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Agrobiotecnología Curso 2011
Fitorremediación Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires
Sumario Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados Fitorremediación - Ventajas - Limitaciones - Tipos de plantas más utilizadas
Tipos de fitorremediación - Fitoextracción - Rizofiltración - Fitotransformación - Fitodegradación de compuestos orgánicos - Fitoestimulación Agrobiotecnología Fitorremediación
- Fitoestabilización
Plantas transgénicas para detectar compuestos inorgánicos tóxicos en el medio ambiente Referencias
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados
Agrobiotecnología Fitorremediación
Rangos de concentración comúnmente hallados y límites permitidos para los contaminantes metálicos y los radionucleótidos más importantes
Agrobiotecnología Fitorremediación
a
Elemento
Rango de concentración
Límite regulatorio
Metales
(µ µg/Kg)a
(mg/Kg) b
Plomo
1.000-6.900.000
600
Cadmio
100-345.000
100
Arsénico
100-102.000
20
Cromo
5,1-3.950.000
100
Mercurio
0,1-1.800.000
270
Cobre
30-550.000
600
Zinc
150-5.000.000
1.500
Radionucleótidos
Unidades
pCi . g-1
Uranio
0,2-16.000 c 0,06-18.700 d
------250 f
Estronio
0,03-540.000 e
-------
Cesio
0,02-46.900 e
-------
Plutonio
0,00011-3.500.000 e
-------
Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1998.
Riley et al. b Clean up Standards for contaminated sites. New Jersey, Department of Environmental Protection (1996) c Microgramos por gramo d Picocuries por gramo e Picocuries por kilogramo f Stern et al.
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados
•
- Rellenado de terrenos - Fijación química e impermeabilización superficial - Lixiviación y reposición del suelo
•
Agrobiotecnología Fitorremediación
Suelos
Aguas - Precipitación o floculación - Intercambio iónico - Osmosis inversa - Microfiltración
Mercado potencial para la descontaminación ambiental en Estados Unidos mediante las tecnologías actuales
• En los últimos 10 años se ha desarrollado un mercado . importante para la biorremediación, principalmente en . Estados Unidos. Productos tóxicos: Metales pesados: Metales pesados y tóxicos:
~ U$S 400.000 M ~ U$S 7.100 M ~ U$S 35.400 M
• El costo estimado para remediar los sitios utilizados . por el Departamento de Energía Atómica por métodos . convencionales se calculó en U$S 142.000 M • En 2005, el mercado norteamericano de remediación . ambiental era de U$S 6.000 a 8.000 M por año. • El mercado norteamericano de fitorremediación era de . U$S 100-150 M anuales (0.5% del total de remediación).
Agrobiotecnología Fitorremediación
• El mercado comercial de fitorremediación comprende . 80% de contaminantes orgánicos y 20% de inorgánicos. • El mercado de fitorremediación creció de 3 y 5 veces . entre 1999 y 2005.
La fitorremediación es económicamente competitiva respecto de otras alternativas de remediación
Adaptado de Chappell, US Environmental Protection Agency,1998.
Fitorremediación
Agrobiotecnología Fitorremediación
Fitorremediación “Conjunto de métodos para degradar, asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados y compuestos orgánicos por medio de la utilización de plantas.” “Es el empleo de vegetación para el tratamiento in situ de suelos, sedimentos y aguas contaminadas.”
