocurarina y el hexametonio (Rucho, 1986 ; Ochoa y col., 1989). a-neurotoxinas, las más utilizadas provienen del veneno de las serpientes Bungarus multicinctus y Naja Naja siamensis (Fulpius y col., 1975 ; Tzartos y Remounds, 1990; Négrerie y col ., 1991) . Antagonistas no competitivos, que son compuestos heterogéneos en estructura (cationes anfipáticos) que bloquean la acción de agonistas de forma no competitiva de dos modos: a) bloquean esténcamente la apertura y cierre del canal iónico en membranas nativas y reconstituidas y b) bloquean de forma alostérica promoviendo desensibilización (Heidmann y col., 1983 ; Heidmann y Changeux, 1984 ; Giraudat y col., 1986; Heidmann y Changeux, 1986; Giraudat y col ., 1987; Changeux y Eldestein, 1994 ; Jackson, 1994; Changeux, 1995 ; Johnson y Ayres, 1996 ; Luitz y col ., 1997) .

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El AcChR en forma nativa o purificado, posee dos sitios de unión para la AcCh, que pueden ser ocupados por agonistas, antagonistas y a-neurotoxinas . Los agonistas y antagonistas se unen al AcChR de forma reversible y mutuamente excluyente, mientras que las a-neurotoxinas se unen de forma prácticamente irreversible (Changeux y col ., 1984). AGUNISTAS H3

O

H3C--N - CHI -C Hd'O- C -C H.1 1 C11,

ANTAGONISTAS

_

ACETILCOLINA CH3 O H3CEN-CH2- C HZ-C>-C- NH3 1 CH3 CARBAMILCOLINA CH3 CH3 1 H3C®N -(C"2110-!71 , .-CN3 1 I CH3 CH3 DECAMETONIO CH3 CH3 O O H3CN-CH2-CH2-O-C-(CH2 ) 6-C-O-CH2-CH2-N-CH3 1 I CH3 CN3 SUBERILDICOLINA

COMPFTITIVOS CH3,C"3 m

OH O CH3 ~ -O-C ~) ~CH a~,

CH

PCH3

NO-COMPETITIVOS

çN H 3

ON

d-TUBOCURARINA 4)1 C2 H5 O-CH CH2- N-C2N,5 ~Y C2H5 /C2M5 O-CH2-CH2-N-C2Hs ~ C2H5

.'/C2 I15 O.-CH2-CHTN -C 2 H5 HS FLAXEDIL

CH

((''O1i

t.- l

~H H; HC CxH / HCmC

HISTRIONICOTOXINA

1 FENCICL.IDINA

cH 3

CH3 CH3 Ñ- ICH2)S~~Ñ-CH3 çH3

CH3

HEXAMETONIO

"

TPMP' çH37 F2H5 ~NH- -C4H2fl v CN3 C2H5 LIDOCAINA

5

~

CH3 O'Cli?CHZ Ñ-CN3 Iri AN CH3 C4HA

f .

TRIMETM000INA cC-BUNGAROTOXINA CI

?-,

fH3 ' H2 CH2 CH2 N C113

CLORPROMAZINA

Tabla II. Efectores colinérgicos . Se representan algunos compuestos pertenecientes a las cuatro clases principales de efectores. Tabla tomada de Hucho, 1986 .

Para abrir el canal es necesaria la unión de dos moléculas de AcCh (Sine y Taylor, 1980). Si bien la unión de los ligandos no es cooperativa, si lo es la apertura del canal, que muestra un coeficiente de Hill aproximadamente igual a 2 (Neubig y Cohen, 1980 ; González-Ros y col., 1984) . En cada subunidad a se encuentra un sitio de unión a agonistas, que une AcCh con relativa baja

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afinidad (KD = 0.1-1 mM) (Hess et al 1982a; Raftery y col., 1983). La presencia continuada de agonista, modifica la constante de afinidad para el mismo, disminuyendo la KD de 3 a 5 ordenes de magnitud (McCarthy y col., 1986). Los dos sitios de unión de la aceflcolina no presentan propiedades simétricas diferenciándose, en concreto, en las cinéticas de unión de aneurotoxinas (Maelicke y col ., 1977; Watters, 1983) y en las constantes de equilibrio de unión a agonistas y antagonistas. Estos datos se correlacionan con el hecho de que las dos subunidades a tienen microentornos diferentes en la molécula del AcChR (Damle y col., 1978 ; Neubig y col., 1979 ; Unwin, 1996) . La apertura del canal asociado al receptor se produce aproximadamente 10 lis después de la unión del ligando (Krouse y col., 1980), provocada por la unión cooperativa de dos moléculas de acetilcolina al receptor . La duración media de apertura depende del potencial de membrana, de la Temperatura y sobre todo del tipo de agonista utilizado: 1 ms para carbamilcolina, 2.4 ms para AcCh y 5.6 ms para suberildicolma . Las aperturas se ven interrumpidas por cierres muy breves, de 50 lis, que son transiciones a estados no conductores (Sakmann y Methfessel, 1985) . La traslocación de iones es un fenómeno de difusión pasiva: los iones fluyen según su potencial electroquímico a través del poro acuoso (Popot y Changeux, 1984). El canal iónico es muy selectivo para cationes, siendo impermeable a aniones. Entre diferentes cationes la selectividad es menor, dejando pasar iones monovalentes (Cs+> Rb+> K+> Na+> Li+) y divalentes (Mg2+> Ca2+> Ba2 +> Sr2+), así como moléculas neutras y cationes orgánicos de un tamaño máximo de 6.5 Á; esto implica que algunos cationes pueden pasar parcialmente hidratados (Popot y Changeux, 1984). Estudios de la actividad a nivel de canal único del AcChR muestran valores de conductancia comprendidos en un amplio rango, (16-80 pS) . Esta gran diversidad de valores incluye la utilización de una metodología variada: diversas técnicas de reconstitución, patch-clamp en células y la expresión del AcChR en oocitos, así como diversas fuentes de AcChR: Torpedo, electrophorus, músculo de mamíferos, de rana, o de Xenopus .(Schindler y Quast, 1980 ; Nelson y col., 1980; Hamill y col., 1981 ; Tank y Miller, 1983, Labarca y col ., 1984 ; Labarca y col., 1985 ; Leonard y col . 1984; Brehm y col ., 1984a,b ; Sakmann y Methfessel, 1985 ; Hanke y Breer, 1986 ; Brehm y Kullberg, 1987; Imoto y col., 1988; Marsal y col ., 1995 ; Morales y col., 1995). En células musculares de mamíferos se han descrito dos tipos de corrientes, aparentemente procedentes de dos poblaciones distintas de receptores, cuyas conductancias son cercanas a los 40 y 60 pS (Brehm y col.,

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1984a,b; Leonard y col ., 1984; Schuetze y col. 1986 ; Brehm y Cullberg, 1987). Independientemente de los valores de conductancia hallados, todos estos autores coinciden en que la población de AcChR que presenta menor conductancia predomina en la etapa prenatal, y la de mayor conductancia en el adulto . Durante la formación del contacto neuronal coexisten ambos tipos de receptores en la misma fibra muscular (Missias y col ., 1996). Mediante experimentos de expresión del receptor de músculo de mamíferos en oocitos de Xenopus, Mishina y col . (1986) demostraron que los dos tipos de receptor se corresponden con dos moléculas diferentes estructuralmente . El receptor embrionario, cuya composición de subunidades es a2Ry8, da lugar al menor valor de conductancia y el receptor de adulto cuya composición de subunidades es a2RE8, da lugar al mayor valor de conductancia (Witzemann y col., 1996;

Herlitze y col ., 1996). En condiciones fisiológicas, los tiempos de apertura media de canales individuales han sido descritos mediante dos distribuciones de Poisson, obteniéndose tiempos de 1 mseg. El cierre del canal es espontáneo y se produce por la disociación de una de las dos moléculas de acetilcolina del receptor . La acetilcolina difunde a través del espacio sináptico y es hidrolizada por el enzima acetilcolinesterasa localizado en la lámina basal. El mecanismo de acción de este enzima es sumamente rápido, impidiendo que el receptor pase al estado desensibilizado . Se han postulado diversos modelos cinéticos del AcChR. Básicamente, todos ellos distinguen cuatro estados funcionales del receptor (Figura 4): de reposo (R), abierto (A), desensibilizado lento (D) y desensibilizado rápido (I), que se diferencian en la afinidad por los agonistas y en el estado, cerrado o abierto, del canal iónico asociado (Conti-Tronconi y Raftery, 1982; Raftery y col., 1983 ; Changeux y col ., 1984 ; Stroud y Finner-Moore, 1985; Karlin y col., 1986; Edelstein y col ., 1996). El estado de reposo se caracteriza por tener baja afinidad por los agonistas y porque el canal iónico está cerrado al paso de cationes . La unión del agonista al AcChR da lugar a un cambio conformacional del mismo originando así el estado abierto, en el cual el canal iónico está abierto y presenta una vida media de 1-10 ms. (Montal y col., 1984; Sine y Steinbach, 1984; Leibowitz y Dione, 1984). La presencia continua de agonistas, induce el fenómeno conocido como desensibilización, que es un estado no conductor del AcChR donde no hay respuesta a los agonistas. El proceso de desensibilización se acompaña de un incremento de la afinidad hacia el ligando, producido por un cambio conformacional del receptor (desensibilización específica) (Kuhlman y col .,

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1991) . Este fenómeno es reversible, recuperándose la actividad completa del receptor cuando se elimina el agonista . La desensibilización se observa tanto en membranas nativas enriquecidas en AcChR (Gonzalez-Ros y col., 1979), como en AcChR extraído de su ambiente nativo (McNamee y Ochoa, 1982), o expresado mediante ingeniería genética, inyectando en oocitos los diferentes mRNAs de las subunidades (Mishina y col., 1984; Marsal y col ., 1995 ; Morales y col., 1995). Esto indica que la desensibilización es una propiedad molecular intrínseca del receptor, así como de otros receptores de membrana activados por ligando, como el AcChR neuronal, el AcChR muscarínico, receptores de GABA (ácido y-aminobutírico) y glutamato, etc. (revisiones en Popot y Changeux, 1984; McCarthy y col., 1986; McCarthy y Stroud, 1989; Ochoa y col ., 1989; Stroud y col., 1990). BC e

R

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A C C h o-----

u

A

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1(1Í11i

a

f ~"VIIIIII

illllllME

.Ca 2 .

Figura 6. Esquema cinético de las transiciones alostéricas del ACChR. Se distinguen cuatro estados funcionales del receptor, que se diferencian en la afinidad por los agonistas y en el estado del canal fónico . La unión de dos moléculas de AcCh al receptor en estado de reposo (R), produce la apertura del canal iónico asociado al mismo (A) . La exposición prolongada al agonista provoca la desensibilización del receptor en dos etapas : un proceso rápido (100 ms, estado 1) o bien lento de alrededor de segundos (estado D). A es el único estado activo del AcChR; los estados R, D e 1 representan estados inactivos del AeChR con alta, intermedia y baja afinidad por agonista . (Kv= 3 nM, 1 mM y 50-100 mM respectivamente) . BC : bloqueador competitivo . BNC: bloqueador no competitivo . Figura tomada de Changeux, 1990 .

Dependiendo de la duración y de la concentración del agonista, se diferencian dos tipos de desensibilización : la rápida (escala de tiempo de milisegundos a segundos, t 1/2 = 300 ms) y la lenta (de segundos a minutos, t 1/2 = 6-7s). La inactivación rápida produce una disminución del flujo iónico en

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razón de un factor de 250 (Walker y col., 1982) a 1000 veces (Changeux y col., 1984 ; Changeux, 1995), mientras que en la lenta el flujo es indetectable . Un esquema cinético simple para estas transiciones es el postulado por Changeux y col ., (1984) (figura 6). Este modelo de cuatro estados incluye un estado de reposo (R), un estado de canal abierto (A) y dos estados desensibilizados cerrados (1, D). En cada una de estas etapas la afinidad por el agonista aumenta dos ordenes de magnitud. Las constantes de velocidad para las transiciones entre los estados varían en 6 ordenes de magnitud, desde 104 s 1 para el canal activo a 10-2 S-1 para el de desensibilización lenta (Karlin y col ., 1986) . En ausencia del agonista, el AcChR recupera su estado de reposo de un modo lento, en un proceso de varios minutos de duración (Eldestein y col., 1996). Un esquema cinético más completo aplicado al AcChR se puede representar mediante el modelo propuesto por Hess y col ., (1982a) (figura 7), donde se observa igual que en el modelo anterior, que la desensibilización puede alcanzarse sin necesidad de pasar por el estado abierto (Tamamiza y col ., 1996) . En este modelo se representa que el estado abierto se alcanza tras la unión cooperativa de dos moléculas de AcCh, mientras que para inducir la desensibilización es suficiente que se asocie una sola molécula, señalando aún más la interrelación entre estados cerrados y desensibilizados . ESTADO DE REPOSO (bala afinidad por agonlsta) 2 K1

koJ 1 k_o

k, ~

~ K_,

K

k2

k2

12 K;

ESTADO DESENSIBILIZADO (alta afinidad por agonlsta)

Figura 7. Esquema cinético complejo de las transiciones alostéricas del AeChR. Se aprecian las transiciones entre los estados de reposo y desensibilizado en ausencia o en presencia de una o dos moléculas de AcCh . Figura tomada de McNamee y col ., 1986 .

El significado fisiológico del estado desensibilizado es desconocido : se propone que es un mecanismo defensivo de las células o tejidos frente a una sobreexposición del agonista (Ochoa y col., 1989) .

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Además de los efectos fisiológicos que produce la aceflcolina, otros muchos agentes, fisiológicos o no, modulan la actividad del receptor . Entre los primeros se incluye el Cae+, la fosforilacion citoplasmáfca, la glicosilación y la unión de ácidos grasos. Los agentes no fisiológicos incluyen las neurotoxinas de veneno de serpiente, el curare, agentes descritos y usados clínicamente como relajantes musculares, tales como suberildicolina, y numerosos compuestos descritos ampliamente como bloqueadores no competitivos o anestésicos locales (Stroud y Finner-Moore, 1985 ; Wu y Miller, 1994). S. DOMINIOS ESTRUCTURALES CON RELEVANCIA FUNCIONAL. La unidad funcional mínima necesaria para la apertura del canal iónico asociado al AcChR es un pentámero heterólogo formado por cuatro cadenas polipeptidicas diferentes ((X2078) . Mediante experimentos de purificación y reconstitución del AcChR, y medidas electrofisiológicas del mismo, se ha demostrado que el conjunto de las cinco subunidades posee los sitios de unión de acetilcolina, el canal iónico y los elementos estructurales necesarios para la activación de la respuesta iónica al agonista en condiciones fisiológicas normales. El clonaje y la secuenciacíón de las cuatro subunidades del AcChR procedentes de distintas especies : T. californica, T. marmorata, E. electricus (Raftery y col., 1980; Devillers-Thiery y col ., 1983 ; Conti-Tronconi y col ., 1982) y la inyección de los mRNA de las cuatro subunidades en sistemas de expresión (Mishina el al ., 1984), producen canales fónicos activados por acetilcolina y bloqueados por antagonistas como d-tubocurarina. Estos experimentos apoyan la teoría de que el oligómero formado por las subunidades (X2078 es suficiente para generar la respuesta fisiológica del AcChR en músculo y órgano eléctrico. El análisis del mecanismo molecular del AcChR requiere la localización de los sitios de unión de ligandos dentro de la secuencia aminoacídica del receptor, así como la identificación de la estructura del canal iónico asociado al mismo. 5.1. Sitios de unión de ligando . De los dos aspectos funcionales mas notorios del AcChR, la unión de ligandos y la tráslocación de iones, la primera es la mejor conocida y caracterizada. La subunidad a contiene el sitio de unión a agonistas y a antagonistas competitivos (Popot y Changeux, 1984), existiendo, por tanto dos sitios de unión de AcCh por molécula de receptor, que interaccionan de forma alostérica para abrir el canal (Changeux y col., 1984; Changeux y Edelstein,

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1994). La identificación aminoacídica de estos sitios de unión se ha llevado a cabo con técnicas basadas en el mapeo peptídico, la secuenciación (Kao y col., 1984), la unión de a-toxinas a fragmentos de la subunidad a (Oblas y col., 1986 ; Wilson y col ., 1988), la unión de toxinas a péptidos sintéticos, la expresión de fragmentos de la subunidad a en transformantes de E.Coli (Gershoni, 1987) y mutagénesis dirigida (Mishina y col., 1985). Estos sitios de unión no son equivalentes puesto que la bromoacetilcolina y el agente alquilante 4-N-(Maleimido) benciltrimetilamonio (MBTA) se unen a ambos lugares con diferentes afinidades (Damle y col ., 1978; Delegeane y McNamee, 1980) . Cuando se utiliza MBTA para marcar el AcChR reducido, los únicos aminoácidos que aparecen marcados son los residuos de Cisteina 192 y 193 (Karlin y col., 1971 ; Kao y col ., 1984). Tras la reducción del puente disulfuro formado entre estos aminoácidos se observa una disminución en la afinidad del receptor por acetilcolina ; este resultado confirma la implicación de estos residuos en el sitio de unión de ligandos colinérgicos (Karlin y col., 1986). En experimentos de mutagénesis dirigida (Mishina y col., 1984), se demuestra que la sustitución de los residuos de Cys 192 y 193 por serina produce una marcada disminución de la afinidad del AcChR por carbamilcolina . Los resultados obtenidos con estos experimentos concluyen que esta región de la subunidad a constituiría el sitio potencial de interacción del AcChR con ligandos colinérgicos.

a 93

CHO

H2N

149

x N r:r. w t~fr:i.

DDF r aTC

~1 199 194 193

Figura 8. Modelo del sitio de unión de agonístas y antagonistas competitivos . Se presenta una vista superior de la posible conformación del segmento aminoterminal de la subunidad a. La esfera representa el antagonista fotoactivable DDF, rodeado por los aminoácidos que resultan marcados (Y = Tirosina, W = Triptófano, C = Cisteína) . Según este modelo, el sitio de unión de AcCh al receptor, estaría formado por tres dominios de la subunidad a, y dominios aún no identificados (X) de las subunidades contiguas . * Sitios de unión de MBTA, A sitio de unión de lofotoxina . Figura tomada de Galzi y col., 1991 .

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Recientemente se ha obtenido un marcaje más detallado del sitio de unión de agonistas, utilizando el antagonista competitivo p-^N) dimetil aminobenzoato diazonio fluoroborato (DDF), (Galzi y col., 1990) (Figura 8). Tras la unión del DDF al AcChR resultan marcadas tres regiones diferentes de la subunidad a: los residuos Trp-86 y Tyr-93 ; Trp-149 y Tyr-151 y Cys-192193 (Dennis y col., 1988) . Estas regiones se encuentran localizadas en tres zonas distintas de la estructura primaria de la subunidad a, que posiblemente se encuentren próximas entre sí, a nivel del sitio de unión del ligando (Galzi y col., 1991) . La unión del DDF al AcChR, en presencia de a-toxinas o carbamilcolina, reduce el marcaje de las tres regiones ; estos resultados indican que serían tres los dominios implicados en el sitio de unión de acetilcolina . Los aminoácidos que componen estos dominios están conservados en posiciones homólogas en las subunidades a de AcChR procedente de distintas especies, pero no están presentes en las subunidades R, y, o 8. Por ello se ha postulado que al menos tres segmentos diferentes del extremo amino terminal de la subunidad a cooperan en la unión de AcCh, así como algunos dominios de las subunidades contiguas a la a, que por el momento permanecen sin identificar (Galzi y col ., 1991). La diferente farmacología encontrada para los AcChR de diferentes especies y procedencias se explica porque los lugares adyacentes a estas tres regiones no están conservados, proporcionando ambientes diferentes para las subunidades a, de los distintos AcChR (Unwin, 1996). Influye además, la interacción con el resto de las subunidades, que es diferente incluso para las cadenas a de una misma molécula (Galzi y col ., 1991). Las subunidades a están codificadas por un solo gen, por lo que sus estructuras primarias deben ser idénticas, si bien los dos sitios de unión de acetilcolina, presentes uno en cada subunidad, difieren en sus propiedades de unión de a-toxinas, d-tubocurarina y lofotoxina (Neubig y Cohen, 1979) . Estas diferencias pudieran ser debidas a la contribución de las subunidades 0, S y y al sitio de unión de acetilcolina (Pedersen y Cohen, 1990). Esta hipótesis se demuestra utilizando el antagonista competitivo DDF, que además de marcar dominios de la subunidad a marca, en menor extensión, regiones de las subunidades (3 y 8, sugiriendo que cada una de ellas podría participar en uno de los dos sitios de unión de acetilcolina junto con la subunidad a (Prince y Sine, 1996) . El empleo de DDF para marcar el AcChR desensibilizado produce un aumento de marcaje en la subunidad S y una disminución del mismo en las regiones del sitio de unión de agonistas de la subunidad a (Figura 9). Estos resultados indican que tras la desensibilización, ocurren cambios

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conformacionales locales que hacen más accesible dominios de la subunidad S. Por lo tanto,

esta subunidad podría estar implicada en el proceso de

desensibilización del AcChR.

Los antagonistas competitivos, tales como la a-bungarotoxina o la cobratoxina, se unen al receptor con alta afinidad (KD menor de 0 .1 nM), tanto

en el estado cerrado como desensibilizado (Weiland y Taylor, 1979) . Estos compuestos actúan bloqueando de forma competitiva la unión de agonistas, sin

interaccionar con el canal iónico, por lo tanto, los sitios de unión de antagonistas competitivos, solapan con los sitios de unión de acetilcolina. En el

caso de las a-toxinas, el sitio de unión cubre una superficie de 20 x 30 A, en la región extracelular del AcChR (Kistler y col ., 1982). Mediante microscopía electrónica se ha visualizado la unión de estas toxinas al AcChR, utilizando complejos

toxina-anticuerpos

(Klimkowsky

y

Stroud,

antitoxina

1979).

Debido

con

marcados a

que

las

oro

coloidal

toxinas

bloquean

competitivamente la unión de agonistas a los sitios de alta afinidad, estos sitios

serían también los sitios de unión de toxinas. Por otra parte, y dado el tamaño de estos antagonistas (7000-8000 Da), las cuatro cadenas que componen el AcChR podrían estar implicadas en estos sitios de unión.

DESENSIBIL IZADO

REPOSO

rs 93

149

190

ei

9r 192

192 H2Ñ

93

141

193

H2N

Figura 9. Modelo de las transiciones en el sitio de unión de DDF tras la desensibilización del AeChR. En la figura se esquematiza uno de los sitios de unión de DDF compuesto por tres dominios de la subunidad a, un dominio de la subunidad R y un dominio de la subunidad S. Tras la exposición del AcChR al agonista (estado desensibilizado) el dominio de la subunidad S aparece más marcado con DDF, indicando el posible papel de esta subunidad en la desensibilización del AcChR. Figura tomada de Galzi y col., 1991 .

5.2 Sitios de unión de bloqueadores no competitivos

La permeabilidad a cationes puede ser disminuida o incluso eliminada por un grupo de fármacos denominados bloqueadores no competitivos (BNCs)

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(Tabla II), que se unen al AcChR en lugares topologicamente distintos a los agonistas, y que ínteractuan con los mismos de modo alostérico (Heidmann y col., 1983 ; Heidmann y Changeux, 1984, 1986; Pedersen y col ., 1992; Johnson y Ayres, 1996). Los BNCs constituyen un grupo heterogéneo de compuestos químicos, entre los que se incluyen anestésicos locales como lidocaína o procaína; toxinas alcaloides como histrionicotoxina ; alucinógenos como fenciclidina ; neurolépticos como clorpromazina, detergentes, ácidos grasos y anestésicos generales (Lin y col, 1995) . Los BNCs disminuyen la probabilidad de encontrar al AcChR en estado abierto mediante tres mecanismos diferentes : i) la transición de estados cerrado a abierto se hace más lenta; ii) bloquean el canal directa o indirectamente, y iii) se favorece la desensibilización . Mediante estudios de unión a equilibrio de BNCs al AcChR se han podido distinguir dos categorías diferentes de sitios de unión : i) numerosos sitios de unión de baja afinidad, localizados principalmente en la interfase lípido-proteína, y ii) un sitio de unión de alta afinidad . Mediante análisis biofisicos se ha postulado que el modo de acción de los BNCs que se unen a este sitio de alta afinidad sería la inhibición estérica del transporte de iones mediante su entrada en el canal ; estos BNCs se unirán pues al interior del

canal fónico . Los sitios de unión de alta afinidad, a los que se unen histrionicotoxina y fenciclidina, son las regiones más estudiadas . Estos lugares de unión no son los mismos que los de acetilcolina, si bien estarían acoplados alostéricamente. Con el fin de localizar estas regiones, se han realizado diversos experimentos de marcaje covalente de AcChR procedente de distintas especies y utilizando distintos derivados de BNCs. Los experimentos más reveladores son los que se hicieron con 3 H-clorpromazina, donde se marcaron las cinco subunidades del AcChR. El marcaje se incrementa con carbamilcolina y se disminuye con histrionicotoxina . El primer aminoácido identificado fue Ser-262 en la subunidad S y más tarde se observó un "anillo" de serenas homólogas que también se marcaba con 3 H-clorpromazina: Ser-248 en a, Ser-254 en R, y Ser257 en y. Igualmente, se encontraron anillos de treonina, leucina y aminoácidos aniónicos (Asp, Glu) (Figura 10). Las medidas electrofisiológicas muestran que en determinadas condiciones, algunos bloqueadores no competitivos entran por difusión en el canal abierto y lo bloquean estéricamente (Adams, 1981). Estos resultados indican la existencia de un único sitio de unión de alta afinidad para BNCs (Heidmann y col., 1983), común a todas las subunidades y localizado en el eje de simetría del AcChR, donde la distancia entre las cinco subunidades es mínima. Estos aminoácidos se encuentran en el segmento hidrofóbico MII, uno

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de los potenciales segmentos transmembrana (Giraudat y col., 1987; Revah y col., 1990).

a

A I L

A L

L F

F

a

T

L

F

1

v

A

L A

L

S

S T

K

E

M K

CITOPLASMA

Figura 10. Modelo del sitio de unión de alta afinidad para clorpromazina (BNC) al AcChR. En la figura se muestran los segmentos MII de las subunidades P y y así como la posible distribución de los residuos de serina, leucina y treonina presentes en las cuatro subunidades . Los anillos formados por estos restos aminoacídicos podrían formar el sitio de unión de alta afinidad de BNCs en el eje de simetría del oligómero. Figura tomada de Revah y col., 1990.

Experimentos adicionales, empleando clorpromazina para marcar el AcChR, dan como resultado el marcaje de los residuos Leu 257 en la subunidad 0 y Thr 253 y Leu 260 en la subunidad y localizados igualmente en el segmento MII . La posición respectiva de estos aminoácidos en la secuencia del fragmento MII es consistente con la organización de esta región en a-hélice (Figura 10). Los tres residuos marcados estarían alineados en giros sucesivos de la a-hélice . Las regiones marcadas por BNCs constituyen regiones conservadas y están en posiciones homólogas a secuencias conocidas de otros canales fónicos activados por ligando ; por lo tanto podrían jugar un papel importante en los mecanismos de transporte fónico (Devillers-Thiéry y col., 1993) .

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Además de este sitio de unión de alta afinidad para BNCs, se ha demostrado la existencia de otro sitio de unión en la región MI de las subunidades a y R (Karlin y col., 1986) . Esta región hidrofóbica está compuesta por los aminoácidos 211-237, que están relativamente cercanos a los sitios de unión de aceflcolina. 5.3 El canal iónico y su apertura. El empleo de técnicas electrofisiológicas junto con la expresión del AcChR en oocitos- de Xenopus (Mishina y col ., 1985 ; Marsal y col ., 1995 ; Morales y col., 1995) ha demostrado que se requiere la presencia de las cuatro subunidades para obtener un receptor funcional, si bien no se conoce con exactitud cuales son las regiones polipeptídicas de cada subunidad implicadas en la formación del canal iónico . Del análisis de la estructura primaria de las cuatro cadenas del AcChR se dedujo la existencia de cuatro segmentos hidrofóbicos en cada subunidad (Àkabas y col., 1994; Hucho y col., 1994 ; Gorne-Tschelnokow y col., 1994; Sankararamakrishnan y col ., 1995) . Estos fragmentos forman hélices a que atraviesan la membrana, si bien no formarían parte del canal iónico debido a su carácter hidrofábico . Según el modelo de cinco regiones transmembrana, postulado por Finer-Moore y Stroud (1984) se hipotetizó que este canal estaría formado por las hélices anfipáticas MA de las cinco subunidades. Con objeto de probar que son estas hélices las que forman el canal, se han realizado un gran número de experimentos entre los que se incluyen técnicas immunológicas empleando anticuerpos dirigidos contra distintas regiones de las subunidades que componen el receptor (Lindstrom y col ., 1984; Young y col ., 1985 ; ContiFine y col., 1996), técnicas de mutagénesis dirigida (Mishina et al, 1985 ; Akabas y col ., 1992; Lee y col ., 1994) y técnicas de microscopía electrónica (Brisson y Unwin, 1985 ; Toyoshima y Unwin, 1990) . Los resultados obtenidos difieren de unas técnicas a otras. Una aproximación eficaz para identificar las regiones implicadas en el canal iónico es el marcaje del AcChR con antagonistas no competitivos que bloquean el canal . La conclusión de estos experimentos es que los antagonistas no competitivos se unen de forma estérica o alostérica a los sitios que constituyen el canal. El análisis de las regiones marcadas ha permitido demostrar que la región hidrofóbica MII estaría implicada en la estructura del canal iónico, formando las paredes de dicho canal (Hucho y col ., 1986). La importancia de esta región en la actividad de receptor queda demostrada en experimentos de mutagenesis dirigida realizados en la hélice MII (Imoto y col., 1991 ; Herlitze y col., 1996) . Las mutaciones en los residuos cargados de esta

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región alteran la conductancia del canal . Se ha encontrado un sitio de unión para quinacrina (antagonista competitivo) en la hélice MI (Karlin y col., 1986), por lo que se deduce que esta región también estaría implicada en la formación del canal, quizá rodeando la hélice MII . Esta hipótesis se ha verificado con experimentos de sustitución de los segmentos transmembrana por fragmentos polipeptídicos de otras proteínas (Tobimatsu y col ., 1987). Solamente la sustitución de la región MIV no altera las propiedades del canal, sugiriendo que MI y MIII quedarían en las proximidades de la región MII, estando implicadas en el funcionamiento del canal (Stroud y col., 1990). Con objeto de determinar el mecanismo de apertura del canal se han realizado experimentos de expresión de AcChR formados con mRNA procedente de subunidades de distintas especies. Los AcChRs formados con subunidad 8 de ternera y el resto de las subunidades de Torpedo muestran actividad semejante a la del AcChR de ternera. Este resultado indica la importancia de la subunidad 8 en el funcionamiento del canal iónico asociado al receptor (Imoto y col., 1986). La interpretación de los resultados obtenidos con experimentos de marcaje con antagonistas competitivos, registros electrofisiológicos y mutaciones puntuales indican que las paredes del canal iónico estarían formadas por los segmentos MII de cada subunidad, estando implicada la subunidad 8 en la apertura del canal (Leonard y col., 1988 ; Hucho y col., 1986; Hucho y Hilgenfeld, 1989). Según este modelo, el transporte de iones tendría lugar a través de un canal formado por segmentos transmembrana hidrofóbicos, tal como predice el modelo de cuatro a-hélices transmembrana ; estos segmentos orientarían sus aminoácidos cargados hacia el interior del canal. La formación del canal a partir de la hélice anfipática quedaría pues descartado. Los estudios con azida de quinacrina (Di Paola y col., 1990) sugieren que el segmento MI de la subunidad a está implicado en el acoplamiento entre el canal iónico y el lugar de unión a agonistas. La flexibilidad del segmento MI permitiría a las hélices MII adoptar diferentes orientaciones unas con respecto a otras y dar cuenta de los diferentes estados funcionales del AcChR. Adicionalmente a estas modificaciones locales, pueden estar implicados otros cambios de estructura cuaternaria (Unwin y col ., 1988 ; Unwin, 1993 ; Unwin, 1995) que servirían para explicar algunas características típicas de la apertura del canal en el AcChR (apertura o cierre siguiendo la ley del todo o nada, conductancia independiente del tipo o concentración de agonista y aperturas espontaneas en ausencia de agonista) . Los dos modelos de transiciones alosténcas propuestos son: i) alabeo global de todos los fragmentos

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transmembrana, inclinándose tangencialmente al eje del canal y cambiando el diámetro interno del poro, y ii) apertura o cierre de la molécula como si de un paraguas se tratase: inclinación vertical de todos los fragmentos transmembrana quedando fija la parte inferior de la molécula (Galzi et al, 1991 ; Unwin y col., 1995) . 5.4 Región inmunogénica principal, (MIR). En la subunidad a existe un dominio implicado en un trastorno inmunológico denominado Miastenia gravis (Wittbrodt, 1997; Marx y col ., 1996); esta patología se caracteriza porqu anticuerpos antireceptor producen la desorganización de la membrana postsináptica y la disminución del número de receptores, pudiéndose producir mediante dos mecanismos diferentes: i) entrecruzamiento de dos moléculas de AcChR por un mismo anticuerpo, provocando un incremento en el recambio (internalización y degradación) de la proteína ; y ii) lisis de la membrana postsináptica. Los anticuerpos están dirigidos contra una región de la zona extracelular de la subunidad a, denominada región inmunogénica principal (MIR), (Tzartos y Lindstrom, 1980). Realizando un barrido con anticuerpos anti-MIR con péptidos correspondientes a diferentes regiones de la subunidad a, la región MIR se ha localizado en los residuos 6-85 de la subunidad a de ratón (Ratman y col ., 1986a), los residuos 46-127 de la subunidad a de T. californica (Barkas y col., 1987) y los residuos 67-76 de la subunidad a de músculo humano (Tzartos y col., 1988; Saedi y col., 1990). 5.5 Otros lugares de relevancia funcional. La síntesis de AcChR en retículo endoplásmico, va seguida de ciertas modificaciones post-traduccionales, que de diferentes formas afectan su funcionalidad . Son en general poco conocidas y entre las más importantes destacan : la separación proteolítica de las secuencias señal en el extremo aminoterminal (Anderson y Blobel, 1983); la unión covalente a ácidos grasos (Olson y col ., 1984); las metilaciones (Ochoa y col ., 1989); la unión de iones Cae+ (Chang y Newmann, 1976) y, finalmente, la glicosilación y la fosforilación, procesos mejor conocidos. 5.5.1 Glicosilación. Las cuatro cadenas polipeptídicas del AcChR son glicoproteínas en todas las especies estudiadas (Figura 2). La glicosilación afecta a un total de setenta y cinco residuos de hidratos de carbono por molécula de receptor (Raftery y col ., 1980) . Contienen manosa, galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina y ácido Nacetilsiálico, que pueden ser eliminadas cuantitativamente sin que se produzca

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pérdida de función. La síntesis "in vitro" de las cadenas polipeptídicas que componen el AcChR, a partir de sus mRNA, no produce receptores activos, indicando que la secuencia aminoacídica no es suficiente para el ensamblamiento correcto de las subunidades y su posterior inserción en la membrana . La inhibición de la glicosilación del AcChR durante su biosíntesis, así como la mutación en la subunidad a del resto aminoacídico Asp-141, posible sitio de glicosilación, previene la síntesis de AcChR funcional (Mishina y col., 1985) . La diferente glicosilación de las subunidades a incrementa aún más la no equivalencia de las mismas en lo que se refiere a la unión de ligandos, como MBTA, bromoacetilcolina, etc. 5.5.2 Fosforilación . Todas las subunidades presentan distintos sitios de fosforilación localizados principalmente en el dominio intracitoplasmático (Figura 2) que conecta las regiones transmembrana M3 y M4, existiendo un total de siete grupos fosfato en la molécula del AcChR (Huganir y Racker, 1982; Schroeder y col ., 1991) . Se han identificado cuatro proteínas quinasas que se encuentran íntimamente asociadas con las membranas procedentes del órgano eléctrico de Torpedo: proteína quinasa dependiente de calcio/calmodulina, proteína quinasa A dependiente de AMPc, proteína quinasa C dependiente de calcio/fosfolípidos, que fosfonlan el AcChR en residuos de serina y/o treonina, y la proteína quinasa específica de tirosina. La proteína quinasa A fosforila las subunidades y y 8, mientras que la proteína quinasa C fosforila las subunidades a y8. A partir de la secuencia primaria de las subunidades del AcChR en T.californica, se ha encontrado un número total de siete posibles sitios de fosforilación en el AcChR, algunos de los cuales se encuentran fosforilados en las preparaciones de AcChR nativo. Estos sitios se encuentran localizados en el mayor segmento citoplasmático del receptor, que conecta las regiones M3 y M4 transmembrana (ver modelo 4 hélices en figura 3). Se ha propuesto que la fosforilación en éste área específica podría regular la interacción de las subunidades con el citoesqueleto y afectar a la localización del AcChR en la membrana (Miles y Huganir, 1988). Alternativamente se ha postulado que la fosforilación del receptor podría modular propiedades del canal iónico como tiempo de apertura del canal, conductancia, selectividad o la velocidad de desensibilización (Miles y Huganir, 1988; Reuhl y col ., 1992). Por otra parte, también podría regular propiedades del receptor como son su localización y estabilización en la sinapsis (Changeux y col., 1984).

