FACTOR MASCULINO Y STRESS OXIDATIVO  Á GUEDA

ORTIZ

  La fertilidad masculina en la especie humana es relativamente baja en relación  con la de otras especies. El tamaño relativo del testículo de los seres humanos es no‐ tablemente menor que el de otros mamíferos y tiene una de las  tasas más bajas en  cuanto  a  producción  diaria  de  espermatozoides  por  gramo  de  testículo,  así  como  proporciones bajas de espermatozoides progresivamente móviles y morfológicamen‐ te normales.1 Esto hace que el varón pueda estar en mayor riesgo frente a las sustan‐ cias tóxicas que afectan la reproducción.  El  factor  masculino  está  presente  en  aproximadamente  la  mitad de  los  casos  de esterilidad y no se puede hallar ninguna causa identificable en más del 25% de los  varones estériles.2 En 1979 se publicó un trabajo que relacionaba el estrés oxidativo  con  alteraciones  en  la  función  espermática3.  Desde  entonces,  numerosos  estudios  han  demostrado  su importancia  clínica  en la  etiología  de  la  esterilidad  masculina.4,5  Hoy en día se le atribuye un papel principal en la esterilidad con origen en el varón ya  que no sólo disminuye la capacidad fecundante del espermatozoide, sino también su  habilidad para dar lugar a embriones sanos. 

ESTRÉS OXIDATIVO Y FUNCIÓN ESPERMÁTICA  El  estrés  oxidativo es la  situación  en  la  que  se  encuentra  una  célula  que pre‐ senta  un  desequilibrio  entre  sustancias  oxidantes  y  antioxidantes;  bien  sea  por  un  exceso  en  la  producción  de  especies  reactivas  de  oxígeno  (ROS),  bien  por  una  defi‐ ciencia en los sistemas de detoxificación de éstas.  El gameto masculino fue el primer tipo celular donde se constató la capacidad  para generar ROS.6  La habilidad para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) es  un aspecto fundamental de la fisiología del espermatozoide.7 Los metabolitos del oxí‐ geno están implicados en procesos tan importantes como la capacitación espermáti‐ ca,  la  hiperactivación,  la  reacción  acrosómica  y  la  fusión  de  membranas  para  la  fe‐ [1]     

  Actualización Obstetricia y Ginecología 2011     cundación.8,9 La capacitación espermática, por ejemplo, implica un gran aumento en  el  nivel  de  tirosina  fosforilada  en  la  cola  y  sobre  todo  en  la  pieza  intermedia.10  Las  señales implicadas para que tenga lugar la fosforilación son el AMPc y el estado redox  de la célula.11 El anión superóxido y el peróxido de hidrógeno son dos factores impor‐ tantes en este proceso.12 Dependiendo de la naturaleza de las ROS y su concentración, así como el mo‐ mento y el lugar de la exposición, las especies reactivas tienen efectos favorables o  perjudiciales sobre las funciones de los espermatozoides. 

ESTRÉS OXIDATIVO Y VULNERABILIDAD ESPERMÁTICA  Un conjunto de enzimas antioxidantes citoplasmáticas, tales como la superóxi‐ do dismutasa (SOD), la catalasa y la glutatión peroxidasa (GPX), mantiene la concen‐ tración  de  ROS  y  protege  a  las  células  de  su  exceso.  Pero  los  espermatozoides  son  más  susceptibles  ya  que  su  reducido  citoplasma  hace  que  carezcan  de  estos  meca‐ nismos endógenos para reparar los daños asociados al estrés oxidativo.13   La generación excesiva de ROS en el semen, principalmente por los neutrófilos,  pero también por espermatozoides anormales, podría ser una causa de esterilidad14.  El peróxido de hidrógeno es la principal ROS tóxica para los espermatozoides huma‐ nos. Las concentraciones moderadamente altas no afectan la viabilidad de los esper‐ matozoides, pero los inmovilizan, generalmente por agotamiento del ATP intracelular  y disminución ulterior en la fosforilación de las proteínas del axonema.   El plasma seminal no sólo presenta especies reactivas, también posee los me‐ canismos  para  mantener  un  estado  de  oxidación  adecuado.  Contiene  enzimas  anti‐ oxidantes y diversas moléculas antioxidantes no enzimáticas como la melatonina, la  vitamina C, la vitamina E, el piruvato, el glutatión y la carnitina.15,16 Varios investiga‐ dores han encontrado concentraciones significativamente menores de antioxidantes  en el semen de hombres estériles en relación con los controles. No obstante, las con‐ centraciones patológicas de ROS detectadas en el semen de hombres estériles se de‐ ben más probablemente al aumento de la producción de ROS que a la disminución de  la capacidad antioxidante del líquido seminal.   El  alto  contenido  de  los  espermatozoides  en  ácidos  grasos  poliinsaturados  también hace que estas células sean más sensibles al estrés oxidativo.17 La peroxida‐ ción lipídica afecta sobre todo a las membranas y se asocia a una disminución de la  movilidad espermática. La pérdida de fluidez en la membrana, origina un fallo en la  [2]     