Agrobiotecnología Fitorremediación
Se basa en los procesos que ocurren naturalmente por los cuales las plantas y los microorganismos rizosféricos degradan y secuestran contaminantes orgánicos e inorgánicos
La fitorremediación permite detoxificar distintos sustratos • Sustratos sólidos (suelos y sedimentos): - sitios militares (TNT, metales, orgánicos) - campos agrícolas (herbicidas, pesticidas, metales, selenio) - sitios industriales (orgánicos, metales, arsénico) - minas (metales) - sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos aromáticos policíclicos; PAHs)
• Sustratos líquidos - aguas residuales (nutrientes, metales) - drenajes de agricultura (nutrientes, fertilizantes, metales, arsénico, selenio, boro, pesticidas orgánicos y herbicidas) - efluentes industriales (metales, selenio) - efluentes de minería (metales) - plumas subterráneas (metales, compuestos orgánicos)
• Sustratos gaseosos - aire libre e interior (óxidos de nitrógeno, SO2, ozono, CO2, gases neurotóxicos, partículas de hollín, e hidrocarburos halogenados volátiles)
Contaminantes orgánicos • Son consecuencia de las actividades humanas: - industria petroquímica (derrames de combustibles y solventes) - actividades militares (explosivos y armas químicas) - agricultura (pesticidas, herbicidas) - industria química (efluentes) - industria forestal y maderera (efluentes)
• Dependiendo de sus propiedades, pueden ser: - degradados en la zona radicular - incorporados a la planta
degradación secuestro volatilización
• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación: Solventes orgánicos, herbicidas, explosivos, hidrocarburos derivados del petróleo, bifenilos policlorinados (PCBs), tricloroetileno (TCE), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs).
Contaminantes inorgánicos
• Pueden ser consecuencia de elementos naturales presentes en la corteza . terrestre y/o en la atmósfera, o resultado de actividades humanas: - minería - industria - transporte - agricultura - actividades militares
• No pueden ser degradados, pero pueden fitorremediarse mediante . estabilización o secuestro en la parte cosechable de la planta. • Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación: Macronutrientes vegetales (nitrato y fosfato), elementos traza (Cr, Cu, Fe, . Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, V y W), e . isótopos radioactivos (238U, 137Cs y 90Sr), entre otros.
Fitorremediación
Ventajas • Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas (costo 7-10 veces menor respecto de los . métodos tradicionales). - Las plantas emplean energía solar. - El tratamiento es in situ. • Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos. • Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos largos.
Agrobiotecnología
• Es una metodología con buena aceptación pública. Fitorremediación
• Se generan menos residuos secundarios.
Fitorremediación
Limitaciones • El proceso se limita a la profundidad de penetración de las raíces o a aguas poco profundas. • La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente contaminadas. • Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados. • La biodisponibilidad de los compuestos o metales es un factor limitante de la captación. • Deben considerarse contaminaciones potenciales de la cadena alimentaria y napas de agua.
Agrobiotecnología
• Se requiere comprender mejor la naturaleza de los productos de degradación (fitodegradación).
Fitorremediación
• Falta elaborar el marco regulatorio detallado.
Biología de la acumulación de metales en plantas
• Captación por las raíces: - Movilización de los metales • Quelación mediante fitosideróforos • Unión a proteínas quelantes (fitoquelatinas) • Acidificación por exudado de H+ - Captación por la raíz • Via apoplástica • Vía simplástica
• Transporte: - Almacenamiento en raíz o exportación al tallo por xilema - Transporte por xilema o redistribución por floema - Almacenamiento en vacuolas
• Mecanismos de evasión o tolerancia:
Agrobiotecnología Fitorremediación
- Captación celular limitada (evasión) - Metabolismo tolerante a metales pesados - Detoxificación por quelación, compartimentalización o precipitación
• Mecanismos más probables: - Compartimentalización en vacuolas y quelación con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ ) - Precipitación como fitatos (Zn2+)
Mecanismos involucrados en la quelación y compartimentalización
pared celular citoplasma Contaminante inorgánico secuestro conjugación
adsorción
vacuola degradación enzimática
Contaminante orgánico modificación enzimática
Agrobiotecnología Fitorremediación
secuestro Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Biollogy, 2005.
Mecanismos de tolerancia para contaminantes orgánicos e inorgánicos en plantas. La detoxificación generalmente involucra la conjugación seguida del secuestro activo en la vacuola y el apoplasto, donde el contaminante hace el menor daño. Los quelantes son: glutatión (GSH), glucosa (Glu), metalotioneínas (MT), nicotinamina (NA), ácidos orgánicos (OA, fitoquelatinas (PC). Los transportadores se representan por cajas con flechas.
Estrategias de fitorremediación utilizadas para remediar agua, suelo o aire contaminados.
hidroponia (rizofiltración)
humedal artificial Plantas usadas como filtros
Plantas usadas como barrera hidráulica para prevenir la contaminación de napas y la dispersión horizontal de plumas. Agrobiotecnología Fitorremediación
barrera hidráulica
fitoextracción y fitoestabilizacion
filtración de aire
Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Biology, 2005.