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Mediante experimentos de reconstitución de AcChR puríficado y fosforilado con proteína quinasa dependiente de AMPc, y analizando la actividad de estos receptores mediante técnicas de cinética rápida (Hess y col., 1982b), se ha comprobado que la velocidad de transporte iónico no depende de la fosforilación del receptor, si bien la velocidad de desensibilización es de 7 a 8 veces más rápida en el receptor fosforilado (Huganir y col., 1986). Estos resultados sugieren que los dominios intracelulares de las subunidades Y y 8, fosforilados por proteína quinasa dependiente de AMPc, estarían implicados en el proceso de desensibilización del AcChR. Este incremento en la velocidad de desensibilización parece deberse a un desplazamiento de la curva de inactivación del AcChR en función de la concentración de agonista, hacia concentraciones menores del mismo, lo que indica una posible regulación fina en la activación e inactivación del AcChR mediante la fosforilación de uno o varios residuos de serina, treonina o tirosina (Ferrer-Montiel y col., 1991, Díaz y col ., 1992). Se observó asimismo que la fosforilación del AcChR activaba la apertura del canal en "ausencia" de agonista (Ferrer-Montiel y col ., 1991) . Estos resultados son compatibles con la idea de que la fosforilación produzca un efecto similar al de un "ligando intracelular covalente", siendo entonces los sitios de fosforilación, auténticos lugares de unión a ligandos citoplasmáticos. Este mecanismo de regulación fina en la activación e inactivación del AcChR podría tener diferente eficacia dependiendo de la subunidad que se fosforile, y por tanto, es posible que la respuesta funcional del AcChR dependa de qué sitios sean fosforilados (Ferrer-Montiel y col., 1991). El papel de la fosforilación del AcChR por proteína quinasa C o tirosina proteína quinasa no ha sido aún determinado, si bien, debido a que los sitios de fosforilación están localizados en regiones comunes de las diferentes subunidades, la fosforilación del receptor por cualquiera de las proteínas quinasas podría modular de manera similar la velocidad de desensibilización del AcChR (Huganir y col ., 1984 ; Hofer, 1996) . 5.5.3 Grupos sulfhidrilo Desde que Karlin y Bartels (1966) demostraron que el AcChR posee residuos sulfhidrilo y disulfuro se han hecho considerables progresos en el estudio de éstos, documentándose bien los efectos producidos por agentes reductores, oxidantes y alquilantes. La oxidación o alquilacion de los grupos sulfhidrilo libres en estado nativo no afecta a las propiedades del receptor según se ha comprobado mediante estudios de velocidad de unión de a-neurotoxinas al AcChR.

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Asimismo, la reducción con DTT disminuye la afinidad del AcChR por el agonista (Walker y col ., 1981) ; este efecto es totalmente reversible, de hecho se revierte al tratar el receptor con agentes oxidantes (Moore y Raftery, 1979; Barrantes y col., 1980). Estos hechos sugirieron que el DTT reduce un enlace disulfuro (o varios) que provoca una alteración en la conformación de la molécula del receptor . Utilizando preparaciones de electroplaca de Torpedo, se descubrió un puente disulfuro localizado cerca del sitio de unión a agonistas que puede ser reducido o reducido y alquilado dando lugar a una inhibición temporal o permanente de la respuesta a agonistas colinérgicos (Karlin y col., 1966) . Estos efectos sé revierten al tratar la electroplaca reducida con agentes oxidantes, excepto cuando se alquila la electroplaca reducida, lo que sugiere que el receptor se altera irreversiblemente al alquilar los grupos sulfhidrilo formados por reducción del disulfuro crítico. Este puente disulfuro se considera el responsable de la alteración en la discriminación de ligandos y, de la formación de estados modificados del AcChR. Se ha identificado que son las subunidades a, de 40 Kd de peso molecular las que presentan este disulfuro entre las cisteinas 192-193, a un nm del sitio de unión de agonistas (Kellaris y Ware, 1989). El agonista carbamilcolina protege el disulfuro cercano al sitio de unión a agonistas de la reducción, tanto en el estado activo como en el desensibilizado, modificando la velocidad de reducción (Damle y Karlin, 1980 ; Barrantes y col., 1980). Esta protección no es debida a un impedimento estérico, sino mas bien a un cambio conformacional local inducido por el agonista, cuya magnitud aumenta al incrementar la potencia del mismo . Debido a los diversos efectos de agentes alquilantes y reductores en la función del receptor, tanto los enlaces disulfuro como los grupos sulfhidrilo han recibido mucha atención ; además del sulfhidrilo situado en la vecindad del sitio de unión a ligandos en la subunidad a, las otras subunidades también tienen puentes disulfuro y grupos sulfhidrilo que han sido estudiados. Las subunidades a, p, y y S contienen 7, 5, 8 y 6 residuos de cisteina (Moda y col ., 1983). Kellaris y Ware (1989), demostraron que hay 2, 1, 1 y 1 cistina intramolecular en cada una de las subunidades a, R, Y y 8, ademas de el puente disulfuro intermolecular entre las cys 500 en las subunidades 8 de dos monómeros, en el dímero nativo de Torpedo (Dipaola y col ., 1989). El resto de las cisteinas se hallan como grupos sulfhidrilo libres en el receptor nativo. De los siete residuos de cisteina que posee la subunidad a se han identificado dos cistinas intramoleculares 128-142 y 192-193 y una cisteina libre, cys 222, localizada en el segmento hidrofóbico MI, que contiene una

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cisteina homóloga, cys 241, conservada en las cuatro subunidades del AcChR (Marquez y col ., 1989) . Las dos cisteinas restantes, 412 y 418, no se encuentran como sulihidrilos libre, lo que lleva a especular que estos dos residuos o bien forman un puente disulfuro o bien forman tioesteres con la bicapa (Mosckovitz y Gershoni, 1988). Recientemente se ha visto que la cistina intramolecular formada entre las Cys 128 y 142, es común a todas las subunidades y contribuye en el proceso de ensamblaje del AcChR de modo distinto en cada subunidad (Fu y Sine, 1996) . Asimismo, la ruptura del puente disulfuro en la subunidad a, evita la formación de los dos sitios de unión a agonistas (Walcott y Sumikawa, 1996). 6. INTERACCIÓN DEI, AeChR CON OTROS COMPONENTES DE MEMBRANA. 6.1 Proteínas. El AcChR se encuentra en altas concentraciones en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular, donde su densidad es de 10.00020.000 moléculas por ¡,m2 (Conti-Tronconi y Raftery, 1982), mientras que fuera de la zona de sinapsis es 500 veces menor (Mathews-Bellinguer y Salpeter, 1978; Changeux y col., 1984). Los mecanismos moleculares responsables del mantenimiento de esta distribución no están completamente definidos; sin embargo, se sabe que están implicadas proteínas del citoesqueleto de la célula postsináptica; siendo las más importantes las conocidas como v (vI, v2, v3) que copurifican con el receptor . Así, estudios de microscopía electrónica revelan la presencia de un material denso en el lado citoplasmático de la membrana, con una distribución que asemeja a la del AcChR, (Sealock y col ., 1984) (Figura 2) . Por otra parte, el tratamiento de vesículas de membrana obtenidas a partir de electrocitos de T marmorata con una solución alcalina (pH 11), o su exposición a agentes caotrópicos (Neubig y col . ; 1979 ; Sealock y col ., 1984), solubiliza el material postsináptico denso a los electrones y provoca una mayor difusión lateral (Barrantes y col ., 1980) y rotacional (Rousselet y col., 1982) del AcChR sin que se produzcan otros efectos en las demás propiedades del receptor ( Changeux y col., 1984) . La proteína más abundante en los extractos alcalinos de las membranas postsinápticas de electrocitos de T. marmorata es vI, tiene un peso molecular de 43 kDa. Es una proteína periférica de membrana localizada en la cara citoplasmática de ésta, claramente diferenciada de la actina (Burden y col., 1983) . Se encuentra en concentraciones similares al AcChR y no es esencial para la apertura del canal iónico activado por acetilcolina . Aunque a esta

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proteína se le han asignado diversas funciones en la sinapsis, ninguna de ellas se ha demostrado . La hipótesis más atractiva consiste en que la proteína de 43K interacciona directamente con el AcChR con objeto de anclar al receptor en la membrana postsináptica y, asi, mantener una alta concentración de receptores cerca de los sitios de liberación del neurotransmisor (Conti-Tronconi y Raftery, 1982 ; Gysin y col., 1987; Maimone y Merlie, 1993) . En experimentos de reconstitución de la proteína de 43K marcada con 125 1, en liposomas de composición definida, se ha demostrado que esta proteína se une estrechamente a los liposomas y que esta unión se puede revertir por tratamiento alcalino a pH 11 . Esta disociación podría ocurrir como consecuencia de una repulsión de cargas entre la proteína y los lípidos, ya que la proteína 43K tiene un pl de 8, por lo que adquiere carga neta negativa conforme varía el pH de 7 a 11 . Estos resultados indican que las moléculas de 43K son anfipáticas y que interaccionan entre sí y con los lípidos que las rodean . 6.2 Lípidos Con el fin de analizar las interacciones específicas que pueden existir entre los componentes lipídicos y proteicos, tanto a nivel estructural como funcional, se han utilizado una gran variedad de aproximaciones fisicoquímicas, bioquímicas y químicas. Así, técnicas tales como el dicroismo circular (Moore y col ., 1974), resonancia magnética nuclear (Griffith y col., 1982), espectroscopía de fluorescencia (London y Feigenson, 1981 ; Pink y col ., 1984 ; González-Ros y col ., 1983 ; Antollini y col ., 1996), resonancia de spin electrónico (Dreger y col., 1997) y espectroscopia infrarroja (Ryan y col., 1996 ; Fernández-Ballester y col ., 1994) han contribuido notablemente al conocimiento de las propiedades generales de las membranas biológicas. Estas técnicas pueden ser empleadas en el estudio de las interacciones lípido-proteína en el seno de una membrana biológica siempre que se disponga de una fracción de membranas altamente enriquecida en la proteína de interés o que sea posible purificar y reconstituir esta proteína en un medio lipídico conocido. A partir de los resultados obtenidos se ha concluido que los lípidos de membrana no son sólo un componente estructural de la compartimentación celular, sino que también constituyen un elemento funcionalmente importante involucrado en la modulación de algunas funciones biológicas de las proteínas de membrana (Heidmann y col., 1980; González-ros y col., 1992; Zanello y col., 1996 ; Ryan y col., 1996 ; Dreger y col., 1997). De todos modos, no se han propuesto hipótesis generales que expliquen a nivel molecular las interacciones que puedan existir entre las proteínas y los lípidos que las rodean.

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Se ha caracterizado químicamente la composición lipídica de membranas ricas en AcChR, obtenidas a partir de electrocitos de T.californica (GonzálezRos y col., 1982), obteniéndose una relación lípido/proteína de 1 .40 peso/peso, lo que viene a suponer que por cada molécula hay 400-500 moléculas de lípido. La relación fosfolípido/colesterol, 1 .10 mol/mol, indica una extraordinaria abundancia de colesterol en estas membranas, siendo éste el principal componente de la fracción de lípidos neutros . Los fosfolípidos más abundantes en las membranas procedentes de tejido eléctrico son fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y fosfatidilserina, constituidos por ácidos grasos de cadena larga y de alto grado de insaturación. En menor proporción se encuentran cardiolipina, ácido fosfatídico, esfingomielina y lisofosfatidilcolina. En el estudio de las interacciones lípido-proteína en sistemas de membrana son de gran utilidad las técnicas de reconstitución desarrolladas, ya que permiten modificar los elementos que constituyen una membrana, posibilitando así definir el número mínimo de componentes de la misma absolutamente necesarios para realizar una determinada función y estudiarla libre de las influencias de cualquier otro proceso de membrana . Al ser el AcChR un sistema modelo de proteína integral de membrana, del que se dispone de abundante información estructural y funcional, su reconstitución en vesículas artificiales de composición definida con retención de sus características, junto con el desarrollo de técnicas sensibles para medirlas, constituyen un sistema modelo para el estudio de la dependencia de parámetros estructurales y funcionales del AcChR con las propiedades fisico-químicas de la matriz lipídica que lo contiene . Con los experimentos de reconstitución de AcChR en vesículas lipídicas de composición definida se ha comprobado, i) la elevada concentración lipídica necesaria para reconstituir eficazmente el AcChR (Criado y col., 1982 ; Paraschos y col ., 1982 ; Criado y col., 1984 ; Fong y McNamee, 1992). ii) la necesidad de colesterol para el mantenimiento de las transiciones entre estados del AcChR (Criado y col., 1982 ; Paraschos y col., 1982 ; Criado y col., 1984 ; Artigues y col., 1989) y de las propiedades de traslocación de iones (Dalziel y col., 1980 ; Fernández y col., 1993) y iii) el efecto de lípidos específicos en la modulación de las propiedades de transporte iónico (Ochoa y col., 1983 ; Fong y McNamee, 1986 ; Sunshine y McNamee, 1992 ; Barrantes y col., 1993 ; Blanton y Cohen, 1994). Mediante diversos experimentos se ha comprobado que los lípidos de membrana interaccionan de forma diferenciada con el receptor nicotínico de acetilcolina, demostrándose que aquellos que tienen mayor afinidad por el receptor son también los que tienen mayores efectos sobre la función del

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mismo (Ellena y col., 1983). La existencia de diferencias cualitativas y cuantitativas en las propiedades de flujo iónico del receptor sugieren un papel modulador de determinados lípidos (Fong y McNamee, 1986); de esta forma el colesterol y los lípidos cargados negativamente, tales como el ácido fosfatídico, son necesarios para mantener esta actividad (Ochoa y col ., 1983 ; Criado y col., 1984). Por el contrario, los ácidos grasos libres e instaurados inhiben el flujo iónico del canal asociado al AcChR (Andreasen y McNamee, 1977, 1980), lo que puede ser atribuido a la perturbación de interacciones funcionalmente importantes entre el receptor y el colesterol y/o los lípidos cargados negativamente . De modo análogo, la desensibilización del receptor nicotínico de acetilcolina que, al igual que la apertura del canal iónico implica cambios conformacionales, viene determinada por el entorno lipídico . De esta forma se ha podido comprobar que la capacidad del receptor nicotínico para sufrir transiciones entre estados de alta y baja afinidad inducidos por ligandos puede verse afectada por las propiedades dinámicas del entorno lipídico y por la composición del mismo (Lindstrom y col ., 1980 ; Ryan y col., 1996). En relación con el colesterol, se ha demostrado que la presencia de colesterol constituye un requerimiento esencial para la correcta actividad del canal iónico asociado al receptor, así como para las transiciones entre distintos estados de afinidad inducidas por agonistas (Criado y col ., 1982; Jones y col., 1988). Se ha propuesto una hipótesis (fluidez óptima) basada en la aparente correlación entre la presencia de colesterol, la modificación de la fluidez de la membrana y la alteración de las propiedades del AcChR (Fong y McNamee, 1986). Por el contrario, hay también evidencias en favor de una interacción directa entre colesterol y AcChR. Esta segunda hipótesis se sugirió en primer lugar con estudios en los que se utilizaban sondas esteroideas con marcaje de espín (Marsh y Barrantes, 1978 ; Ellena y col ., 1983 ; Devaux y Seigneuret, 1985) . Más tarde, con estudios de apagamiento de fluorescencia usando un análogo esteroideo bromado, se predijo que la porción transmembrana del AcChR poseía dos lugares de unión a lípidos, diferentes. Estos lugares de unión se diferenciaban únicamente en la distinta afinidad para fosfolípidos o para colesterol . Así, los lugares "no anulares" (5-10 por monómero de AcChR) serian inaccesibles para los fosfolípidos y tendrían una afinidad 20 veces mayor por el colesterol que los lugares "anulares" (45 por monómero), que estarían ocupados mayormente por fosfolípidos (Dones y col ., 1988) . El efecto modulador del colesterol sobre la actividad del AcChR, se correlaciona con un efecto modulador del colesterol sobre la estructura secundaria del AcChR, tal y como revelan las modificaciones detectadas sobre la banda amida 1 mediante

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espectroscopia infrarroja. Además, la presencia del colesterol parece indispensable para poder observar el aumento de estabilidad térmica que experimenta el AcChR en presencia de agonistas colmérgicos ( González-Ros y col ., 1992; Fernández-Ballester y col., 1994; Fernández y col., 1993) . Estos resultados indican que los efectos del colesterol podrían estar mediados por mecanismos más complejos que la simple alteración de las propiedades de membrana . De todos los resultados obtenidos hasta el momento se deduce que el entorno lipídico es fundamental para el mantenimiento estructural y/o funcional del receptor nicotínico de acetilcolina (Ryan y col., 1996). Los lípidos de membrana posiblemente intervienen a nivel de la alteración de las propiedades dinámicas de la membrana y/o a nivel de una posible interacción directa con las proteínas que en ella se incluyen. 7. RECONSTITUCIÓN.

La purificación y caracterización de proteínas de membrana, presenta varias dificultades que no se hallan presentes al trabajar con proteínas solubles . Estas proteínas se hallan íntimamente asociadas a la bicapa lipídica, son insolubles en agua y requieren el uso de detergentes, tanto para su solubilización como para su posterior purificación. Las técnicas utilizadas para liberar a las proteínas integrales de membrana de su entorno, destruyen la estructura de la membrana nativa haciendo necesario comprobar que la función de la proteína no se altera durante el proceso de solubilización y purificación . Con éste fin, se reincorpora la proteína purificada en una estructura de membrana, a éste proceso se le llama reconstitución. En términos físico-químicos, la solubilización se podría definir como la preparación de una disolución isotrópica, termodinámicamente estable, de una sustancia normalmente insoluble en un disolvente dado, mediante la introducción de uno o varios componentes anfipáticos adicionales (Litchtenberg y col ., 1983). En el caso de membranas biológicas dichos componentes son los detergentes. Los detergentes poseen la capacidad de formar estructuras llamadas micelas, que pueden definirse como agregados coloidales termodinámicamente estables, que se forman espontáneamente a partir de cierta concentración de sustancias anfipáticas conocida como la concentración micelar crítica (CMC), a temperaturas superiores a la temperatura micelar crítica . Por debajo de la CMC los detergentes se dispersan en su forma monomérica . Las micelas son conjuntos de moléculas que presentan las zonas hidrofilicas hacia la superficie,

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en contacto con el agua y las zonas hidrofóbicas hacia el interior evitando el contacto con el agua. La CMC es una característica de cada detergente y depende de una serie de factores del medio en que se encuentra tales como el pH, la temperatura o la fuerza iónica. Una consecuencia directa de esto es que los detergentes con CMC alta se eliminan con más facilidad mediante diálisis, que aquellos con baja CMC. La eliminación del detergente es un paso clave en la reconstitución de una proteína (Helenius y col., 1979; Lévy eta al ., 1990) . El proceso de solubilización de una membrana consta de tres fases (Rigaud y col., 1988) . En la primera fase el detergente se distribuye entre la bicapa y el medio acuoso, hasta saturarla. En la segunda fase, se produce una solubilización gradual del lípido dando lugar a micelas mixtas de lípidodetergente y bicapas saturadas de detergente. La tercera fase se caracteriza por la completa solubilización de los lípidos, se da una total conversión de la bicapa en micelas mixtas detergente-lípido . Para realizar éste proceso de solubilización es necesario añadir la suficiente cantidad de detergente, si bien, más importante que el ajuste de la concentración del detergente, es el ajuste de la relación detergente/lípido en la membrana (Schurholz, 1996). La reconstitución de una proteína integral de membrana mediante eliminación del detergente se lleva a cabo por distintos mecanismos, dependientes de la naturaleza del detergente empleado . La orientación de la proteína en los proteoliposomas resultantes depende del mecanismo de incorporación ; se dan principalmente dos mecanismos : i) la proteína participa en el proceso de formación de la membrana, que corresponde a la transición de fase de una solución micelar a una fase lamelar. ii) los liposomas se forman primero por eliminación parcial del detergente y después de esto, la proteína se incorpora en los liposomas preformados (Paternostre y col ., 1988) . El éxito de un proceso de solubilización, purificación y reconstitución viene determinado en gran medida por la elección del detergente; este debe solubilizar, pero no desnaturalizar a la proteína . Los requisitos de un detergente para la solubilización pueden ser totalmente diferentes de los necesarios para la reconstitución de la proteína . Otra consideración a tener en cuenta a la hora de escoger un detergente, es que éste puede interferir con los posteriores ensayos a realizar en el material solubilizado. Algunos detergentes contienen altos niveles de fosfatos, que afectan seriamente a los análisis lipídicos, otros detergentes presentan absorbancia a 280 nm, que dificulta la determinación de proteína . En ocasiones el detergente puede interferir con uno o más componentes de la mezcla de ensayo, por ejemplo secuestrando ligandos .

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La ausencia de lípidos en las membranas biológicas inactiva la mayoría de las proteínas de membrana, incluso en presencia de detergente. No está claramente definido qué lípidos ofrecen mayor protección sobre el AcChR (Ochoa y col ., 1983) . Este, se ha reconstituido con éxito utilizando octilglucósido con lípidos nativos de T. marmorata, pero se inactiva al utilizar octilglucósido con lípidos de asolectina (González-Ros y col ., 1980, 1981 ; Anholt y col., 1981 ; Paraschos y col. 1982; Huganir y Racker, 1982) . Se apunta la posibilidad de que el éxito de detergentes como CHAPS, colato o digitonina en la conservación de actividad del AcChR, se deba a la capacidad de dichos compuestos de sustituir al colesterol, en la estabilización de la estructura del AcChR (Jones y col ., 1987; Schurholz, 1996). La reconstitución del AcChR "in vitro", permite la investigación de su función controlando las concentraciones de lípido y proteína en la membrana reconstituida . Además, el AcChR puede ser modificado bioquímicamente antes o después de la reconstitución, y los efectos de estas modificaciones en su función pueden ser estudiadas en la membrana reconstituida (Miller, 1983). Hay, principalmente, dos modelos de reconstitución en membranas artificiales : bicapas lipídicas planas y liposomas. En general, las bicapas planas se han utilizado para medidas de corriente eléctrica a través del canal, mientras que los liposomas, se han utilizado para medidas bioquímicas del flujo de iones. 7.1 Reconstitución del AcChR en vesículas lipídicas. Las vesículas reconstituidas son un método ideal para: estudiar flujos iónicos transmembrana, analizar el efecto lipídico en las propiedades moleculares del AcChR, estudiar el efecto de modificaciones químicas en el receptor, y caracterizar las interacciones lípido-proteína. Además el AcChR, al ser una de las proteínas transmembrana mejor conocidas, sirve para estudiar los principales problemas de la reconstitución . La reconstitución de proteínas de membrana en liposomas puede realizarse de varios modos (Miller, 1984), pero generalmente, el método más aplicable es el de eliminación del detergente (Eytan, 1982; González-Ros y col ., 1980 ; Epstein y Racker, 1978). La proteína de membrana, previamente solubilizada, se combina con lípido exógeno en presencia de un detergente a concentración inferior a su CMC, para preservar la integridad del canal; la afinidad de los lípidos por el receptor debe ser mayor que la afinidad del detergente por éste . Las proteínas en esta solución micelar se fraccionan por diversos procedimientos bioquímicos. Las fracciones de proteína purificada, todavía en exceso de lípido, se someten a procesos de eliminación del

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detergente. La diálisis (Milsman y col ., 1978 ; Patemostre y col., 1988) es el método más directo, aunque también se emplean técnicas de filtración en gel (Huganir y Racker, 1982 ; Lévy y col ., 1990) y técnicas de dilución. La eliminación del detergente fuerza a los lípidos y a las proteínas de membrana a autoensamblarse en una nueva estructura micelar o liposoma, con la proteína de membrana insertada de un modo termodinámicamente correcto, esto es, con la superficie hidrofóbica en contacto con la región hidrocarbonada de la bicapa, y su área hidrofilica en contacto con las dos fases acuosas a ambos lados de esta bicapa. El 95 % del AcChR reconstituido se orienta con los sitios de unión de agonistas en la cara externa de las vesículas (Hartig y Raftery, 1979; Paraschos y col ., 1982). El número de receptores que contienen las vesículas, el volumen interno por AcChR en estas vesículas y la orientación del receptor reconstituido, son parámetros variables que pueden estar influidos por la composición lipídica de la membrana y el tipo de detergente utilizado . El método más frecuentemente utilizado para separar los liposomas con el AcChR incorporado, de aquellos que no lo contienen, consiste en pasar los liposomas por una columna de afinidad de lectina inmovilizada (Lindstrom y col ., 1980). La determinación de la orientación del AcChR se suele hacer midiendo la unión a 125 -1-a-Bgt en ausencia y en presencia de detergentes que exponen los sitios internos de las vesículas a la 125 -1-a-Bgt (Anholt y col., 1981 ; Ochoa y col ., 1983 ; Criado y col., 1984). Los liposomas formados por éste mecanismo son de una gran variedad de tamaños y composiciones. Estas variaciones dependen más del detergente y del procedimiento utilizado para eliminarlo que de la composición lipídica. Así, el colato da lugar a liposomas de un tamaño menor que los formados en presencia de octilglucósido . La eliminación del detergente por diálisis o . filtración en gel produce liposomas menores que aquellos formados eliminando el detergente por adsorción, aunque la velocidad de eliminación del detergente durante la diálisis influye en el tamaño, así como en que las vesículas sean un¡ o multilamelares . Estos liposomas que contienen AcChR intacto deben exhibir una traslocación de cationes, activada por los agonistas y dependiente de la concentración, que puede ser bloqueada por inhibidores conocidos como a Además, la preincubación con neurotoxinas y d-tubocurarina . neurotransmisores debe prevenir la apertura del canal indicando la desensibilización de éste . El estudio de la función del AcChR en liposomas se halla restringido por varios factores que limitan la magnitud del flujo iónico : la desensibilización,

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proceso intrínseco del AcChR, y la velocidad a la cual los iones se equilibran entre el interior y el exterior de las vesículas. El tamaño de las vesículas tiene un papel importante en éste último punto porque la velocidad de flujo es proporcional al número de moles de AcChR por litro de volumen interno, y la magnitud de la respuesta depende directamente del tamaño de la vesícula . Las vesículas con un volumen interno pequeño alcanzan rápidamente el equilibrio con el exterior, y esto complica las medidas de velocidades iniciales de flujo iónico. El principal problema en la medida de flujo de iones radiactivos en liposomas con el receptor incorporado es la escala de tiempo a la cual tiene lugar éste proceso . Un liposoma de 100 nm de diámetro con un sólo canal activo, estará completamente lleno en pocos milisegundos . Para separar los liposomas del medio externo radiactivo se requieren 1-10 s, por lo tanto el ensayo de flujo de 10 s no mide la velocidad de entrada de iones en el liposoma a través del AcChR. Esta medida indicará el número de liposomas en los que se ha abierto un canal al menos una vez. Este ensayo, permite obtener información sobre los canales, de tipo cualitativa, pero no cuantitativa. 7.1.1 Uso de técnicas de congelación-descongelación para aumentar el tamaño de los liposomas Una proteína con actividad de canal fónico puede ser aislada, purificada, modificada y reconstituida en una vesícula lipídica . Esto, da lugar a un sistema de membrana bien caracterizado, en el cual las propiedades bioquímicas de la proteína pueden controlarse fácilmente . Por otro lado, las técnicas de patchclamp poseen la sensibilidad necesaria en medidas de transporte iónico para discriminar cambios en la proteína a nivel de canal único. Tank y Miller (1983), describieron un método que combina estas dos técnicas complementarias transformando las pequeñas vesículas lipídicas formadas mediante diálisis del detergente, en liposomas grandes. Este método se basa en aumentar el tamaño de las vesículas lipídicas mediante un ciclo de congelación-descongelación, esto es, congelar rápidamente varias veces las vesículas en nitrógeno líquido y descongelarlas lentamente a 4°C. Estos ciclos parecen inducir la fusión entre liposomas dando lugar a liposomas de hasta 1030 pm de diámetro, accesibles a la técnica de patch-clamp. Este sistema se ha probado con escasas preparaciones de membrana. Son necesarias composiciones lipídicas determinadas para que se produzca la fusión con éste ciclo de congelación-descongelación. Hay sólo un pequeño número de trabajos hechos con esta técnica.

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7.2 Reconstitución del AeChR en bicapas planas Las bicapas lipídicas planas, se forman a partir de dos monocapas que se unen por su parte hidrofábica para formar una bicapa con la proteina de interés incorporada. Estas bicapas pueden formarse a través de aperturas en una cámara de teflón (Montal y Mueller, 1972; Montal, 1974 ; Montal y col ., 1981 ; Grove y col ., 1994; Montal, 1995), o bien en la punta de una pipeta de patch (Suarez-Isla y col., 1983). En ambas modalidades, el número de AcChRs incorporado en la bicapa se puede variar diluyendo las vesículas reconstituidas de partida con liposomas sin proteína (Shindler y Quast, 1980). Se ha descrito que las propiedades del canal incorporado dependen de las propiedades superficiales de la monocapa y de la composición lipídica de las vesículas reconstituidas . Son necesarias dos condiciones para que el AcChR conserve su integridad funcional durante la reconstitución : 1) Presencia de colesterol, que parece ser que estabiliza el canal. 2) La presión superficial de la monocapa debe ser 30 dyn/cm2 . La cantidad de AcChR presente en las vesículas lipídicas de partida, que se incorpora en la monocapa, se puede determinar mediante estudios de unión a 125 1-a-Bgt . El AcChR reconstituido en bicapas planas conserva los fenómenos asociados al AcChR en membranas nativas, esto es, la activación y desensibilización en presencia de agonistas colinérgicos. Asimismo, la conductancia de membrana activada por el agonista, aumenta con la concentración de éste y es inhibida por el antagonista d-tubocurarina y por aBgt. (Nelson y col., 1980; Labarca y col., 1984 ; Montal y col ., 1984) . 7.2.1 Bicapa formada a través de una apertura. Este método de formación de bicapas se lleva a cabo en una cámara con dos compartimentos separados por una película de teflón (se usa éste material debido a su flexibilidad), en cuyo centro existe un orificio. Las cámaras se llenan con el tampón indicado en cada caso, y se induce la formación de una monocapa lipídica en cada compartimento . Existen vanos modos de inducir la formación de una monocapa lipídica (Montal y Mueller, 1972 ; Schindler y col., 1980 ; Grove y col., 1994) cada uno de ellos presenta ventajas e inconvenientes, por lo tanto son muchos los factores a tener en cuenta a la hora de escoger el método que se ajusta más a las condiciones requeridas por una determinada proteína . A partir de ambas monocapas, elevando sucesivamente los niveles de tampón sobre el orificio, se produce la formación de una bicapa en éste, y azarosamente la inserción de la proteína en ella. Cuando se pretende construir bicapas asimétricas, en el compartimento que ha de contener el AcChR (cis), se colocan las vesículas con éste incorporado y en el compartimento que ha de dar

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lugar a la bicapa lipídica sin proteína (trans), se añaden liposomas sin AcChR. Para la formación de bicapas simétricas se aplica el mismo protocolo en ambas cámaras . La formación de la bicapa a través de la apertura de teflón se sigue continuamente midiendo la capacitancia de la membrana.

Entre las ventajas de éste sistema se encuentran, su resolución, que es suficiente para medir con alto grado de precisión las corrientes iónicas que fluyen a través del AcChR, la accesibilidad a ambos lados de la membrana

reconstituida y la posibilidad de mantener el voltaje constante . Entre las

desventajas se hallan : la probabilidad de que queden restos de solventes que dañen a la proteína que se ha de insertar en la bicapa, el poco control que se

tiene sobre la inserción de las proteínas en la bicapa (Miller, 1983), y la

imposibilidad de realizar medidas bioquímicas y eléctricas en la misma muestra . 7.2.2 Reconstitución del AeChR en una bicapa en la punta de una pipeta de

patch.

El proceso de formación de monocapas en la interfase aire-agua en la

punta de la pipeta, es análogo al proceso de formación de las dos monocapas en

la interfase aire-agua a través de una apertura de Teflón. Las monocapas lipídicas se derivan de, vesículas reconstituidas de AcChR y la pipeta de patch

se introduce en la cámara con una presión positiva para evitar su oclusión . Al sacar la pipeta de la solución, la cabeza de los lípidos polares de la monocapa

es atraída por el cristal polar de la pipeta y las colas hidrocarbonadas contactan con el aire. La pipeta, vuelve a sumergirse en la solución y se forma la bicapa en la punta de la pipeta . Con éste método se obtienen con frecuencia bicapas que no contienen AcChR incorporado, y es necesario volver a intentarlo de

nuevo. Una gran ventaja de éste método con respecto a la formación de bicapas

en apertura de Teflón, es que al ser menor el diámetro de la pipeta, el número de receptores incorporados es mucho menor. Esto simplifica muchísimo los análisis de registro de canal único. Otra ventaja adicional, es el hecho de que la

relación señal-ruido es mucho mayor en la bicapa en la punta de una pipeta. No está todavía establecido si el paso por la interfase aire-agua puede dañar o modificar de algún modo el canal iónico .

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Objetivos

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II OBJETIVOS

El receptor nicotínico de acetilcolina es una de las proteínas de membrana mejor conocidas y caracterizadas . Desde que se dispuso de AcChR en grandes cantidades, se han llevado a cabo estudios funcionales y estructurales mediante una amplia variedad de técnicas, que han descrito con detalle la activación y modulación del canal fónico y la correspondiente respuesta funcional, así como la composición polipeptídica, la disposición de las subunidades, la inserción en la bicapa, etc . No obstante, los estudios de la actividad del receptor a nivel de canal único, muestran valores de conductancia comprendidos en un amplio rango (16-80 pS), posiblemente debido a la utilización de una metodología variada, así como diversas fuentes de AcChR: Torpedo, Electrophorars, músculo de diversas especies, etc. Asimismo, se ha descrito que en el órgano eléctrico de Torpedo el receptor se encuentra predominantemente en forma dimérica, formando un puente disulfuro entre dos monómeros adyacentes (Chang y Bock, 1977 ; Hamilton y col., 1979), y por el contrario, en tejido muscular y en Electophonis el receptor se encuentra en forma monomérica (Lindstrom y Patrick, 1974). Sin embargo, no hay una información precisa acerca del comportamiento de los diferentes estados de agregación del AcChR. En trabajos anteriores se ha propuesto que las estructuras monomérica y dimérica

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Objetivos

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del receptor de tejido eléctrico de Torpedo marmorata, reconstituido en bicapas planas son funcionalmente diferentes (Schindler y col., 1984) . En cualquier caso actualmente se desconoce el significado funcional de ninguna de estas formas de agregación del AcChR. El presente trabajo se ha centrado en el estudio estructural y funcional de las formas monomérica y dimérica del AcChR, tanto en su ambiente nativo como purificado y reconstituido . Para llevar a cabo dichos estudios ha sido necesario : 1 . Poner a punto de un método de reconstitución de proteínas de membrana, en liposomas con tamaño comparable al de una célula que permiten la realización de medidas de corrientes iónicas de canal único, como es la técnica de patch-clamp, que será muy útil a lo largo de este trabajo. 2 . Obtener de modo controlado los distintos estados de agregación del AcChR, monomérico o dimérico, sin producir modificaciones estructurales importantes en el resto de la molécula. 3. Analizar mediante técnicas de criofractura las características morfológicas de ambas formas del receptor, con el fin de establecer una correspondencia entre los distintos agregados definidos del receptor y las imágenes a que dichos agregados dan lugar. 4. Estudiar mediante la técnica de espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-1R) los cambios producidos en la estructura secundaria de la proteína, durante el proceso de obtención de la forma monomérica de la misma. 5. Estudiar la capacidad funcional del AcChR en formas monomérica y dimérica, tanto a nivel del mantenimiento de sus propiedades de traslocar iones en respuesta a agonistas colinérgicos como en lo relativo a experimentar las transiciones distintos estados de afinidad inducidos por agonista, propias de la desensibilización del AeChR. Combinando los resultados obtenidos, se pretende elaborar una hipótesis sobre la importancia funcional de los diversos estados de agregación del receptor y así, profundizar en el conocimiento de las relaciones estructura/función en una proteína integral de membrana de importancia fisiológica, como es el AcChR .

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Materiales y Métodos

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III MATERIALES Y MÉTODOS

1 PURIFICACIÓN DE a-BUNGAROTOXINA A PARTIR DEL VENENO DE LA SERPIENTE BUNGARUS MUL TICINCTUS.

1.1 Cromatografía de intercambio iónico y filtración. La obtención de a-Bungarotoxina a partir del veneno de la serpiente Bungarus multicinctus, se realiza mediante el procedimiento descrito por Mebs y col., (1972), consistente en cuatro etapas consecutivas de cromatografias de intercambio iónico y de exclusión utilizando como material de partida veneno liofilizado. a. Cromatografla de intercambio iónico. En esta primera etapa se utiliza el intercambiador de cationes CM-Sephadex C-25 (Carboximetil Sephadex, tamaño de partícula 40-120 p.m). Se hidrata en agua durante al menos 48 horas y se empaqueta en columna de vidrio 40 x 1 .5 cm, dejándolo equilibrar con el tampón de partida (acetato amónico 0.05 M, pH 5 .8). Se disuelven 200 mg de veneno liofilizado en 2 ml de tampón acetato amónico 0.05 M, pH 5.8 y se aplican sobre la columna. Una vez depositada la muestra, la elución se lleva a cabo aplicando un gradiente de fuerza iónica y pH. El primer recipiente, que contiene 500 ml de acetato amónico 0.05 M, pH 5 .4, se conecta mediante un puente salino a un segundo recipiente que contiene 500 ml de acetato amónico

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0 .5 M, pH 7. En el primer recipiente se instala un agitador magnético para

permitir la mezcla adecuada de los dos tampones y obtener así un gradiente lineal continuo .