Reproducción      actividad  Ca2+/Mg2+ ATPasa,  que  provoca  un  aumento  del  calcio  intracelular  y  como  consecuencia la pérdida de la movilidad espermática. En este sentido, Gomez y cola‐ boradores señalaron  que  los  niveles  de  producción  de  ERO  por  las  poblaciones  es‐ permáticas puras se correlacionaron negativamente con la calidad del semen.18 Fun‐ ciones dependientes de la fluidez de la membrana como son la fusión al ovocito y la  reacción acrosómica también se ven alteradas.  Otra  diana  espermática  para  sufrir  daño  oxidativo  es  el  material  genético,  siendo  el  agente  inductor  principal  el  peróxido  de  hidrógeno.  El  ADN  nuclear  está  bien protegido por las protaminas, unas proteínas que sustituyen a las histonas nu‐ cleares presentes en otros tipos celulares y que ofrecen mayor estabilidad a la cade‐ na  de  ADN.19  El  genoma  del  núcleo  es  particularmente  resistente  al  exceso  de  ROS  pero no acurre lo mismo con el material genético de las mitocondrias.20 De hecho, la  integridad del ADN mitocondrial es un excelente marcador de estrés oxidativo. 

FUENTES DE ROS  Las especies reactivas se generan de forma controlada en el metabolismo del  espermatozoide pero varios factores pueden estimular su producción. Por ejemplo, la  presencia de leucocitos activados como consecuencia de una infección del tracto re‐ productor masculino;21 las radiaciones electromagnéticas;22 las radiaciones de teléfo‐ nos móviles23 o agentes xenobióticos como las quinonas24 favorecen la producción de  ROS llegando a niveles perjudiciales.  Otros  factores  hacen  a  los  espermatozoides  más  susceptibles  de  sufrir  daños  por  las  especies  reactivas  porque  impiden  el  correcto  empaquetado  del  ADN  como  ocurre con algunos pesticidas organofosforados25 y tóxicos ambientales.   Algunas patologías asociadas a una espermatogénesis incompleta o a una dis‐ minución  del  sistema de  antioxidantes también  incrementan los  efectos  producidos  por el exceso de ROS. Es lo que ocurre en casos de criptorquidia,26 torsión testicular,27  varicocele,28 hipertiroidismo29 o diabetes.30   El  manejo  de  las  muestras  seminales  en  el  laboratorio  es  otra  posible  fuente  de ROS. La centrifugación a la que se someten las muestras durante la realización de  Swim‐up o gradientes de densidad aumenta el contenido en ROS. Los choques térmi‐ cos y la exposición al oxígeno atmosférico durante los procesos de criopreservación  [3]     

  Actualización Obstetricia y Ginecología 2011     seminal  afectan a  la  integridad de  la  membrana  y  se asocian  al aumento  en  la  pro‐ ducción de ROS y a la disminución de antioxidantes.31  