Diseño de sistemas de fitorremediación
• Selección de la especie vegetal
• Datos de toxicidad y de degradación de contaminantes
• Tasa de captación del contaminante y tiempo de limpieza requerido
• Esquema y densidad de las plantaciones
• Costos de Irrigación, insumos agronómicos, . mantenimiento y gastos de cosecha. Agrobiotecnología
• Zona de captura de agua y tasa de transpiración
Fitorremediación
• Análisis de riesgos contingentes (plagas, sequías, etc.)
Tipos de plantas más utilizadas
• Freatófitas - Plantas de raíces profundas (álamo, sauce, algodonero). • Pasturas - Por su tipo de raíz retienen el suelo. • Legumimosas - Permiten enriquecer el suelo en N2. • Acuáticas - Permiten la degradación de contaminantes en humedales artificiales.
Agrobiotecnología Fitorremediación
Algunas especies propuestas para fitorremediación Brassica juncea
Thlapsi caerulescens
Lotus corniculatus
Silene vulgaris
Alyssum lesbiacum
Hibiscus cannabinus
Festuca arundinacea
Ejemplos de pruebas de campo para fitorremediación de metales
Metal
Planta
Ubicación
Métodoa
Comentarios
Pb
Brassica juncea
Trenton, N.J.
FE-FEAQ
La incorporación de Pb2+ aplicando EDTA resultó en la reducción del 28% en la contaminación en el área en una temporada de cosecha.
Cd Zn
Thlapsi caerulescens Silene vulgaris
Beltsville, Md.
FE-FEC
Fitoextracción de suelos enmendados con barros sedimentarios. La acumulación de Zn2+ en T. caerulescensfue 10 veces mayor que en otras plantas.
Zn Cd Ni Cu Pb Cr Se B
Brassica oleracea Raphanus sativus Thlapsi caerulescens Alyssum lesbiacum Alyssum murale Arabidopsis thaliana Brassica juncea Festuca arundinacea Hibiscus cannabinus Lotus corniculatus
Rothamstead, U.K.
FE-FEC
Suelos enmendados con sedimentos.
FE-FEC FV
El contenido de B extraible por agua se redujo entre 24% y 52%, y el de Se se redujo entre 13% y 48% por todas las especies.
U
Helianthus annus
Asthabula, Ohio
RF
Remoción de U de aguas subterráneas
Agrobiotecnología Fitorremediación
Los Baños, California
Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. a:
Métodos de fitorremediación. FE: fitoextracción; FV: fitovolatilización; RF: rizofiltración; FEAQ: fitoextracción asistida por quelantes; FEC: fitoextracción continua
Características del contaminante que afectan la captación por la planta
• Contaminantes orgánicos: No existen generalmente transportadores específicos en la planta. Se mueven por difusión en los tejidos vegetales, según sus propiedades químicas. La hidrofobicidad les permite atravesar fácilmente la bicapa lipídica pero se mueven con dificultad por los fluidos celulares.
• Contaminantes inorgánicos: Incorporados por procesos biológicos mediante transportadores de membrana, preexistentes porque son nutrientes o similares a ellos (arsenato y selenato son incorporados por transportadores de fosfato). Por ello, su captación es saturable.
• Los contaminantes inorgánicos causan en general toxicidad . por daños en la estructura celular (estrés oxidativo por su . actividad redox) y reemplazan a otros nutrientes esenciales. • Los contaminantes orgánicos suelen ser menos tóxicos: no . tienden a acumularse a altos niveles y son menos reactivos. Agrobiotecnología Fitorremediación
• En los suelos con mezcla de ambos contaminantes, el . crecimiento vegetal y la posibilidad de fitorremediación son . más limitados
Factores físicos y químicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante
La biodisponibilidad depende de: • Las propiedades químicas del contaminante (hidrofobicidad . y volatilidad): Las moléculas con extrema hidrofobicidad (PCBs, PAHs, hidrocarburos) se unen fuertemente a la materia orgánica y no se disuelven en el agua (contaminantes “recalcitrantes”). Los contaminantes no volátiles son fitodegradados o secuestrados, mientras que los volátiles pueden liberarse a la atmósfera sin transformaciones.
