Estudios genéticos de  enfermedades renales hereditarias:  experiencia y proyecciones Dra. Paola Krall Unidad de Nefrología‐ Instituto de Medicina Facultad de Medicina‐ Universidad Austral de Chile Congreso SCHN, Octubre 2016

FONDECYT de Iniciación #11140242 “Estudios genéticos de enfermedades renales hereditarias: aplicaciones en  diagnóstico, consejo genético, tratamiento, prevención y trasplante renal” Ejecución: Noviembre 2014‐ Noviembre 2017

¿Por qué? Paciente

Obtener respuestas

Especialista

Orientar conductas terapéuticas

Investigador

Generar conocimiento sobre las bases moleculares

Febrero 2001: publicación de primer borrador del genoma humano

Farmacogenómica Medicina Forense Pruebas de paternidad

Antropología

Evolución

Diagnóstico de enfermedades

Enfermedades renales hereditarias (ERH) OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)  300 ERH  45 ERH progresan en 10 años a enfermedad renal terminal  Terapia de remplazo renal (Diálisis o Tx) Tx renal (DV> DC) aumenta expectativa de vida  DV puede ser descartado si hay antecedentes familiares (+) 

Enfermedades renales hereditarias (ERH)  Poliquistosis renal autosómica dominante (ADPKD)  Poliquistosis renal autosómica recesiva (ARPKD)  Síndrome de Alport (SA)  Síndrome nefrótico córtico‐resistente (SNCR)  Otras ERH

Enfermedades renales hereditarias (ERH)

Poliquistosis renal autosómica dominante (ADPKD)

Poliquistosis renal autosómica dominante (ADPKD)  Poliquistosis “de adulto”  ERH más frecuente (1/1000)   Herencia autosómica dominante (90% casos) 70a Tx 39a 65a HD

59a HD

7

42a Eco (‐)

54a

57a Tx

43a

?

42a Eco (‐)

20a ??

?

33a

20a 3

? >18a

1 quiste simple 1 quiste simple >6a 2

5a

20a

22a Eco (‐)

1.5a ?

??

18a

?

Poliquistosis renal autosómica dominante (ADPKD) 85% casos = mutaciones en PKD1; 15% casos = mutaciones en PKD2 

METODOLOGÍA  Identificación paciente/familia ADPKD  Contacto e invitación a participar del estudio (firma CI)  Extracción de 20 ml de sangre venosa  Purificación DNA  Amplificación de 46 exones de PKD1 por PCR  Secuenciación directa ABI 310

$700‐$1400 por paciente

PKD1 Exon 37 c.10907_10908del TG p.Ala3635fsX84

PKD1 Exón 24 c.8887insA p. Arg2962fsX9

Poliquistosis renal autosómica dominante  RECLUTADOS: 34 casos familiares; 12 casos aislados  ANALIZADOS O EN ANÁLISIS: 20 casos familiares; 2 casos aislados  13 casos familiares con mutación PKD1 identificada, que segrega con la presentación clínica  11 mutaciones son tipo truncantes; 2 mutaciones son tipo missense  Objetivos logrados: confirmación diagnóstico, diagnóstico temprano, identificación donante seguro para tx renal

Exones 1‐25

Exones 26‐46

Relación truncamiento y ERT 65 60 55 50 45 40 35 ≤ Exon 25  > Exon 25 38.9±5.6 años              50.6±4.1 años p=0.0000503

30 25 20 1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

ADPKD en pediatría  Mayo 2016: caso familiar con ADPKD •

1 lactante con quistes renales y falla función renal

Agosto 2016: caso familiar con ADPKD •

1 lactante con ecografía (+) quistes y sospecha de esclerosis tuberosa

Septiembre 2016: caso familiar con ADPKD •

2 niños menores a 6 años con ecografía (+) quistes

Enfermedades renales hereditarias (ERH)

Síndrome nefrótico cortico‐resistente (SNCR)