CONSECUENCIAS DE LA GENERACIÓN EXCESIVA DE ROS  Durante  procesos  dependientes  del  estado  redox  como  la  capacitación  es‐ permática  se  han  observado  transformaciones  morfológicas  en  las  mitocondrias.32  Recientemente se ha demostrado que estos orgánulos, tan abundantes en la cola y la  pieza intermedia, son los principales generadores de ROS en los espermatozoides33 y  que cualquier factor capaz de interferir en la cadena transportadora de electrones es  un potencial inductor de ROS. LA enzima mitocondrial implicada es la oxidorreducta‐ sa (diforasa) dependiente de NADPH.34  La otra vía de formación de ROS en los espermatozoides es el sistema fosfato  nicotinamida adenina dinucleótido (NADPH) oxidasa a nivel de la membrana plasmá‐ tica.  Prácticamente  el  semen  de  cada  eyaculación  está  contaminado  con  posibles  fuentes  de  ROS.  Se  deduce  que  en  cada  eyaculación  algunos  espermatozoides  su‐ frirán daño oxidativo y pérdida ulterior de la función. De esta manera, el impacto de  las ROS sobre la fertilidad masculina es un problema de grado más que de presencia o  ausencia de la patología.  En  las  mitocondrias  disfuncionales  la  producción  de  ROS  aumenta  significati‐ vamente y estas moléculas a su vez afectan la función mitocondrial de los espermato‐ zoides. Esta relación se puede deber a dos fenómenos interconectados mutuamente:  las  ROS  que  lesionan la  membrana  mitocondrial,  y la membrana  mitocondrial  lesio‐ nada que aumenta la producción de ROS.  Por otro lado, las mitocondrias tienen una función clave en el mecanismo de la  apoptosis. Su integridad está determinada por la presencia de citocromo c en el es‐ pacio de la membrana interna. Los niveles altos de ROS desorganizan las membranas  interna y externa de las mitocondrias. Esto produce la liberación de la proteína cito‐ cromo c de la mitocondria, que activa las caspasas e induce apoptosis. Se ha demos‐ trado en varios tipos celulares que el estrés oxidativo puede ser inductor de la apop‐ tosis.35  

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Reproducción     

ESTRATEGIAS PARA REDUCIR EL ESTRÉS OXIDATIVO  Como  ya  hemos  mencionado,  los  leucocitos  y  espermatozoides  inmaduros  o  anormales presentes en el eyaculado son fuentes generadoras de un exceso de ROS.  Con las técnicas de selección espermática, separamos la fracción de espermatozoides  móviles y “sanos” que generan cantidades fisiológicas de ROS. Es mejor, por tanto, no  quedar el eyaculado en el laboratorio y demorarse mucho en seleccionar los mejores  espermatozoides,  libres  de  plasma  seminal  y  otras  células,  lo  que  comúnmente  lla‐ mamos “técnicas de capacitación”.  Además, en el desarrollo de estas técnicas se utilizan medios de cultivo suple‐ mentados con gran cantidad de antioxidantes que contribuyen al balance redox. Re‐ cientemente, se ha comprobado en las técnicas de  criopreservación seminal, que la  suplementación de los medios empleados con antioxidantes tiene un efecto criopro‐ tector sobre las células;36 tras la descongelación los espermatozoides muestran mejor  movilidad y mayor integridad en la membrana que utilizando medios carentes de an‐ tioxidantes.  El tiempo y velocidad de centrifugación también afectan a los niveles de ROS.  Especies  negativas  para  ROS  se  vuelven  positivas  tras  la  centrifugación  a  200g  ó  500g.37  El  tiempo  de  centrifugación  es  más  importante  que  la  velocidad,  por  tanto,  disminuyendo  este  intervalo  y  bajando  la  velocidad,  obtendremos  muestras  menos  oxidadas.  Otra acción beneficiosa sería realizar el “swim‐up” previo a la centrifugación.  Tanto  la  retirada  de  plasma  seminal  como  la  centrifugación  contribuyen  a  generar  ROS,  así  que,  los  espermatozoides  deberían  ser  separados  de  los  leucocitos  cuando  todavía son protegidos por los antioxidantes del plasma seminal. Las mejores técnicas  de capacitación son aquellas en las que los espermatozoides móviles son separados  previo a la centrifugación. 

MEDIDA DE LAS ROS  A  pesar  de  los  numerosos  estudios  sobre  el  papel  de  las  ROS  durante  tantos  años y de conocer su importancia sobre la esterilidad masculina, no existen métodos  fiables y reproducibles de uso clínico rutinario para calcular los niveles de ROS y com‐ plementar el estudio del varón.   [5]     

  Actualización Obstetricia y Ginecología 2011     Existen métodos para medir ROS en el interior de la célula, como por ejemplo  medir  superóxido  implicado  en  la  reducción  de  ferricitocromo  C.  Son  métodos  muy  sensibles pero necesitan que la concentración de espermatozoides no sea demasiado  baja.38 No sirven en caso de oligozoospermia.  Otros  métodos,  miden  ROS  intra  y  extracelular  por  quimioluminiscencia.  Son  muy utilizados para medir peróxido de hidrógeno39 pero tienen el inconveniente de  no ser tan sensibles. Dado que la capacidad de generar ROS de los espermatozoides  es muy baja comparada con los leucocitos, necesitamos de métodos más sensibles.  Por otro lado, tenemos el inconveniente de que aún no se ha definido el nivel  normal de ROS en hombres fértiles. 

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