• Las propiedades del suelo: Los arcillosos (partículas pequeñas) retienen más agua que los arenosos y tienen más sitios de unión para iones (cationes), al igual que los de mayor concentración de materia orgánica (humus). Éstos pueden unir mayor cantidad de contaminantes hidrofóbicos. La biodisponibilidad de los contaminantes iónicos está afectada por el pH del suelo (pH ácido, aumenta la biodisponibilidad de cationes) Agrobiotecnología
• Las condiciones medioambientales: Fitorremediación
La temperatura y la humedad afectan la biodisponibilidad (por ejemplo, aumentando la migración de contaminantes disueltos en agua)
Factores biológicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante
Interacciones planta-microorganismo: - La liberación de fotosintatos por la planta aumenta la población . microbiana capaz de remediar. - La liberación de metabolitos secundarios de la planta puede activar . la expresión de genes relacionados a la degradación de . contaminantes en los microorganismos o actuar como co-metabolitos . para la degradación por los microorganismos.
La biodisponibilidad es modificada por liberación de:
Agrobiotecnología Fitorremediación
• Biosurfactantes (ramnolípidos) liberados por bacterias que aumentan . disponibilidad de compuestos hidrofóbicos • Exhudados vegetales con compuestos que pueden promover la síntesis . de biosurfactantes por las bacterias • Enzimas (vegetales y bacterianas) que modifican las cadenas laterales de . algunos compuestos orgánicos aumentando su biodisponibilidad. • Quelantes por plantas y bacterias (sideróforos, ácidos orgánicos y . fenólicos) que aumentan disponibilidad de metales. • Secreción de H+ por las plantas que acidifican el suelo. • Enzimas que convierten los metales a formas menos tóxicas o más . biodisponibles (por ejemplo, Cr VI a Cr III)
.
Aspectos que requieren de mayor investigación
Procesos que requieren aumentar los conocimientos para aumentar la eficiencia de la fitorremediación: • Interacciones planta-microorganismo y otros procesos . rizosféricos • Captación por la planta • Mecanismos de traslocación • Mecanismos de tolerancia (compartimentalización, . degradación) • Quelantes vegetales involucrados en transporte y . almacenamiento
Agrobiotecnología Fitorremediación
• Movimiento de los contaminantes en los ecosistemas . vía el sistema suelo-agua-planta hacia niveles tróficos . superiores
Tipos de fitorremediación
Agrobiotecnología Fitorremediación
Las bases conceptuales de la fitorremediación se apoyan en los mecanismos presentes en plantas que hiperacumulan metales
Acumulación o degradación en el tejido cosechable
Fitorremediación
Fitovolatilización
Fitoestimulación Fitodegradación Microorganismo que degrada toxinas
Toxina
Fitoextracción Fitoestabilización
Agrobiotecnología Fitorremediación Adaptado de: Buchanan et al., Biochemisty and Molecular Biology of Plants, 2000.
Tipos de fitorremediación
• Fitoextracción Las plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).
• Rizofiltración Las raíces de las plantas se usan para adsorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.
• Fitoestimulación Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).
• Fitoestabilización Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire.
• Fitotransformación Agrobiotecnología Fitorremediación
- Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos. - Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósfera mediante la transpiración.
Las diferentes estrategias de fitorremediación son adecuadas para distintos contaminantes
• Fitoextracción: Usada principalmente para remediar metales y otros tóxicos inorgánicos . (Se, As, radionucleótidos).
.
• Rizofiltración: Técnica relativamente cara de implementar, siendo útil para cantidades . pequeñas de aguas residuales conteniendo compuestos inorgánicos . peligrosos (radionucleótidos). Los humedales artificiales se utilizan para . una amplia gama de contaminantes inorgánicos (metales, percloratos, cianuro, . nitratos y fosfatos) y contaminantes orgánicos (explosivos y herbicidas). • Fitoestimulación: Es usado para remediar contaminantes orgánicos hidrofóbicos que no pueden . ser incorporados por la planta pero que pueden ser degradados por los . microorganismos (PCBs, PAHs e hidrocarburos derivados del petróleo).