Síndrome nefrótico cortico‐resistente ‐ Enfermedad renal hereditaria MUY RARA (1‐2 casos de cada 100.000 niños) ‐ Presentación clínica: edema, proteinuria, dislipidemia, hipoalbuminemia ‐ 10% no responden o responden parcialmente a corticoides ‐ Base genética heterogénea: NPHS1, NPHS2, WT‐1, ACTN4, CD2AP, PLCE1,  TRPC6, MYH9, INF2, entre otros…(!!!) ‐ Algoritmo genético según tipo de herencia y edad de inicio de síntomas

ALGORITMO DE ANÁLISIS MUTACIONAL

Síndrome nefrótico (cortico‐resistente) ‐ RECLUTADOS: 23 casos ; 17 casos pediátricos y 6 casos adultos ‐ ANALIZADOS O EN ANÁLISIS: 23 casos ‐ 4 casos con mutaciones NPHS2/NPHS1 identificadas 2 casos con mutaciones “comunes” de la población chilena (Azocar et al. 2016)  NPHS2 (Exon 5) R229Q; NPHS2 (Exon 7) A284V  

Caso SN congénito ‐ Enero 2016: recién nacida al 7° día con edema, 20° día hipoalbuminemia,  proteinuria masiva ‐ Estudio genético NPHS1 negativo; estudio NPHS2 negativo  ‐ Paciente fallece a la 4° semana de vida, padres solicitan consejo genético ‐ No se hizo biopsia, no había compromiso neurológico, no tenia malformaciones

• WT‐1 c.755A>G, p.D396G [Het] • Mutacion di novo o en células germinales de uno de sus progenitores • Diagnóstico prenatal no invasivo?

Köhler et al. (2004), European Journal of Endocrinology

• 12 casos de SN sin causa genética identificada

Estudio mutacional WT1 exones 7‐10 en casos SN • WT‐1 p.D396G [Het]; RN sexo F, SN congénito  • WT‐1 p.R434H [Het]; Lactante sexo F, SHU y SN congénito • WT‐1 p.R430* [Het]; RN sexo M criptorquidia, 8m. masas renales bilaterales • WT‐1 p.G447R [Het]; RN sexo F, SN congénito, falla renal aguda

Enfermedades renales hereditarias (ERH)

Síndrome de Alport (SA)

Síndrome de Alport ‐ Enfermedad renal hereditaria rara (1/50.000) ‐ Glomerulonefritis que progresa a ERT a los 16‐35 años, hipoacusia, etc. ‐ Tres genes candidatos: COL4A3, COL4A4, COL4A5 ‐ 2015 recepción de muestras de 7 varones chilenos con diagnóstico SA ‐ Secuenciación directa no resulta costo‐efectiva ($3.000.000 por paciente)

GENES RESPONSABLE DE AS • COL4A3 (Cromosoma 2)

10%

• COL4A4 (Cromosoma 2)

10%

• COL4A5 (Cromosoma X) 

80%

Febrero 2016 ensayo secuenciación masiva

Síndrome de Alport ‐ Secuenciación masiva detectó 7 mutaciones (COL4A3 y COL4A5) ‐ Confirma diagnóstico en 6 pacientes ‐ Estudio genético se extendió a familiares con aplicaciones importantes en  diagnóstico y trasplante renal

Enfermedades renales hereditarias (ERH)

Cistinosis nefropática

Cistinosis nefropática ‐ Abril 2016 solicitan apoyo para estudio genético gen CTNS en paciente de 11  meses de vida ‐ El diagnóstico temprano es de vital importancia para facilitar un tratamiento  oportuno con cisteamina, que asegura un mejor crecimiento y retarda el inicio  de la ERT como las complicaciones extra‐renales 

?

?

Estándar

Hija

Padre

La paciente posee la deleción en homocigosis de ~57 kb que abarca el gen CTNS. 

Madre

Enfermedades renales hereditarias (ERH)

Nefronoptisis

Nefronoptisis  ‐ Nefropatía túbulo‐intersticial crónica que progresa a ERT ‐ Afecta a 1/100.000 ‐ Caso familiar con grado de consanguineidad ‐ 2 de 4 hijas de debut adolescente, progresaron a ERT ‐ 1 de ellas sometida a Tx renal hace 10 meses

7

?

?

?

?