O 00 cV

cv c)

C cu

0.8 0 .6 0 .4

0.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fracción 11 Perfil de elución en columna de intercambio Figura fónico CM-Sephadex C-25 de a-Bungarotoxina procedente del veneno de la serpiente Bungarus multicinctus.

La elución comienza cuando se conecta el primer recipiente a la columna, y ésta al colector de fracciones . El flujo se mantiene a 30 mllh, recogiendo fracciones de aproximadamente 7 ml. La elución de la proteína se sigue

midiendo la absorbancia a 280 nm (Figura 11). Los tubos correspondientes al pico de la proteína mayoritaria (a-Bgt) se unen y se concentran mediante liofilización .

b. Cromatografia de filtración en gel. El desalado de la proteína se realiza

mediante Cromatografla de filtración . Para ello se utiliza el gel Sephadex G-25 (grano medio), que se equilibra en agua durante 12 horas y se empaqueta en una columna de 40 x 2 .5 cm . La muestra anterior se disuelve en 10 ml de agua, se aplica a la columna y se eluye con agua . La medida de absorbancia a 280 nm revela un pico mayoritario de toxina que eluye en el volumen muerto de la columna y que se concentra de nuevo mediante liofilización.

c. Segunda cromalografia de intercambio fónico. La muestra desalada y disuelta en acetato amónico 0 .05 M, pH 5 .8, se aplica a una nueva columna de intercambío iónico de las mismas características que la del apartado (a), sustituyendo el tampón final por acetato amónico 0.3 M, pH 7. Las fracciones que contienen el pico mayoritario de absorbancia a 280 nm (Figura 12) se unen

y se liofilizan ; seguidamente se resuspenden en 10 ml de agua para el siguiente desalado .

d Segunda cromatografta de filtración en gel. Nuevamente se eliminan las sales de la muestra, acetato amónico en este caso, mediante cromatografa de

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exclusión (b). La a-Bungarotoxina así purificada y desalada, se liofiliza y se guarda a -20°C hasta su uso .

1-1

c O

(ú .5. C (L3

.Q

Q

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fracción

Figura 12 Perfil de elución en columna de intercambio iónico CM-Sgphadex C-25 del pico de a-Bungarotoxina procedente de la columna del apartado b.

1.2 Cromatografía líquida de alta resolución . Un proceso alternativo de purificación de a-Bgt exenta de fosfolipasa A2 es el descrito en Ferragut y col. (1984). El pico de a-Bgt obtenido en la primera cromatografia de intercambio iónico por columna, se puede purificar directamente sometiéndola a cromatografia líquida de alta resolución (HPLC). Para ello, la fracción de a-Bgt obtenida en la cromatografia de intercambio iónico (apartado 1 . la), se dializa frente a agua durante 35 h. con tres cambios, utilizando bolsas de diálisis que tienen un limite de exclusión de 3000 Daltons. Se utiliza una columna de intercambio iónico CM60 (6 mm x 15 cm, IEX535CM, Altex), y se equilibra con tampón acetato amónico 150 mM, pH 5 (tampón de partida) a un flujo de 1 ml/min. Se cromatografian 100 p,l de la muestra con un gradiente lineal de acetato amónica 150 mM, pH 5, a acetato amónico 500 mM, pH 7, variando de modo lineal la fase móvil desde un 100% de tampón de partida hasta un 100% de tampón final en un tiempo de 45 minutos. Los cambios de absorbancia se monitorizan a 280 nm con un detector Beckman 163 acoplado a un registrador Spectra- Physics 4290. En estas condiciones, el tiempo de retención de la toxina purificada es de aproximadamente 16 minutos para cada ensayo. Los picos de a-Bgt se reúnen y se dializan frente a agua durante 24 h. A continuación se liofiliza y se resuspende en una solución acuosa conteniendo azida sódica al 0.02%. La concentración de la a-Bgt se determina midiendo la absorbancia a 280 nm (1

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mg/m1= 0.6 unidades de absorbancia) . La toxina se conserva liofilizada a -20° C. Todos los reactivos utilizados en la cromatografla líquida de alta resolución se desgasifican y se filtran previamente, a través de un filtro Millipore de 0.45 Im. 1.3 Marcaje de a-Bgt con isotiocianato de tetrametil rodamina

El procedimiento utilizado para el marcaje de la a-Bgt purificada, es el descrito por Ravdin y Axelrod, (1977). A 2.7 mg de a-Bgt disuelta en 3 ml de tampón bicarbonato sódico 90 mM, pH 9 .5 se añade 1 mg de isotiocianato de tetrametil rodamina (TMRITC) y se incuba a temperatura ambiente durante 90 minutos, en oscuridad. Con el fin de eliminar el exceso de fluoróforo, la mezcla de reacción se aplica en una columna Sephadex G-25 (2.0 x 25 cm), previamente equilibrada con agua desionizada. La elución se realiza con tampón fosfato pH 7,0; colectándose fracciones de 3 ml. La fracción que contiene la TMR-a-Bgt se determina midiendo la absorbancia a 550 nm. Las fracciones que presentan mayor absorbancia a 550 nm se unen y se aplican en una columna de intercambio iónico CM-Sephadex C-50 (2.0 x 25 cm). La columna se equilibra previamente con tampón fosfato sódico 3.3 mM pH 7.0 y la elución de la muestra se realiza, en primer lugar con 20 ml de tampón fosfato pH 7.0, y a continuación con un gradiente de fuerza iónica (160 ml de un gradiente lineal de NaCI 0-80 mM en tampón fosfato sódico pH 7,0), finalmente, se eluye con 40 ml de tampón fosfato pH 7 .0, NaCI 150 mM. Se colectan fracciones de 2.5 ml y se detecta la fracción, que contiene la TMR-aBgt midiendo la absorbancia a 550 nm. La TMR-a-Bgt así purificada se concentra mediante liofilización, resuspendiendose a continuación en 2 ml de agua desionizada. Con el fin de eliminar el exceso de sales, la muestra se aplica a una columna de filtración Sephadex G-25 (2.0 x 25 cm) y se eluye con agua desionizada. La detección de la TMR-a-Bgt, libre de sales se realiza medidas de absorbancia a 550 nm. Esta TMR-a-Bgt se concentra mediante liofilización tal y como se ha indicado anteriormente. La TMR-a-Bgt obtenida se disuelve en 3 ml de agua, y se almacena congelada a -20°C hasta su uso. 1.4 Pretratamiento de la 125I_a-bungarotoxina comercial para experimentos de unión de toxina al AcChR.

Con el fin de eliminar la BSA presente en la 1251-a-Bungarotoxina comercial, se realiza una cromatografïa de intercambio iónico. Se pesa 1 g. de

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DEAE-Sephadex (dietilaminoetil Sephadex intercambiador anionico) y se equilibra en agua durante 4 horas; se empaqueta en una columna de 11 ml de capacidad total, rellenándose con el Sephadex hasta 8 ml. La columna se equilibra con 4 volúmenes de agua y azida sódica al 0.02%. La 1 2 51-a-Bgt comercial (250 pCi) se resuspende en 1 ml de agua y azida sódica al 0.02%; se aplican 0 .5 ml a la columna y se eluyen añadiendo alícuotas de 0 .5 ml de azida sódica al 0.02%. La elución de 1251-a-Bgt se monitoriza realizando el contaje de las fracciones recogidas, alícuotas de aproximadamente 0.5 ml, en un contador y (Wilj). Las fracciones que contienen radioactividad se reúnen y su concentración se determina midiendo su absorbancia a 280 nm. La 1251-a-Bgt se lleva a la concentración requerida para los estudios de unión al AcChR, rutinariamente 40 pg/ml, mediante la adición de a-Bgt no radioactiva (fría). 2 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS. Las muestras, tanto de AcChR como de membranas alcalinas, se analizan mediante electroforesis en gel de poliacnlamida con dodecil sulfato sódico (SDS) como agente solubilizante, según la técnica descrita por Laemmli (1970). La electroforesis se realizó en geles de 7 x 10 cm con un espesor de 0.75 mm. El gel separador se prepara a una concentración de acrilamida del 7 .5% y el gel concentrador al 4%. El gel separador (7.5% de acrilamida) se prepara añadiendo 4.35 ml de H2O bidestilada, 2.5 ml de Tris 1 .5 M pH 8 .8, 100 pl de SDS 10% y 3 ml de una disolución de acrilamida :bisacrilamida (30 :0 .8). La disolución resultante se desgasifica y se le añaden 65 pl de una disolución de PSA 100 mg/ml y 7 pl de TEMED (N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamida) . La polimerización se lleva a cabo a temperatura ambiente, dejándose reposar un mínimo de 2 horas antes de su utilización . El gel concentrador (4% de acrilamida), se prepara mezclando 3 .05 ml de agua bidestilada, 1 .25 ml de Tris 0 .5 M pH 6.8, 50 pl de SDS 10% y 0 .65 inl de acrilamida :bisacrilamida (30:0.8). La disolución resultante se desgasifica y se le añaden 35 pl de PSA 100 mg/ml y 7 pl de TEMED. Las muestras se diluyen hasta una concentración de 2 mg/ml y se mezclan en proporción 1 :1 (v:v) con tampón de desnaturalización: Tris 120 mM pH 6.3, glicerol 10%, SDS 6%, 13-mercaptoetanol 15% (sólo cuando la electroforesis se hace en condiciones reductoras), azul de bromofenol 0.005% (como marcador del frente de migración). La ausencia de O-mercaptoetanol en el tampón de

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desnaturalización es lo único que caracteriza a la electroforesis en condiciones no reductoras . La mezcla así preparada se deja a temperatura ambiente durante 15 minutos y a continuación se aplica una alícuota de 30-50 [Cl en cada pocillo del gel . En cada gel se colocaron patrones proteicos de alto y bajo peso molecular (40-200 y 16-60 kDa, respectivamente) . El tampón de electroforesis es Tris 25 mM, pH 8 .3, glicina 190 mM y SDS 0.1%. La electroforesis se realiza a voltaje constante, se inicia con 50 voltios hasta que la muestra penetra en el gel separador, entonces se eleva el voltaje a 150 voltios. La electroforesis se da por terminada cuando el azul de bromofenol llega al final del gel. Los geles se tiñen durante 1 hora con una disolución que contiene 0.25 g del colorante Comasie Brilliant Blue (R-250), disueltos en 125 ml de isopropanol, 50 m1 de ácido acético glacial y 325 ml de agua. La destinción se lleva a cabo con varios lavados de ácido acético glacial al 7 .5%.

3 OBTENCIÓN DE MEMBRANAS DE TORPEDO ENRIQUECIDAS EN RECEPTOR DE ACETILCOLINA 3.1 Obtención de membranas crudas

Las membranas enriquecidas en AcChR se obtienen a partir de ejemplares de Torpedo marmorata procedentes del Mediterráneo y capturados durante las estaciones de invierno y primavera, con un peso medio de tres Kg. Los Torpedos se mantienen vivos hasta su llegada al laboratorio, donde se procede a la disección del tejido eléctrico, que se congela rápidamente en nitrógeno líquido y se mantiene así hasta su utilización. El método utilizado para el aislamiento de membranas procedentes de la electroplaca de T. marmorata es el descrito por Marfnez-Carrion y col . (1984), que supone una modificación del descrito por Lindstrom y col . (1980) . Está compuesto por las siguientes etapas : una porción del tejido eléctrico (100-200 g) se descongela en tampón Tris-HCI 10 mM, pH 7.4, EDTA 5 mM, iodoacetamida 5 mM, fluoruro de fenil-metil-sulfonilo (PMSF) 0.5 mM, previamente enfriado en un baño de hielo picado . Se trocea en pequeños fragmentos (1 cm3) y se homogeneiza en el mismo tampón utilizando un Politrón (Kinematica GmbH), 3 x 90 s al 70 % de potencia. El homogeneizado resultante se centrifuga en rotor Beckman JA-14 a 3500 r.p .m . durante 10 minutos en centrífuga refrigerada. El sedimento compuesto mayoritariamente por material fibroso, se desecha y el sobrenadante se filtra a través de 8 capas de gasa . El filtrado se ultracentrífuga en rotor Beckman tipo 35 a 30000 r.p .m. durante 30 minutos a 4 °C . El sobrenadante se descarta y el sedimento

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(fracción de "membranas crudas") se resuspende en tampón Tris 10 mM, pH 7 .4, NaCI 100 mM. 3.2 Extracción alcalina.

Las proteínas periféricas de membrana presentes en la preparación de membranas crudas, se eliminan mediante un procedimiento de extracción en medio alcalino descrito por Neubig y col., (1979a). La preparación de membranas crudas se diluye con agua destilada hasta obtener una concentración de proteínas de aproximadamente 0.6 mg/ml y se lleva a pH 11 .0 con NaOH 0.1 N, agitándose suavemente durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las membranas alcalinizadas se concentran mediante ultracentrifugación en rotor Beckman tipo 35 a 30000 r.p.m. durante 30 minutos. El sobrenadante, que contiene buena parte de las proteínas periféricas extraídas, se descarta, y la parte superior del sedimento se lava con 2 ml de tampón Hepes 10 mM, pH 7 .4, NaCI 100 mM para eliminar la proteína periférica depositada. El sedimento obtenido se resuspende en el mismo tampón. Mediante este proceso de alcalinización, la fracción de membranas se enriquece relativamente en AcChR hasta alcanzar aproximadamente un 60-70% de la proteína total . Esta preparación de membranas de tejido eléctrico de T. marmorata, se fracciona en alícuotas y se conserva en nitrógeno líquido hasta su utilización. 3.3 Caracterización de las membranas

La cuantificación de proteínas se realiza según el método descrito por Lowry y col ., (1951), con las siguientes modificaciones : puesto que las membranas crudas o alcalinas se solubilizan con Tritón X-100 al 1% y éste interfiere parcialmente con el reactivo de Folin, es necesario centrifugar las muestras por aparecer un precipitado amarillento . Este hecho no perturba la cuantificación y proporciona un método rápido para determinar la concentración de proteína . . Los reactitivs usados en ésta determinación son los siguientes: Reactivo A: sulfato de cobre (11) pentahidratado al 1%. Reactivo B : tartrato sódico potásico al 2.3 %. Reactivo C: carbonato sódico (30 g/1) en hidróxido sódico 0 .1 N. Reactivo D: 1 .0 ml de A + 1 .0 m1 de B + 98 ml de C. Reactivo E: reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 1 :1 con agua destilada. Solución patrón : albúmina de suero bovino (BSA), 1 mg/ml en el mismo tampón en el que se encuentran las membranas suplementado con 1 % de Tritón X-100 .

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La curva patrón se obtiene con alícuotas de 5, 10, 25, 50, 75 y 100 P.1 de la disolución de BSA. De la muestra problema se toman alícuotas de 10, 25, 50, 70 y 100 wl. El procedimiento seguido es el siguiente: las alícuotas de BSA y de las muestras, previamente solubilizadas con Tritón X-100 al 1%, se llevan a 250 P.l con el tampón anterior (1 % Tritón X-100) . Seguidamente, se añaden 2 .5 ml de reactivo D y se agita. Después de 10 minutos, se añaden 250 p1 de reactivo E. Transcurridos 30 minutos se mide la absorbancia a 650 nm, tras eliminar el Tritón por centrifugación . La concentración de proteína se determina interpolando con los valores de absorbancia obtenidos de la recta patrón . La concentración de proteína, en las condiciones indicadas es por termino medio de 10 mg/ml para las membranas crudas y de 5-7 rng/ml para las membranas alcalinas. La medición de lugares de unión de a-Bungarotoxina (a Bgt) se lleva a cabo según el apartado 10 .1, obteniendo por término medio 1 .25 nmoles de a-Bgt por mg de proteína en las membranas crudas y 4 nmoles de aBgt unida por mg de proteína en las membranas alcalinas. El patrón electroforético (método detallado en el apartado 2) muestra principalmente cuatro bandas correspondientes a las subunidades del AcChR, apareciendo la proteína 43 kDa entre las subunidades a y B en el caso de las membranas crudas, y desapareciendo tras la extracción alcalina (Resultados, Figura 1 .2). En ambos casos se aprecian bandas de mayor y menor peso molecular que las bandas típicas del AcChR, indicando que una parte de la proteína presente no es AcChR. 3.4 Marcaje de membranas de Torpedo ricas en AeChR con isotiocianato de fluoresceina.

El marcaje de proteínas con isotiocianato de fluoresceina (FITC) se lleva a cabo mediante el ataque nucleofllico de los grupos amino libres de la proteína sobre el grupo isotiocianato del fluoróforo, formándose un enlace tiourea. Esta reacción presenta máxima eficacia a pH 9 .5 . La presencia de nucleófilos como Tris, azida, iones amonio etc. inhiben el marcaje de la proteína . Debido a estas razones para realizar el marcaje de membranas enriquecidas en AcChR con isotiocianato de fluoresceina, las muestras se someten a diálisis exhaustiva frente a tampón Na2CO3/NaHCO3, pH 9.5, llevándolas a una concentración final de 2 .5 mg/ml. A continuación se añade el FITC, a una concentración de 0.25 mg/ml, y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos protegido de la luz. Con objeto de eliminar el FITC libre, se centrifugan las membranas a 50000 r.p.m. en un rotor TFT-70 30 minutos a 4°C, y se resuspenden en

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tampón Hepes 10 mM, NaCI 100 mM, pH 7 .4, a una concentración final de 8 mg/ml. Las muestras así preparadas se fraccionan en alícuotas y se conservan congeladas a -80°C. 4 PURIFICACIóN DEL AeChR MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD. La purificación del AcChR mediante cromatografia de afinidad a partir de extractos solubilizados de membranas de Torpedo está basada en la utilización de un gel de afinidad obtenido tras la alquilación de una matriz de agarosa por bromoacetilcolina. El método empleado descrito por Jones y col ., (1987) es el que se describe a continuación : 4.1 Preparación de la matriz cromatográfica. 4.1.1 Síntesis de bromuro de bromoacetilcolina. La bromoacetilcolina se obtiene partiendo de cantidades equimoleculares (0.1 moles) de bromuro de colina y bromuro de bromoacetilo . El bromuro de bromoacetilo (p = 2.32 g/ml) se deja caer gota a gota sobre el bromuro de colina previamente pulverizado, agitando suavemente . La mezcla viscosa así obtenida se coloca e un baño de hielo con agitación durante 120-180 minutos. A continuación se añaden lentamente, 50 m1 de etanol absoluto para permitir la cristalización del bromuro de bromoacetilcolina, precipitado de color blanco. Una vez cristalizado se transfiere a un embudo de placa filtrante donde se continua el lavado con etanol hasta que desaparece el color amarillo de los reactivos. A continuación se seca a vacío y el precipitado se fracciona guardándose con desecante en congelador a -20°C. El bromuro de bromoacetilcolina se va a utilizar en la alquilación de los grupos sulfhidrilo presentes en las matrices de Affigel que se describen en los apartados 4.1 .2 y 4 .1 .3 . Al aplicar los extractos solubilizados de membranas crudas a la columna, el AcChR quedará unido a la acetilcolina por afinidad . La disociación del receptor de la matriz cromatográfca se lleva a cabo mediante elución con disolución de carbamilcolina tal como se describe en el apartado 4.2. 4.1.2 Derivatización del Afigel 401 con bromoacetilcolina. 25 ml de Affigel 401 (Bio-Rad) se transfieren a un embudo de placa filtrante y se lavan con 200 ml de H2O para eliminar el conservante . Se equilibra con 100 ml de Tris 100 mM pH 8. A continuación se añaden 50 ml de DTT 20 mM, Tris 100 mM pH 8, incubando durante 20 min. El agente reductor ditiotreitol (DTT) rompe los puentes disulfuro del gel, originando así los grupos tioles libres, cuya presencia puede constatarse mediante reacción con

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ditionitrobenzoato (DTNB) (apartado 4 .1 .4) que da lugar a un intenso color amarillo . Seguidamente se lava el DTT con 100 ml de agua y se equilibra con 50 ml de fosfato sódico 50 mM, pH 7, NaCI 100 mM. Se añaden entonces 300400 mg de bromuro de acetilcolina en polvo y se agita suavemente en baño de hielo, dejándolo reaccionar durante 30 minutos. Pasado este tiempo se lava el gel con 200 ml de agua y se determinan de nuevo los grupos tioles. Se obtiene un color débilmente amarillo, que indica que la mayoría de los grupos tioles han reaccionado con el bromuro de bromoaceti¡colina. Los restantes grupos tioles libres se bloquean por acetilación con 50 mg de iodoacetamida. El Affigel así derivatizado se empaqueta en una columna Econo Bio-Rad 1 .5 x 20 cm y se guarda a CC en baja fuerza iónica y bajo pH (tampón acetato amónico O .OIM pH 4). 4.1.3 Derivatización del Affigel 10 con bromoacetilcolina.

El Affigel 10 (Bio-Rad), a diferencia del 401, no contiene grupos sulfhidrilo sino ésteres de N-hidroxisucinimida unidos covalentemente a la matriz de agarosa, capaces de reaccionar con grupos amino primarios. Por ello el procedimiento es ligeramente diferente, incorporando en una primera etapa estos grupos tioles y derivatizándolos posteriormente . Así, 25 ml de gel, a los que se a eliminado el conservante lavándolos con 200 ml de H2O, se transfieren a un embudo de placa filtrante y se equilibran con 50 ml de Hepes 20 mM pH 7.4 y posteriormente con 50 ml de cistamina (C4Hl4Cl2N2S2) 54 mM , Hepes 20 mM pH 7.4, dejándolo reaccionar durante 1 hora. A continuación se lava el exceso de cistamina con 200 ml de agua y se añaden 25 ml de DTT 100 mM, Tris 100 mM pH 8, incubando durante 20 minutos. El procedimiento que se sigue a continuación es el mismo que el descrito para la derivatización del Affige1401, en el apartado 4.1 .2 desde el lavado del DTT. 4.1.4 Determinación cualitativa de grupos tioles.

Se utiliza el reactivo DTNB, que forma un compuesto de color amarillo en presencia de grupos tioles (Figura 13). A 0.33 ml de una solución de DTNB 10 mM en tampón Tris 100 mM pH 8, se añaden 10 ml del mismo tampón . Se hace reaccionar 1 ml de la disolución anterior con 50 p,l del gel derivatizado. El color amarillo producido por los grupos tioles libres no debe aparecer una vez que los geles se derivatizan con bromuro de acetilcolina. 4.2 Solubilización, purificación y caracterización del receptor purificado El procedimiento utilizado para la purificación del receptor es el descrito por McNamee y Ochoa (1982), (Figura 14) . Las membranas enriquecidas en

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receptor nicotínico correspondientes a preparaciones de 200 g de electroplaca (membranas crudas), se diluyen hasta 2 mg/ml con tampón DB-1* (Tris 10 mM, pH 7.4, NaCI 100 mM, EDTA 0.1 mM) y se solubilizan con colato sódico al 1% (concentración final) . La mezcla se agita suavemente durante 20 minutos y se ultracentrífuga durante 50 min. a 30000 r.p.m. en rotor Beckman 35 . El sobrenadante resultante, tras añadirle inhibidores de proteasas (iodoacetamida 5 mM, PMSF 0.5 mM), se aplica a una columna de cromatografia de afinidad (23 x 2 .5 cm) rellena con 25 ml de Affigel 10 (Bio-Rad) o bien con 25 ml de Affigel 401 (Bio-Rad) ambas derivatizadas como se ha descrito anteriormente y previamente equilibrado con tampón DB-2 (DB-1 + 1% colato), manteniendo un flujo constante de 1-1 .5 ml/minuto.

HOOC R-NH--CH 2-CH2 SH

+

COOH

02N

S-S

1

2

DTNB

COOH R-NH-CH2-CHT-S-S

N

N02

COO" HS

N02

ácido 2 nitro 5 AAERCAPTOBENZOICO

Figura 13 Reacción de DTNB con grupos sullhidrilo libres presentes en el affigel. Figura tomada de Lunbland & Noyes, (1984) .

Una vez aplicada la muestra, la columna se lava con 100 ml de tampón DB-3 (DB-2 suplementado con 1 mg/ml de lípidos de asolectina) . La elución del receptor unido al gel de afinidad se lleva a cabo con 50 ml de tampón DB 4 (DB-3 + 292 mg de NaCI + carbamilcolina 10 mM), recogiéndose fracciones de 2 ml . La concentración de proteína durante el lavado y la elución se determina midiendo la absorbancia a 280 nm (l u.a. corresponde aproximadamente a 0.6 mg/ml de proteína) (Resultados, Figura 1 .1). El rendimiento normal obtenido es de unos 25 mg de proteína purificada, que eluye a una concentración 0.8-2 mg/ml. La elevada concentración de asolectina presente en las muestras de AcChR purificado interfiere en la mayoría de los métodos colorimétricos utilizados para cuantificar proteína . Por esta razón tanto las muestras de AcChR purificado como las vesículas formadas por reconstitución del receptor, se solubilizan con 1% de SDS y la proteína se precipita añadiendo 10 volúmenes de la mezcla acetona:trietilamina :ácido acético (95 :5 :5, v :v). Se forma un par iónico que permite que la proteína precipite, quedando en disolución el

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detergente y la asolectina. Se centrifuga a 3500 r.p .m. durante 10 minutos en centrífuga refrigerada (Beckman GS-6R), descartando el sobrenadante y lavando el precipitado varias veces con acetona para eliminar la trietilamina . A continuación se elimina la acetona con centrifugación a vacío. Finalmente la proteína precipitada se resuspende en 1% SDS y se determina se concentración mediante el método descrito por Peterson, (1977) . MEMBRANAS NATIVAS

Y

( JEL=Y^'V ) 1 ~, COLATO

MICELAS MIXTAS

vw N ocN2cM(s ":irwóc"

NICH2

i

W2 1

" I NJ -#&-e 1 C~

ELUCION CON CARBAMILCOLINA ADICION DE LIPIDOS

R~1yi iï'1!I

r

ï

DIALISIS ELIMINACION DEL COLATO FYfe

ACChR ORIENTADO CORRECTAMENTE DIAMETRO MEDIO x. 500

Figura 14 Esquema de la purificación y reconstitución del AcChR. Se representa la solubilización de membranas nativas con colato sódico, purificación por cromatografia de afinidad y la diálisis del detergente, obteniéndose finalmente vesículas reconstituidas . Figura tomada de McNamee y col ., (1986) .

Los reactivos utilizados en esta determinación fueron los siguientes : Reactivo A: sulfato de cobre (11) pentahidratado al 0 .1%, tartrato sódico potásico al 0.2%, carbonato sódico al 10% .

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Reactivo B : SDS al 10%. Reactivo C: Hidróxido sódico 0.8 N. Reactivo D: A:B :C :agua (1 : 1 :1 :l,v:v) Reactivo E: reactivo de Folio-Cicocalteau diluido 1 :5 con agua destilada. Solución patrón: BSA (0 .5 mg/ml) en 1% de SDS . La curva patrón se obtiene con alícuotas de 10, 25, 50, 75, 100 y 200 [.1 de la disolución de BSA. De la muestra problema se toman alícuotas de 10, 25, 50, 75 y 100 ~i1. El procedimiento seguido es el siguiente : las alícuotas de BSA y muestra se llevan a 200 pi1 con SDS al 1%. Seguidamente se añade 1 ml de reactivo D y, transcurridos 10 min. se añaden 0 .5 ml de reactivo E. Se agita y a los 30 min. se mide la absorbancia a 750 nm. Para determinar la concentración de proteína se hace una representación logarítmica de la concentración de BSA frente a la absorbancia obtenida ajustándose por regresión lineal mediante el método de mínimos cuadrados. La concentración del receptor se calcula aplicando la ecuación: Ng AcChR = (L x A)s L= 1/ antilogaritmo del punto de intersección en el eje de ordenadas S= 1/ pendiente de la recta obtenida. A= Absorbancia. Se obtienen así concentraciones de proteína comprendidas entre 0.8 y 2 mg/ml. El AcChR así purificado presenta una actividad específica de 8 nmoles de a-Bgt unida por mg de proteína (apartado 10.2) . El perfil electroforético (en medio reductor) muestra las bandas correspondientes a las cuatro subunidades del AcChR. 5 RECONSTITUCIóN DE AeChR EN VESÍCULAS LIPÍDICAS POR DIÁLISIS DEL DETERGENTE 5.1 Preparación de vesículas lipidicas a partir de lípidos de semilla de soja. El preparado comercial de lípidos de semilla de soja, asolectina, se disuelve en cloroformo, se seca en rotavapor y se somete a períodos de vacío intercalados con períodos de evaporación del disolvente con corriente de N2. Tras eliminar las trazas del solvente orgánico, los lípidos se hidratan en tampón Tris 10 mM, pH 7.4, CINa 100 mM, añadiendo la cantidad necesaria del detergente CHAPS (3-[(3-chola-midopropil) dimetil-am onio] 1-propanosulfonato) para alcanzar un 2-3% final. Mediante ciclos de agitación, sonicación en baño (15 min) y sonicación con sonda de titanio (sonicador tipo

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Artek 300), 3 ó 4 ciclos de 3 min alternados con enfriamiento en baño de hielo, se obtiene un solubilizado transparente compuesto básicamente de micelas mixtas. Estas micelas se dializan extensivamente, obteniéndose vesículas útiles para reconstitución (Riquelme y col ., 1990 a, b), que se dividen en alícuotas y se congelan a -40°C hasta su uso. 5.2 Procedimiento de reconstitución . Se utiliza el llamado método de diálisis de detergente (octilglucósido, colato o CHAPS) (Paternostre y col., 1988 ; Wrigglesworth y col ., 1987) . El AcChR purificado recién eluido de la columna de afinidad se mezcla con las vesículas lipídicas obtenidas según el apartado anterior, solubilizadas en 4% de colato. Podemos de esta forma variar la relación molar lípido/proteína (que varía entre 10000 y 1000, según los requerimientos del experimento) . Estas mezclas solubilizadas de lípido y proteína se dializan exhaustivamente frente a Tris 10 mM, pH 7.4, CINa 100 mM, EDTA 0 .1 mM durante al menos 60 h. con 6 cambios de tampón (2 L). En los dos últimos cambios de tampón se puede variar la composición del mismo (llepes, Tris, etc.) cuando sea necesario. 5.3 Determinación de la relación fosfolípido-AeChR. La cantidad de AcChR con respecto al fosfolípido se expresa como una relación molar de sitios de unión de 125 1-a-Bgt/fosfolípido. La cantidad de AcChR se ha calculado mediante la determinación del número de sitios de unión de 125 1-a-Bgt según el método descrito en el apartado 10.2. La determinación de fosfolípidos totales presentes en cada una de las muestras a analizar, se realiza según el método descrito por Kyaw y col., (1985) . Las disoluciones empleadas son: - Solución patrón de fósforo, KH2PO4 1 mM. - Ácido perclórico, 35 % (v/v). - Tritón X-100, 5 % (p/v) . - Molibdato amónico 2.5% . Se preparó disolviendo 2.5 g de molibdato amónico en 30 ml de ácido sulfúrico 10 N y diluyendo a 100 ml con agua bidestilada. Se toman alícuotas de 10, 25, 50, 75, 100, 150 y 200 j1 de la solución patrón y los diferentes problemas por duplicado y se llevan a un volumen final de 250 j1. Seguidamente se añade a todos los tubos 300 [1 de HC104 35 %; se tapan con una bola de vidrio y se mantienen a 180°C durante 90 min . Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente, añadiéndose a continuación 100 11 de H202 al 30% y se mantienen de nuevo a 180°C durante 90 min.

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Posteriormente, se dejan enfriar y se añaden 400 ji1 de agua desionizada, 300 [.l de Tritón X-100 al 5 % y 300 p.1 de molibdato amónico al 2 .5%. Se dejan reposar 15 min. antes de medir la absorbancia a 375 nm, determinándose la concentración de fosfolípidos por interpolación con los valores de absorbancia obtenidos de la recta patrón. 6 RECONSTITUCIÓN DEL AcChR EN LIPOSOMAS GIGANTES 6.1. Formación de liposomas gigantes Los liposomas gigantes se forman por fusión entre vesículas ricas en receptor de acetilcolina y vesículas lipídicas, mediante un ciclo de deshidratación parcial/rehidratación. El método utilizado está descrito en Riquelme y col. (1990 a, b) . En una primera fase, la formación de las vesículas lipídicas se ensayó con distintos tipos de lípidos y detergentes. El método seleccionado finalmente, consiste en la solubilización de lípidos de asolectina a 100 mg/ml con 1 CHAPS, dilución a 10 mg/ml y posterior eliminación del detergente por diálisis (apartado 5.1). Estas preparaciones se fraccionan en alícuotas de 850 Pl y se almacenan a -80 °C hasta su utilización. Las muestras utilizadas son membranas enriquecidas en AcChR, o bien receptor purificado y reconstituido . Se mezclan alícuotas conteniendo aproximadamente 100 lig de proteína, con fracciones de 1 .7 ml de una suspensión 13 mM de las vesículas lipídicas previamente formadas. La mezcla membranas/vesículas se ultracentrífuga durante 30 minutos, a 50000 r.p.m. en un rotor TFT-70 Kontron y el sedimento se resuspende en 75 ~11 de tampón Hepes 10 mM, pH 7.4, con un 5 % (v/v) de etilen-glicol . La resuspensión se lleva a cabo forzando la muestra a través de la aguja de una jeringuilla, tantas veces como sea necesario, para obtener una suspensión aparentemente homogénea. La mezcla resultante se deposita en gotas de 20 ~11 en vidrios portaobjetos de microscopio, que han sido deslipidizados previamente con cloroformo :metanol (2:1, v:v), y se somete a un proceso de deshidratación parcial, durante tres horas a CC en un desecador conteniendo CaC12 anhidro . Las muestras se rehidratan mediante la adición de 20 [1 de NaCI 50 mM (o simplemente agua desionizada) sobre la superficie de cada gota deshidratada . La formación de liposomas gigantes se sigue con el microscopio óptico inmediatamente después de hidratar la muestra. Habitualmente, las muestras en los portaobjetos permanecen hidratándose toda la noche, a 4°C, en una placa de Petri con papel de filtro humedecido en su fondo . Los liposomas gigantes así formados, pueden pipetearse directamente de la gota rehidratada, o

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bien obtenerse por medio de un lavado del vidrio en que se han formado, con 1 ml tampón Hepes 4 mM, NaCI 50 mM, CaC12 0.1 mM, pH 7.4, para conseguir un mayor aprovechamiento de la muestra. A continuación se muestra el esquema de formación de los liposomas seguido habitualmente . LÍPIDOS DE ASOLECTINA SOLUBILIZACIÓN

RECEPTOR DE ACETILCOLINA (membranas nativas o vesículas reconstituidas)

VESÍCULAS UNILAMELARES

ULTRACENTRIFUGACIÓN

RESUSPENSIÓN A BAJA FUERZA IÓNICA ll DESHIDRATACIÓN (3 h a 4°C) REHIDRATACIÓN (Fusión) (12 h a 4°C)

LIPOSOMAS GIGANTES 6.2 Fraccionamiento de los liposomas gigantes en gradiente de sacarosa. Con el fin de separar los liposomas gigantes formados, del posible material de partida no incorporado, que podría interferir en los ensayos de determinación de la relación lípido-proteína, se ha realizado un fraccionamiento de éstos mediante ultracentifugación en gradiente de sacarosa . (González-Ros y col ., 198 1) .

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El gradiente de densidad lineal (2-25%) de sacarosa se forma directamente en tubos de "polyalomer" de 12 ml de capacidad que se adaptan a los recipientes basculantes del rotor Kontron SW-28. Para formar los gradientes, en el primer compartimento del gradientador y separado por una válvula de cierre se colocan 6 ml de la disolución de sacarosa (en tampón Hepes 4 mM, NaCI 50 mM, CaC12 0 .1 mM, pH 7.4) menos densa (2%); en el segundo compartimento y mas cercano al tubo de salida se colocan 6 ml de la disolución más concentrada (25%), que se mantiene en agitación durante todo el proceso. La formación del gradiente comienza cuando se adapta la salida del gradientador al tubo de centrífuga y se abre la válvula de separación. La mayor densidad corresponde al fondo del tubo y la menor a la parte superior del mismo. Alícuotas de 0.75 ml de AcChR, incubadas o no con 125 1-a-Bgt como marcador radioactivo, se colocan en la parte superior del gradiente y se centrifugan 15 horas a 24000 r.p.m. en el rotor Kontron SW-28 a 5°C . El fraccionamiento del gradiente se lleva a cabo perforando el extremo inferior del tubo y colectando alícuotas de aproximadamente 750 j1. La fracción del gradiente que contiene los liposomas se detecta mediante medidas de dispersión de luz a 400 nm en las muestras no incubadas con 125 1-a-Bgt, o bien mediante el contaje de radioactividad de las fracciones ; debido a la unión de 125 1_(1-Bgt al receptor . El perfil obtenido mediante ambos procedimientos se muestra en la Figura 15 . a U C1)

m

O

3500 3000

O

2500

n. [u

2000

-a

1500

.C

1000

C

Cr Cs

O O

3

500 0

Fracción

Figura 15 Perfil obtenido al fraccionar liposomas gigantes en gradiente de sacarosa. La fracción cero corresponde al fondo del tubo, máxima densidad del gradiente, mientras que la fracción 25 corresponde a la parte superior, con menor densidad de sacarosa y donde se aplica la muestra . La centrifugación y posterior fraccionamiento de los liposomas gigantes incubados con 125 1--Bgt da lugar al perfil mostrado en la Figura . La linea continua indica el perfil obtenido al medir la radioactividad de las fracciones recolectadas . La linea discontinua indica el perfil obtenido midiendo la absorbancia a 400 nin .