Las diferentes estrategias de fitorremediación son adecuadas para distintos contaminantes • Fitoestabilización: Este técnica es usada cuando se plantan coberturas vegetales en sitios . conteniendo contaminantes orgánicos o inorgánicos; o cuando se usan . árboles como barreras hidráulicas para permitir el filtrado de contaminantes . orgánicos e inorgánicos. • Fitodegradación: Es útil para compuestos orgánicos que se movilizan dentro de la planta, . (herbicidas, TNT, MTBE y TCE). • Fitovolatilización: Puede utilizarse para compuestos orgánicos con formas volátiles (TCE y . MTBE) y para algunos compuestos inorgánicos que pueden existir en forma . volátil (Se y Hg).
Fitoextracción
• Se utiliza para el tratamiento de contaminaciones con metales (Cd2+, Co2+, Cr2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Se2+, Zn2+). • Características deseables en la planta: - Debe tolerar y acumular altas concentraciones de metales en las partes cosechables - Debe tener una alta tasa de crecimiento - Debe producir un gran volumen de biomasa
Coeficiente de bioacumulación ± DE Tallos
Agrobiotecnología Fitorremediación
1
Raíces
Metal
Brassica
Thlapsi
Brassica
Thlapsi
Cd2+ (5)1
175 ± 16
59 ± 12
20.574 ± 4295
4258 ± 168
Cu2+ (1)
159 ± 32
623 ± 265
55.809 ± 9221
60.716 ± 21510
Cr2+ (0,4)
80 ± 8
89 ± 15
5.486 ± 393
8.545 ± 4220
Ni2+ (1)
587 ± 115
2.739 ± 383
11.475 ± 125
8.425 ± 4220
Pb2+ (5)
3±1
29 ± 23
1.432 ± 1409
7.011 ± 3616
Zn2+ (3)
49 ± 31
770 ± 320
1.816 ± 1739
2.990 ± 1424
Concentración inicial del metal en solución (mg/L)
Tomado de: Salt et al., Biotechnology 1995.
Coeficiente de bioacumulación: relación entre la acumulación en el tejido (µg/g de peso seco) y concentración en solución (mg/L) o en suelo.
Fitoextracción
• Plantas típicas empleadas en fitoextracción: - Girasol (Helianthus annuus) - Mostaza de la India (Brassica juncea) - Nabos (Brassica napus; B. rapa) - Cebada (Hordeum vulgare) - Lúpulo (Humulus lupulus) - Ortigas (Urtica dioica; U. urens), - Diente de León (Taraxacum officinale)
• Hiperacumuladores:
Agrobiotecnología Fitorremediación
- Thlapsi caerulescens - Brassica juncea - Pelargonium spp. - Allysum lesbiacum
Fitoextracción
Los metales en el suelo pueden estar en distintas formas: • Como iones o complejos insolubles • Adsorbidos a constituyentes inorgánicos del suelo o unidos a sitios de intercambio • Unidos a moléculas orgánicas • Como compuestos o precipitados insolubles (óxidos, carbonatos, hidróxidos) • Integrados a la estructura de los silicatos
Formas de incrementar la biodisponibilidad: • Agregado de quelantes de metales Agrobiotecnología Fitorremediación
• Establecimiento de un pH moderadamente ácido • Disolución de surfactantes para contaminantes hidrofóbicos • Agregado de microorganismos
Esquema de fitoextracción continua y asistida por quelantes
La línea sólida naranja ( ) representa la concentración de metal en la biomasa, la línea discontinua ( ) representa la biomasa de tallo. Fitoextracción asistida por quelantes
Fitoextracción continua
Aplicación del quelante
Fase de captación de metal Fase de captación de metal
Fase de crecimiento
Cosecha
Fase de crecimiento
Cosecha
Adaptado de: D. E. Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.
Agrobiotecnología Fitorremediación
Concentración de Pb2+ en tallos (µg/g)
Concentración de Pb2+ en tallos de Brassica juncea en un suelo contaminado con plomo (600 mg/kg de suelo) tratado con EDTA.