Chilegenomico.cl  ‐ Iniciativa de ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile ‐ Concurso 2016 para Secuenciación gratuita de Exomas Humanos ‐ Agosto 2016 comunica evaluación positiva de la propuesta

Otras enfermedades renales hereditarias no filiadas

WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS)

Genoma

3.000.000.000 pb

$1000 GENOME $ 1000 GENOME

WHOLE EXOME SEQUENCING (WES) Genoma

3.000.000.000 pb

Exoma 30.000.000 pb ($1300)

85% mutaciones se encuentran en exones

CASO FAMILIAR NEFROPATÍA LÚPICA ?

?

• Paciente sexo femenino  • 35 años glomerulonefritis crónica e hipertensión 43a

• Niveles séricos C3 bajo (¿LUPUS?) • HD 35‐43 años • Tx renal 43 años • Fallece 3 meses post‐trasplante sepsis por cándida

27a

Debut 19 años Bp GN Lúpica

24a

Debut 16 años Bp GN Lúpica

19a

Debut 10 años Proteinuria Bp GN proliferativa

WHOLE EXOME SEQUENCING Dra. Katherina Walz U. Miami

RESULTADO SECUENCIACIÓN EXOMA • Por cada DNA se identificaron ~100.000 variantes genéticas • En 2 DNA´s se reducen las variantes candidatas (restricciones de herencia) • 3 DNA´s se redujeron a 10.500 variantes • 16 genes candidatos conteniendo una única variante compartida por las 3  hermanas en estado heterocigoto • TLR5, PARP1, RTL1, ITGB2, MBD5, MYBPC3, EIF4G1, KDM3A, HOXC4, WHAMM, HMHA1, XDH, MCCC1, PPP1R17, TRPA1, FLRT3

CONCLUSIONES GENERALES • Estudios genéticos tienen un alto valor clínico en pacientes/familias chilenas con enfermedades renales hereditarias • Secuenciación directa: resultados de alta calidad y cumple con los objetivos • Secuenciación masiva: herramienta costosa, aunque recomendable en casos aislados, clínicas no concluyentes o en enfermedades de origen genético heterogéneo

Unidad de Nefrología‐UACh: Mag. Daniela Nualart Dr. Sergio Mezzano Dr. Claudio Flores Dra. Celeste Fulgeri Dra. Daniela Ubilla Dr. Leopoldo Ardiles TM Paula Alruiz TM Alejandra Moscoso TENS Carolina Trujillo TM Graciela Valderrama Dra. Alejandra Droguett TM Maria Eugenia Burgos PACIENTES/FAMILIAS

Centro Transplante Valdivia: Enf. Verónica Gallardo Enf. Alejandra Flores Enf. Ruben Torres Fundació Puigvert Dra. Elisabet Ars Dra. Roser Torra University of Miami Dra. Katherina Walz Mayo Clinic Faculty Dr. Peter Harris

Agradecimientos por colaboraciones Patricio Downey Pilar Hevia Juan Carlos Flores Carolina Ramirez Felipe Verscheure Andrea Lazcano Boris Garcia Lizzy Orellana Rocio Saenz Maria Pía Rosati Jean Grandy Angélica Rojo Daniela Arriagada Daniela Carrillo

Camilo Ulloa Emilia Gonzalez Julio Zamorano Vilma Nazal Felipe Cavagnaro Ignacio Salgado Andrea Lazcano  Angela Delucchi Ximena Ibarra Viola Pinto  Natalia Gutierrez Sonia Marquez

Confirmación diagnóstico en familiares pre‐sintomáticos

65a HD

59a HD

54a

57a Tx

?

42a Eco (‐)

20a ?? 1 quiste simple

?

33a

20a 3

? >18a

1 quiste simple >6a 2

• Diagnóstico temprano en familiares “asintomáticos” • Identificación donante seguro para tx renal 70a Tx 39a 7

42a Eco (‐)

5a

43a

20a

22a Eco (‐)

1.5a

?

?

18a

?

SNCR DE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA ‐ Genes candidatos: NPHS1 (nefrina) y NPHS2 (podocina)

18a Tx

11a SN ?

19a SNCR

?

??

‐ NPHS2 R229Q;A284V

‐ NPHS2 R229Q;A284V