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7 OBTENCIÓN DE LAS FORMAS MONOMÉRICA Y DIMÉRICA DEL AeChR. 7.1 Reducción de la forma nativa del AeChR. El AcChR procedente del órgano eléctrico de Torpedo, se puede aislar en forma monomérica o diménca, dependiendo del procedimiento de extracción utilizado . La presencia de iodoacetamida 5 mM durante la homogeneización inicial del tejido eléctrico, conserva el receptor formando un dímero ; consistente en la unión de dos monómeros de receptor unidos mediante puentes disulfuro entre las subunidades 8 . La forma monomérica se obtiene mediante la incubación del receptor con el agente reductor DTT. Las membranas alcalinizadas, o bien el receptor purificado y reconstituido, se incuban con una concentración 5 mM del agente reductor DTT durante una hora a temperatura ambiente; transcurrido ese tiempo se elimina el DTT mediante ultracentrifugación en rotor Kontron TFT-70 a 45000 r.p .m., durante una hora a 4C . El sobrenadante se descarta y el sedimento se resuspende en tampón Tris-HCI 10 mM, pH 7.4, NaCI 100 mM. Con el fin de eliminar completamente el agente reductor, se dializa la muestra frente al mismo tampón de resuspensión durante 24h. con dos cambios de tampón (21.). La composición del tampón de diálisis se puede variar cuando sea necesario por Hepes 10 mM, pH 7.4, N03Na 100 mM . La muestra no tratada con agente reductor, sigue el mismo proceso de incubación, centrifugación y diálisis descrito para la muestra reducida, con la diferencia de que la incubación se realiza con tampón sin DTT. Estas preparaciones se fraccionan en alícuotas y se conservan en nitrógeno líquido hasta su utilización . Se ha utilizado electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), en condiciones no reductoras para confirmar el estado de agregación de las preparaciones obtenidas. 7.2 Determinación del número de puentes disulfuro afectados El objetivo de este tipo de este análisis es estudiar cuantos puentes disulfuro se reducen tras el tratamiento realizado (apartado 7 .1), y de éstos, cuantos permanecen reducidos al eliminar el agente reductor. El método empleado se basa en alquilar los grupos sulfhidrilo libres en la molécula, con iodoacetamida, someterlos a hidrólisis ácida y detectarlos mediante análisis de aminoácidos como carboximetilcisteinas (Gavilanes y col ., 1983) En la Figura 16, se muestra la reducción con DTT, así como la alquilación con iodoacetamida.

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RC112S-SC112R'

cadenas unidas mediante puentes disulfuro

SCH2(CHOH)2CH2SH 1,4 Ditictreitol

H

HO

RCH2SH + R'CH2SH cadenas reducidas separadas

ICH2CONH2

lodoaaetamlda

RCH2SCH2CONH2 + R'CH2SCH2CONH2 Figura 16 . Los puentes disulfuro se disocian mediante reducción con 1,4 ditiotreitol dando lugar a grupos sulfliidrilo libres ; éstos se formando los derivados alquilan con iodoacetamida, carboxiarnidometílicos correspondientes.

7.2.1 Preparación de las muestras. Partiendo de vesículas reconstituidas a partir de AcChR purificado y lípidos de asolectina, se preparan cuatro tipos de muestras diferentes denominadas a, b, c y d. a) muestras incubadas con DTT (11 a temperatura ambiente), que sin eliminar el agente reductor, se incuban a continuación con iodoacetamida en exceso (25 mM) con el fin de alquilar todos los grupos sulfhidrilo accesibles . b) muestras con el receptor en su estado nativo, que se incuban directamente con iodoacetamida en exceso (25 mM), con el fin de alquilar los grupos sulfhidrilo libres presentes como tales en la proteína . c) muestras que tras la incubación descrita en "a" son sometidas a centrifugación y diálisis, se incuban con iodoacetamida en exceso (25 mM) con el propósito de alquilar los sulfhidrilos que no se han reoxidado al eliminar el DTT.

d) muestras equivalentes a las descritas en "b", excepto que sufren el proceso de centrifugación y diálisis en paralelo con la muestra "c" . En todas las muestras el tampón utilizado es Tris 10 mM, pH 7,4, CINa 100 mM. La iodoacetamida en exceso se elimina por diálisis. Las muestras se secan en un "speed-vac" a vacío, y se liofilizan durante 5 horas .

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7.2.2 Análisis de aminoácidos

La hidrólisis de la proteína (50 g) se realiza a vacío ; se introducen en un tubo pyrex (12 x 100 mm) 0.4 mg de proteína . Se añade 0.1 ml de HCI tridestilado azeotropo, 5 .7 M, conteniendo fenol al 0.1 % (v/v) con el fin de evitar la destrucción de la tirosina durante la hidrólisis . El tubo se estira a la llama, se congela su contenido, y se hace vacío con una bomba durante un tiempo aproximado de 10 minutos. Se cierra el tubo a la llama por la zona previamente estirada, manteniéndose el vacío . La hidrólisis se realiza a 108 C, durante 24h. Para cada experimento se realizan tres hidrolizados diferentes. Finalizada la hidrólisis las muestras se llevan a sequedad en rotavapor. Se lavan posteriormente 2-3 veces con un volumen de 0.2 ml de 1120 destilada y se llevan nuevamente a sequedad tras cada adición. Este lavado exhaustivo tiene

el fin de eliminar bien el HCI. Las muestras secas se disuelven en 50 1 del tampón de aplicación siguiente : Citrato sódico. 2 H2O (0.2 M de Na+), pH 2.20, HCI 0 .75 %, Tiodiglicol 0.5 %, fenol 0.1%; se pasan a un tubo cónico de teflón, de 4 cm de longitud y 0.3 cm de diámetro máximo, y se centrifugan durante 5 minutos . Todos los análisis se llevan a cabo en un analizador automático Beckman 6300, cuyo soporte cromatográfico es una resina de intercambio catiónico . Se analizan entre 10 y 40 p,l de muestra, la elución se realiza con gradiente creciente de pH con tampón citrato pH 3 .5, 0.2 M, pH 5 .5, 0.2 M, pH 6.1, 1 .0 M.

Una vez separados los distintos aminoácidos, se detectan mediante reacción con ninhidrina; midiendo de modo continuo en un espectrofotómetro a dos longitudes de onda distintas (550 y 490 nm) con el fin de determinar todos los aminoácidos presentes en la muestra (Figura 17). La ninhidrina reacciona con el grupo amino de los aminoácidos dando un compuesto azul, que tiene su máximo de absorción a 550 nm excepto la prolina que al ser un iminoácido da un compuesto color amarillo cuyo máximo de absorción esta a 490 nm . Una vez detectados todos los aminoácidos se identifican según su tiempo de

retención en la resina. Antes de cada muestra se pincha un patrón de norleucina para calibrar la áreas. La duración del análisis es de 82 minutos; finalizado cada análisis la resina de la columna se regenera mediante lavado con NaOH 0.3 N, conteniendo EDTA 0 .25 g/1. A partir de los datos obtenidos del análisis se determina la composición de aminoácidos en % molar, calculando el numero de nanomoles de cada aminoácido mediante la comparación con un patrón .

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0 C

COOH NH,-C-H + 2 \~

A

I/

OH C

l

0 11 C

/C-N=C \ OH

0

Ninhidrina

cr-Aminoácido

0 II C

C I O H

\C

PIPAI

IONS

110A

H +

0, + K - C

,~l O

O

Producto azul (amarillo con la prolina)

Figura 17 Reacción de un aminoácido con la ninhidrina . El grupo amino de los aminoácidos reacciona con la ninhidrina en caliente dando un compuesto azul . Dado que la reacción es estequiométrica, se puede cuantificar la cantidad de un aminoácido presente según la absorción de la luz a 570 nin de longitud de onda . La prolina, que es un iminoácido también reacciona con la ninhidrina pero da color amarillo con un máximo de absorbancia a 440 nm.

8 PREPARACIóN DE LAS MUESTRAS PARA ANÁLISIS MEDIANTE TÉCNICAS DE CRIOFRACTURA . La criofractura es el único método de que se dispone actualmente para observar al microscopio electrónico el interior hidrofóbico de las membranas, proporcionando así mucha información sobre las mismas. Los débiles enlaces hidrofóbicos del interior de la bicapa favorecen el avance del plano de fractura a través del centro de las bicapas lipídicas, separando la bicapa en dos monocapas, llamadas hemicapas. De esta manera se estudian dos caras de fractura diferentes ; la cara que representa el interior hidrofóbico de la mitad citoplasmática (o protoplasmática) de la bicapa, se denomina cara P, y la cara que representa el interior hidrofábico de la mitad extracelular de la bicapa se denomina cara E (Figura 18)

..

;:";~, .. . s1 e IMP ..p! .R.A~,iry'i Vi

A

C

Figura 18. Esquema de las caras de la membrana expuestas tras la criofractura. A: Estado inicial de la muestra mostrando el plano típico de fractura (f). B y C : Caras complementarias resultantes de la fractura : E: cara externa; P: cara interna. IMP: partículas intramembrana ; d: hoyos dejados por IMP que tras la fractura ha quedado en la cara complementaria .

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Para realizar estos estudios hemos partido de liposomas gigantes con el receptor incorporado en forma de membranas nativas o bien purificado en sus distintas formas de agregación, monomérica y dimérica. Se ha utilizado el método descrito por Garcia-Segura y col. (1986a). 8.1 Preparación de los liposomas para la criofractura : Fijación, crioprotección y congelación Los liposomas gigantes se centrifugan en tubos Eppendorf a 12000 r.p.m. durante 1 hora y el sedimento resultante se fija con glutaraldehido al 2 % en tampón fosfato sódico 0 .1 M pH 7.4, durante 1 h a temperatura ambiente . Las muestras fijadas se lavan varias veces con tampón Hepes 4 mM, NaCI 50 mM, CaC12 0 .1 mM, pH 7.4 . Una vez fijada la muestra se trata con un crioprotector . Los agentes crioprotectores son sustancias capaces de fijar moléculas de agua, con lo que producen un descenso sustancial del punto de congelación; de ésta forma, se reduce el tiempo disponible para el crecimiento de los cristales de hielo, formándose cristales más pequeños, y por lo tanto, menos destructivos . Se ha utilizado como crioprotector el glicerol . El sedimento fijado se ha mantenido en una solución de glicerol al 20 % en fosfato 0 .1 M, pH 7 .4, durante 2 horas a temperatura ambiente. La congelación rápida es un componente esencial en ésta técnica. El bloque montado sobre una pieza transportadora, se sumerge rápidamente en Freón 22 enfriado con nitrógeno líquido . Después de unos 30 segundos, la muestra congelada se transfiere rápidamente a nitrógeno líquido, donde puede almacenarse durante meses sin que sufra daño . 8.2 Procedimiento defractura y replicación de la muestra. El proceso de fractura y replicación se realiza en un aparato Balzers BAF 4001) (Balzers, Liechtenstein) . La transferencia de la muestra a la cámara de vacío debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar la recristalización . Una vez colocada la muestra en el soporte, se cierra la cámara de vacío y se evacua el aire hasta una presión de 10-7 torr; la cámara se enfría con nitrógeno líquido hasta alcanzar una temperatura cercana a -130C; el brazo de la cuchilla se enfría hasta la temperatura del nitrógeno líquido . La muestra se pasa entonces a la temperatura de fractura, alrededor de -100 C . Es importante que la temperatura de la muestra sea mayor que la de la cuchilla . La muestra se fractura e inmediatamente después del último corte se evaporan mediante un electrodo, carbono y platino, que forman sobre la superficie fracturada una capa de 10 mn de espesor, uniforme, densa a los electrones y con un tamaño de grano de 20-30 A. El ángulo de evaporación es de 45° ; a continuación de la

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capa de platino-carbono, se evapora, perpendicularmente a la muestra, otra capa de carbono de 30 nm de espesor. Esta segunda capa, invisible al microscopio electrónico, sirve sólo para reforzar la réplica de platino que es extraordinariamente fina y frágil . La muestra, con la réplica unida, se extrae de la cámara, se descongela y se coloca flotando en un recipiente con agua conteniendo hipoclorito sódico . El objetivo de este procedimiento es eliminar completamente el material biológico por digestión, manteniendo la réplica intacta y flotando en la solución limpiadora. La réplica posteriormente se lava en agua destilada y se monta sobre rejillas de microscopía electrónica. ' 8.3 Cuantificación de las IMPs. Se han preparado de 3 a 6 réplicas de cada preparación de AcChR, las cuales fueron observadas en un microscopio de transmisión JEOL 100 B . Las réplicas han sido fotografiadas sin ningún criterio previo de selección, fotografiándose todas las caras P y E de membranas de los liposomas. El aumento final para la cuantificación de IMPs fue de 72.000 . La cuantificación de la densidad de partículas intra membranas (IMPs) se realiza superponiendo una rejilla de área conocida sobre la foto, y el diámetro de las IMPs se mide, con una lupa calibrada, como la base de una línea que pasaría por la base de la sombra triangular proyectada por la partícula (Figura 19).

s

:.JUVI~ 'S.!i?.J

Figura 19 Medida del diámetro de las IMPs. El diámetro de las IMPs (m), se mide como la longitud de una linea que pasaría por la base de la sombra triangular proyectada por la partícula. Las flechas verticales indican la dirección del sombreado de platino (Pt). (s), sombra libre de platino producida por la partícula.

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Materiales y Métodos 9 ESPECTROSCOPIA INFRARROJA POR FOURIER.

71 TRANSFORMADA DE

Se utiliza un espectrómetro Nicolet 520 FT-IR equipado con un detector DTGS . La técnica de FT-IR aplicada a muestras biológicas presenta algunas dificultades, como la presencia de H2O, cuya absorción enmascara muchas regiones del espectro de infrarrojo; con el fin de liberar la zona de interés para el estudio de proteínas se ha sustituido el H2O por D20 . Este intercambio isotópico se lleva a cabo mediante dos ciclos de centrifugacion y resuspension en tampón D20 con la misma composición salina que el medio original acuoso. Las centrifugaciones se realizan en rotor Kontron TFT-70, a 55000 r.p .m. durante 45 minutos, dejando una concentración final de proteína de aproximadamente 20 mg/ml. Las muestras se analizan, formando un película líquida en una cámara desmontable (Harrick, Assining, U .S.A .) con ventanas de CaF2 (transparente a la radiación infrarroja en el rango de frecuencias de interés); se utilizan separadores de teflón de 50 wm y 25 pl de volumen de muestra. La célula de muestra se termostatiza (211 C) mediante un baño de agua circulante y el vapor de H2O y el C02 atmosféricos en el interior del espectrómetro se eliminan mediante un flujo de aire seco originado por un compresor (Balston), dejando estabilizar la cámara durante 30 minutos cada vez que se abre. Para cada espectro se adquieren 600 barridos ; durante una serie de desnaturalización térmica se toman 15 espectros diferentes, cada uno de los cuales consta de 200 barridos, aumentando progresivamente la temperatura entre 21C y 63C. Un ciclo de desnaturalización térmica dura aproximadamente 150 min ; el primer espectro se toma una vez transcurridos 30 min. desde el depósito de la muestra 1 en la cámara, tiempo necesario para que ocurra el intercambio H/2H y se termostatize la muestra. La resolución final de los espectros es 2 cm -1 . Las deconvoluciones se llevan a cabo utilizando una anchura de banda Lorenziana (hw) de 18 cm-1 y un factor de aumento de resolución (k) de 2 cm1 . Para la derivación se utiliza una potencia (pw) de 3 y un punto de corte (bp) de 0.3 (Moffatt y Mantsch, 1992) . Para llevar a cabo la estimación cuantitativa de estructura secundaria del AcChR, se realiza la descomposición de la banda amida 1 original siguiendo el método de Castresana y col. (1988) y Arrondo y col. (1993) . Es necesario eliminar el ruido de los espectros originales con el fin de minimizar la variabilidad inducida por los procedimientos de ajuste; para lo cual se reconstruye el espectro original (resultado de sustraer el espectro correspondiente al tampón, del espectro de la muestra) empleando algoritmos

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de máxima entropía . A partir del espectro reconstruido se calculan la derivada y la deconvolución que nos proporcionan el número y posición de componentes a los que ajustaremos la traza. El ajuste se hace con una subrutina del programa SpectraCal (Galactic Industries Corp ., Salem, NH). Se ajusta la línea de base entre 1700 y 1600 cm-', haciendo que la absorbancia correspondiente a los números de onda extremos tenga valor cero . Como parámetros iniciales, junto al número y posición de componentes, se emplea la altura, anchura y forma de la banda. El proceso consta de 200 iteraciones, con todos los parámetros libres excepto la posición y la forma de banda (que fijamos como gaussiana) ; seguido de otras 50 iteraciones liberando la posición de banda. Finalmente el programa informático presenta los resultados calculados de posición, altura, anchura y área, así como la bondad de ajuste (x 2=1-2 x 10-5 ) . A partir de los valores de área se calcula porcentaje de áreas de las bandas individuales en función del área total (sin tener en cuenta la contribución de las vibraciones de cadenas laterales a 1612 cm-1 ).

10 ESTUDIOS DE UNIóN 125I a-BUNGAROTOXINA AL AeChR 10.1 Determinación del número de sitios de unión de a-bungarotoxina al AeChR.

La a-Bgt se une específicamente al AcChR con una alta afinidad (Kd = 10- 11 M). La incubación del receptor solubilizado con un exceso de 1251-a-Bgt, 30-60 minutos a temperatura ambiente, permite la formación de complejos AcChR-1251-a-Bgt, fácilmente separables de la 12 5 1-a-Bgt libre . Debido a esto es posible determinar el número de sitios de unión de a-Bgt presentes en una muestra determinada, empleando una concentración constante de 125 1-a-Bgt y concentraciones crecientes de AcChR solubilizado en Tritón X-100. El método que se sigue para el estudio del número de sitios de unión de 1251-a-Bgt al receptor, es el descrito por Schrnidt y Raftery, (1973). Las muestras (membranas enriquecidas en AcChR (1 mg/ml) o vesículas conteniendo receptor purificado) se solubilizan en presencia de 1% de Tritón X-100 . Se toman alícuotas de esta preparación comprendidas entre 5-100 Vil y se llevan a un volumen final de 100 [1 con tampón Hepes 10 mM pH 7.4, NaCI 100 mM, Tritón X-100 1%, añadiendo a cada uno de los tubos 25 [1 de una . Tras un periodo de incubación de 2 disolución de 1251_(x-Bgt (30-40 mg/ml) horas a temperatura ambiente, alícuotas de 100 jl de cada fracción se adsorben sobre un disco de papel Whatman DE 81 (intercambio fónico) de 2 .3 cm de diámetro, de forma que el complejo 1251-a-Bgt-AcChR queda retenido en el disco . Con objeto de eliminar la 1251_(x-Bgt no unida, se realizan tres lavados

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de 10 minutos con tampón fosfato 10 mM pH 7.4, NaCI 0 .05 M, Tritón X-100 0.1%, NaN3 0.02% a temperatura ambiente, en una proporción de 500 ml de tampón para cada 30 discos de papel . Finalmente, los discos se dejan secar y se colocan en tubos para determinar su radioactividad (c.p.m .) en un contador Beckman 5500 (Smichdt y Raftery, 1973). El número de cuentas obtenido (c.p.m .) es proporcional a la cantidad de complejo AcChR-1251-a-Bgt formado. La unión no específica de la toxina, proporciona un valor constante, menor del 0.5 % del número total de cuentas. Mediante la representación de la radioactividad obtenida frente a la concentración de AcChR, se obtiene una curva de saturación en la cual se determina el número de sitios de unión al AcChR (zona lineal), tomando como referencia la cantidad máxima de ligando radiactivo unido al AcChR (saturación) . Teniendo en cuenta que por cada mol de AcChR se unen dos moles de a-Bgt, el valor máximo teórico de los sitios de unión de a-Bgt en una preparación de AcChR purificado, es de aproximadamente 64 l g de a-Bgt unida por mg de proteína total (8 nmoles de a-Bgt por mg de AcChR) . 10.2 Análisis de las transiciones entre los distintos estados de afinidad por agonistas del AcChR. Una de las propiedades funcionales del AcChR es la capacidad de producir transiciones entre los distintos estados (cerrado, abierto y desensibilizado), inducidos por agonista . La preincubación del AcChR con un agonista lleva al receptor a un estado de alta afinidad (estado desensibilizado) fácilmente distinguible del estado de reposo mediante ensayos de unión de 1251_a-Bgt al receptor. Mediante estos ensayos es posible determinar la capacidad del AcChR, de producir transiciones entre los distintos estados de afinidad . El método que se sigue para el estudio de la cinética de unión de 1251a-Bgt al AcChR, es el descrito por Quast y col . (1978b). Las vesículas enriquecidas en receptor de acetilcolina, así como membranas alcalinas, nativas, se diluyen hasta que la concentración final en el ensayo es de 0 .5 x 10-7 M en sitios de unión de 1251-a-Bgt. Con esta muestra se preparan tres alícuotas. A la primera de ellas (a), se le añade 1251-a-Bgt a una concentración final de 5 x 10-7 M; a la segunda alícuota (b), se le añade simultáneamente la misma cantidad de 1251_(x-Bgt y carbamilcolina 2 x 10-6 M, y la tercera alícuota (c), se preincuba con carbamílcolina 2 x 10-6 M durante 20 minutos con el fin de alcanzar el estado desensibilizado, añadiendo a continuación la 1251-a-Bgt . En las tres situaciones estudiadas, la concentración final de receptor y toxina se mantienen constantes, hallándose la toxina en gran exceso sobre el receptor. Todo el ensayo se realiza en baño de hielo .

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En la primera y tercera alícuota se considera como tiempo cero, el momento en que se añade la 125 1-a-Bgt. En la segunda alícuota se añaden primero la 1251-a-Bgt y la carbamilcolina, y se considera tiempo cero, el momento en que se añade el receptor. A partir de este instante se toman alícuotas de 100 p.l a distintos tiempos (0-240 s) y se depositan en filtros DE81 (Whatman). Estos filtros contienen una alta concentración de grupos dietilaminoetil que compiten con la a-Bgt en su unión al AcChR consiguiendo de esta forma detener la reacción de unión de a-Bgt al receptor (Blanchard y col., 1979). Los filtros se lavan y la radioactividad asociada se cuantifica mediante el procedimiento descrito en el apartado 10.2. La preincubación del AcChR con un agonista, le lleva a un estado de alta afinidad por el mismo, que produce un enlentecimiento en la unión de a-Bgt. Por este motivo, la velocidad de unión de a-Bgt al AcChR en (b), es mayor que cuando el AcChR ha sido expuesto al agonista (c). En caso de pérdida de funcionalidad del receptor, la cinética de unión de a-Bgt al receptor preincubado con el agonista (c) es indistinguible de la situación en la que se añaden simultáneamente ambos ligandos (b) . 11 ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DEL AcChR MEDIANTE TÉCNICAS DE CINÉTICA RÁPIDA. Con objeto de medir la translocación de iones mediada por el AcChR, en una escala de tiempo próxima a la fisiológica, se ha utilizado el procedimiento descrito inicialmente por Moore y Raftery (1980) y modificado posteriormente por González-Ros y col . (1984). Se utiliza la técnica de flujo detenido ("stopped-flow") basada en el apagamiento de la fluorescencia del fluoróforo hidrofilico tetrasulfonato sódico de pireno (PTSA), atrapado en el interior de las vesículas . El método implica la mezcla rápida de las vesículas con el catión Tl+ (Figura 20), que se añade al medio extravesicular y se pone en contacto con el fluoróforo mediante la apertura del canal fónico asociado al AcChR en presencia del agonista colinérgico carbamilcolina . Esta técnica permite el seguimiento continuo del flujo catiónico en una escala de tiempo de milisegundos (próxima a la fisiológica) . Las medidas de apagamiento de fluorescencia dan información sobre la constante aparente máxima de velocidad (kappmax) de entrada de Tl+ y a su vez se puede determinar la constante de disociación (Kd) y el coeficiente de Hill (nl,) para la unión del agonista (Donnelly y col., 1984 ; González Ros y col., 1984).

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11.1 Preparación de vesículas cargadas con luoróforo para medidas de actividad deflujo iónico. El AcChR purificado, se reconstituye en vesículas lipidicas, guardando una relación molar lípido :proteína de aproximadamente 3000-5000 . Las vesículas así reconstituidas, o bien vesículas de membranas enriquecidas en AcChR, se cargan con el fluoróforo, añadiendo 0.13 ml de PTSA 32 mM por cada mililitro de vesículas (de aproximadamente 1 rng proteína/ml), mediante 2-3 ciclos de congelación rápida (N2 líquido) y descongelación lenta, a 4°C . Al finalizar el segundo ciclo de descongelación, las vesículas se homogeneizan en un Politrón al 50% de potencia durante dos ciclos de 1 minuto . Na03S

S03Na

NaO 3S

S03Na PTSA

1 .MARCADOR FLUORESCENTE -ql, .111

`

QIf=ITt,C9I " Carb (91 Jí

3 .CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

-

WX

FLUORESCENCIA-

91

2.CONGELACION-DESCONGELACION

9-(T i,Ci)+ Tampon

MEZCLA RAPIDA

i? ,,

~tih!tM+'i

EXTINCION DE FLUORESCENCIA FLUORESCENCIA

Figura 20 Esquema de la técnica de cinética rápida empleado para medir el flujo ¡único a través del AcChR. En el esquema se representa la preparación de vesículas cargadas con PTSA (pasos 1, 2 y 3) y la mezcla rápida de dichas vesículas con el tampón que contiene los iones de Tl+, en presencia y ausencia de carbamilcolina . La interacción del agonista con el receptor abre el canal iónico y pone en contacto al fluoróforo con los iones Tl+ Figura tomada de McNamee y col., (1986) .

Para separar el fluoróforo encapsulado en las vesículas del no encapsulado, las muestras se aplican a una columna de Sepharosa 6MB (preparación descrita en el apartado 11 .2), eluyendo con Hepes 10 MM, pH 7.4, NaN03 100 mM y recogiendo fracciones de 2 ml. Las vesículas eluyen en

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el volumen de exclusión de la columna y son fácilmente reconocibles por la turbidez de las fracciones, así como por la fluorescencia emitida al excitar con luz ultravioleta . En este proceso de separación la muestra se diluye al menos tres veces, aunque no supone ningún inconveniente, ya que en general es necesaria una dilución adicional para evitar problemas de dispersión de luz producidos por muestras muy turbias. 11.2 Preparación de la columna de cromatografía de exclusión.

Se utiliza el gel Sepharosa 6MB (Pharmacia tamaño de grano 300 [m), del que se dispone comercialmente en forma activada con CNBr. Con el fin de bloquear los grupos resultantes de la activación del CNBr, el gel se incuba con Tris 1 M, pH 8, durante 12 h. a temperatura ambiente y evitando cualquier agitación mecánica brusca. Una vez inactivado se empaqueta en una columna de 1 .5 x 27 cm y se equilibra con el tampón Hepes 10 mM, pH 7.4, NaN03 100 mM. Esta columna se lava con agua y azida sódica al 0 .02%, y se conserva a 4 C hasta su posterior utilización. 11.3 Adquisición y tratamiento de datos

Las trazas espectroscópicas resultantes de la disminución de la intensidad de fluorescencia con el tiempo, se obtienen en un espectrofluorímetro de flujo detenido de la casa AMINCO, modelo SLM-8000, equipado con : i) una fuente de voltaje para una lámpara de arco de Xenón de 450 W, ii) una cubeta de cuarzo, iii) un sistema neumático de pistón (presión de trabajo de 4-5 bares) para mezclar los reactivos y iv) un sistema de adquisición de datos controlado por un IBM PS/2-30. El tiempo muerto de mezcla del aparato es inferior a 3 ms. Las muestras se excitan a 374 nm, midiéndose la intensidad de emisión a través de un filtro Corning 3-75 . Una de las jeringas contiene las membranas nativas (o las vesículas reconstituidas) cargadas con el fluoróforo en tampón Hepes 10 mM, pH 7.4, NaN03 100 mM, . La otra jeringa contiene el ion TV(40 mM) en tampón Hepes 10 mM, pH 7.4, NaN03 60 mM, y la concentración correspondiente de carbamilcolina (entre 25 y 1000 IM). La relación de mezcla de los reactivos para cada medida es 1 :1, siendo el volumen total de avance del pistón de 0.1 ml . El análisis cuantitativo de las trazas obtenidas se lleva a cabo combinando la ecuación de velocidad de entrada de TI} (ecuación l), con la relación de Stern-Volmer para el apagamiento de fluorescencia (ecuación 2). Ecuación (1) Q(t) = Q (1 - e-kt ) Q(t) = concentración de iones TV- a tiempo t. Q = concentración máxima de iones T+(20 mM).

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k = Constante aparente de velocidad de flujo de iones TI-'La fluorescencia del PTSA a una concentración (Q) dada de iones TVviene dada por la relación de Stern-Volmer: FO /F= 1 + KQ K = Constante de Stern-Volmer. F = Fluorescencia a tiempo 0 .

Ecuación (2)

O

Sustituyendo Q(t) en la ecuación (2) se obtiene la intensidad de fluorescencia en función del tiempo. Fo

1 + KQ (1- e

Ecuación (3)

_k t )

F. Fluorescencia a tiempo 0. K= constante de Stern-Volmer. Q = concentración máxima de iones TV-(20 mM). k = constante aparente de velocidad de flujo e iones TI-'-. Para ajustar las trazas obtenidas, se incluye un factor de normalización, quedando la ecuación (3) como: F - F, +

Fa

1 + KQ (1- e

_k

`)

Ecuación (4)

F,= Factor de normalización Las trazas experimentales obtenidas contienen 200 puntos; la traza correspondiente al flujo inespecífico (0 pM Cch) se sustrae de las trazas que representan el flujo inducido por agonista . Una vez eliminado el efecto de permeación pasiva, las trazas obtenidas se ajustan a la ecuación (4) según el método de regresión no lineal del programa comercial de tratamiento de datos Sigma Plot V.4.1 que utiliza el algoritmo de Marquardt-Levenberg. El ajuste de las trazas proporciona información sobre las constantes aparentes de velocidad de entrada de iones Tl+ en el interior de las vesículas (kapp). 12 ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DEL AcChR MEDIANTE LA TÉCNICA DE PATCH-CLAMP. 12.1 Fundamento de la técnica La técnica de patch-clamp (método de fijación de potencial en un "parche de membrana), desarrollada por E. Neher, B . Sakmann y sus colaboradores, permite medir el flujo de corriente que pasa a través de canales iónicos individuales en la membrana celular. La información obtenida mediante la

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utilización de esta técnica ha supuesto una revolución en el estudio de los canales iónicos. El fundamento es bastante simple : una micropipeta de vidrio, con diámetro interno de aproximadamente l pun. en la punta, se coloca contra la membrana de una célula; al aplicar una succión se logra un sello eléctrico de alta resistencia entre el vidrio y la membrana ("gigasello") . Dependiendo del tamaño del "parche" de membrana atrapado en la pipeta y de la densidad de canales iónicos en la misma, puede aislarse una o más de estas proteínas . La Figura 21 ilustra esquemáticamente las diferentes configuraciones que se pueden alcanzar con esta técnica. En la parte superior de la misma se observa que al sellar la punta de la pipeta contra la membrana y succionar ligeramente se obtiene un sello de alta resistencia que permite el registro de corriente "in situ" ("cell-attached") ; a partir de aquí se pueden alcanzar tres configuraciones diferentes . Aumentando la succión hasta romper el "parche" de membrana se establece una conexión eléctrica entre la pipeta y el interior celular, con lo que se consigue el registro de "célula entera" ("Whole-cell") que permite medir la comente total que atraviesa la célula. Desde esta configuración, separando lentamente la pipeta de la célula los bordes de la membrana unidos a la punta de la pipeta se sellan, obteniéndose el registro de "parche aislado exterior-baño" ("outside-out"), en el cual la cara externa de la membrana queda expuesta a la solución del baño y la cara interna queda expuesta al interior de la pipeta. Por último, desde la configuración inicial de registro "in situ", retirando la pipeta se obtiene el registro de "parche aislado interior-baño" ("inside-out"), en el cual la cara interna de la membrana queda expuesta a la solución, del baño y la cara externa queda expuesta al interior de la pipeta de registro . Tanto "outside-out" como "inside-out", son configuraciones complementarias que registran un parche de membrana aislado, en el que pueden determinarse las corrientes iónicas que atraviesan los canales presentes en el fragmento de membrana atrapado. En este trabajo se ha puesto a punto un nuevo método de reconstitución : la reconstitución de proteínas en liposomas gigantes, de tamaño comparable al de una célula, que permite realizar medidas de actividad de canal único utilizando la técnica de patch-clamp .

12.2 Preparación de las muestras Se realiza el mismo proceso de preparación de la muestra en todos los estudios que se describen a continuación . La proteína, ya sea en forma de membranas o de receptor purificado y reconstituido, e independientemente del estado de agregación del mismo, se incorpora en liposomas gigantes (apartado 6 .1); a su vez se preparan liposomas gigantes sin proteína incorporada para

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utilizarlos como control de la actividad eléctrica registrada. En placas de Petri de 3 .5 cm de diámetro, se depositan alícuotas de 3 a 15 EL1 de liposomas gigantes y se incuban con 1 ml del tampón apropiado para el registro electrofisiológico : Hepes 4 mM, pH 7.4, NaCI 50 mM, CaC12 0.1 mM o bien Hepes 10 mM, pH 7 .4, NaCI 140 mM, CaC12 0 .1 mM (solución del baño), durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.

~-1

SELLO DE BAJA RESISTENCIA (M11.)

SELLO DE ALTA RESISTENCIA (G _n_) [REGISTR O ! IN SITU"

SUCCION O PULSOS DE VOLTAJE

RETIRAR

/

UTILIZANDO UNA CELULA PEQUEÑA RETIRAR

lopm

RETIRAR

REGISTRO EN CELULA ENTERA

IV

PARCHE AISLADO EXTERIOR-BAÑO

IV PARCHE AISLADO INTERIOR-BAÑO

Figura 21 Este esquema ilustra las diferentes configuraciones que presenta la técnica de patch clamp, así corno las distintas manipulaciones que conducen a ellas . Figura tomada de Hamill y col. (1981) .

12.3 Registro de la actividad eléctrica. Los registros de canales únicos reconstituidos en liposomas gigantes se obtienen mediante la técnica de patch-clamp descrita por Hamill y col . (1981), en configuración de parches aislados "inside-out" . Debido a que estos son multilamelares es necesario registrar en parche aislado, y en base a la

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orientación que adopta el AcChR en los liposomas (sitio de unión al agonista en la cara externa del liposoma), hemos denominado a esta configuración "inside-ouC . Las pipetas se hacen de vidrio de borosilicato, lavado con O .1N de ácido nítrico y agua destilada. El estiramiento se realiza en un estirador BB-CH (Mecanex, Ginebra-Suiza) . Aproximando la punta de la pipeta a la superficie del liposoma con la ayuda de un micromanipulador, y succionando ligeramente hacia el interior de la pipeta, se forman sellos de alta resistencia (10-20 GOhm) . La mayoría de los experimentos se hicieron en condiciones iónicas simétricas, esto es, la solución de la pipeta es la misma que la del baño, con o, sin la presencia de algún agonista colinérgico, u otro ligando en la pipeta, tal y como se ve en Resultados . Todas las soluciones empleadas se filtran previamente con un filtro millipore de 0 .22 p,m. La señal de comente es amplificada mediante un conversor corrientepotencial EPC-7 patch-clamp (List Medical Electronics), a una ganancia de 50100 mV/pA y un filtro de 10 KHz. El potencial se aplica en el interior de la pipeta, y el baño se mantiene conectado a tierra. La corriente se observa en un osciloscopio y se almacena en una cinta de video. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (Riquelme y col ., 1990 a,b) . 12.4 Análisis de los registros obtenidos. Para el análisis posterior los registros se filtran con un filtro de baja frecuencia tipo Bessel de 8 polos y se digitalizan mediante una interfase electrónica. La señal almacenada en una cinta de vídeo se transfiere a un disco magnético. El análisis de los registros de canal único se realiza mediante el programa diseñado por el Dr. J. Dempster de la Universidad de Strathclyde (cedido gentilmente por el autor). Para cada potencial aplicado se miden los valores de amplitud de corriente de las aperturas del canal y se representan los histogramas de amplitud de corriente frente a número de aperturas medidas.