EDTA aplicado (mmol/kg suelo) Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.
Acumulación de metales y tolerancia a manganeso en plantas de tabaco que expresan el gen cax2 de Arabidopsis
• El transporte de metales desde el citosol a la vacuola es un componente importante para la tolerancia a metales en las plantas. • El intercambiador de Ca2+ CAX2 (Calcium Exchanger 2) de Arabidopsis es un regulador clave de este proceso. • La expresión del gen cax2 en células de Saccharomyces cereviciae suprime defectos en el crecimiento debidos a excesos de Ca2+ y Mn2+. • Se transformaron plantas de tabaco con el gen cax2 dirigido por el promotor de 35S de CaMV. La secuencia se introdujo también en antisentido para usar esta construcción como un control interno.
Vector Control CAX2 Control Vector cnb CAX2 cnb
Agrobiotecnología Fitorremediación Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol. 2000. Control: cepa salvaje de S. cereviciae cnb: cepa de S. cereviciae mutada en el gen de calcineurina (suceptibilidad a Mn2+) Vector: cepas transformadas con el vector vacío CAX2: cepas transformadas con el gen cax2
Ensayo de tolerancia a Mn2+ en cepas de Saccharomyces cereviciae que expresan el intercambiador CAX2.
Las plantas de tabaco que expresan CAX2 acumularon más Ca2+, Cd2+ y Mn2+ y fueron más tolerantes a niveles elevados de Mn2+.
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Control C-21 C-14 Tiempo (min)
B
Transporte de iones (nmoles/mg de proteína)
A
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Tiempo (min)
C
Transporte de iones (nmoles/mg de proteína)
Fitorremediación
µ g/g peso seco
µ g/g peso seco Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Concentración de iones en las raíces (izquierda) y en los tallos (derecha) de plantas transgénicas. Vector: controles transformados con el vector vacío. C-14: línea transformada con el gen cax2. Los ensayos se realizaron complementando el medio con 10 mM Cl2Ca, 0,1 µM Cl2Cd ó 0,1 mM Cl2Mn.
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Agrobiotecnología
µ g/g peso seco
CAX2
µg/g peso seco
Vector
Transporte de iones (nmoles/mg de proteína)
Acumulación de metales y tolerancia a manganeso en plantas de tabaco que expresan el gen cax2 de Arabidopsis
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Tiempo (min)
Captación de iones en vacuola de células de raíces de plantas que expresan el gen cax2. A: transporte de Cd2+; 10 µM total Cd2+. B: transporte de Mn2+; 100 µM total Mn2+. C: transporte de Ca2+; 10 µM total Ca2+.
Remoción de metales utilizando algas y plantas acuáticas
Las plantas acuáticas emplean dos mecanismos para separar metales y otros contaminantes (incluyendo radioisótopos) de aguas polucionadas: - Reacción superficial rápida independiente del metabolismo: proceso de difusión que finaliza cuando los iones metálicos solubles se unen o adsorben a la pared celular. Puede remover cantidades significativas en minutos. - Reacción de incorporación intracelular lenta dependiente del metabolismo: proceso de transferencia desde la pared celular al interior de la célula. Demanda horas o días.
Agrobiotecnología Fitorremediación
Lemna minor
Microspora
Modelo
Concentración de Ni 2+ (mg/L)
Remoción de metales utilizando Lemna minor
0,0 mg/L Pb 2+
Concentración inicial de Ni2+ : 5 mg/L
5,0 mg/L Pb 2+ 10,0 mg/L Pb 2+
Tiempo (h)
Agrobiotecnología
Concentración Pb2+ (mg/L)
Modelo
Concentración inicial de Pb2+ : 10 mg/L
Fitorremediación Tiempo (h) Tomado de: Axtell et al., Bioresource Technology, 2003.
0,0 mg/L Ni2+ 2,5 mg/L Ni2+ 5,0 mg/L Ni2+
Rizofiltración • Se emplea en el tratamiento de contaminaciones por: - Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+) - Radioisótopos (137Cd, 90Sr, U) - Compuestos orgánicos hidrofílicos
• Características deseables en la planta: - Debe tener raíces de crecimiento rápido y ramificación abundante. - Debe poder remover metales tóxicos por períodos prolongados. - No debe ser un translocador eficiente al tallo.
