Los hongos poseen un genoma complejo consistente en:
ADN nuclear (n ADN) ADN mitocondrial (mt ADN) en algunos casos ADN plasmídico
EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS
Extracción de ADN mitocondrial Pasos más importantes: No necesita tratamiento con fenol, ni la utilización de bis-bencimida. 1.- Lisis de la pared: Zymoliasa, 37ºC. 2.- Rotura de la membrana celular: Buffer de lisis, 4ºC. Centrifugar a 15.000g. 3.- Purificación de mitocondrias: Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Extracción de las mitocondrias. Centrifugar 40.000 g. 4.- Rotura de la membrana mitocondrial: SDS, Proteinasa K, 37ºC, 3horas. Centrifugar a 17.000 g, 4ºC. 5.- Extracción y precipitación del ADN mitocondrial. Isopropanol, etanol.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS Etapa microbiológica 1. - Se inocula 100 ml de Medio de cultivo líquido con conidios y se incuba en agitación orbital (150 rpm) a 28ºC durante el tiempo necesario.
2. - El micelio se recoge sobre un filtro de nylon (200 mm de diámetro de poro) y se seca con la ayuda de papel absorbente hasta eliminar la humedad. Una vez seco, se aplana formando una capa lo más fina posible y se liofiliza para desecarlo completamente.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS Etapa biología molecular Lisis de la pared celular y la membrana plasmática
3. - Se pesan 0,06 g del micelio liofilizado dentro de un tubo eppendorf y se tritura con la ayuda de un clip de metal. Es muy importante que se consiga una trituración adecuada, pues el rendimiento de la extracción depende del grado de fragmentación del micelio.
4. - Se añaden 600 µl de Solución de Lisis y se incuba en un baño a 65ºC durante una hora.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS Digestión y/o precipitación de proteínas (purificación) 5. - Se añade igual volumen de fenol/cloroformo/isoamílico (500 µl ) y se agita hasta que se mezclan todas las fases. Una vez mezcladas las fases, se centrifuga durante 15 min. a 12000 rpm. 6. - Se recoge la fase acuosa (arriba) en un eppendorf limpio, y se le añade Acetato potásico 5M y ClNa 4M hasta conseguir una concentración final de 1.8 M y 1 M respectivamente. Luego se deja en hielo durante 30 min. 7. - Se centrifuga 10 min. a 12000 rpm para precipitar restos de proteínas. Y se recoge el sobrenadante en un tubo eppendorf limpio.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS Extracción y Precipitación del ADN con solventes orgánicos (concentración) 8. - El DNA se precipita con 0.54 volúmenes de isopropanol. Si el rendimiento en ADN es alto, éste precipita en forma de ovillo y se puede extraer con una punta estéril. 9. - El DNA recogido se pasa a un nuevo tubo eppendorf al que se añade 500 µl de etanol al 70%. 10. - Centrifugar 5 min. a 12000 rpm. Descartar el sobrenadante. 11. - Secar al vacío. 12. - Resuspender el pellet en 200 µl de Solución TE. Guardar en la heladera al menos 2 horas para que se resuspenda el DNA. Luego conservarlo a –20°C.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS
El mayor problema que presenta la obtención de ADN total de especies fúngicas es la rotura y, sobre todo, la eliminación de las estructuras que forman parte de la pared celular de los hongos. Es importante disponer de un micelio joven donde estas estructuras están en menor proporción. Además una vez obtenido el DNA es importante eliminar el RNA si lo que queremos es hacer RFLPs de mtDNA.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS 9’.- Se preparan tubos eppendorf nuevos con 400 µl de agua
estéril. Se recoge el ovillo y se resuspende en el agua. 10’.- Se añaden 3 µl de RNAsa (500 mg/ml) y se ponen en un baño de agua a 37ºC durante 30 min. para eliminar el RNA de la extracción. 11’.- Se añaden 2 volúmenes de etanol absoluto (100%) y se centrifuga 10 min. a 12000 rpm. 12’. - Secar al vacío. 13’. - Resuspender el pellet en 200 µl de Solución TE. Guardar en la heladera al menos 2 horas para que se resuspenda el DNA. Luego conservarlo a –20°C.
Minipreparación rápida de ADN para PCR. (Técnica de Liu y col. 2000)
Cultivar los hongos en medio de cultivo por 7 días a 28oC. Una pequeña porción del micelio se raspó del cultivo, se colocó en un tubo eppendorf de 1,5 ml conteniendo 500 µl de solución amortiguadora de extracción, tratando de disgregar el micelio con la punta de un clip flameado. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agregar 150 µl de KAc 3 M (pH= 4,8). Centrifugar por 2 minutos a 10000 rpm. Agregar al sobrenadante un volumen igual de isopropanol. Centrifugar 2 minutos a 10000 rpm. Lavar el precipitado con etanol al 70%. Centrifugar 1 minuto a 10000 rpm. Eliminar el sobrenadante, secar el pellet por 10 minutos a 37oC. Resuspender el ADN en 50 µl de agua desionizada ultrapura estéril. Guardar a –20oC.