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Resultados

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IV RESULTADOS

1 OBTENCIÓN DE MEMBRANAS RECONSTITUIDAS CONAcCh£

NATIVAS

1.1 Membranas alcalinas.

Y

VESÍCULAS

El tejido eléctrico de T. marmorata puede ser empleado en el acto para extraer AcChR o bien ser almacenado en N2 líquido hasta su utilización. La purificación del AcChR comienza con la obtención de una fracción de membrana parcialmente purificada, empleando métodos de homogeneización del tejido, centrifugaciones de baja velocidad para separar el tejido conjuntivo y centrifugaciones de alta velocidad para sedimentar las membranas (McNamee y col. , 1986). Durante la homogeneización del tejido, es necesario incluir inhibidores de proteasas como PMSF, iodoacetamida, EDTA, etc . (ContiTronconi y Raftery, 1982). Estas membranas parcialmente enriquecidas en AcChR son en general el punto de partida para la purificación del AcChR mediante cromatografía de afinidad (ver Métodos, apartado 2). Si se pretende llevar a cabo estudios bioquímicos o biofsicos directamente sobre fracciones de membranas nativas, se utilizan otros métodos, como la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y la extracción alcalina para obtener membranas altamente enriquecidas en AcChR. La extracción alcalina, utilizada en este trabajo, elimina la mayoría de las proteínas periféricas asociadas a la membrana, incluida la de 43 kDa, componente mayoritario junto con el AcChR

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de las membranas postsinápticas de Torpedo. Se obtienen así, vesículas selladas con un alto contenido en AcChR. Las membranas obtenidas se caracterizan midiendo la cantidad total de proteína, la capacidad de unión de a-Bgt, y el perfil electroforético. La concentración de proteína obtenida, en las condiciones indicadas en Métodos, es por término medio de 10 mg/ml para las membranas crudas y de 5-7 mg/ml para las membranas alcalinas. La capacidad de unión de a-Bungarotoxina (aBgt) es de aproximadamente 1 .25 nmoles de a-Bgt por mg de proteína en las membranas crudas y 4 nmoles de a-Bgt unida por mg de proteína en las membranas alcalinas. En la Figura 1 .2 se puede observar una electroforesis en gel de poliacrilamidá en condiciones reductoras, de membranas parcial y altamente enriquecidas en AcChR. En la calle Á, se halla la fracción de membranas crudas, en la cual además de las cuatro bandas correspondientes al AcChR, se ven bandas pertenecientes a otras proteínas que se hayan en mucha menor cantidad . En la calle B, se localiza la fracción de membranas alcalinas que no presenta la banda de peso molecular de 43 kDa que se halla en las membranas crudas, indicando que esta proteína periférica se ha extraído durante el tratamiento alcalino . Las bandas de peso molecular aparente 40, 50, 60 y 65 kDa corresponden a las subunidades a, R, y y S respectivamente. Las membranas procedentes de la extracción alcalina se han estudiado extensamente y proporcionan un sistema adecuado con el que comparar el AcChR solubilizado y reconstituido 1.2 AeChR solubilizado y purificado. La purificación del AcChR mediante cromatografia de afinidad comienza con membranas parcialmente purificadas que se solubilizan con colato sódico y se introducen en la columna de afinidad . El lavado y la elución del AcChR se llevan a cabo añadiendo lípidos adicionales al medio, solubilizados con colato, puesto que el no hacerlo implica una pérdida irreversible de las propiedades funcionales del AcChR (Anholt y col. , 1981) . En la Figura 1 .1 se puede apreciar un típico perfil de elución de la columna de afinidad Affigel 10 derivatizado con bromoacetilcolina . El perfil muestra la absorbancia de las fracciones tomadas desde la entrada de las membranas solubilizadas en la columna, pasando por el lavado con lípidos exógenos, hasta la elución con carbamilcolina y lípidos. El lavado elimina la mayor parte de proteína retenida inespecíficamente en la columna. La adición del tampón que contiene carbamilcolina desplaza la unión del receptor a la columna, concentrando el AcChR en pocas fracciones de absorbancia elevada. Partiendo de 200 g de electroplaca se obtiene un

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rendimiento aproximado de unos 25 mg de proteína purificada que eluye a una concentración de 0.8-2 mg/ml

E c

2 .0

^ AcChR so lubi lizado

DB-3

DB-4

c D

ó

0 .5 0 .0

0

20

40

Froccion

60

80

Figura 1 .1 Perfil de elución del AcChR en la columna de afinidad Affigel-

401 . Las flechas corresponden a la aplicación de las membranas nativas solubilizadas, el tampón de lavado suplementado con lípidos (DB-3) y el tampón de elución, suplementado con lípidos y con carbamilcolina 10 mM (DB-4) . Al aplicar este último, el AcChR eluye de la columna, produciendo un aumento en la absorbancia a 280 nm de las fracciones recogidas.

97.4 kDa. 66.2 kDa. 55 kDa. 42 kDa. 40 kDa.

411114

31 kDa.

A

B

C

D

E

F

G

Figura 1 .2 Perfil electroforético del AcChR en diferentes etapas de extracción y purificación . (A) Membranas crudas ; (B) Membranas alcalinas; (C) Membranas crudas solubilizadas con Colato al 2%; (D) Eluído obtenido tras pasar la muestra solubilizada por la columna de Affigel ; (E) Lavado de la columna con tampón DB-3 ; (F) AcChR purificado; (G) Patrones de peso molecular. En el margen derecho se indican los pesos moleculares del patrón empleado .

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El AcChR eluido se caracteriza midiendo la cantidad total de proteína, la capacidad de unión de a-Bgt, y el perfil electroforético . La actividad especifica para estas muestras resultó ser de aproximadamente 60 pg de a-Bgt unida por mg de proteína, coincidiendo con el máximo valor teórico, según el método utilizado de determinación de los sitios de unión de a-Bgt (ver métodos, apartado 10 .2). El perfil electroforético obtenido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, se muestra en la Figura 1 .2 . Las calles C-F, muestran el patrón obtenido en las distintas etapas de purificación del AcChR. En la calle F se hallan únicamente las bandas correspondientes a las cuatro subunidades del AcChR, cuyos pesos moleculares son: a = 40 kDa, B = 50kDa,y=60kDay3=65kDa. 1.3 Reconstitución en vesículas lipídicas En la Introducción se ha comentado la importancia del entorno lipídico en la modulación del AcCW, lo que hace imprescindible una selección adecuada del mismo (McNamee y col., 1986). En este trabajo se han elegido los lípidos de asolectina (también llamada lecitina de soja) puesto que, a pesar de ser un sistema muy heterogéneo, proporcionan un entorno adecuado para reconstituir correctamente el AcChR (Fong y McNamee, 1986). La relación lípido/proteína juega un papel decisivo en la correcta reconstitución del AcChR ; el aumento de dicha relación favorece la disminución de la densidad superficial del AcChR en las vesículas, aunque también produce una subpoblación de vesículas que no contienen receptor. La disminución de la relación lípido/proteína por debajo de ciertos valores conduce a la inactivación irreversible de la función del AcChR (Anholt y col., 1981) . En este trabajo se ha utilizado el método de diálisis de detergente (Paternostre y col., 1988 ; Wrigglesworth y col ., 1987), descrito en el apartado 5.2 de Métodos que permite variar la relación molar lípido/proteína según los requerimientos del experimento. En la mayoría de los trabajos realizados en la presente memoria la relación molar lípido/proteína ha sido de 4000. Las vesículas resultantes son unilamelares y contienen incorporado al AcChR con los sitios de unión de a-Bgt orientados en más de un 90% hacia el medio extravesicular (González-Ros y col ., 1980 ; González-Ros y col., 1981 ; Paraschos y col ., 1982) . 1.4 Reconstitución en liposomas gigantes. Durante el desarrollo de los experimentos conducentes a la realización de la presente Memoria se puso a punto un nuevo método de reconstitución de proteínas transmembrana, la reconstitución en liposomas gigantes . A

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contiíiuación se describe con detalle el proceso de formación de los liposomas gigantes, por ser un método novedoso en comparación con la reconstitución en vesículas lipídicas descrita en el apartado anterior . -

- ..p: ~,a

B

.

Y w "

-

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" aK.,cV

" l f '.- v. .. -

^ .~ "a . : -al^i

Figura 1 .3 Cinética de formación de los liposomas gigantes. Rehidratación de una mezcla de vesículas lipídicas de asolectina y membranas de 7: marmorata que ha sido previamente deshidratada . En A se observa esta mezcla momentos antes de la rehidratación, en B, C y D tras 1 minuto, 1 hora y 3 horas de haber añadido la solución de hidratación (NaCI 50 mM) . 400 Aumentos.

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Para comprobar la validez de este nuevo método se utilizó como modelo de proteína transmembrana el AcChR. La formación de liposomas gigantes, hasta de 60 pm de diámetro, se lleva a cabo mediante la deshidratación parcial y posterior rehidratación de una mezcla de vesículas conteniendo AcChR procedente de T. marmorata y vesículas lipídicas previamente formadas (Criado y Keller, 1987; Keller y col ., 1988) . El proceso comienza inmediatamente después de la hidratación de ésta mezcla, continuando durante varias horas después. La formación de liposomas al hidratar la muestra puede seguirse mediante microscopía óptica, observándose, el aumento gradual de tamaño de éstos. En la Figura 1 .3, se observa la secuencia de formación de los liposomas durante el período de rehidratación, seguida mediante microscopía óptica. 1.4.1 Factores determinantes Son muchos los factores que influyen en la formación de los liposomas gigantes : i) El tipo de lípidos utilizado en las vesículas lipídicas de partida. La utilización de lípidos de asolectina, procedentes de semilla de soja, da lugar a liposomas de gran tamaño. Con fosfatidilcolina purificada de huevo, en idénticas condiciones que la asolectina, no se produce la formación de liposomas visibles a microscopía óptica. fi) El método de preparación de las vesículas lipídicas de partida. Las vesículas formadas por sonicación (SUV), dan lugar a escaso número de liposomas y de pequeño tamaño; cuando las vesículas lipídicas, además de sonicarse, se solubilizan con detergente, y posteriormente se dializan, mejora mucho el rendimiento de formación de los liposomas. üi) El tipo de detergente empleado en el proceso de solubilización tiene gran influencia. El uso de colato sódico, da lugar a pocos liposomas y de pequeño tamaño, muy semejantes a los obtenidos mediante sonicación del lípido en ausencia de detergente . Tanto CHAPS como OG, dan lugar a un abundante número de liposomas, pero mientras que con CHAPS se obtienen liposomas mayoritariamente esféricos, el uso de OG da lugar a una mezcla de liposomas esféricos y estructuras tubulares diversas . Estas estructuras tubulares se cierran sobre sí mismas dando lugar a estructuras espirales aparentemente esféricas, que pierden tanto su apariencia globular, como su consistencia al ser tocadas por la punta de la pipeta de patch. iv) El tiempo tanto de deshidratación como de rehidratación de la muestra. En la fase de deshidratación, se han probado tiempos desde 1 hasta 5 horas, obteniéndose liposomas gigantes en todo caso. Se ha elegido como

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tiempo óptimo de deshidratación 3 horas, pues se ha comprobado que en éste tiempo, la deshidratación de la muestra no daña la actividad de la proteína incorporada, y los liposomas resultantes poseen una buena resistencia frente a la pipeta de patch al realizar el sello . Cuando el tiempo de deshidratación es menor de 3 horas la obtención de sellos se complica mucho como consecuencia de la escasa consistencia de los liposomas, y de los sellos obtenidos, una gran mayoría no presenta actividad de canal iónico. Cuando éste tiempo es mayor de tres horas, los registros obtenidos presentan un patrón de actividad muy complejo, indicando probablemente, que la proteína se ha dañado durante la deshidratación . La rehidratación, admite aún mayor margen de tiempo, entre 12 y 36 horas se obtiene abundantes liposomas gigantes en los cuales no se daña el AcChR incorporado. Con tiempos menores o mayores que éstos, no se obtuvieron buenos resultados . Cuando el tiempo de hidratación fue menor de 12 horas, los liposomas estaban todavía en fase de formación, sin haber alcanzado el tamaño óptimo . En tiempos superiores a 36 horas, los liposomas pierden la estructura esférica así como la estabilidad. v) La fuerza iónica del medio es un parámetro fundamental durante el período de formación de los liposomas y, más drásticamente, en la fase de rehidratación . La hidratación con disoluciones de fuerza iónica alta (NaCI 500 mM), disminuye en gran medida la consistencia de los liposomas, llevando en muchas ocasiones a la ruptura de éstos tras su formación. Una fuerza iónica baja (NaCI 50 mM) es la idónea durante el proceso de rehidratación, pudiendo aumentarse lentamente al finalizar éste período. vi) La temperatura a la que se lleva a cabo éste ciclo . El número y tamaño de los liposomas resultantes disminuye en gran medida cuando el proceso se realiza a temperatura ambiente . Una temperatura de 4 °C resulta favorable tanto para el proceso de formación de los liposomas, como para la conservación de éstos hasta el momento de su utilización. En resumen, la formación de liposomas gigantes es un proceso complejo y dependiente de gran cantidad de variables experimentales en el que conviene, por tanto, detallar con precisión las condiciones utilizadas en cada caso. Los estudios incluidos en éste trabajo se han hecho con liposomas formados a partir de membranas de T. marmorata (o bien AcChR purificado y reconstituido), y vesículas lipídicas de asolectina, que a su vez, se han formado mediante solubilización y posterior diálisis del detergente CHAPS. Según el método de formación descrito en Métodos (apartado 6.1), que incluye las condiciones que optimizan el proceso. Se forman liposomas hasta de 60 pm de diámetro, pero los más abundantes se hallan en un rango entre 1 y 15 Im de diámetro . En la

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Figura 1 .4, se observa la distribución de tamaños de los liposomas gigantes vistos a microscopía óptica. 25 20 Ic m

15

a> -o c

10

m

0

10

20

30

40

50

60

Diámetro fm) Figura 1 .4 Distribución de tamaños. Liposomas gigantes formados en las condiciones óptimas seleccionadas. Se observa en la Figura que se forma liposomas de hasta 60 pm de diámetro pero los mas abundantes se hallan entre 5 y 15 pm de diámetro .

1.4.2 Estudio de la relación AeChRfosfolípido en los liposomas gigantes.

Se ha estudiado la relación receptor/fosfolípido del sistema con el fin de conocer, tanto el rendimiento de formación de los liposomas gigantes, como la densidad final de AcChR incorporado en ellos . Los resultados obtenidos indican que esta densidad varia proporcionalmente a la relación de lípido y de AcChR de partida. Se ha estudiado la relación AcChR-fosfolípido tanto en liposomas gigantes fraccionados mediante gradiente de sacarosa, como en liposomas gigantes sin fraccionar. La relación molar AcChR/fosfolípido permanece constante en ambos casos, indicando que la pérdida de material a lo largo del fraccionamiento no es selectiva. En el material de partida, también se mantiene constante esta relación, indicando la ausencia de selectividad en la pérdida de material a lo largo de todo el proceso. Cuando se parte de 1 .7 ml de lípidos de asolectina 13 mM y 100 !ig de membranas alcalinas, con una actividad específica de 5 nm 125 1-a-Bgt/mg proteína, el rendimiento de formación de liposomas es del 70%, y la relación molar final lípido/AcChR hallada es 2.5 x 10-5 sitios de unión a-Bgt/PL . Esta relación permanece constante siempre que lo hacen las cantidades de lípido y receptor de partida. 1.4.3 Mecanismo deformación de los liposomas gigantes. 1.4.3a Estudio de la distribución del material de partida.

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Se han utilizado membranas de T marmorala marcadas con FITC en Ja formación de liposomas gigantes, con el fin de observar si los componentes de estas membranas se mezclan y redistribuyen homogéneamente con los de las vesículas lipídicas de partida durante el proceso de formación de los liposomas.

Figura 1 .5 Microscopía de Fluorescencia . Liposomas gigantes formados mediante la fiisión de vesiculas lipidicas con membranas de Torpedo, que han sido marcadas previamente con FTIC . Se observa una distribución homogénea del marcador fluorescente en el contorno del liposoma, que sugiere la redistribución de las membranas de partida en los liposomas gigantes resultantes . A Contraste de fases . B Fluorescencia . 320 Aumentos .

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Los liposomas formados con éstas membranas muestran fluorescencia homogénea en todo el contorno del liposoma sugiriendo, que durante su formación hay redistribución homogénea del material que presenta grupos amino libres, esto es, los componentes de las membranas marcados fluorescentemente se hallan uniformemente distribuidos en el liposoma gigante . En la Figura 1 .5, se observa un campo de liposomas marcados con FITC, que no ha sido sometido a ningún lavado después de ser sembrado . 1.4.3b Estudio de la redistribución del AeChR Se han utilizado para éste estudio liposomas gigantes formados tal y como se ha descrito en Métodos (apartado 6.1), se incuban con TMR-a-Bgt, durante 2h. a 4°C; a continuación se siembran en placas de Petri y se observan en un microscopio equipado para epifluorescencia, con el objeto de ver si la TMR-aBgt, y con ella el AcChR, se distribuye homogéneamente en el liposoma gigante durante el proceso de formación. En la Figura 1 .6, se observa la distribución homogénea de la TMR-a-Bgt en los liposomas gigantes . Como control, se incubaron liposomas que no contenían AcChR con TMR-a-Bgt, observándose que, en este caso, los liposomas no se marcan fluorescentemente . 1.4.4 Caracterización funcional de membranas nativas de Torpedo reconstituidas en liposomas gigantes Existen diversos métodos electrofisiológicos que permiten la caracterización funcional y farmacológica de canales iónicos, pero muchos de estos métodos tradicionales presentan limitaciones ya sea de accesibilidad o de complejidad técnica del proceso experimental. Una alternativa de reconstitución interesante se basa en la obtención de liposomas con el tamaño comparable al de una célula con el fin de estudiar los canales utilizando el patch-clamp como técnica de registro ; para hacerlo hay que comprobar que la incorporación de un canal iónico en liposomas gigantes, no causa alteración en los parámetros funcionales conocidos . Con éste propósito, se han realizado estudios con membranas de T. marmorata altamente enriquecidas en AcChP, incorporadas en liposomas gigantes . 1.4.4a Actividad del AeChR en liposomas gigantes Se han utilizado membranas de Torpedo reconstituidas en liposomas gigantes, para comprobar la viabilidad del sistema de reconstitución, obteniéndose los resultados que se exponen a continuación. Los liposomas gigantes, formados tal y corno se describe en Métodos (apartado 6. l), con o sin proteína incorporada permiten la formación de sellos

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de alta resistencia (GQ), y parches de membrana en la configuración "inside. out"

:

Figura 1.6 Microscopía de Fluorescencia . Liposomas gigantes formados en las

condiciones habituales e incubados posteriormente con TMR-a-Bgt Se observa la fluorescencia distribuida homogéneamente en el contorno del liposoma gigante, que indica la redistribución en los liposomas gigantes . A. Contraste de fases. B. Fluorescencia . -3-7-- ~~-s .

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En liposomas gigantes sin proteína incorporada, esto es formados con vesículas de asolectina en ausencia de membranas de T. marmorata, no se detecta actividad eléctrica en un rango de potenciales en la pipeta entre ±150 mV ( n=10 ) . Todos los experimentos se han realizado en soluciones simétricas Hepes 4 mM, pH 7,4, NaCI 100 mM, CaC12 0.1 mM y con acetilcolina 5 p.M en la pipeta. La convención de signos empleada para el potencial y las soluciones es la misma para todos los experimentos ; se da el potencial de pipeta. En los liposomas con el AcChR incorporado, en ausencia de activación colinérgica, se halló actividad eléctrica característica de un canal iónico, tan sólo en el 11 % de los casos (n=9) . Las características de éste canal son muy similares a las encontradas para el canal de cloruro de la cara no inervada del tejido eléctrico de T marmorata por Miller y col. , (1983), que también es independiente de la activación colinérgica. Cuando los liposomas gigantes se incuban previamente con exceso de a-Bgt, con (n = 6) o sin (n=7) la presencia de AcCh 5 ptM en la pipeta, o bien con AcCh y un exceso de 10 a 20 veces molar de d-tubocurarina en la pipeta, se obtiene la misma actividad eléctrica y una probabilidad similar de encontrar sellos activos, que en ausencia de activación colinérgica.

11111111*""~~ V

r

A

20.5 m s

,'IAIjJ*JV*,y" Hl~

+65 mV

B r

n "

S.opA L0 s

+50 mV

Figura 1.7 Registro representativo de canal único, obtenido en liposomas gigantes mediante la técnica de patch-clamp en la configuración "inside-out", en respuesta a estimulación colinérgica (acetilcolina 5 p.M en la pipeta). Realizado en tampón Hepes 4 mM, pH 7,4, NaCI 100 mM, CaC12 0.1 mM, en condiciones simétricas. A. Fragmentos de registro a +65 mV, el nivel cerrado se indica con "C", y el nivel abierto con "O" . En B se muestra el mismo registro que en A a +50 mV, a distinta escala de tiempo . Las flechas indican apertura y cierre de un subnivel de corriente asociado al canal iónico del AcChR .

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En condiciones de activación colinérgica se obtiene una situación más compleja. En presencia de AcCh 5 pM en la pipeta y en condiciones iónicas simétricas, se obtienen registros con un patrón de actividad eléctrica complicado durante los primeros segundos, o incluso minutos, siguientes a la formación del sello. A continuación disminuye ésta actividad y es posible obtener registros correspondientes a fluctuaciones entre dos o más niveles de corriente, asociables a la apertura y cierre de un canal fónico. A la concentración de proteína indicada en Métodos (apartado 6.1), se halla actividad eléctrica en repuesta a una concentración 5 pm de AcCh en el 51 % de los casos (21 de un total de 41 sellos), disminuyendo o aumentando la concentración de proteína inicial se consigue una disminución o aumento del número de sellos activos. Concentraciones mayores de proteína dificultan mucho el análisis de los registros obtenidos. En la preparación estándar de liposomas, con AcCh 5 pM en la pipeta y en condiciones simétricas de NaCI (100 mM), se encuentra el patrón de actividad que se muestra en la Figura 1 .7. De la actividad de canal único observada en sellos aislados en la configuración "inside-out", el canal más frecuentemente obtenido tiene una conductancia de 78 pS y un subestado de 23 PS. I (pA) 7.0-

40-1

l.0079~Ak

40D

80A V (MV)

-5 .0-

Figura 1.8 Curva corriente-potencial (I-V) obtenida para el nivel principal de corriente ("), y el subnivel (O) mostrados en la Figura 2.6 . Realizado en condiciones iónicas simétricas en tampón Hepes 4 mM, pH 7,4, NaCI 100 mM, CaC12 0.1 mM, y con 5 p.M AcCh en la pipeta .

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La Figura 1 .8 muestra la gráfica corriente-potencial (IN), obtenida para las distintas aperturas a distintos potenciales, para el principal nivel de corriente, y el subnivel asociado. Ambos tienen un comportamiento óhmico, dentro del rango de potencial estudiado, y en condiciones de NaCI 100 mM simétricas. Los valores de conductancia estimados son 78.6 ± 10.8 pS (n=14) para el nivel principal y 24.9 ± 4.1 pS (n=9) para el subestado. Se han realizado experimentos similares, con 5 pM AcCh pero en condiciones iónicas asimétricas (NaCI 100 mM en la pipeta y NaCI 190 mM en el baño), con el propósito de determinar el potencial de inversión del sodio para el nivel principal de corriente y el subnivel (Figura 1 .9). Los potenciales de inversión para ambos niveles fueron iguales, +12 mV, que es cercano al potencial de inversión para Na+ esperado en estas condiciones (+ 16 mV a 20° C).

7.0-

r

G.0

-G0.0 =i .0-~

-5.0 J Figura 1 .9 Curva corriente-potencial obtenida en condiciones fónicas asimétricas, en las que la pipeta contiene idéntico tampón que la Figura 2.7 y el baño contiene una concentración 180 mM NaCI. La flecha indica el potencial de inversión para el nivel principal de corriente (") y el subnivel (0) en condiciones iónicas asimétricas.

La presencia de 4 p,M TTX, en la pipeta, o bien en la pipeta y en el baño no tiene efecto en la actividad del canal iónico detectada. La sustitución de Na+ por K+ en la solución del baño, (NaCI 100 mM en la pipeta y KG 100 mM en el baño), da lugar a curvas 1-V, con un potencial de inversión cercano a cero, para ambas conductancias indicando que la permeabilidad del canal para los cationes monovalentes es muy parecida. Esto se confirmó utilizando

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condiciones simétricas de KG 100 mM, en lugar de NaCI, a ambos lados del parche. La conductancia de canal iónico estimada es similar a la calculada en presencia de NaCI 100 mM simétrico. Tras obtener estos resultados podemos afirmar que este canal se corresponde con el canal asociado al AcChR en base a las siguientes evidencias

experimentales : 1- Es activado por AcCh y su potencial de inversión corresponde al potencial de inversión del sodio . 2- No es sensible a TTX y es inhibido por a-Bgt o D-Tub, siendo ambos ligandos del AcChR. 3- Las permeabilidades para el sodio y el potasio son similares, 1o que concuerda con la escasa selectividad observada en el AcChR para cationes monovalentes (Lewis y Stevens, 1983). 4- La alta probabilidad de obtener éste canal y no otros, se correlaciona con la abundancia del AcChR en las membranas utilizadas como material inicial. Además, la probabilidad de encontrar sellos activos decrece con el aumento de la concentración de agonista en la pipeta, por otro lado, se detecta una mayor actividad en los momentos iniciales del sello, sugiriendo ambos sucesos un proceso de desensibilización característico del AcChR.

1.4.4b Orientación del AcChR en liposomas gigantes

Un aspecto interesante para la completa caracterización de éste método es estudiar si la orientación del receptor en las membranas nativas, con los sitios de unión al agonista en la cara externa, se conserva durante la incorporación en liposomas gigantes . Para ello, se ha registrado mediante la técnica de patchclamp, la actividad eléctrica tras la aplicación del agonista, acetilcolina, en ambas caras del receptor . Los sellos realizados en liposomas gigantes que no responden a la presencia de AcCh en la pipeta, así como los sellos no expuestos al agonista colinérgico, no responden a la adición de AcCh a la solución del baño, indicando que los lugares de unión a AcCh no están expuestos a la solución del baño en los sellos de configuración "inside-out" .

2 OBTENCIÓN DE LAS FORMAS MONOMÉRICA Y DIMÉRICA DEL AeChR.

En el órgano eléctrico de Torpedo en estado nativo, el AcChR se encuentra predominantemente en forma dimérica, esto es, dos moléculas de receptor están unidas covalentemente mediante un puente disulfuro entre las subunidades S de dos monómeros adyacentes . Cuando la homogeneización del tejido eléctrico se lleva a cabo en ausencia de agentes alquilantes parte de los

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dímeros se reducen dando lugar a monómeros, probablemente debido a la presencia en la membrana de una proteína cercana al AcChR que contiene grupos sulfhidrilo con potenciales redox muy bajos. La presencia de agentes alquilantes durante la homogeneización inicial del tejido impide la actuación de esta proteína, conservando la mayoría de los receptores en forma dimérca (Chang y Bock, 1977). El método de aislamiento de las membranas, empleado en este trabajo incluye una concentración 5 mM de iodoacetamida en el tampón de extracción, lo que favorece que el AcChR permanezca en forma dimérica durante el proceso de purificación (Métodos, apartado 3 .1) . La forma monomérica se obtiene mediante tratamiento con el agente reductor DTT (Métodos, apartado 7 .1) .

a-a-

a_

#411ft 4911W A

Figura 2.1 SDS-PAGE en condiciones no reductoras del AcChR purificado y reconstituido en ambos estados de agregación . En A se observa el patrón de subunidades correspondiente al dímero, la subunidad S se encuentra unida mediante puentes disulfuro 8-8 (S2 peso molecular 130.000 Da). En B, como consecuencia de la reducción, se observa la desaparición de la banda 82, y la aparición de la subunidad S (65.000 Da) correspondiente a la forma monomérica del AcChR

En todas las muestras utilizadas en la presente memoria, tanto en membranas alcalinas enriquecidas en AcChR como en el caso del receptor purificado y reconstituido, se ha utilizado la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras, para analizar el estado de agregación correspondiente a las preparaciones obtenidas (Laemmli y

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col. , 1970). Cuando la muestra se halla en estado nativo las subunidades 8 de dos monómeros adyacentes se encuentran unidas de modo covalente formando el dímero s-3. Tras el tratamiento de las muestras con el agente reductor y su posterior eliminación, se observa la desaparición de la banda correspondiente al dímero 32 y la aparición de una banda correspondiente a la subunidad 8 perteneciente a la forma monomérica del receptor, lo que indica que la reducción de la subunidad 32, no se revierte, siendo la forma monomérica estable en el tiempo . En la Figura 2.1, se muestra el patrón electroforético obtenido en una preparación de AcChR purificado y reconstituido, tanto en estado nativo, como después del tratamiento y posterior eliminación del agente reductor . Un densitograma de estos geles muestra que aproximadamente un 80% del receptor se halla en la forma dimérica en estado nativo y monomérica después del tratamiento. En la Figura 2.2 se presenta el densitograma correspondiente.

0

10

L

20

30

*.250-

40

a ~, 60 70

, 80

0

0

w

10

^

20

MM

].

30

U.

40

50

. `*10

80

80

mm

Figura 2.2 Densitograma del AcChR nativo (A) o tratado con DTT (B). En la Figura se muestran dos densitogramas representativos de la electroforesis presentada en la Figura 2.1 .

3 ESTUDIO DE LAS FORMAS MONOMÉRICA Y DIMÉRICA DEL RECEPTOR PURIFICADO MEDIANTE CRIOFRACTURA. Mediante la microscopía electrónica de criofractura estudiamos las características morfológicas de las distintas formas agregadas del receptor purificado, reconstituido en liposomas gigantes . La alta resolución de esta técnica permite observar las partículas intramembranosas (IMPs) en los

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liposomas gigantes, permitiendo establecer una correspondencia entre estados de agregación definidos del AcChR (monomérico y dimérico) y las imágenes de criofractura a que dichos agregados dan lugar.

r,s 5

F

*ay'i l,

e . Figura 3.1 Imagen de microscopía electrónica de Criofractura . Vista panorámica de los liposomas. Aumentos 136.000.

Las réplicas de las hemicapas de las membranas de los liposomas gigantes, estudiadas de ésta manera aparecen sembradas de pequeñas protuberancias, denominadas partículas intramembrana (IMPs), debidas a la presencia del receptor . Del mismo modo, se ha comprobado que los liposomas gigantes que no contienen AcChR carecen de partículas intramembrana, y aparecen como superficies lisas al ser fracturados. La Figura 3 .1 muestra una

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réplica de criofractura en la que se observa el aspecto general de los liposomas estudiados mediante esta técnica. Se han observado IMPs en los liposomas formados (Figura 3 .2), y se han diferenciado los distintos estados de agregación del receptor por poseer estas un tamaño distinto.

14

§JIVI, ~~

W AV >" .4H - `C " ZC"i"

,;

r ~[ . . . . .r-6 .

:. .

Figura 3.2 Imagen de microscopía electrónica de criofractura de membranas alcalinas incorporadas en liposomas gigantes. Cara P de la membrana de un liposoma . Aumentos 220.000 .

En la tabla III se muestra el diámetro de las IMPs antes y después del tratamiento con DTT. El diámetro de partícula disminuye en la muestra que ha sido reducida, desde 13 iun hasta 9 nm. Se observa también en la tabla que en

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la muestra no reducida el 80% de las partículas tienen un diámetro correspondiente a la forma dimérica del receptor, y que tras la reducción solo un 20% de las partículas tiene este diámetro . Tabla 111: Análisis de las imágenes de criofractura obtenidas en liposomas gigantes con el AcChR purificado y reconstituido en estado nativo, y tras el tratamiento con el agente reductor.

AcChR nativo

AcChR reducido 9 ± 0,1 nin

270

404

81 ± 2

22 ± 3

12,5 nm

8,4 nm

N

13 ± 0,2 nin IMPS - 10 nm

~ M: Diámetro correspondiente al valor medio ( ± S .E .M.) N: Número de IMPs medidas en cada muestra. IMPS >10 nm: Porcentaje de IMPs con diámetros superiores o iguales 10 a nm (± S.E .M.) observadas en cada muestra . IE :Diámetros correspondientes al valor más frecuente encontrado en cada una de las muestras analizadas . o Las dos poblaciones fueron significativamente diferentes con P < 0,001 .

Otra forana de ver estos mismos resultados, es mediante la representación gráfica del diámetro de partícula frente a la frecuencia de aparición. En la Figura 3 .3, se distinguen claramente dos poblaciones de partículas con un distinto tamaño, dependiendo del estado de agregación del receptor. 40 o 0 DTT . 5 DTT °~. 30 c 0 Ú l0

m 20 V C Ol

U

10 z 0

5

10

15

20

Diametro IMPs (nm)

25

30

Figura 3.3 Representación gráfica del tamaño de partículas . Las dos poblaciones son claramente diferentes al representar el tamaño de partícula frente a la frecuencia de aparición.

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4 IRREVERSIBILIDAD ESPONTÁNEA DE LA REDUCCIÓN DEL PUENTE DISULFURO RESPONSABLE DE LA FORMA DIMÉRICA DEL RECEPTOR.

Se ha estudiado el efecto de la reducción con DTT en el AcChR, con el fin de saber cuantos puentes disulfuro se reducen con el tratamiento realizado (Métodos apartado 7.2), y de estos cuantos permanecen reducidos al eliminar el agente reductor del medio . El método utilizado se basa en alquilar los grupos sulfhidrilo libres en la molécula con iodoacetamida y, tras someterlos a hidrólisis ácida, detectarlos en análisis de aminoácidos como carboximeflcisteinas (Gavilanes y col ., 1983). De este modo, se han detectado los grupos sulfhidrilo libres, en las cuatro situaciones indicadas en Métodos (apartado 7.2) : (a) se alquilan todos los grupos sulfhidrilo presentes en el receptor tras la reducción con DTT, y en presencia de este; (b) se alquilan los sulfhidrilos presentes como tales en la proteína en estado nativo; (c) se alquilan los grupos sulfhidrilo presentes en el AcChR tras la reducción y posterior eliminación del DTT; (d) se alquilan los grupos sulfhidrilo presentes en el receptor nativo tras ser procesado en paralelo con la muestra (c). En (b) y (d) el receptor se encuentra en estado nativo, estas situaciones se utilizan de control con respecto a las situaciones (a) y (c) en las que el receptor se ha reducido con DTT. Con el fin de diferenciar los grupos sulfhidrilo presentes en la molécula nativa de los debidos a la reducción con DTT, la situación (b) se resta de la (a), y la (d) se resta de la (c). Después de haber hecho esta substracción, los resultados obtenidos (tabla 1V) indican que tras el tratamiento con DTT (situación a), se producen 6 grupos sulfhidrilo en la molécula, esto es se han reducido tres puentes disulfuro (S-S). Cuando después del tratamiento se elimina el agente reductor (situación c), solo dos grupos sulfhidrilo permanecen como tales, y el resto se reoxidan. Estos datos permiten concluir que de los tres puentes disulfuro reducidos tras la incubación con DTT, dos de ellos se reoxidan al eliminar el agente reductor, y solo uno permanece reducido . La identificación del puente disulfaro que permanece reducido al eliminar el agente reductor, se realiza mediante electroforesis (SDS-PAGE) . En la figura 2.1 se observa que como consecuencia del tratamiento con el agente reductor la banda correspondiente a la subunidad 82 desaparece, dando lugar a la banda correspondiente a la subunidad 8, asociada a la forma monomérica del receptor . Estos resultados indican que el puente disulfuro que permanece reducido al eliminar el agente reductor es el responsable de la forma dímérica del AcChR.

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Tabla IV: Grupos sullhidrilo libres debidos al tratamiento con DTT, antes y después de eliminarlo .

AcChR(*)

AcChR(x)

0

6,6±1,4

2,3±0,5

S-S

3

1

e : Grupos suilhidrilo producidos debido al tratamiento Expresado como residuos de con DTT . Carboximetilcisteina / molécula de receptor . S-S: Puentes disulfuro reducidos. (*) : AcChR tras la incubación con el agente reductor DTT. (x): AcChR tras la incubación y posterior eliminación del agente reductor DTT.

S. ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEI. AcChR PURIFICADO Y RECONSTITUIDO EN SUS DOS FORMAS MOLECULARES. La banda amida 1 (1700-1600 cm-1 ) del espectro de infrarrojo de proteínas debida a vibraciones del enlace peptídico, es la banda dependiente de conformación mejor conocida y caracterizada. La frecuencia de vibración de esta banda depende de la naturaleza de los puentes de hidrógeno en los que se ve implicado el enlace C=0, que a su vez depende de la estructura secundaria que adopta la proteína . La banda amida 1 resulta del solapamiento de otras bandas componentes, originadas por diferentes motivos estructurales, (X-hélices, hojas (3, giros y estructura no ordenada. La información estructural que puede obtenerse a partir de la amida 1 está limitada por el solapamiento de bandas individuales que conforman la banda total, por lo que es necesaria la aplicación de métodos matemáticos de estrechamiento de bandas (derivación y deconvolución) para visualizar mejor estos componentes individuales . La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-1R) ha demostrado un gran potencial a la hora de detectar cambios entre diferentes confórmeros de proteínas de membrana complejas (Arrondo y col ., 1987 ; He y col ., 1991 ; Rotschild 1992), e incluso del AcChR (Fong y McNamee, 1987; Fernández Ballester y col ., 1992). Por ello se ha utilizado el estudio de la banda amida 1 para detectar los cambios producidos en la estructura secundaria del AcChR debidos al tratamiento con el agente reductor DTT (ver Métodos apartado 7.1 ) .