• La remoción tiene distintos componentes: - Componente rápido: combinación de procesos físicos y químicos (quelación, intercambio iónico, adsorción); puede ocurrir en raíces muertas. Agrobiotecnología Fitorremediación
- Componentes intermedios: Incluyen captura intracelular, deposición en la vacuola y translocación a los tallos. - Componente lento: precipitación mediada por la raíz; involucra exudados de la raíz.
Rizofiltración
Las plantas -acuáticas son buenos candidatos para encarar procesos de rizofiltración • Plantas acuáticas sumergentes:
• Plantas acuáticas emergentes: - Scirpus validus - Typha latifolia - Ceratophyllum demersum - Potamogeton pectinatus - Maranta arundinaceae - Lemna spp
- Algas - Chara vulgaris - Myriophyllum aquaticum - Myriophyllum spicatum - Hydrilla verticillata
Flujo vertical
Scirpus validus
Agrobiotecnología Fitorremediación
Capas de arena y grava
Eflujo
Esquema de rizofiltración basado en Scirpus validus
Rizofiltración de uranio usando cultivos de raíces de Brassica juncea y Chenopodium amaranticolor
Agrobacterium rhizogenes es capaz de transformar raíces y provocar el sobrecrecimiento de las mismas.
Tejido radicular de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor. C. amaranticolor
B. juncea
Se utilizaron raíces transformadas de ambas especies para remover U de soluciones con baja concentración. C. amaranticolor
Tasa de acumulación de U en raíces de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor. Los valores se expresan como µg U/g tejido seco.
µg U/g tejido seco
Agrobiotecnología
µg U/g tejido seco
B. juncea
Fitorremediación Concentración de U (µM)
Concentración de U (µM) Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.
• Se utilizaron raíces transformadas de ambas especies para remover U de soluciones con alta concentración. • Para todas las concentraciones utilizadas, el 90% del U fue absorbido por las raíces dentro de las 10 h de tratamiento. B. juncea C. amaranticolor
µg U/g D.w.t. ( X10 3)
Rizofiltración de uranio usando cultivos de raíces de Brassica juncea y Chenopodium amaranticolor
Agrobiotecnología
Tasa de acumulación de U en raíces de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor. Los valores se expresan como µg U/g tejido seco.
Concentración de U (µM) Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.
Fitorremediación
Las raíces transformadas de ambas especies podrían usarse como bioabsorbentes de uranio, para lo cual podrían producirse a gran escala en biorreactores.
Fitotransformación
La fitotransformación comprende los procesos de fitodegradación y fitovolatilización Empleada en tratamientos de contaminación por: • Herbicidas (atrazina, alaclor) • Aromáticos (BTEX: benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos) • Alifáticos clorinados (TCE: tricloroetileno; tetracloroetileno) • Deshechos de nutrientes (NO3-, NH4+, PO43-) • Deshechos explosivos (TNT; RDX: hexahidrotrinitrotriazina)
Depende de: • Concentración del compuesto disuelto en el suelo • Eficiencia de captura, que depende de: - las propiedades físico-químicas del compuesto - especie química - propiedades de la especie vegetal Agrobiotecnología Fitorremediación
• Tasa de transpiración, que depende de: - el tipo de planta - área foliar - nutrientes - humedad del suelo - temperatura - viento - humedad relativa
Fitotransformación
• Una vez translocado, el compuesto puede tener los siguientes destinos: - Almacenamiento del producto (o de sus productos de .degradación) vía conjugación o lignificación - Metabolización a distintos productos de degradación - Volatilización por la transpiración - Mineralización (CO2 + H2O)
• Plantas típicas empleadas en fitotransformación: - Arboles freatófitos (álamo, sauce, álamo americano) - Pasturas (centeno, sorgo, festuca) - Leguminosas (trébol, alfalfa, caupí)
Agrobiotecnología Fitorremediación
Fitodegradación de compuestos orgánicos Las plantas pueden desarrollar una serie de reacciones para metabolizar o mineralizar compuestos orgánicos Enzimas
Rol natural
Aplicaciones en fitorremediación
Nitroreductasas
Su función es la reducción de nitrato para obtener nitrógeno destinado al crecimiento celular
Reducen grupos nitrato en explosivos y otros compuestos nitroaromáticos y remueven el nitrógeno del anillo aromático
Deshalogenasas
Están vinculadas a la degradación de subproductos de etileno durante la senescencia
Deshalogenan solventes clorinados
Nitrilasas
Detoxifican compuestos aromáticos cianamidados naturales
Procesan grupos cianidados de los anillos aromáticos en herbicidas y otros compuestos cianidados
Fosfatasas
Su rol es el procesamiento de fosfato durante el desarrollo
Procesan grupos fosfato de pesticidas organofosfatados y de compuestos que afectan el sistema nervioso
Lacasas
Intervienen en la lignificación y delignificación por adición de oxígeno
Completan la degradación del TNT. Aparentemente involucradas en la incorporación de fragmentos de anillos aromáticos en la biomasa vegetal
Peroxidasas
Degradan en forma no específica compuestos fenólicos, lignina, y otros
Empleadas en el tratamiento de aguas residuales para degradar fenoles Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin, 1998.