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Resultados

La banda amida 1 del AcChR reconstituido en lípidos de asolectina, tanto en condiciones nativas como tras el tratamiento con el agente reductor DTT es una banda compleja; las pequeñas diferencias entre ambas muestras observadas en el espectro original se han tratado de cuantificar con el ajuste de las bandas componentes. Empleando las técnicas de estrechamiento de banda, derivada y deconvolución, observamos que presenta los siguientes máximos: 1690, 1680, 1670, 1657, 1642, 1630, 1612 y 1605 cm -1 . Mientras los componentes de 1605 y 1612 cm-' corresponden a vibraciones de cadenas laterales de aminoácidos, los restantes componentes se han asignado a vibraciones del grupo carbonilo del enlace peptídico que forma parte de los distintos motivos de estructura secundaria: la banda de 1657 cm-1 se atribuye a a-hélice, la de 1630 cm-' a hoja R, la de 1642 cm- ' a estructura no ordenada y las restantes a giros (Arrondo y col ., 1987 ; Fernández Ballester y col., 1992) . En la figura 5 .1 se muestran los cambios producidos en la banda amida 1, debidos al tratamiento con el agente reductor DTT (ver Métodos apartado 7.1). En el espectro original (A), se aprecia un estrechamiento en la banda amida 1 de la muestra tratada con respecto a la muestra nativa . Estos cambios se ven mucho mejor en el correspondiente espectro deconvuelto (B).

A

1700

B

1650 Número de onda, cm -'

1600

1700

1650

1600

Número de onda, cm -'

Figura 5.1. Banda Amida 1 del AcChR reconstituido en sus dos formas moleculares. Se muestran los espectros originales (A) y deconvueltos (B) del AeChR en forma nativa (traza continua) y en forma reducida (traza discontinua) .

Los cambios producidos por el tratamiento realizado se reflejan en una disminución de la absorbancia a 1630 cm-1 (hojas R) sin modificarse la absorbancia a 1657 cm-1 «x-hélices). Para llevar a cabo la estimación cuantitativa de la estructura secundaria del AcChR se realiza la descomposición de la banda amida 1 original siguiendo el método de Castresana y col. (1988) y Arrondo y col. (1993), tal y como se ha

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Resultados

10 4

indicado en Métodos apartado 9. Los porcentajes de área obtenidos para los distintos motivos estructurales se muestran en la tabla V. Tabla V. Estimación cuantitativa de la estructura secundaria del AcChR a partir de los datos obtenidos de los ajustes de componentes de la banda Amida I. Los valores que se muestran se corresponden con los porcentajes de área obtenidos para cada componente . 1680 cm (giros)

-1

-1

1670 cm-' 1657 cm - ' 1642 cm 1630 cm-1 (giros) (a hélice ) (Estructura al azar) (hojas R )

AcChR control

3 .7±1 .1

5.5±3 .3

40.3±1 .9

20.0±1 .6

30.5

AcChR nativo

4 .82

1 .66

39.3

20 .8

33 .4

AcChR reducido

4 .24

1 .75

43 .5

28.0

23 .6

.4,

Otra forma de ver estos mismos resultados es mediante la representación. gráfica del porcentaje de área obtenido en cada una de las formas estructurales en ambas muestras (Figura 5 .2) . ® AeChR nativo 0 AcChR reducido 40

30 Q 20 10 1680

1670

1657 1642 Número de onda, cm- '

1630

Figura 5.2. Efecto del tratamiento con DTT sobre la estructura secundaria del AeChR purificado y reconstituido. Se representa el porcentaje de área obtenido para el receptor en ambos estados de agregación, en cada una de las distintas formas estructurales presentes en la banda amida 1 del espectro FT-IR. .

El análisis de la banda amida I, indica que el tratamiento con DTT no afecta de modo significativo al porcentaje de estructura de a-hélice en el AcChR (banda a 1657 cm-1), permaneciendo en torno al 40% en ambos casos. Sin embargo hay una variación significativa en las bandas a 1642 y 1630 cm-1, asignadas a hojas R y estructuras al azar. La banda a 1630 cm -1 pasa de un 20% en las muestras nativas a un 28% en las muestras reducidas, mientras que la

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Resultados

banda a 1612 cm-1 , pasa de un 33% en las muestras nativas a un 23 .6% en las muestras reducidas (figura 5 .2) . Se ha sometido al AcChR purificado y reconstituido tanto en forma nativa como reducido, a desnaturalización térmica. Para ello se han tomado espectros IR a intervalos de temperatura crecientes con el fin de inducir cambios estructurales grandes en el receptor, como consecuencia de la desnaturalización térmica.

B

A v 22 .1 ~ , .69 l /_65 61 58 55 C- 51 ~48 ` -~44 ~40 ~36 32 ~-~, 30 -,27 -1\ 23 21

1700 1675 1650 1625 1600 Número de onda, cm -`

22 .9 69 .3 .4 6561 . 9 5 .3 54 .6 52 .0 48 .1 44 .1 40 .3 36 .8 32 .9 31 .1 28 .1 23 .6 21 . 5

.0 .4 .9 .6 .0 .6 .1 .1 .3 .8 .9 .1 .4 .5 .3

1700 1675 1650 1625 1600 Número de onda, cm -'

N

69 .0

48 .1 44 .1 21 . 3

1700

1650 1600 Número de onda, cm"

Figura 5.3. Dependencia con la temperatura del espectro de infrarrojo del AcChR purificado y reconstituido en estado nativo (A) y reducido (B). En C se muestra la comparación a distintas temperaturas de los espectros de AcChR en estado nativo (traza continua) y reducido (traza discontinua) . Espectros deconvueltos de la banda amida 1, registrados a las temperaturas indicadas (°C) .

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Resultados

Estudiando los cambios producidos en la banda amida 1 del espectro deconvuelto, se pueden apreciar las variaciones estructurales dependientes de la temperatura. Se observa una disminución de estructuras organizadas, como a hélice y hojas (3 y la aparición de dos componentes espectrales a 1620 y 1684 cm-1 , típicos de la desnaturalización de proteínas. Estos últimos componentes se han asignado a interacciones entre cadenas desordenadas o extendidas, relacionadas con la agregación de proteínas desnaturalizadas térmicamente (Castresana y col ., 1992). La figura 5 .3 muestra la pérdida de estructura proteica del AcChR en estado nativo y reducido, inducida por calor, así como la comparación entre ambas formas moleculares. La monitorización de los efectos térmicos que se producen en la proteína y se reflejan en su espectro, se puede llevar a cabo midiendo la anchura total de la banda amida 1 a la mitad de la altura . En la figura 5 .4 se representan estos datos frente a la temperatura . Cuando se hacen estas representaciones, se obtienen curvas de tipo siginoide, cuyos puntos de inflexión coinciden en un estrecho rango de temperaturas ; siendo 49.0 °C en la muestra nativa y 49 .7 °C en la muestra reducida. Estas temperaturas de desnaturalización del AcChR son similares a las encontradas por diferentes procedimientos calorimétricos, DSC (Farach y Martínez-Carrion, 1983) e inactivación térmica (Artigues y col ., 1987).

58 56 54-

461 44-

AcChR nativo [;;-AcChR reducido

Temperatura, °C

Figura 5.4. Estabilidad térmica del AcChR purificado y reconstituido en forma nativa y reducida. Se representa la anchura de la banda Amida 1 a mitad de altura en función de la temperatura . Los puntos de inflexión de las curvas sigmoideas coinciden en un rango estrecho de temperaturas siendo 49 .0 °C en la muestra nativa y 49.7 °C en la muestra reducida .

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Resultados

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6 ESTUDIO DE LAS TRANSICIONES ENTRE LOS DISTINTOS ESTADOS DE AFINIDAD INDUCIDAS POR AGONISTA EN EL RECEPTOR EN FORMA NATIVA Y TRATADO CON EL AGENTE REDUCTOR.

Una de las propiedades funcionales del AcChR es la capacidad de producir transiciones entre los distintos estados de reposo, abierto y desensibilizado, que se diferencian en la distinta afinidad por los agonistas y en el estado, cerrado o abierto del canal fónico asociado al receptor . En el estado de reposo, el canal fónico esta cerrado al paso de cationes, y presenta baja afinidad por agonistas. La unión del agonista produce la apertura del canal y la presencia continuada del mismo da lugar al estado desensibilizado, estado no conductor del AcChR. El proceso de desensibilización se acompaña de un incremento de la afinidad del receptor por el ligando, este fenómeno es una propiedad molecular intrínseca de la proteína, necesaria aunque no suficiente para asegurar que el AcChR sea completamente funcional (Fong y McNamee, 1986) . La capacidad de producir transiciones de afinidad en el AcChR puede verse afectada por diversos factores, entre ellos, el tratamiento con sustancias endógenas y exógenas, la reconstitución en sistemas lipídiços de distinta composición a la nativa, los procesos de inactivación térmica, las modificaciones covalentes en la estructura del receptor, etc.(Ochoa y col.,

1989). Mediante ensayos de cinética de unión de 125 1-a-Bgt al receptor es posible determinar la capacidad del mismo de producir transiciones entre los distintos estados de afinidad por el agonista . Se ha estudiado la formación del complejo 125 1-a-Bgt-AcChR en función del tiempo en las tres situaciones indicadas en Métodos (apartado 10 .3); (a) unión de 1251-a-Bgt al receptor sin competencia con ningún otro ligando; (b) la adición de 125 1-a-Bgt y carbamilcolina simultáneamente, en la que ambos ligandos compiten por los mismos sitios de unión; (c) preincubación del receptor con carbamilcolina y adición posterior de 125 1-a-Bgt. Se han utilizado condiciones en que la toxina se halla en gran exceso sobre el receptor con el fin de obtener una cinética de unión de pseudo primer orden. Cuando el receptor está desensibilizado (alta afinidad por el agonista) tiende a retener el ligando unido, con lo que la velocidad de unión de la toxina al. receptor es menor que cuando está totalmente activo (baja afinidad por el agonista, y por tanto más facilidad para unir toxina). El ensayo de desensibilización inducida por agonista en membranas nativas de Torpedo (ver Métodos, apartado 10.1 y 10.2) da lugar a resultados

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Resultados

como los que se muestran en la Figura 6.1 . La preincubación con el agonista nos asegura que el receptor se encuentra en el estado desensibilizado; la velocidad de unión será siempre más lenta en esta situación (Figura 6.1 c), que cuando se añaden 125 1-a-Bgt y carbamilcolina simultáneamente (Figura 6.lb), puesto que la a-Bgt debe desplazar al agonista de sus sitios de unión de "alta afinidad" (Quast y col., 1978b). 7000

É Ú

m O(]

6000

5000 m c :o

4000

3000

0

50

100

150

200

250

Figura 6.1 Cinética de unión de 1251-a-Bgt al AeChR en vesículas de membranas alcalinas. Se distinguen tres situaciones distintas: en ausencia de agonista (a), adición simultánea de la toxina y el agonista (b), y preincubación del receptor con el agonista (c).

El cálculo de la constante aparente de velocidad de unión de 125 1-a-Bgt al receptor, se realiza mediante la representación de -In (1-cpm (t) / cpm (eq)) frente al tiempo (Figura 6.2); donde cpm (t) son las cuentas de 125 1_(X-Bgt unida en el tiempo t, después del inicio de la reacción y cpm (eq) es el valor de equilibrio, de la radioactividad unida al receptor transcurridas dos horas desde el comienzo de la reacción (Sunshine, y McNamee, 1992) . De la pendiente de esa representación, se obtiene directamente la constante aparente de velocidad de unión a 125 1-a-Bgt, de primer orden k, determinada: en ausencia de carbamilcolina (kmax), cuando el agonista' y la toxina se añaden simultáneamente (kco) y cuando el receptor se ha preincubado con carbamilcolina antes de añadir la 1 25 1-a-Bgt (kpre). Sunshine y McNamee, (1992), han definido que el receptor es capaz de llevar a cabo la transición de afinidad si la constante aparente de velocidad de unión de 125 1-a-Bgt cuando el receptor se preincuba con carbamilcolina es al menos dos veces menor que cuando la toxina y el agonista se añaden simultáneamente. Los experimentos se han realizado tanto en membranas de Torpedo alcalinizadas como en AcChR, purificado y reconstituido . En ambos tipos de

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Resultados

muestra se ha comparado el estado nativo de la proteína (predominantemente dimérica), con el estado de la misma tras el tratamiento con el agente reductor DTT (predominantemente monomérica). Previamente a estos experimentos se ha comprobado que el tratamiento realizado con el agente reductor, no afecta al número total de sitios de unión de a-Bgt al receptor .

U w Q U C 50

100

150

200

250

Tiempo (s)

Figura 6.2 Formación de los complejos 1251-a-Bgt-AcChR en función del tiempo en vesículas de membranas alcalinas . (a) En ausencia de carbamilcolina . (b) Adición simultánea del agonista y la toxina . (c) Preincubación con la toxina antes de la reacción .

6.1 Análisis de las transiciones entre los distintos estados de afinidad inducidas por agonista en membranas de Torpedo alcalinas Se ha estudiado la influencia del estado de agregación del receptor en la capacidad del mismo de llevar a cabo las transiciones de afinidad por el agonista . Los ensayos de desensibilización inducida por agonista en membranas de Torpedo nativas y tratadas con el agente reductor DTT, dan lugar a los resultados que se observan en la Figura 6.3. En dicha Figura se representa la unión de 125 1-a-Bgt al receptor en función del tiempo, en las tres situaciones descritas, tanto en membranas alcalinas nativas (A), como reducidas (B). En los dos estados de agregación se ha observado que : i) en ausencia del agonista, la velocidad de ínteracción de 125 1-a-Bgt con el receptor, es mayor que en presencia del mismo ; ii) cuando las membranas se incuban con el agonista 30 minutos, antes de añadir la 125 1-a-Bgt, la cinética de unión de toxina es significativamente menor que cuando se añaden simultáneamente el agonista y la toxina; iii) en las tres situaciones estudiadas la cantidad de toxina unida a t,, es la misma.

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Resultarlos

110

A

7000 _6 m

(a)

ib)

6000

5000 N C 4000 C

0

3000 I 0

I 50

I 100

I 150

I 200

250

0

5o

100

150

200

250

Tiempo (s) Figura 6.3 Transiciones de estado inducidas por agonista en membranas de Torpedo alcalinizadas. En la Figura se muestra la cinética de unión de 125 1-a-Bgt al AcChR en forma dimérica (A) o monomérica (B) . En todos los ensayos realizados, las concentraciones utilizadas han sido : 0.5x10-7 M de receptor (en términos de sitios de unión de 125 1-a-Bgt), 5x10 -7 M de toxina y 2x106 M de carbamilcolina . Las distintas trazas representan: ausencia de agonista (a), adición simultánea de la toxina y el agonista (b), y preincubación con agonista (c) .

La constante aparente de velocidad de unión de 125 1_a-Bgt al receptor, en las tres situaciones expuestas en la Figura 6 .3, se calcula mediante la representación de -In (1-cpm (t) / cpm (eq)) frente al tiempo. En la Figura 6 .4 se observa esta representación para membranas alcalinas nativas (A) y reducidas (B); la velocidad de unión de la toxina en la situación control (a), no se ve afectada por el tratamiento con el agente reductor. Las constantes aparentes de velocidad de unión a 125 1-a-Bgt obtenidas en membranas de Torpedo alcalinas, nativas y tratadas con el agente reductor DTT, se muestran en la Tabla VI. 5

A

oU 3 p_ 2 U 0

0

o

I ' 50

I 100

I :.. 150

I 200

0

(C) 250

0

50

100

150

200

250

Tiempo (s) Figura 6.4 Representación de -In (1-cpm (t) / cpm (eq)) frente al tiempo, en membranas de Torpedo en forma dimérica (A) o monomérica (B). La pendiente de la recta obtenida permite obtenerla constante aparente de velocidad de unión a 1251_a -Bgt en ausencia de agonista (a), adición simultánea de la toxina y el agonista (b), y preincubación con agonista (c).

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11 1

Tabla VI: Parámetros cinéticos basados en la capacidad del receptor de unir 125 1-a-Bgt en membranas alcalinas en ambos estados de agregación . kmax

kco

kpre

kco i kpre

Membranas nativas

13 ± 1

6,2 ± 0,2

1,4 ± 0,1

4,4

Membranas reducidas

13 ± 2

7,3 ± 0,9

2,5 ± 0,4

2,9

k: constante aparente de velocidad de unión de 1251-a.-Bgt a membranas de Torpedo alcalinas, con y sin tratamiento con agente reductor DTT (s-1) (x10 3). kmax : k calculada cuando no hay competencia con ningún otro ligando. kro: k calculada al incubar simultáneamente el receptor con Cch y 125 1-a-Bgt. 125 1-a-Bgt. kpre: k calculada al preincubar el receptor con Cch antes de añadir " Los errores vienen dados como la desviación estándar de la media ( ± S.E.M. ; N=5)

6.2 Análisis de las transiciones entre los distintos estados de afinidad inducidas por agonista en AcChR purificado y reconstituido.

Con la intención de comprobar la influencia del estado de agregación del receptor purificado y reconstituido, con respecto a la capacidad de llevar a cabo la transición entre los distintos estados de afinidad, se han realizado estudios comparativos de la velocidad de unión de 125 1-a-Bgt al receptor' en estado nativo y, tratado con el agente reductor . La Figura 6.5 muestra las transiciones de estado inducidas por agonista en el receptor en ambos estados de agregación . 8000

á U

7000

m 6000 v c 5000 ,o .Ç 4000

0

50

100

150

200

250 0

Tiempo (s)

50

100

150

200

250

Figura 6.5 Transiciones de estado inducidas por agonista en AcChR purificado y reconstituido. En la Figura se muestra la cinética de unión de 1251-a-Bgt al AcChR en forma predominantemente dimérica (A) o predominantemente monomérica (B). En todos los ensayos realizados, las concentraciones utilizadas han sido: 0 .5x10-7 M de receptor (en términos de sitios de unión de 125 1-a-Bgt), 5x10 -7 M de toxina y 2x10-6 M de carbamilcolina . Tanto en A como en B, las distintas trazas representan: ausencia de agonista (a), adición simultánea de la toxina y el agonista (b), y preincubación con agonista (c).

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11 2

Resultados

5

A

o0 3 2 Q_ U

(c)!

C 0

50

100

150

200

250 0

i

i

50

100

i

150

i

200

i

250

Tiempo (s) Figura 6.6 Representación de -In (1-cpm (t) 1 cpm (eq) ) frente al tiempo, en AcChR en forma dimérica (A) o monomérica (B). La pendiente de la recta obtenida permite obtener la constante aparente de velocidad de unión a 125 1-a-Bgt en ausencia de agonista (a), adición simultánea de la toxina y el agonista (b), y preincubación con agonista (c).

Tal y como se ha visto en membranas de Torpedo, la velocidad . de unión de 125 1-a-Bgt al receptor, en estado nativo y tratado con agente reductor, en ausencia de agonista (a), es mayor que cuando se expone al agonista . (b) y (c). La representación de -In (1-cpm (t) / cpm (eq)) frente al tiempo, se muestra en la Figura 6.6 . La pendiente de dicha representación proporciona la constante aparente de velocidad de unión de 1 25 1_(x-Bgt al receptor, en las tres situaciones expuestas. Los resultados obtenidos de esta representación se recogen en la Tabla Vil . Tabla VII : Parámetros cinéticos basados en la capacidad del AcChR purificado y reconstituido de unir 125 1-a-Bgt en ambos estados de agregación . kmax

kco

kpre

kco / kpre

AcChR nativo

13 ± 1

5,6 ± 0,5

1,2 ± 0,1

4,7

AcChR reducido

11± 1

4,0 ± 0,6

1,4 ± 0,1

2,8

k: constante aparente de velocidad de unión de 125 1-a-Bgt a receptor purificado y reconstituido, con y sin tratamiento con agente reductor DTT (s-1) (x10 3) . con ningún otro ligando. kmax k calculada cuando no hay competencia receptor con Cch y 125 1-a-Bgt. k al incubar simultáneamente el kco : calculada 125 1-a-Bgt. kpre: k calculada al preincubar el receptor con Cch antes de añadir " Los errores vienen dados como la desviación estándar de la media ( ± S.E.M . ; N=5)

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11 3

7 MEDIDAS DE LAS ACTIVIDAD DEL CANAL IÓNICO DEL AeChR A NIVEL DE FLUJO TOTAL DE IONES.

Los métodos utilizados normalmente para estimar el flujo iónico a través del AcChR son los de mezcla manual (filtración), los de flujo amortiguado o "quench-flow" (Walker y col ., 1982) y los de flujo detenido o "stopped-flow" (Quast y col., 1978a) . Esta última técnica posee una gran ventaja sobre las otras dos, puesto que permite seguir de modo continuo el flujo de iones a través de la vesícula en una escala de tiempo de milisegundos . Moore y Raftery, (1980) desarrollaron un método de "stopped-flow" para medir el flujo iónico en membranas de Torpedo, basado en la extinción de la fluorescencia del fluoróforo ANTS (8-aminc-1,3,6-naftaleno trisulfonato) atrapado en el interior de las vesículas mediante iones Tl+. Este método fue mejorado posteriormente : i) sustituyendo el fluoróforo ANTS por PTSA (tetrasulfonato sódico de pireno), que además de ser muy soluble en agua presenta cuatro cargas negativas, lo que dificulta extraordinariamente su permeación a través de la membrana y la consiguiente pérdida de fluoróforo y ii) optimizando el procedimiento de separación del fluoróforo no encapsulado, mediante la cromatografía de exclusión basada en Sepharosa 6-MB, que permite la recuperación de aproximadamente el 100% de los sitios de unión de a-Bgt (González-Ros y col., 1984). La fluorescencia del PTSA puede ser apagada eficazmente con iones Tl+ a través de un proceso de apagamiento dinámico. El PTSA muestra un mejor rendimiento cuántico que el ANTS, tiene mayor solubilidad en H2O y no experimenta fotólisis durante el tiempo de exposición a la luz de excitación, correspondiendo la caída de fluorescencia con el efecto de apagamiento del TI-'-. La Figura 7.1 muestra como se ha determinado la constante de SternVolmer en las condiciones de trabajo habituales de temperatura, pH y fuerza iónica del medio. La relación entre la extinción de fluorescencia del PTSA y la concentración del Tl+ se muestra en el panel A. Los datos obtenidos se ajustan a la ecuación de Stern-Volmer para la extinción dinámica de la fluorescencia, Fo/F=(1+KQ), donde Fo y F representan la fluorescencia en presencia y ausencia de TI--, Q es la concentración de iones Tl+ y K es la constante de Stern-Volmer (panel B). En las condiciones de pH (7 .4), temperatura (20°C) y fuerza iónica (100 mM) del presente trabajo, la constante de Stern-Volmer para este proceso es de aproximadamente 73 .4 M-1.

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11 4

Resultados

100

c

4

80

U aD U

60

N O

lL

àf

40 20 0

0

2D

40

60

80

100

0

Tr . mM

10

20

30

40

TI', mM

Figura 7.1 Determinación de la constante de Stern-Volmer para el apagamiento de fluorescencia de PTSA por iones TI'-. (A) Representación directa de la fluorescencia del PTSA (5 pM) frente a concentraciones crecientes de TI' añadido, en tampón Hepes 10 mM, pH 7.4, (NaN03 + TINO3) 100 mM, a 20°C . El 100% corresponde a la fluorescencia del PTSA en ausencia de TI'. (B) La representación de Fp/F da lugar a una linea recta cuya pendiente es la constante de Stem-Volmer. La línea continua muestra la regresión lineal de los puntos experimentales, obteniéndose una pendiente de 73 .4 M-1 con un coeficiente de regresión de 0.999. Fp : fluorescencia en ausencia de TI'-

El ion Tl+ es un apagador eficaz de la fluorescencia, probablemente debido al efecto del átomo pesado. Su radio iónico es similar al del K+, lo que le permite imitar a éste en muchos sistemas biológicos . El único problema asociado al uso del ion Tl+ es que permea a través de las membranas a alta velocidad. Por ello, la velocidad de permeación no selectiva a través de la membrana debe ser separada de la velocidad de permeación a través del canal iónico del AcChR. 7.1 Encapsulamiento delfluoróforo en las vesículas y separación del PTSA externo. Para medir el flujo iónico controlado por el receptor antes de que se produzca la desensibilización, se preparan membranas de Torpedo alcalinas (3 mg/ml de proteína) o vesículas reconstituidas de AcChR (1 mg/ml de proteína) con PTSA atrapado en su interior; estas concentraciones proporcionan un valor de intensidad de fluorescencia suficiente para los ensayos de valoración con carbamilcolina . Debido a que el volumen interno de las vesículas es mucho menor que el volumen total de la disolución, queda PTSA externo que se elimina mediante cromatografla de exclusión en Sepharosa 6-MB. En la Figura 7.2 se muestra el perfil de elución de las vesículas conteniendo PTSA y el fluoróforo libre .

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Resultados

11 5

2000 U

a)

U m aD

1500 1000

A

0

w

500

0

20

40

60

Número de fracción

Figura 7.2. Perfil de elución de las vesículas cargadas con PTSA. Columna Sepharosa 6-MB, las vesículas con PTSA eluyen en el volumen de exclusión de la columna (fracción A) mientras que el PTSA libre queda parcialmente retenido en el gel, eluyendo en la fracción B.

En el volumen de exclusión aparecen las vesículas cargadas con el fluoróforo, mientras que el PTSA libre queda más retenido en la columna y no contamina la muestra. Las vesículas que contienen PTSA así formadas y purificadas son estables durante varios días a 4°C, permaneciendo la fluorescencia en el interior de las mismas. 7.2 Permeación no selectiva de iones Tl+ a través de las vesículas de membrana. Cuando se mezclan las vesículas cargadas con PTSA con tampón conteniendo iones Tl+ en un instrumento de flujo detenido, y se registra la fluorescencia a tiempos largos (20s), se observa una caída lenta (tli2 -10s) de la fluorescencia. Esta caída representa el apagamiento de la fluorescencia del PTSA interno, debida a la entrada no selectiva de TI-'- a través de la membrana (Figura 7.3). Estas variaciones de fluorescencia se producen así porque el PTSA está encapsulado en las vesículas ; de lo contrario, la caída de fluorescencia sería tan rápida (del orden de nanosegundos) que quedaría dentro del tiempo muerto del instrumento . Si se reemplazan los iones TI-'- por iones de Na+, no se produce ninguna caída de fluorescencia, confirmando que el apagamiento de la misma es debido a la entrada pasiva de iones TI -'~ (Figura 7.3 ). A tiempos cortos (ms) la permeación no selectiva de Tl+ es apreciable, aunque resulta fácilmente

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11 6

Resultados

distinguible de la permeación selectiva inducida por agonista, a través del canal iónico (Figura 7 .4).

0 U

c

U (D 0

6 .8 6 .4 6 .0 5 .6 5 .2 Tiempo

(s)

Figura 7.3 Permeación de iones TI' a través de la membrana a tiempos largos. La traza superior se corresponde con la fluorescencia obtenida al reemplazar TI' con Na+, esto implica mezclar las vesículas cargadas con PTSA (jeringa 1), con Hepes, pH 7 .4, 100 NaN03 (jeringa 2). La fluorescencia se monitoriza excitando a 374 nm. La traza inferior muestra la caída de fluorescencia correspondiente a la entrada no selectiva de iones de TI'; es el resultado obtenido tras sustituir el NaN03 (jeringa 2) por TINO3 40 mM 1 NaN03 60 mM. Las trazas corresponden a registros de 20 segundos con 200 puntos .

7.3 Permeación de iones. mediada por agonista a través del canal iónico en membranas de Torpedo alcalinas La caída de fluorescencia por permeación pasiva de Tl+que se muestra en la Figura 7 .3 y que a la escala de tiempo utilizada representa un fenómeno notable, no lo es tanto cuando la observación se realiza a tiempos más cortos como el utilizado en la Figura 7.4. La adición de carbamilcolina al tampón que contiene Tl+ incrementa drásticamente la velocidad de caída de fluorescencia de PTSA. En la Figura 7 .4 se puede apreciar la disminución de fluorescencia que experimentan las vesículas cuando se mezclan con concentraciones crecientes de carbamilcolina . La primera traza corresponde a la entrada inespecífica de iones Tl+ a través de la membrana, mientras que la siguientes corresponden a la causada por la adición de 12.5, 50, 75, 100 y 200 p,M de carbamilcolina (concentración final), respectivamente . La caída de fluorescencia a concentraciones más elevadas de carbamilcolina (> 500 p,M) es tan rápida que no puede ser medida con un instrumento de flujo detenido.

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Resultados

11 7

Puesto que la velocidad de flujo iónico a través de las membranas es proporcional al número de canales activados presentes en la superficie de las mismas, la velocidad de caída de fluorescencia del PTSA producida por los agonistas colipergicos sirve igualmente como medida de la población de receptores activados . 6 .8 6 .6 co ü c

6.4

d

6.2

Ú

6 .0 5 .8 0

50

100

150

200

Tiempo (ms)

Figura 7 .4 Permeación selectiva de iones TI' a través de canal iónico . Disminución de fluorescencia en membranas nativas cargadas con PTSA en ausencia (a) o en presencia de 25 (b), 100 (c), 150 (d), 200 (e), y 400 pM (f) de carbamilcolina (concentración inicial) .

Es en última instancia la farmacología la que nos puede confirmar que la señal de fluorescencia producida por los agonistas representa exactamente el flujo iónico a través del canal del AcChR. La farmacología exhibida por estas muestras se representa en la Figura 7.5 . Todas ellas se hicieron con la misma preparación de membranas de Torpedo que en la Figura 7 .4 y se mezclaron con 150 p,M de carbamilcolina. El receptor se preincubó con 1 mM de d-tubocurarina (A), exceso de a-Bgt (B) y 1 mM de carbamilcolina (C) . La presencia de d-tubocurarina, al igual que la aBgt en exceso inhibe completamente la caída de fluorescencia producida por el agonista . La incubación previa con el propio agonista inhibe la señal porque induce la desensibilización del AcChR.

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Resultados

11 8

6 .6 6 .3 (D6 .6 U

L 6 .3 0

6 .6 6 .3 0

5 ,0

100 Tiempo

150

200

(ms)

Figura 7.5 Cinética de flujo de TI+ inducida por agonista en presencia de agentes bloqueadores del canal iónico (A y B) o en receptor desensibilizado (C). Las vesículas de membrana conteniendo PTSA encapsulado, se incuban en presencia de carbamilcolina 1 mM (panel C), dtubocurarina 1 mM (panel A) o abungarotoxina en exceso (panel B) durante 10 minutos, a continuación se mezclan con carbamilcolina 150 pM, midiéndose la entrada de TI' a través del canal iónico asociado al receptor.

Las constantes aparentes de velocidad (kapp) correspondientes al proceso de flujo iónico al interior de las vesículas se obtienen ajustando las trazas experimentales a la ecuación de Stern-Volmer dependiente del tiempo después de haber eliminado el efecto de la permeación pasiva (Métodos, apartado 11 .3), tal y como se observa en la Figura 7.6.

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Resultados

0.0

ca -0.2 Ü C

MR

tn

o

-0.4

-0 .6 W

0

50

100

150

200

Tiempo (ms) Figura 7 .6 Cinética del flujo de TI' inducido por agonista. En la Figura se muestra la extinción de fluorescencia del PT5A encapsulado en vesículas de membranas de Torpedo nativas, habiendo eliminado el efecto de la permeación pasiva . Las distintas trazas representan el flujo inducido por 25 (a), 50 (b), 75 (c), 100 (d), 150 (e) y 250 11 M (t) de carbamilcolina (concentración final) . Las lineas continuas se corresponden con el ajuste de cada traza a la ecuación 1 de Métodos (apartado 11 .3).

La dependencia de kapp con la concentración de carbamilcolina se muestra en la Figura 7 .7A, según la ecuación (3):

kaPP

_

k .pp~

(L + KD)

Ecuación (3)

L= concentración de agonista El carácter signoide de la curva resultante de la ecuación 3 (Figura 7.7A), indica la necesidad de unión de dos moléculas de agonista a los sitios correspondientes en las dos subunidades a del AcChR para dar lugar al flujo fónico. La representación doble logarítmica (Figura 7 .7 B) es una aproximación para determinar el coeficiente de Hill (nH) de unión del agonista al receptor . La línea recta obtenida tiene una pendiente (nH) de 1 .9 ::E 0.1 . Para determinar los valores de la constante de disociación (KD) y de velocidad aparente máxima (kmax), se ajustan los datos experimentales a la ecuación (3): valores de kapp frente a [L] ; tomando nH = 2.

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Resultados

12 0

25

2.0 1 .5

20

1 .0 V

_o 5

0.5 0.0 -0.5 -1 .0

0 0

50

100 150 200 250

-1 .5 1 .0

Carbamilcolina (uM)

1 .5

2.0

2.5

log(carb.)

Figura 7.7 Análisis de datos cinéticos. (A) Representación directa de los valores de kaPP frente a la concentración de carbamilcolina . La linea continua representa el mejor ajuste a la ecuación (3), asumiendo nH = 2. (B) La representación doble logarítmica resulta en una linea recta, cuya pendiente es el coeficiente de Hill (nH = 1 .9 ± 0.1, r = 0.973) .

7.4 Flujo de iones TI-1- en membranas de Torpedo nativas y tratadas con agente reductor.

Se ha estudiado la influencia del estado de agregación del receptor en su funcionalidad utilizando vesículas de membrana de Torpedo alcalinizadas, cargadas con PTSA, aptas para ser utilizadas en experimentos de cinética rápida. En la fase inicial de este estudio, el método de obtención de la forma monomérica del AcChR en las membranas de Torpedo se diferenció del utilizado rutinariamente a lo largo de este trabajo en la forma de eliminar el agente reductor . A continuación de la incubación, una hora a temperatura ambiente, de las membranas con una concentración 5 mM del agente reductor DTT; este se eliminó mediante centrifugación , y posterior resuspensión en tampón Hepes 10 mM, NaN03 100 mM, pH 7,4 . En la Figura 7 .8 se observa la cinética del flujo de TI-í- inducido por agonista en las membranas así tratadas . En la muestra reducida (B), a la misma concentración de agonista que en las membranas nativas (A), no hay respuesta clara al agonista; se observa una gran diferencia de comportamiento entre ambas muestras, al aumentar progresivamente la concentración de carbamilcolina . Esta situación podría indicar que el agente reductor no ha sido eliminado totalmente, y permanecen trazas que afectan al comportamiento del receptor .

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Resultados

121

7.6 ' cts

vC

7.4

a)+ bI

~ 7 .2 N L = 7.0 6.8 6.6

0

50

100

150

200

0

50

100

150

200

Tiempo (ms) Figura 7.8 Cinética de flujo de Tl+ inducido por agonista, en presencia de trazas de DTT. (A) Disminución de fluorescencia en membranas de Torpedo nativas cargadas con PTSA. (B) Disminución de fluorescencia en membranas de Torpedo reducidas, en las que el DTT se ha eliminado por centrifugación. Tanto en A como en B las distintas trazas representan el flujo en ausencia (a) o en presencia de 75 (b), y 150 ~LM (c)de carbamilcolina (concentración final) .

Con el fin de asegurarnos de la total eliminación de las trazas de DTT que puedan quedar, se procedió a dializar la muestra reducida, después de la centrifugación, durante 24 horas frente a 41 de tampón Hepes 10 MM, NaN03 100 mM, pH 7,4. Las muestras de membranas nativas se dializaron paralelamente . A partir de este momento, todas las muestras, tanto de receptor como de membranas, utilizadas a lo largo de este trabajo se dializaron rutinariamente hasta la completa eliminación del agente reductor, con el fin de evitar la influencia de las posibles trazas de DTT en la respuesta. Seguidamente, se procedió a estudiar la entrada pasiva de iones Tl+ a tiempos largos (20 s), en vesículas de membrana con el receptor incorporado en ambos estados de agregación. En la Figura 7.9, se puede comparar la caída de fluorescencia en vesículas con el receptor en forma dimérica (a) y monomérica (b); la respuesta de flujo en ausencia de agonista fue idéntica en ambas poblaciones de receptores. Este hecho indica que el tratamiento con el agente reductor no modifica la permeación pasiva de la membrana al TI-'-.

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Resultados

122

8.0 m .Ü

7.6 7.2 6.8

0

6.4 6.0 0

5

10

15

20

Tiempo (s) Figura 7.9 Entrada pasiva de iones TI' a través de las vesículas de membrana. Se representa la caída de fluorescencia a tiempos largos de membranas de Torpedo en forma nativa (a) y reducida (b).

A tiempos cortos la permeación de iones TI-" inducida por agonista en vesículas de membrana, presenta algunas diferencias entre las dos formas de agregación del receptor. La Figura 7 .10 muestra algunas trazas representativas obtenidas con membranas en forma nativa (A), y en forma reducida (B). Aunque ambas formas responden al agonista, carbamilcolina, transportando iones Tl+ ; en las muestras reducidas la respuesta a la misma concentración del agonista, es menor. m 0.0 .5 C

5

-0.2

loo =s -0.4

Li-

-0.6

i

0

i

50

i

100

i

150

i

200

0

50

100

150

200

Tiempo (ms) Figura 7.10 Cinética de flujo de T1+ inducido por agonista. En la Figura se muestra la extinción de fluorescencia del PTSA encapsulado en vesículas de membrana de Torpedo en forma dimérica (A) o monomérica (B). Las distintas trazas representan el flujo inducido por 25 (a), 50 (b), 100 (c) y 200 p,M (d) de carbamilcolina (concentración final) . Las lineas continuas se corresponden con el ajuste de cada traza a la ecuación 1 de Métodos (apartado 11 .3) .

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Resultados

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La representación de las constantes aparentes de velocidad (kapp) en función de la concentración del agonista nos permite calcular los valores de KD y kmax . En la Figura 7.11 se observa esta representación para las membranas de Torpedo nativas (a) y reducidas (b); observándose un desplazamiento de la respuesta hacia concentraciones mayores del agonista cuando el receptor está en forma monomérica . 30 25 20 V

10 5 0

0

50

100

150

200

250

Cch (uM) Figura 7.11 Representación de las constantes aparentes de velocidad (kapp) en función de la concentración de agonista. En la Figura se representa la variación de kapp con la concentración de agonista en vesículas de membranas alcalinas nativas (a), y reducidas con DTT (b) . La linea continua representa el mejor ájuste a la ec (3), tomando nll2.

El coeficiente de Hill obtenido es de 1 .77±0.13 para las muestras nativas y 1 .86±0.13, para las reducidas, lo que indica que no se producen cambios en la cooperatividad en la unión del agonista entre ambas formas moleculares. Los parámetros cinéticos obtenidos se recogen en la Tabla VIII. Tabla VIII : Parámetros cinéticos basados en la velocidad de flujo de TVinducida por agonista en vesículas conteniendo membranas de Torpedo en los distintos estados de agregación . Experimentos realizados en un instrumentos de flujo detenido, SLM-AMINCO-8000, en tampón Hepes 10 mM, pH 7,4 TINO3 40 ^NaN03 60 mM.

Membranas nativas Membranas reducidas

KD (a)

2,30±0,08 4,47±0,29

(a) Los valores de KD están expresados en M x 104. (b) Los valores de kmax están expresados en s-1

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kmax (b)

70±10 67±7

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Resultados

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Se observa que la kmax, proporcional al número de canales activos, no varia de modo significativo indicando que el flujo máximo de permeación de iones permanece constante . Se advierte también que la constante de disociación aumenta en la muestra reducida, indicando que se produce una disminución en la afinidad del receptor por el agonista .

7.5 Flujos de iones Tl+ en vesículas con el AeChR reconstituido en forma dimérica y monomérica.

Se han realizado estudios comparativos de la fixncionalidad del receptor purificado y reconstituido en asolectina total, en ambas formas estructurales. El receptor purificado mediante Cromatografía de afinidad se reconstituye añadiendo lípidos de asolectina, y se trata, o no, con el agente reductor DTT ; tras la incubación y posterior eliminación de este agente se obtienen vesículas aptas para su utilización en experimentos de cinética rápida. La medida de flujo de Tl+ a través de las vesículas en ausencia de agonista (flujo inespecífico) es semejante para las vesículas conteniendo el receptor en ambos estados de agregación; tal y como se aprecia en la Figura 7.12. En (a) está representado el flujo inespecífico a 20 segundos de las vesículas con el receptor en su estado nativo (predominantemente dimérico), mientras que en (b) se observa el flujo correspondiente a las vesículas con el receptor en su forma reducida (predominantemente monomérica) . 8.4 ct3

8.0

a? ó 7.6

0

5

10

15

20

Tiempo (s) Figura 7.12 Entrada pasiva de iones TI' a través de las vesículas reconstituidas . Se representa la caída de fluorescencia a tiempos largos del AcChR reconstituido en forma nativa (a) y reducida (b).

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A tiempos cortos, al igual que ocurría con las membranas de Torpedo alcalinas, la contribución de Tl+ inespecífico en la caída de fluorescencia es mucho menor, y por tanto distinguible de la caída de fluorescencia provocada por la entrada de Tl+ específica a través del poro iónico. La Figura 7.13 muestra la cinética del flujo de TI-4- dependiente de agonista para AcChR reconstituido en lípidos de asolectina en los dos estados de agregación . En ambos casos se puede observar que a medida que se aumenta la concentración del agonista, la caída de fluorescencia debida al apagamiento producido por la entrada de iones TI-4- aumenta progresivamente, pero a la misma concentración de agonista la respuesta de flujo es mayor cuando el receptor está en forma dimérica, tal y como ocurre en las membranas de Torpedo (Figura 7.6). 0.2 .

Ú

C

0.0

-0.2 Ú 2-0.4 O -0.6 -0.8 -1 .0

0

50

100

150

200

0

50

100

150

Tiempo (ms) Figura 7.13 Cinética de flujo de TI' inducido por agonista para AeChR purificado y reconstituido. En la Figura se observa la disminución de fluorescencia a concentraciones crecientes de agonista cuando el receptor se halla en forma predominantemente dimérica (A), o predominantemente monomérica (B). Tanto en A como en B, las distintas trazas representan el flujo inducido por 25 (a), 50 (b), 100 (c), y 200 pM (d) de carbamilcolina (concentración final) . Las lineas continuas se corresponden con el ajuste de cada traza experimental a la ecuación 1 de Métodos (apartado 11 .3) .

Las constantes aparentes de velocidad de flujo calculadas del ajuste de cada traza a la ecuación 1 de Métodos (apartado 11 .3), permiten determinar los valores de la constante de disociación (KD) y de velocidad aparente máxima (kmax) del proceso . La Figura 7.14 muestra la representación de los valores de kapp obtenidos frente a la concentración de agonista permitiendo distinguir la diferencia de comportamiento del receptor en sus dos formas de agregación. El coeficiente de Hill obtenido es 1 .6±0 .1 para la forma dimérica del receptor y 1 .8±0 .1 para la forma monomérica del mismo; confirmando que no se producen cambios significativos en la cooperatividad en la unión del agonista entre ambas formas moleculares.

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Resultados

126

20 15

oCL

5 0 0

100

200

300

400

Cch (uM)

Figura 7.14 Representación de las constantes aparentes de velocidad (kapp) en función de la concentración de agonista . En la Figura se compara el comportamiento del AcChR purificado y reconstituido en forma nativa (a) y reducido con DTT (b). La linea continua representa el mejor ajuste a la ec (3), tomando nH2.

El análisis de los datos cinéticos del receptor reconstituido en ambos estados de agregación se recoge en la tabla IX. Tal y como se ha visto en membranas de Torpedo en la forma monomérica aumenta la KD, indicando una disminución de la afinidad del receptor por el agonista, mientras que la velocidad aparente máxima (kmax), proporcional al número de canales activos permanece sin modificar. Tabla IX: . Parámetros cinéticos basados en la velocidad de flujo de TI' inducida por agonista en vesículas conteniendo AcChR purificado y reconstituido en la forma nativa (dimérica) y 'reducido (monomérico) . Experimentos realizados en un instrumentos de flujo detenido, SLM-AMINCO8000, en tampón Hepes 10 mM, pH 7,4 TINO3 40 mM, NaN03 60 mM.

AeChR dimérico AcChR monomerico

KD (a) 2,71±0,27 3,80±0,13

(a) Los valores de KD están expresados en Mx 104. (b) Los valores de lc .X están expresados en s-1

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kmax (b)

53±3 51±4

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8 ESTUDIOS DE LA ACTIVIDAD DEL CANAL IÓNICO ASOCIADO AL AcChR MEDIANTE LA TÉCNICA DE PATCH-CLAMP EN LIPOSOMAS GIGANTES. 8.1 Actividad de las formas monomérica y dimérica del receptor purificado, reconstituido en fposomas gigantes

Se han estudiado las características funcionales, mediante el método de patch-clamp, tanto del receptor en estado nativo (dímero), como tratado con el agente reductor DTT (monómero), reconstituidos en liposomas gigantes . Todos los experimentos se han realizado en soluciones simétricas Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCI 140 mM, CaC12 0 .1 mM, en configuración "inside-ouV y con Carbamilcolina 10 p,M en la pipeta. La convención de signos empleada para el potencial y las soluciones es la misma para todos los experimentos; se utiliza el potencial de membrana, que corresponde al valor con signo opuesto del potencial de pipeta. Unicamente se ha observado la actividad de canal iónico asociada al receptor cuando el agonista, carbamilcolina, está presente en la pipeta de registro ; este hecho confirma que el receptor se orienta con el sitio de unión a agonistas hacia el exterior del liposoma. En los liposomas gigantes sin proteína incorporada, esto es formados con vesículas lipidicas en ausencia de AcChR, no se ha detectado actividad eléctrica en el rango de potencial aplicado, ±100 mV .

8.1.1 Comportamiento del AeChR en estado nativo.

En estado nativo, el AcChR se encuentra predominantemente en forma dimérica, mediante la unión covalente de dos monómeros adyacentes . En liposomas con el receptor incorporado en forma nativa, y con carbamilcolina 10 p,M en la pipeta, el número de sellos activos varia entre un 20 y un 60%, dependiendo de la cantidad de proteína inicial (100-200 pg) y de la preparación empleada. En la preparación estándar de liposomas, con carbamilcolina 10 pM en la pipeta y en soluciones simétricas de NaCI (140 mM), el canal presenta un comportamiento óhmico dentro del rango de potenciales estudiado, ±100 mV. En la mayoría de sellos con actividad se registra más de un nivel de corriente; el canal más frecuentemente obtenido tiene una conductancia entre 67 y 80 pS y con menos frecuencia un subestado de 21-28 pS . En la Figura 8.1 se presenta un resumen de'las características básicas del canal obtenido. En A, algunos fragmentos de registros a ±60 mV (potencial de membrana) muestran el patrón de actividad encontrado ; se observan dos niveles de 67 pS cada uno y un subestado de 28 pS . Para cada potencial aplicado se

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miden los valores de amplitud de corriente de las aperturas del canal y se representan histogramas de amplitud de corriente frente a la frecuencia de aparición normalizada; B y C, muestran los histogramas correspondientes a -60 y +60 mV, donde se pueden observar los niveles de corriente mencionados. Comparando ambos histogramas se observa que a potenciales positivos hay mayor probabilidad de ver ambos niveles juntos. En D se muestra la curva corriente / potencial, y se indican las conductancias obtenidas. Estas características son consistentes con las descritas en el apartado 2.4 utilizando membranas de Torpedo alcalinizadas, en lugar de receptor purificado. - 60 mV

A

+ 60 mV 1y~.lw+n

,~w~~+

100 ms 6

B

a a E

3

134 pS ~0

I IILIIL1IIII1III1IIIIIIIIII

-15

C

-10

10 f

-5

67 pS 0

5

5-

28 pS

-100

-lo -

Figura 8.1 Comportamiento del receptor en forma dimérica . Registro obtenido mediante la técnica de patch-clamp en la configuración "inside-out" . Realizado en condiciones simétricas de sodio (Hepes 10 mM, pH 7 .4, NaCI 140 mM, CaC12 0 .1 mM) y con carbamilcolina 10 liM en la pipeta . Se presenta un sello con dos canales de conductancia 67 pS, su doble 134 pS y con menor frecuencia un subestado de 28 pS . En A se observan fragmentos de registros a ±60 mV (potencial de membrana), la flecha en el costado indica el nivel cerrado. En B y C se muestran los histogramas correspondientes a -60 y +60 mV respectivamente. En D se muestra la relación IN para este sello.

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129

8.1.2 Comportamiento del AeChR tratado con DTT. El tratamiento del AcChR nativo, con el agente reductor DTT, da lugar a la forma monomérica del mismo (Métodos, apartado 7). En liposomas con el receptor incorporado en forma reducida, y con carbamilcolina 10 p,M en la pipeta, se ha obtenido un alto porcentaje de sellos silenciosos (60-80%) en todas las preparaciones utilizadas . Los sellos considerados activos poseen actividad corta y caótica, muy dificil de analizar; se observan saltos discretos de corriente, asociables a la actividad de un canal, pero de corta duración. En estos registros se observan varios niveles de corriente con amplitudes unitarias menores que las observadas para el dímero, es así que se obtiene una conductancia base alrededor de 37 pS, que corresponde a la mitad del valor determinado para el dímero, y otros valores múltiplos de éste. En la figura 8 .2, se observa un sello con múltiples niveles sincronizados, con una conductancia unitaria de 37 pS y la máxima un múltiplo de cinco veces esta. A

5 PA 100 ms

n6 . E a) j_ 4

-10

~IIIIIIIIIIIIIIII~II~IIIIIIh~

-5

0

5

I (PS) Figura 8.2 Comportamiento del receptor en forma monomérica. Registro obtenido mediante la técnica de patch-clamp en la configuración "inside-out" . Realizado en condiciones simétricas de sodio (llepes 10 mM, pH 7.4, NaCI 140 mM, CaC12 0.1 mM) y con carbamilcolina 10 pM en la pipeta . En A se observan fragmentos de registros a -40 mV (potencial de membrana); la flecha en el costado indica el nivel cerrado. En B se muestra el histograma correspondiente a -40 mV, donde se observa una conductancia mayoritaria alrededor de 37 p S .

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8.1.3 Comportamiento del receptor nativo, en presencia de agente reductor añadido durante el experimento.

Las dificultades de estudio y análisis del AcChR reducido, incorporado en liposomas gigantes (apartado 8.1 .2), hicieron necesario ensayar el efecto de la reducción del receptor en diferentes condiciones experimentales . El cambio de estrategia consiste en incorporar el receptor a los liposomas gigantes en forma nativa y reducirlo una vez que se ha realizado el sello; para ello se añade el agente reductor al baño a una concentración final 5 mM, similar a la utilizada en los experimentos con el receptor previamente reducido. Este nuevo protocolo permite estudiar en el mismo sello el comportamiento del AcChR en estado nativo y reducido. Los resultados obtenidos con esta metodología se repiten consistentemente en todos los experimentos que se han llevado a cabo . A los 15-20 segundos de aplicar el DTT, los registros empiezan a mostrar conductancias menores, que por sus características podrían asociarse al comportamiento observado en las muestras monoméricas. Cuando se obtienen sellos con más de un canal en la situación control, tras aplicar el DTT aparecen varios niveles cuya amplitud de corriente es la mitad de la observada en los saltos discretos iniciales . La figura 8.3 muestra una secuencia temporal del efecto producido por el DTT aplicado directamente en el baño. En situación control se observa un registro con tres niveles de conductancia múltiplos de 75 pS (75, 150 y 225 pS) (A), los primeros segundos tras aplicar el agente reductor no se produce un efecto significativo (B), posiblemente por problemas de difusión. Sin embargo a los 20 segundos se observa un efecto notable (C), el registro empieza a mostrar conductancias menores, se observan varios niveles que el histograma engloba en forma gruesa; el nivel básico tiene una conductancia de 37 pS, la mitad del nivel básico en el control. A otros potenciales se observan varios niveles, múltiplos de esta conductancia pequeña. Por otra parte se observa que tras 40-50 minutos de exposición al agente reductor, la actividad del canal se vuelve ruidosa y caótica; presentando un comportamiento bastante similar al observado en las preparaciones de AcChR previamente reducido.

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Resultados 10

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Figura 8.3 Registros secuenciales a -40 mV. Registros obtenidos mediante la técnica de patch-clamp en la configuración "inside-out" . Realizado en condiciones simétricas de sodio (llepes 10 mM, pH 7.4, NaCI 140 mM, CaC12 0.1 mM) y con carbamilcolina 10 pM en la pipeta . La flecha en el costado indica el nivel cerrado. Junto a cada fragmento de registro se muestra el histograma correspondiente. Inicialmente el AeChR se encuentra en forma nativa (A), los niveles de corriente son 3, 6 y 9 pA que corresponden a una conductancia de 75 pS y múltiplos de ella . Los primeros segundos después de aplicar el DTT no hay efecto significativo (B) ; transcurridos 15-20 segundos se observa disminuir la conductancia hasta la mitad del valor inicial (C).

A la vista de estos resultados, el efecto de la reducción se ha estudiado comparando el comportamiento del receptor en estado nativo con el comportamiento del mismo a los 20 segundos de haberlo reducido. La Figura 8.4 resume el efecto funcional producido a consecuencia del cambio estructural inducido por el DTT agregado en el baño. Se presenta este fenómeno a -60 mV (A) y a -80 mV (B). En la situación control el sello presenta tres niveles de conductancia claramente definidos (75, 150 y 225 pS); en presencia de DTT, los saltos unitarios disminuyen a la mitad, y los diferentes niveles de conductancia pasan a ser múltiplos de la mitad de los valores iniciales (38, 75 y 115 pS). En los histogramas de amplitud se observa este fenómeno, en presencia de DTT las curvas se desplazan hacia niveles de corriente que corresponden a la mitad del control y a múltiplos de esa mitad. Estos resultados concuerdan aparentemente con la actividad rescatada de los sellos realizados con el receptor purificado y tratado previamente con DTT (apartado 8.1 .2).

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Figura 8.4 Efecto de la reducción del AcChR a distintos potenciales . Registros obtenidos mediante la técnica de patch-clamp en configuración "inside-out", realizados en condiciones simétricas de sodio (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCI, 0.1 mM CaC12) y con 10 pM de carbamilcolina en la pipeta. A: Potencial de membrana -60 mV, a) fragmentos de registro en la situación control, se observan tres niveles de conductancia, 75, 150 y 225 pS ; b) una vez aplicado el DTT, los niveles de conductancia se reducen siendo el nivel básico 38 pS y los siguientes múltiplos de éste. En c) se muestran los histográmas correspondientes donde se observan los niveles de corriente mencionados. B: Potencial de membrana -80mV, d) y e) situación control a distinta escala temporal, se observan tres niveles de conductancia, 75, 150 y 225 pS; f) y g) situación una vez aplicado el DTT, los niveles de conductancia se reducen igual que en b). En h) se muestran los histogramas correspondientes donde se observan los niveles de corriente mencionados . Tanto en c) como en h) la linea punteada corresponde a los valores de corriente detectados despues de aplicar el DTT. La flecha en el lateral indica el nivel cerrado .

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Resultados

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Tal y como se ha mostrado el cambio de estrategia experimental aporta un mayor número de evidencias que se repiten consistentemente avalando los resultados obtenidos en las preparaciones de receptor previamente tratado con DTT.

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Discusión

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V DISCUSIÓN

El AeChR es una proteína integral de membrana resultado de la asociación de cuatro subunidades polipeptídicas distintas, a, R, y y 8, en una relación estequiométrica 2 :1 :1 :1 . En tejido eléctrico de 1 : niarnrorala el receptor se encuentra predominantemente en forma dimérica formando un puente disulfuro entre las subunidades 8 de dos monómeros adyacentes . Se ha descrito que la presencia de agentes alquilantes durante la homogeneización inicial del tejido eléctrico da lugar a preparaciones mayoritariamente diméricas, probablemente debido a que impiden la actuación de una proteína presente en la rnenrbrana, cercana al AeCliR, que contiene grupos suifhidrilo con potenciales redox muy bajos (Chang y Bock, 1977) . El procedimiento de purificación del AcChR empleado en este estudio incluye la presencia de iodoacetarnida durante la homogeneización del tejido eléctrico con el fin de obtener preparaciones mayoritariamente diméricas; la forma monomérica se obtiene mediante tratamiento adicional con un agente reductor . En esta memoria se ha planteado el estudio funcional y estructural de ambas formas moleculares. Para llevar a cabo estos estudios se han elegido dos sistemas experimentales distintos : membranas nativas de Torpedo enriquecidas en AeChR, y AcChR purificado y reconstituido en lípidos de asolectina. Las membranas de Torpedo presentan la ventaja de que se pueden obtener de forma

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rápida y en grandes cantidades a partir de la electroplaca de Torpedo marmorata. Suponen por tanto, un sistema de fácil acceso para llevar a cabo una evaluación inicial sobre la influencia del estado de agregación del receptor en su comportamiento . En el estudio de proteínas de membrana son de gran utilidad las técnicas de reconstitución, ya que permiten modificar en gran medida los elementos que constituyen una membrana, posibilitando así definir el número mínimo de componentes de la misma absolutamente necesarios para realizar una determinada función y estudiarla libre del resto de los componentes. Aunque las membranas nativas de Torpedo ofrecen uno de los mejores sistemas para el estudio "in vitro" del AcChR, la composición heterogénea de la mismas, tanto en tamaño vesicular como en componentes proteicos, complica el análisis de los resultados obtenidos. Estos problemas pueden evitarse en parte empleando el receptor purificado y reconstituido . La purificación del AcChR mediante cromatografía de afinidad proporciona una fuente de receptor con al menos 99% de pureza, viéndose contaminado en contadas ocasiones con una proteína minoritaria de peso molecular 90 kDa, que parece corresponderse con un canal de cloruro presente en la cara no inervada del electrocito (Tank y Miller, 1983) . Los métodos de reconstitución mediante diálisis exhaustiva del detergente permiten además escoger el entorno lipídico donde se integra la proteína . De esta forma disponemos de un sistema más controlado y reproducible en el cual el AcChR pasa a ser el único componente proteico del sistema. Durante la fase inicial de la realización de esta memoria se puso a punto un nuevo método de reconstitución, la reconstitución en liposomas gigantes cuyas características principales, ventajas e inconvenientes se discuten a continuación .

1. Reconstitución del AeChR en liposomas gigantes: una alternativa para el estudio de canales iónicos. Es posible preparar liposomas en grandes cantidades y analizarlos bioquímicamente (Miller, 1984), pero existe el inconveniente de que incluso los liposomas de mayor tamaño, formados por métodos de eliminación del detergente mediante diálisis (Alíen, 1984), son aún demasiado pequeños para realizar medidas eléctricas de canales iónicos incorporados. Alternativamente los liposomas pequeños pueden fusionarse, mediante ciclos de congelacióndescongelación, y dar lugar a liposomas de mayor tamaño (Tank y Miller, 1983), pero hasta ahora, éste método se ha visto limitado a un pequeño número de muestras y sólo ha sido descrito como satisfactorio por un grupo de

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investigación (Tank y Miller, 1983). Posteriormente Criado y Keller (1987), describieron la formación de liposomas gigantes con canales fónicos incorporados (Keller y col ., 1988). Esta técnica, que utiliza un proceso de deshidratación parcial y posterior rehidratación para inducir la formación de los liposomas gigantes, está basada en observaciones hechas por Mueller y col. en 1983, sobre la formación de estructuras similares producidas por la hidratación de mezclas lipídicas completamente deshidratadas . Los datos aportados sugirieron que la reconstitución en liposomas gigantes podría ser un método ideal para reconstituir proteínas con actividad de canal fónico, en un sistema accesible a los métodos de patch-clamp convencionales . Con el propósito de demostrar que la incorporación de un canal fónico en liposomas gigantes, no causa alteración en los parámetros funcionales conocidos, se han realizado estudios en liposomas gigantes, con AcChR procedente de membranas de T. marmorata incorporado . Con el fin de ilustrar bien las aplicaciones de ésta técnica a otras proteínas con actividad de canal fónico, que no son fácilmente purificables, se utilizaron en esta primera fase membranas nativas de T marmorata en lugar de AcChR purificado. Los liposomas gigantes pueden prepararse en grandes cantidades, y la densidad superficial de canales fónicos incorporados se controla, ajustando la relación inicial de lípido y proteína . El rendimiento del proceso de formación de los liposomas gigantes, a partir de los componentes lipídicos y proteicos de las vesículas de partida, es del 60-70 %. Los estudios realizados mediante microscopía de fluorescencia, sugieren que los lípidos y las proteínas incorporadas se distribuyen de modo homogéneo en los liposomas gigantes . La sonda fluorescente FITC marca los grupos amino primarios presentes, tanto en lípidos como en proteínas; la utilización de membranas de T marmorata marcadas con FITC en la formación de los liposomas, indica que los componentes de estas membranas se hallan homogéneamente distribuidos en los liposomas gigantes resultantes. Asimismo, la incubación de liposomas gigantes con TMR-a-13gt indica una distribución homogénea del AcChR en éstos . Las imágenes de fluorescencia de los liposomas muestran fluorescencia, aparentemente inespecífica, en el campo de fondo. Estos liposomas, al no fijarse a la placa, no pudieron ser lavados, y la fluorescencia de fondo se debe a liposomas no visibles a microscopía óptica . Ambas sondas fluorescentes indican que durante la formación de los liposomas gigantes tiene lugar la mezcla y redistribución uniforme de los componentes de partida . Esto sugiere que la formación de los liposomas gigantes se lleva a cabo mediante un proceso

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de fusión, seguido de una difusión de los componentes lipídicos y proteicos en el seno del liposoma gigante. Estos resultados se confirman mediante experimentos de criofractura, que proporcionan la evidencia definitiva de la redistribución homogénea del AcChR en los liposomas gigantes, al mostrar numerosas partículas intramembrana (IMPs) uniformemente distribuidas en la membrana del liposoma, sin observarse agrupaciones de AcCbR ni zonas del liposoma especialmente ricas en dicha proteína . Igualmente se ha comprobado que dichas IMPs no se observan cuando los liposomas se forman en ausencia de

AcChR. Se han utilizado liposomas gigantes con el AcCliR incorporado, con el fin de evaluar si éste sistema de reconstitución es adecuado para realizar medidas de actividad de canal iónico utilizando técnicas de alta resolución, como es el patch-clamp . El tamaño de los liposomas, permite realizar con facilidad sellos de alta resistencia y parches de membrana aislados, utilizando pipetas de patch convencionales . Se ha visto que el patrón de actividad eléctrica más común en respuesta a acetilcolina, corresponde a un canal específico para cationes que posee un nivel principal de conductancia de aproximadamente 78 pS y un subnivel de 25 pS . Esta actividad de canal iónico posee especificidad farmacológica, selectividad fónica, y sufre procesos de desensibilización, propiedades observadas en AcChR nativo de 7: niarniorata . Los liposomas gigantes formados con vesículas de asolectina pero en ausencia de AcChR, no muestran actividad de canal iónico; cuando los liposomas contienen AcChR, la relación señal/ruido obtenida es excelente . El AcChR en los liposomas gigantes se orienta con los sitios de unión de ligandos dirigidos hacia el exterior, con lo cual al hacer el sello en parche aislado da lugar a la configuración "inside-out" con lo que dichos sitios de unión quedan en el interior de la pipeta y resulta difícil variar la solución de ésta, durante el experimento . La incorporación de proteínas de membrana con actividad de canal iónico en liposomas gigantes, presenta claras ventajas frente a otros métodos de reconstitución. Se enumeran a continuación ventajas e inconvenientes más generales de cada uno de éstos métodos con el fin de establecer una comparación de las aportaciones de la incorporación en liposomas gigantes frente a otros métodos tradicionales de reconstitución . El primer método desarrollado fue la reconstitución en bicapas plalras. Este método, presenta la ventaja de permitir el acceso a ambos lados de la bicapa durante el experimento, además de permitir la formación de bicapas con diferente composición lipídica, simétricas o asimétricas . Sin embargo, un

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inconveniente esta técnica es que la fusión de proteínas en la bicapa sucede al azar, debido a ello cada experimento es único, diferente al anterior . Además para la formación de bicapas planas se necesitan volúmenes grandes de proteína . La formación de una bicapa en la punta de una pipeta de patch, "double dip", permite la resolución de los canales pequeños debido a que el pequeño diámetro de la pipeta, 1 prn, da lugar a una buena relación señal/ruido. Otra ventaja de éste método, es que se optimiza la cantidad de proteína necesaria, pues se trabaja con volúmenes pequeños de ésta. Las proteínas reconstituidas de éste modo están contenidas en monocapas y durante la formación de la bicapa pasan por la interfase aire/agua, pudiendo esta situación dañar su

actividad. En cuanto a la reconstitución en liposomas gigantes, el principal inconveniente es que debido a que los liposomas son multilamelares únicamente se pueden realizar registros de patch-clamp en configuración de parche aislado, haciendo necesario un sistema de perfusión si se desea cambiar la solución coi-respondiente al interior de la pipeta. A éste inconveniente podría añadírsele la posible alteración de la funcionalidad que tuviese lugar al someter la proteína a un ciclo de deshidratación parcial / rehidratación. Con el AcChR incorporado en liposomas gigantes hemos obtenido valores de conductancia similares a los obtenidos en cultivos de músculo esquelético de ratón (Brelrm y Kullberg, 1987), y músculo de Xenopus (Brehm y col ., 1984a y b), o bien mediante la expresión del AcChR de T. marmorata en oocitos (Imoto y col .,

1988) . En cuanto a las ventajas de éste sistema frente a otros métodos de reconstitución, el diámetro de la pipeta de patch es de aproximadamente 1 lim, lo cual permite detectar canales pequeños con la resolución adecuada, y además se obtiene una buena relación señal/ruido . Se puede variar la cantidad de proteína incorporada, por lo tanto se optimiza la cantidad a utilizar y se controla, con relativa facilidad, la posibilidad de tener canales fónicos a una determinada densidad. Asimismo el experimento es totalmente repetitivo para unas condiciones iniciales determinadas . La ausencia de solventes o detergentes en el proceso elimina el riesgo de que éstos dañen a la proteína . Se ha comprobado que el método sirve tanto para membranas nativas como para material purificado, solubilizado y previamente reconstituido. La principal ventaja e innovación del método de reconstitución en liposomas gigantes, es que permite realizar en el mismo material en que se estudian los canales

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fónicos y de forma paralela estudios bioquímicos y morfológicos que complementan el estudio de la proteína incorporada. En resumen, se ha demostrado que la formación de liposomas gigantes, es en realidad un proceso de fusión seguido por la redistribución de los componentes inicialmente presentes, y se ha caracterizado funcionalmente el AcChR de T rnarrrrorata incorporado en liposomas gigantes mediante la fusión de membranas nativas y vesículas de asolectina . El AcChR incorporado conserva las propiedades de éste receptor previamente observadas en membranas nativas . Esta técnica, en combinación con otras técnicas bioquímicas y de biología molecular puede colaborar en el estudio de las consecuencias funcionales de mutaciones puntuales o modificaciones posttranslacionales, en ésta y en otras proteínas con actividad de canal fónico . De hecho esta técnica ha demostrado ser de gran utilidad en el estudio de las propiedades funcionales de proteínas tales como el receptor de glicina (Riquelme y col ., 1990a), el receptor de glutamato presente en densidades postsinápticas (Riquelme y col., 1993 ; Wynecken y col ., 1996), y el canal de cloro presente en placenta humana (Riquelme y col ., 1995) . 2. Estudio estructural de las formas monomérica y dimérica del AeChR. El puente disulfuro responsable de la formación del dímero, es susceptible de reducción por DTT, dando lugar a grupos sulfhidrilo libres que no se reoxidan espontáneamente . El presente trabajo pretende esclarecer el papel funcional de este disulfuro intermolecular, para lo cual se obtiene la forma monomérica del AcChR incubando la forma nativa con el agente reductor DTT. La reducción se realiza en ausencia de detergentes o agentes desnaturalizantes, por lo que solo se reducen los enlaces disulfuro fácilmente accesibles, y a continuación se elimina exhaustivamente el agente reductor, con lo que parte de los disulfuros reducidos se reoxidan espontáneamente . Mediante la utilización de técnicas electroforéticas se ha estudiado el efecto que produce en el AcChR la reducción con DTT . Se ha comprobado que el puente disulfuro responsable de la forma dimérica del receptor se reduce con el tratamiento efectuado, y que dicha reducción no se revierte al eliminar exhaustivamente el agente reductor del medio, con lo que el monómero resultante permanece estable en el tiempo . Con el propósito de evaluar el efecto del DTT sobre otros puentes disulfuro presentes en el AcChR se han alquilado los grupos sulfhidrilo libres en la molécula, con iodoacetamida, y se han detectado mediante análisis de aminoácidos como carboximetilcisteinas (Gavilanes y col., 1983). Los resultados obtenidos indican que en presencia de

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DTT se reducen tres puentes disulfuro, reoxidandose dos de ellos espontáneamente al eliminar el agente reductor. La combinación de los resultados obtenidos con estas dos técnicas indica que con el tratamiento efectuado sólo permanece reducido el puente disulfuro responsable de la formación del dímero, permitiendo afirmar que el puente disulfuro presente en la subunidad a, cercano al sitio de unión a ligandos queda inalterado . Estos resultados son consistentes con los obtenidos en el estudio funcional de ambas formas moleculares, que se discuten el próximo apartado . La aplicación de la técnica de cnofractura ha contribuido significativamente al conocimiento de las membranas biológicas. La matriz lipídica de la membrana estudiada mediante esta técnica aparece usualmente como una superficie lisa en la que se observan una serie de partículas intramembranosas (IMPs). Existen evidencias acumuladas de que estas partículas representan proteínas o agregados lípido-proteína; sin embargo la demostración más directa de la naturaleza proteica de las IMPs se obtuvo mediante experimentos de reconstitución de membranas, en los que se observó que solo aparecen partículas tras la introducción de proteínas (Vail y col., 1974). La forma y el tamaño de las IMPs son parámetros intrínsecos de la proteína estudiada, no dependen de la concentración de la proteína, de su peso molecular, ni del entorno lipídico (Garcia-Segura y col., 1986a, b) ; pero si parece depender del grado de oligomerización o de la conformación tridimensional de la misma (Garcia-Segura et al, 1986a) . Se han realizado estudios mediante la técnica de cnofractura en membranas nativas de T marmorata observadas "in situ" en periodos de tiempo inmediatamente posteriores a la excitación (Dunant y col., 1989), encontrándose dos tipos de partículas, redondeadas y alargadas . Los autores sugieren la idea de que las partículas alargadas son en realidad dos moléculas de AcCliR unidas formando un dímero. Incluso comprueban que la densidad de estas partículas varía en la membrana postsináptica después de una estimulación eléctrica presináptica, sugiriendo que la activación del receptor se acompaña de la redistribución de los componentes de la membrana postsináptica, tal vez desplazamiento de equilibrios monómero-dímero . Con el fin de comprobar esta teoría, hemos estudiado las características morfológicas de las distintas formas agregadas (monomérica y dimérica) del receptor purificado, reconstituido en liposomas gigantes . Nuestros resultados indican que la cantidad de IMPs observada es proporcional a la cantidad de proteína añadida al formar los liposomas, y que dichas IMPs no se observan cuando los liposomas se forman en ausencia de AcChR. La alta resolución de

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esta técnica permite observar partículas intramembranosas (IMPs) en los liposomas gigantes, pudiéndose distinguir ambas formas moleculares por poseer un tamaño distinto, así se ha logrado establecer una correspondencia entre estados de agregación definidos del AcChR (monomérico y dimérico) y las imágenes de criofractura a que dichos agregados dan lugar. De este modo, hemos comprobado que los agregados observados "in situ" en periodos de tiempo inmediatamente posteriores a la excitación (Dunant y col ., 1989) no parecen corresponderse con los estados de agregación monomérico y dimérico

estudiados en este trabajo . En todas las muestras estudiadas se observan dos tipos de partículas claramente diferenciables por su diámetro . En las muestras nativas el 80% de las partículas observadas tienen un diámetro de 13 nm, y el 20% restante un diámetro de 9 nrn . ; tras la reducción sólo el 20% de las partículas presenta un diámetro de 13 nm, y el 80% restante pasa a tener un diámetro de 9 nm. Estos resultados, sumados a los experimentos realizados por Clrang y Bock (1977) donde se observa que en estado nativo, el 80% del AcChR procedente de Torpedo se encuentra en forma dimérica, nos llevan a concluir que las partículas observadas en las muestras en estado nativo y que representan el 80% de la población se corresponden con el dímero del receptor y que el 20% restante se correspondería al monómero . El tratamiento con el agente reductor invierte estos porcentajes, tal y como se ha observado mediante técnicas de electroforesis.

La aplicación de la técnica de espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier al estudio de proteínas ha demostrado ser especialmente útil para detectar diferencias estructurales existentes entre los distintos confórmeros de proteínas complejas, incluyendo algunas proteínas de membrana . La espectroscopia de FT-IR tiene la ventaja de proporcionar información directa de la estructura secundaria del esqueleto proteico, ya que ciertas bandas de absorción características de las vibraciones de grupos amida, particularmente la banda amida 1, son sensibles a conformación (Surewicz y Mantsch, 1988) . En la presente memoria se ha utilizado esta técnica para estudiar los posibles cambios conformacionales inducidos en el AcChR por el tratamiento con el agente reductor DTT, que permite obtener la forma monomérica del receptor a partir de la dimérica (nativa) . Para llevar a cabo estos estudios se ha utilizado AcChR purificado y reconstituido en lípidos de asolectina, ya que la presencia en la muestra de otras proteínas distintas al AcChR impide la detección de efectos específicos sobre la estructura del mismo .

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Se ha estudiado el espectro FT-IR del AeChR purificado y reconstituido en ambos estados de agregación, comparando entre sí las dos formas moleculares del receptor . Al analizar los resultados se comprobó que la muestra tratada con el agente reductor presenta cambios pequeños, aunque reproducibles en el contorno de la banda amida 1. La cuantificación de las diferentes subestructuras que conforman la banda amida I, indica que no se produce una variación significativa en las estructuras ordenadas a-hélice . En cambio las hojas (3 y las estructuras no ordenadas sí experimentan una variación significativa, disminuyendo las primeras y aumentando las últimas; esto lleva a interpretar que el aumento de estructuras no ordenadas se hace a expensas de las estructuras ordenadas en R . El hecho de que el AcCllR permanezca funcional en ambas formas moleculares podría indicar que el alto porcentaje de a-hélice le permite mantener la actividad de canal rónrco . En nuestro laboratorio se ha estudiado detalladamente la estructura secundaria del AcChR purificado y reconstituido, no encontrando nunca variaciones superiores al 3% entre los diferentes ensayos ; esta ha sido la referencia utilizada a la hora de considerar que no es significativa la variación observada en la estructura de a-Hélice, y en cambio sí son significativas las variaciones cercanas al 10% producidas en las hojas R y estructura no ordenada. Los estudios de desnaturalización térmica producen grandes cambios en la estructura proteica del receptor, fenómeno previamente caracterizado por DSC (Artigues y col ., 1987) . El seguimiento de dicha desnaturalización por FT-IR es fácilmente detectable a través de diversas alteraciones en la forma y en la anchura de la banda amida 1, proporcionando además valores para la temperatura de desnaturalización de la proteína similares a los obtenidos por técnicas de calorimetria diferencial de barrido (Catresana y col ., 1992) . El tratamiento con el agente reductor no provoca variaciones significativas en la temperatura de desnaturalización, por lo que podemos concluir que la reducción del puente disulfuro responsable del dímero no implica variaciones importantes en la estabilidad global de la proteína, ya que no se modifica la estabilidad térmica (no varia la temperatura de desnaturalización). De todo esto podríamos concluir que el tratamiento realizado en este trabajo para obtener la forma monomérica del AcChR, no provoca variaciones estructurales importantes en el mismo, permaneciendo la estructura que conforma el canal fónico sin modificar. Además de las posibles implicaciones dei estado de agregación del receptor en su estructura se liar] llevado a cabo estudios destinados a determinar el comportamiento de ambas formas moleculares a nivel funcional .

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3. Estudiofuncional de lasformas monomérica y dimérica del AeChR. Estudios previos de la funcionalidad de las formas monomérica y dimérica del AeChR realizados midiendo el flujo total de entrada de 22Na+ inducido por agonista, demuestran que la reducción del disulfuro responsable del dímero no afecta a la entrada de iones inducida por carbamilcolitra, concluyendo que el canal fónico está contenido dentro de la unidad estructural del monómero (Anholt y col ., 1980). Posteriormente, Wu y Raftery (1981) estudiaron el transporte fónico en ambas formas moleculares mediante técnicas de cinética rápida, concluyendo que tanto el dímero como el monómero responden al agonista, carbamilcolina, transportando iones en una escala de tiempo de milisegundos ; ambos flujos se bloquean por histrionicotoxina y ambos se desensibilizan en presencia continuada de agonista . En 1984, Schindler y col . propusieron que las estructuras monomérica y dimérica del AcCbR reconstituido en bicapas planas son funcionalmente diferentes, indicando que la conductancia del dímero es aproximadamente dos veces mayor que la del monómero . La presente memoria se ha centrado en estudiar el posible papel funcional de las formas monomérica y dimérica del AcCliR, para lo cual se ha estudiado tanto la desensibilización como el transporte fónico, en ambas formas moleculares, con mayor profundidad. La desensibilización es una propiedad molecular intrínseca del AcChR, inducida por la presencia continuada de agonistas colinérgicos. Es un fenómeno reversible que se caracteriza por la inhibición de la permeabilidad fónica, acompañada por el desplazamiento del receptor de un estado de baja afinidad hacia los agonistas a un estado de alta afinidad por los mismos. A pesar de que su significado fisiológico no se conoce a fondo, parece posible afirmar que tiene un papel significativo en el control del correcto funcionamiento de la sinapsis neuromuscular . De este modo, la desensibilización puede representar un mecanismo general de protección frente a la sobreexposición de un estímulo; en términos farmacológicos el estímulo es el propio agonista al que el sistema responde. Este proceso puede modularse por diversas sustancias endógenas, exógenas y por modificaciones covalentes en la estructura del AcChR (Ochoa y col ., 1989). Las transiciones de afinidad en el receptor se deben a cambios conformacionales que provocan la desensibilización ; según ciertos autores, esta propiedad es necesaria, aunque no suficiente, para asegurar que el AcCliR sea frmcional (Fong y McNarnee, 1986 ; Sunshine y McNarnee, 1992) . Para comprobar la capacidad del AcChR de producir dichas transiciones, se ha medido la cinética de unión a a-Bgt coincubando y preincubando con el

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agonista carbamilcolina . En condiciones de plena funcionalidad la preincubación con el agonista debería llevar al receptor a un estado desensibilizado (de alta afinidad por los agonistas), fácilmente distinguible del estado de reposo (de baja afinidad por los agonistas), midiendo la velocidad de unión de a-Bgt al receptor . Las medidas de la velocidad aparente de unión de toxina al receptor son un ensayo indirecto, pero suficientemente sensible para detectar cambios en las transiciones de afinidad inducidas por el agonista (Barrantes y col ., 1980). En este trabajo se han investigado los efectos de la reducción del enlace disulfuro responsable del dimero del AcChR, en la interconversión entre los distintos estados de afinidad del receptor inducidos por agonistas colinérgicos. Se ha comprobado que ni el número de sitios de unión de t 25 1-a-Bgt al receptor ni la velocidad de unión en ausencia de Cch varían debido al tratamiento con DTT, lo que da validez a la utilización de este método para detectar las transiciones de afinidad inducidas por agonista en los distintos estados de agregación del AcChR. Se han realizado estos estudios tanto en membranas alcalinizadas como en receptor purificado y reconstituido en ambas formas estructurales. Los resultados obtenidos muestran que en ambos estados de agregación tiene lugar la transición entre estados de afinidad, esto es, la preincubación con el agonista aumenta la afinidad del receptor por el mismo con lo que disminuye la velocidad de unión de a-Bgt al receptor . Se ha estudiado la formación del complejo receptor-toxina en exceso de toxína y se ha medido la constante de velocidad de pseudo primer orden; estos resultados se han cuantificado estudiando la relación entre las constantes aparentes de velocidad de unión de a-Bgt, coincubando y preincubando con el agonista, Kco/Kpre. En ambas formas moleculares se ha hallado que esta relación es mayor que dos, lo que según el criterio de Sunshine y McNamee (1992), implica que son capaces de llevar a cabo la transición de afinidad . Moore y Raftery (1979) observaron que la reducción del disulfuro cercano al sitio de unión de ligandos anula la transición de afinidad inducida por carbamilcolina en el AcChR, comprobando que al eliminar el agente reductor por centrifugación o diálisis el receptor recupera de modo gradual su capacidad de llevar a cabo la transición de afinidad, muy probablemente debido a la reoxidación del disulfuro responsable. De acuerdo con esto, nuestros resultados son consistentes con el hecho de que el puente disulfuro cercano al sitio de unión a ligandos no se ha visto afectado con el tratamiento realizado

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para obtener la forana monomérica, tal y como se afirma en el apartado anterior . No obstante, se ha confirmado que tanto en membranas alcalinas como en receptor purificado y reconstituido, la forma monomérica presenta menor incremento de afinidad ti-as la incubación con el agonista que la forma nativa (el valor de la relación Kco/Kpre es casi la mitad) ; lo que parece señalar que aunque la reducción del disulfuro responsable de la forma dimérica no anula la transición de baja a alta afinidad inducida por carbamilcolina, sí la modifica, disminuyendo el incremento de afinidad producido . Estos resultados sugieren que los cambios conformacionales implicados en la transición entre los estados de afinidad en el receptor, son sensibles al estado de agregación de la proteína . Otros autores han estudiado mediante criomicroscopía electrónica la disposición de las subunidades del AcChR, en los estados de reposo y desensibilizado, con una resolución de 18 A . De acuerdo a este estudio la desensibilización implica reordenaciones en la orientación relativa de las subunidades para dar lugar a una configuración menos simétrica del receptor, siendo estos cambios más pronunciados en las subunidades y y 8, en las zonas intra y extracelulares (Unwin y col ., 1988). Del mismo modo, experimentos de marcaje con el antagonista competitivo DDF, indican que tras la desensibilización ocurren cambios conformacionales locales que hacen más accesibles dominios de la subunidad 8, sugiriendo que esta subunidad podría estar implicada en el proceso de desensibilización del AeChR (Calzi y col ., 1991) . Estos resultados podrían explicar que el estado de agregación de la subunidad b este implicado en la mayor o menor facilidad de la misma para orientarse durante el proceso de desensibilización ; modificando así la transición de afinidad . Como ya se ha comentado, el hecho de que se produzcan transiciones de estado no es suficiente para garantizar la plena funcionalidad del AcChR, que implica el control sobre la apertura y cierre del canal asociado, permitiendo el paso de iones a su través. La traslocación de iones en ambas formas moleculares se ha estudiado a nivel de flujo total de iones mediante técnicas de cinética rápida y,. a nivel de canal único mediante la técnica de patch-clamp. El análisis cuantitativo in vitro del transporte fónico a nivel de flujo total de iones a través de vesículas de membrana, se ha llevado a cabo mediante la técnica de flujo detenido, que permite el seguimiento continuo del flujo fónico a través de la vesícula en una escala de tiempo próxima a la fisiológica. Los datos obtenidos muestran que el AcChR procedente de órgano eléctrico de Torpedo, tanto en membranas alcalinizadas como purificado y reconstituido en

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vesículas de asolectina, retiene las propiedades funcionales de la proteína en su ambiente nativo, es decir flujo fónico estimulado por agonista y desensibilización . La realización de estudios comparativos utilizando vesículas de membrana y receptor purificado y reconstituido en ambas formas estructurales demuestra que, tanto el dímero como el monómero responden al agonista carbamilcolina transportando iones Tl+ en la escala de tiempo de milisegundos . Con el fin de establecer una relación entre el estado de agregación del AcChR y el estado fimcional del canal fónico, se ha realizado un análisis cuantitativo de la respuesta de permeabilidad obtenida en ambas situaciones. La naturaleza sigmoide de la curva obtenida al representar la constante aparente de flujo fónico frente a la concentración de agonista corrobora anteriores estudios (Walker y col ., 1982), confirmando la existencia de los dos sitios de unión para agonista en las dos subunidades a, previamente puestos de manifiesto (McNarnee y Ochoa, 1982 ; Kao y col ., 1984). Se ha obtenido un coeficiente de Hill, de unión del agonista al receptor, cercano a dos, tanto en las muestras diméricas como monomericas, lo que indica que no se producen cambios significativos en la cooperatividad de la unión del agonista entre ambas formas moleculares. Ambos estados de agregación necesitan la unión de dos moléculas de agonista por molécula de receptor para proceder a la apertura del canal. De acuerdo con este resultado podría también reafirmarse que el puente disulfuro cercano al sitio de unión a ligandos no se ha modificado, ya que la reducción de dicho puente disulfirro causaría la diminución del coeficiente de Hill de 2 a 1 (Schiebler y col ., 1977; Barrantes y col ., 1980). A esta misma conclusión se ha llegado en el estudio estructural, y en el análisis de las transiciones de afinidad inducidas por agonista anteriormente comentadas. La velocidad de flujo tónico a través de las vesículas es proporcional al número de canales activados en ese momento, por lo tanto la caída de fluorescencia inducida por agonista sirve como medida de la población activa de receptores . De igual forma el efecto del estado de agregación del receptor en su funcionalidad se puede estudiar comparando las velocidades de caída de fluorescencia dependiente del agonista en ambas formas moleculares. La representación de las constantes aparentes de flujo fónico frente a la concentración del agonista, permite calcular los valores de la velocidad máxima de flujo del proceso (kmax), proporcional al número de canales activos presentes en la superficie de las vesículas, y de la constante de disociación del agonista (KD). En las dos formas moleculares se ha observado que la velocidad

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máxima de flujo (kmax) permanece constante, indicando que ambos estados de agregación son igualmente activos a nivel de flujo máximo de permeación de iones . Esto se correlaciona positivamente con la capacidad de llevar a cabo la transición de afinidad inducida por agonista que presentan ambas formas moleculares. Sin embargo, al estudiar la constante de disociación se observan diferencias entre ambos estados de agregación . El receptor reducido, esto es en forma monomérica, muestra valores superiores indicando que en el monómero la afinidad del receptor por el agonista, carbamilcolina, es menor que en el dímero nativo . De estos estudios se puede concluir que el estado de agregación del receptor no afecta a la población de canales activos pero sí al modo de activación de los mismos. La comparación de los resultados obtenidos con estas dos técnicas, velocidad de unión de toxina al receptor, y traslocación de iones mediante técnicas de cinética rápida no se puede realizar directamente ; no obstante ambas técnicas coinciden en lo fundamental . La capacidad del receptor, en ambos estados de agregación, de desensibilizarse en presencia continuada de agonista se ha estudiado a fondo mediante la capacidad del mismo de inducir la transición de afinidad que la acompaña y se ha corroborado observando, mediante técnicas de cinética rápida, que en estado desensibilizado el receptor se encuentra cerrado al paso de iones. Los estudios de las transiciones de afinidad presentan la ventaja de encontrar diferencias entre ambos estados de agregación, aunque ambos se desensibilicen ; no es así con las medidas de traslocación de iones que solo distinguen que en estado desensibilízado el receptor esta cerrado al paso de iones sin permitir diferenciar ambas formas de agregación . No obstante, el estudio de traslocación de iones además de corroborar la capacidad de desensibilización de ambas formas moleculares permite detectas' la población de receptores activos en ambas muestras, descartando la posibilidad de que las diferencias observadas entre los dos estados de agregación se debiesen a que parte de la población no se encontrase totalmente funcional. Adicionalmente esta técnica nos ha permitido estudiar la afinidad del receptor por el agonista y encontrar diferencias entre ambas formas moleculares. Como parte final de este trabajo se han realizado experimentos orientados a confirmar la diferencia de comportamiento en la actividad del receptor a nivel de canal único entre ambos estados de agregación .

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En trabajos anteriores se ha sugerido que las estructuras monomérica y dimérica del AcChR reconstituido en bicapas planas son funcionalmente diferentes, indicando que la conductancia asociada al dímero parece resultar de la apertura sincronizada de los dos monomeros que lo forman, dando la impresión de un único canal (Schindler y col ., 1984); sin embargo se desconoce su significado preciso . Para profundizar en este problema hemos estudiado ambas formas de agregación en sistemas modelo de liposomas reconstituidos (Riquelme y col., 1990b), utilizando la técnica de "patch-clamp" en configuración de parches aislados ; debido a que los liposomas son multilamelares esta es la única configuración realizable, y dada la orientación que el AcChR adopta la hemos denominado "inside-ouC . Se ha estudiado el receptor en tres situaciones diferentes, en forma nativa (dímero), reducido (monómero) y nativo reducido durante el experimento. Los resultados obtenidos corroboran que tanto el monómero como el dímero son funcionales, pues presentan actividad de canal único ; las diferencias encontradas entre ellos se basan en el estado de conductancia predominante en

cada caso. En estado nativo, el patrón de actividad eléctrica obtenido en respuesta a carbamilcolina presenta una conductancia entre 67 y 80 pS, en soluciones simétricas de 140 mM NaCI. Estos valores de conductancia, asociados al dímero del receptor, son consistentes con los que hemos descrito, en la fase inicial de este trabajo, en membranas nativas de Torpedo (Riquelme y col ., 1990b). Estas membranas, utilizadas para evaluar el sistema de reconstitución en liposomas gigantes, contienen al AcChR en forma predominantemente dimérica ya que se han purificado incluyendo agentes alquilantes durante la homogeneización inicial del tejido eléctrico. Adicionalmente, se observan otros valores de conductancia múltiplos de éste que parecen representar transiciones sincronizadas de orden superior ; considerando que el nivel de corriente descrito corresponde a un dímero, estas transiciones sincronizadas podrían ser oligómeros, donde la responsabilidad de la sincronización en la apertura y cierre de los canales no necesariamente es un enlace covalente. Este fenómeno de sincronización parece depender del potencial aplicado (ver Resultados, Figura 8 .1), dando lugar a un comportamiento diferente para los potenciales positivos y negativos; efecto que no se ha estudiado a fondo pues no es relevante para el objetivo de este estudio. En liposomas con el receptor incorporado en forma monomérica, se ha obtenido un alto porcentaje de sellos silenciosos ; sólo el 17% de los sellos realizados se han considerado activos, aunque muestran actividad corta y

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caótica. En los sellos considerados activos se observan saltos discretos de corriente, asociables a la actividad de un canal, pero de corta duración . Estos canales presentan amplitudes unitarias, que se corresponden a la mitad del dímero (alrededor de 37 pS), y otras amplitudes múltiplos pares e impares de ésta. Este comportamiento se asemeja al encontrado en las medidas de flujo total de iones de muestras reducidas, en las que posiblemente el agente reductor no se había eliminado totalmente . En esta situación encontramos trazas ruidosas, que dificultaron mucho el estudio, y que se evitaron dializando exhaustivamente el agente reductor . La dificultad de obtener sellos de buena calidad, y cuando se obtienen, el alto porcentaje de sellos silenciosos o con una actividad poco reproducible podrían deberse bien a la exposición al agente reductor, o bien al proceso de formación de los liposomas gigantes . Tal y como se ha mostrado en esta memoria, el AcChR en estado nativo no presenta estos problemas, hecho que sugiere que podrían deberse al tratamiento con el agente reductor . Mediante experimentos de cinética rápida hemos observado que en las muestras reducidas, una vez que se ha eliminado exhaustivamente el DTT, el flujo máximo de permeación de iones es el mismo que en la muestra nativa (ver secciones 7.4 y 7.5 de Resultados), excluyendo la posibilidad de que el tratamiento efectuado para obtener la forma monomérica esté inactivando un alto porcentaje de receptores. Estas observaciones sugieren que el receptor reducido se alteraría con el ciclo de deshídratación-rehidratación efectuado en el proceso de formación de los liposomas gigantes, dificultando este tipo de registros electrofrsiológicos . Estas dificultades hicieron necesario estudiar el efecto de la reducción del receptor en condiciones de mejor reproducibilidad experimental, para lo cual se diseñó un nuevo protocolo ; partiendo de sellos con el receptor- en forma nativa, se añade el agente reductor "in situ" obteniendo así el receptor nativo y el reducido en el mismo sello . El cambio de estrategia experimental aporta un mayor número de evidencias que se repiten consistentemente corroborando los escasos resultados obtenidos en las muestras previamente reducidas. De esta manera se ha observado, tanto en las muestras previamente reducidas, como en aquellas reducidas durante el experimento, que la reducción del AcChR provoca la disminución de la conductancia . Asimismo, se observa que esta disminución no es al azar, dando lugar a una conductancia unitaria que es la mitad de la conductancia asociada al receptor nativo (dímero) . El estudio del comportamiento de ambas formas moleculares se ha realizado comparando el estado de conductancia predominante en cada una de

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ellas (Figura 8.4). En el receptor en forma nativa el estado de conductancia predominante es aproximadamente el doble que en el receptor reducido . Estos resultados sugieren la posibilidad de un fenómeno de sincronización en la apertura y el cierre de los canales, mediado por enlaces covalentes en la estructura dimérica del receptor en estado nativo . Se ha observado también la existencia de otros valores de conductancia distintos de los predominantes, que parecen múltiplos de estos; este hecho parece indicar que el receptor adopta diferentes estados de agregación, esto es oligómeros, que no precisan necesariamente de la unión covalente mediante puentes disulfuro. La multiplicidad de niveles se ha observado en la dos situaciones estudiadas, aunque los niveles unitarios cambian, siendo el descrito en estado nativo, que se corresponde con estructura dimérica, el doble del descrito como unitario

asociado al monómero . No obstante, al añadir el agente reductor "in situ" no queda bien definido si los resultados obtenidos se deben únicamente a la reducción del puente disulfuro responsable del dímero o pudieran tal vez estar relacionados con la reducción de otros disulfuros presentes en la molécula. En este trabajo, tal y como se ha descrito en la sección 8.1 .3 de Resultados, a los 20s de añadir el agente reductor se detecta una disminución en la conductancia (a la mitad de su valor inicial), y tras la presencia continuada del mismo, aproximadamente a los 40-50 minutos, la actividad eléctrica se modifica drásticamente hasta desaparecer . Estos resultados parecen reflejar el hecho de que el DTT reduce en pocos segundos el puente disulfuro responsable del dímero, y tras la exposición continuada reduce otros puentes disulfuro, probablemente el situado en la subunidad a, cercano al sitio de unión a ligandos, que explicaría el comportamiento observado. Todos los resultados presentados en esta memoria se han obtenido transcurridos 20 segundos después de añadir el agente reductor y antes de los 40 minutos, por lo cual consideramos que estamos estudiando el efecto de la reducción del dímero . Los estudios realizados por otros autores (Schindler y col ., 1984), sobre las estructuras monomérica y dimérica del AcChR reconstituido en bicapas planas ponen de manifiesto que ambas formas son diferentes funcionalmente, indicando que los valores de conductancia asociados al dímero parecen resultar de la apertura sincronizada de dos monómeros dando la impresión de un único canal . Los autores obtienen la forma monomérca mediante distintos procedimientos: separándola con un gradiente de sacarosa, reduciendo previamente el dímero nativo con DTT y reduciendo el receptor durante el experimento, obteniendo con las tres metodologías idénticos resultados. Estos resultados, acordes con los nuestros,

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permiten descartar la posibilidad de que los efectos encontrados cuando el tratamiento con el agente reductor se realiza durante el experimento, sean consecuencia de haber reducido algún otro puente disulfuro en la molécula además del responsable de la forma dimerica. Estudios previos de actividad a nivel de canal único del AeChR, muestran valores de conductancia comprendidos en un amplio rango, (16-80 pS) . Esta gran diversidad de valores incluye la utilización de una metodología variada: diversas técnicas de reconstitución, patch-clamp en células y la expresión del AcChR en oocitos, así como diversas fuentes de AcCliR: Torpedo, Electroplwrus, músculo de mamíferos, de rana, o de Xenopus. Durante el periodo de tiempo transcurrido entre 1980 y 1985 se propusieron una gran diversidad de valores de conductancia para el AcChR procedente del órgano eléctrico de Torpedo estudiado a distintas concentraciones iónicas, y empleando diversos métodos de reconstitución; algunos de estos valores, comparables y no comparables, se detallan a continuación. En bicapas planas, se han descrito los siguientes valores de conductancia, equiparables entre sí : 43 ±3 pS a 0 .5 M de NaCI (Schindler y Quast, 1980; Schindler y col ., 1984 ; Labarca y col ., 1984; Labarca y col., 1985) ; 28 pS a 0.3 M de NaCI (Labarca y col ., 1984) ; 90 pS a 1 M de NaCI (Schindler y Quast, 1980 ; Boheim y col., 1981), así corno otros valores muy dispares, no comparables con estos como son : 60 pS a 0.5 M de NaCI (Nelson y col ., 1980) y un rango de valores de 2131 pS a 0 .141 M NaCI (Coronado y col., 1984). En la punta de una pipeta de patch, en consonancia con algunos valores descritos en bicapas planas, SuarezIsla y col . (1983) obtuvieron un valor de 40 pS a 0 .5 M de NaCI . Mediante la técnica de patch-clamp en liposomas cuyo tamaño se ha aumentado mediante ciclos de congelación-descongelación, se describió un valor de 42 pS a 0.150 M de NaCI (Tank y Miller, 1983). Este autor es el único, dentro del conjunto de trabajos citados, que muestra en su artículo una curva de conductancia frente a concentración de Na+ . Interpolando en dicha curva las concentraciones de Na+ utilizadas en estos trabajos, se obtienen valores de conductancia que no se correlacionan entre sí, e incluso algunos de ellos se contradicen . Por ejemplo, para una concentración 0.5 M de NaCI Tank y Miller (1983) predicen una conductancia de 70 pS mientras que Schindler y col. (1980), para la misma concentración describen una conductancia de 45 pS . En la fase inicial de esta memoria, nosotros estudiamos mediante la técnica de patch-clamp, la forma nativa del AcCliR del órgano eléctrico de T inarmorata reconstituido en liposomas gigantes, hallando un valor de conductancia de 78 pS a 0.1 M de NaCI (ver Resultados apartado 1 .4.4;

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Riquelme y col., 1990) . Adicionalmente Hanke y Breer (1986), estudiaron el AcChR neurona¡ de insecto reconstituido en bicapas planas obteniendo una conductancia de 75 pS (0 .1 M NaCI) ; este resultado es comparable con el nuestro, tanto en el valor de conductancia obtenido, como en la concentración de Na+ utilizada. Mediante la técnica de patch-clame en células musculares de mamíferos se han hallado valores de conductancia bastante concordantes entre sí. Se han descrito dos tipos de corrientes, aparentemente procedentes de dos poblaciones distintas de receptores, cuyas conductancias son: 45 pS y 64 pS (Brehm y col., 1984a,b; Brehm y Cullberg, 1987); 25 pS y 35 pS (Hamill y Sakmann, 1981); 25 pS y 43 pS (Leonard y col., 1984) y 35 pS y 55 pS (Schuetze y col . 1986) . Independientemente de los valores de conductancia hallados, todos estos autores coinciden en que la población de AcChR que presenta menor conductancia predomina en la etapa prenatal, y la de mayor conductancia en el adulto. Durante la formación del contacto neuronal coexisten ambos tipos de receptores en la misma fibra muscular. Mediante experimentos de expresión del receptor de músculo de mamíferos en oocitos de Xenopus, Mishina y col. (1986) demostraron que los dos tipos de receptor se corresponden con dos moléculas diferentes estructuralmente . El receptor embrionario, cuya composición de subunidades es a2Ryb, da lugar a una conductancia de 39 pS y el receptor de adulto cuya composición de subunidades es a2Pc3, da lugar a una conductancia de 60 pS . Previamente los inisinos autores habían estudiado el AcChR de Torpedo, cuya composición de subunidades coincide con el receptor de músculo embrionario, expresado en oocitos obteniendo este mismo valor de conductancia de 42 pS (Sakmann y col ., 1985) . Tras el análisis de la gran diversidad de conductancias existentes en la literatura, y a la vista de los resultados presentados en esta memoria, parece obvio cuestionar si la razón de esta diversidad puede estar relacionada con el estado de agregación del AeChR . Así pues, algunos de los resultados descritos, aparentemente contradictorios, podrían ser interpretados corno pertenecientes a un distinto estado de agregación del receptor (monomérico o dimérico), favorecido por el método de preparación de las muestras, el sistema de reconstitución utilizado e incluso la procedencia del mismo . El método de preparación del AcChR es importante, ya que en el órgano eléctrico de Torpedo en estado nativo, el receptor se encuentra predorninanternente formando un dírnero ; la presencia de agentes alquilantes durante la homogeneización del tejido eléctrico previene su reducción, dando lugar a preparaciones mayoritariamente diméricas (Chang y Bock, 1977). De

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este modo, Tank y Miller (1983) que no utilizaron agentes alquilantes en la fase inicial de la purificación, con lo que probablemente obtienen una preparación mayoritariamente monomérica, obtuvieron un valor de conductancia de 42 pS (0.150 M NaCI), totalmente acorde con la conductancia que proponemos para la forma monomérica del AcChR. En cuanto al sistema de reconstitución utilizado, el receptor reconstituido en bicapas planas da lugar a valores de conductancia en su mayoria menores que los obtenidos en liposomas ; teniendo en cuenta que en todas las preparaciones de receptor utilizadas un porcentaje se encuentra en forma monomérica podría especularse que quizá la reconstitución en bicapas planas esté favoreciendo la inserción del monómero, justificándose así estos valores. Referente al origen del receptor, en el órgano eléctrico de Torpedo éste se encuentra predominantemente en forma dimérica (Chang y Bock, 1977; Hamilton y col., 1979), y por el contrario tanto en el músculo como en Electrophorus se encuentra como monómero (Lindstrom y Patrick, 1974; Froehner y Raftos, 1979) . Estudios realizados mediante la técnica de patch-clamp del AçChR expresado en oocitos, muestran que tanto el receptor procedente de órgano eléctrico de Torpedo como de músculo en la etapa prenatal, dan lugar a un valor de conductancia de aproximadamente 40 pS (Sakmann y col., 1985; Mishina y col., 1986) ; como ya se ha mencionado la composición de subunidades del receptor de músculo fetal concuerda con la del Torpedo . Este valor de conductancia es coincidente con el que hemos descrito en esta memoria para el monómero, apoyando nuestros resultados, ya que tal y como se ha mencionado anteriormente el receptor de músculo está en forma monomérica. En 1981 Boheim y col . estudiaron el AcChR procedente del órgano eléctrico de Torpedo reconstituido en bicapas planas indicando que, tanto en membranas crudas o alcalinizadas, como en AcChR purificado y reconstituido, e independientemente de si se utilizan mezclas monómero/dímero o bien sólo monómeros, las características de canal único son similares presentando un valor de conductancia de 95 pS a una concentración 1 M de NaCI. De acuerdo a estos resultados, los autores concluyen que el monómero asociado al AcChR contiene la estructura de canal iónico, aunque no pueden asegurar que el dímero posea las misma propiedades que el monómero . Posteriormente Schindler y col . (1984) estudiaron las dos formas moleculares del AcChR reconstituido en bicapas planas, para lo cual, tal y como se ha comentado anteriormente, utilizaron el dímero nativo y obtuvieron

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el monómero mediante distintos procedimientos obteniendo idénticos resultados con todos ellos . El dímero nativo presenta un valor de conductancia (39 .5 pS en 0.5 M NaCI) doble que el monómero (20 pS en 0.5 M NaCI) . De acuerdo a estos resultados, los autores concluyen que la actividad de canal único encontrada en el dímero representa la apertura sincronizada de los dos monómeros que lo constituyen y afirman que la cooperatividad observada en el dímero nativo se extiende a más de dos canales, sugiriendo una cooperatividad oligomérica en asociaciones de monómeros y dímeros . Estos dos trabajos (Boheim y col ., 1981 ; Schindler y col ., 1984), que son los únicos que estudian el comportamiento de las formas monomérica y dimérica del AcChR a nivel de canal único se contradicen en sus resultados. Por un lado Boheim y col . (1981) describen las mismas características de canal único en ambas formas moleculares, mientras que Schindler y col. (1984) proponen que el dímero presenta un valor de conductancia doble que el monómero, y por otro, el valor de conductancia descrito . por el grupo de Boheim para el monómero (95 pS a 1 M NaCI), es el doble que el propuesto por Schindler y col (20 pS a 0 .5 M), si se extrapolan estos datos a una misma

concentración iónica. Tal y como se puede observar, al inicio de esta memoria no era posible clarificar el comportamiento funcional de las estructuras monomérica y dimérica del AeChR incorporadas en un sistema reconstituido . En este trabajo, hemos reconstituido ambos estados de agregación en liposomas gigantes, obteniendo unos resultados que concuerdan con los propuestos por Schindler y col . (1984), en el concepto de que ambas formas moleculares son distintas funcionalmente, y la conductancia del monómero es aproximadamente la mitad que la del dímero, aunque no concuerdan en los valores de conductancia descritos . Sin embargo, creemos que los resultados aquí mostrados son totalmente consecuentes a lo largo de todas las etapas de este trabajo y corresponden a los valores esperados para ambos estados de agregación del AcChR, tal y como se ha discutido anteriormente . En resumen, a lo largo de esta memoria se ha conseguido obtener la forma monomérica del AcChR procedente del órgano eléctrico de T marmorata a partir de la forma dimérica nativa, sin modificar de modo significativo el resto de la molécula. Únicamente se ha reducido el puente disulfuro responsable del dímero, con lo que no se modifica la estabilidad global de la proteína, tal y como muestran los estudios de desnaturalización térmica realizg4os mediante espectroscopia infrarrojo . Se ha comprobado que ambos estados de agregación conservan las propiedades funcionales, permitiendo las

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transiciones entre estados de alta y baja afinidad por agonistas, así como la traslocación de iones a través del canal iónico tanto a nivel de flujo total de iones como a nivel de canal único . Los efectos del estado de agregación en la función vienen dados por una variación en el proceso de desensibilización de la forma monomérica, que se acompaña de una menor afinidad por el agonista . La velocidad máxima de flujo del proceso permanece inalterable en ambas formas moleculares, indicando que el número de canales activos no varía. A nivel de canal único, el comportamiento del dímero nativo parece presentar un elevado sincronismo en cuanto a la apertura y cierre del canal asociado al monómero, que produce apariencia de canal único, y que podría representar un ejemplo importante de cooperatividad en un sistema biológico . Se podría especular que la relevancia fisiológica de este hecho pudiera traducirse en la intensa y rápida respuesta de la transmisión nerviosa en la sinapsis colinergica.

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Conclusiones

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VI CONCLUSIONES

1 . La formación de liposomas gigantes es un proceso mediado por un fenómeno de fusión de membranas, inducido por ¡ni ciclo de deshidratación parcial-rehidratación, que implica la redistribución de los componentes lipídicos y proteicos de partida en el seno del liposoma gigante . La reconstitución de proteínas de membrana, con actividad de canal iónico, en liposomas gigantes, permite una completa caracterización de éstas, al hacer posible la realización de estudios bioquímicos, morfológicos y electrof Biológicos en la rnisrna muestra. La reconstitución del AcChR en liposomas gigantes no implica variaciones de los parámetros funcionales conocidos "in vivo" .

2. El tratamiento del AcChR, en rnembranas alcalinas o bien purificado y reconstituido, con el agente reductor DTT ha permitido obtener de modo controlado los distintos estados de agregación covalentes del receptor (monomérico y dimérico) . Mediante técnicas de electroforesis se ha demostrado que el puente disulfuro responsable de la dimerización de la subunidad 8 del receptor se reduce con el tratamiento efectuado, permaneciendo el monómero resultante estable en el tiempo . La incubación del AcChR con el agente reductor DTT reduce tres puentes disulfuro en la

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molécula; tras la eliminación exhaustiva del mismo sólo permanece reducido el responsable del dímero, tal y como se ha determinado mediante análisis de aminoácidos. 3. La aplicación de técnicas de criofractura ha permitido observar partículas intramembrana en los fposomas gigantes formados, pudiéndose distinguir los distintos estados de agregación del receptor por poseer distinto tamaño. De este modo se ha establecido una correspondencia entre ambas formas moleculares (monomérica y dimérica) y las imágenes de criofractura a que dan lugar. 4. El tratamiento del AcCliR purificado y reconstituido con el agente reductor DTT produce cambios pequeños, aunque reproducibles, en el contorno de la banda amida 1 que sugieren que dicho tratamiento modifica su estrctura secundaria. La cuantificación de los componentes de estructura secundaria cuyas contribuciones dan lugar a la banda amida 1, indica que no se modifica apreciablemente el contenido en a-hélice, y que se produce un aumento del componente asignado a estructuras no ordenadas, a expensas de la disminución de estructura R . Asimismo, se ha observado que la reducción efectuada no modifica la temperatura de desnaturalización de la proteína, indicando que las formas morroméricas y diméricas presentan una estabilidad global semejante. 5. Mediante estudios de cinética de unión de a-Bgt al receptor se demuestra que el AeChR es capaz de llevar a cabo la conversión de un estado de baja afinidad por el agonista a uno de alta (estado desensibilizado), tras la presencia continuada del mismo, en ambos estados de agregación . Aunque ambas formas moleculares son capaces de llevar a cabo la transición de afinidad, la forma monomérica, obtenida tras el tratamiento con el agente reductor, presenta un menor incremento de afinidad tras la desensibilización inducida por agonista . 6. Se ha estudiado el transporte fónico de ambas formas moleculares a nivel de flujo total de iones, mediante experimentos de cinética rápida . Tanto en el dírnero como en el monómero del AcChR se ha obtenido un coeficiente de Hill de unión del agonista al receptor cercano a 2, indicando la existencia de cooperatividad en la apertura del canal fónico, que requiere en ambos casos la unión de dos moléculas de agonista por molécula de receptor . Se ha comprobado que el estado de agregación del AcChR no afecta al número de canales activos, ya que en lis dos fornas moleculares la velocidad máxima de flujo tónico (Kmax) es semejante. Por otra parte, se ha observado que la

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constante de disociación de agonista al AcChR es mayor en el estado monomérico que en el estado nativo, dimérico, indicando que el receptor presenta menor afinidad por el agonista en la forma monomérica. 7. Se ha obtenido información del comportamiento del AcChR a nivel de canal único en ambos estados de agregación, tanto dimérico como monomerico, mediante la técnica de patch-clamp en la configuración "inside-out" . Los resultados obtenidos indican de nuevo que ambas formas moleculares son funcionales pues presentan actividad de canal único . No obstante, se observa que el tratamiento con DTT provoca una disminución en la conductancia unitaria, tanto en las muestras de receptor purificado reducido previamente como en aquellas tratadas con el agente reductor durante el experimento. Esta disminución da lugar a una conductancia unitaria en el monomero, que resulta ser aproximadamente la mitad de la conductancia asociada al receptor nativo (dímero). Estos resultados sugieren la posibilidad de un fenómeno de sincronización en la apertura y cierre de los canales pertenecientes al dímero, que parece favorecido por el enlace covalente responsable de la estructura dimérica del receptor en estado nativo. Se han observado también valores de conductancia múltiplos de los predominantes que parecen representar transiciones sincronizadas de más de dos canales iónicos. Este hecho podría indicar que el receptor adopta diferentes estados de agregación, esto es oligómeros, en los que la aparente sincronización podría resultar también de asociaciones multiméricas no covalentes .

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