Contaminación con explosivos
• Las técnicas tradicionales se basan en la . incineración o en utilización de microorganismos . e implican remoción del suelo • La alternativa frente a las técnicas tradicionales fue . usar sistemas de fitorremediación:
.
- Cultivos celulares de remolacha que degradan nitroglicerina (GNT) - Plantas acuáticas y cultivos de raíces que biotransforman trinitroglicerina (TNT)
• El éxito fue limitado, ya que la GNT sólo pudo ser . denitrificado a di- y mononitroglicerol; la remoción . completa de grupos nitratos no se logró nunca.
Agrobiotecnología Fitorremediación
• Además, la degradación de TNT produjo la . acumulación de otra toxina: aminodinitrotolueno. • Otra desventaja es que las plantas captan y . metabolizan los compuestos nitrogenados 10 veces . más lentamente que los microorganismos.
Rutas de degradación del TNT mediante nitroreductasas y lacasas vegetales
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.
Agrobiotecnología Fitorremediación
ADNT: aminodinitrotolueno; DANT: diaminonitrotolueno; TAT: triaminotolueno; TNT: trinitrotolueno
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco transformadas con el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
Crecimiento brotes de tabaco no transformado y transgénico (NR 3-2) en medio líquido. Sin TNT
NT
TNT 0,25 mM
NR 3-2
NT
NR 3-2
Crecimiento de plantas de tabaco no transformado y transgénicas (NR 3-2) luego de la germinación en medio conteniendo explosivos. TNT 0,05 mM
Sin TNT
TNT 0,1 mM
Agrobiotecnología Fitorremediación NT NT
NR NR 3-2 3-2
NT NT
NR NR 3-2 3-2
NT NT
NR NR 3-2 3-2
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
Crecimiento de raíces para brotes de plantas no transformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2) luego de 21 días de exposición a TNT NT TNT (mM)
Longitud de las raíces (cm ± e.s.)
NR 3-2 Indice de tolerancia de las raíces (%)
Longitud de las raíces (cm ± e.s.)
Indice de tolerancia de las raíces (%)
0
8,1 ± 0,1
100
8,1 ± 0,1
100
0,05
5,5 ± 0,6
68
6,2 ± 0,9
77
3
5,5 ± 0,9
68
0,1
0,2
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
e.s.= Error estándar Indice de tolerancia = longitud de las raíces de brotes tratados con TNT/longitud de las raíces de brotes control x 100
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae Estudios de toxicidad de TNT en plantas no transformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2) NT
TNT (mM)
Peso antes del TNT (g)
NR 3-2
Peso después del TNT (g)
Ganancia / pérdida de peso (g)
Peso antes del TNT (g)
Peso después del TNT (g)
Ganancia / pérdida de peso (g)
0
11,37 ± 0,17
16,9 ± 0,28
+5,52 ± 0,45
11,08 ± 0,05
16,88 ± 0,18
+5,79 ± 0,23
0,1
11,2 ± 0,14
11,3 ± 0,02
+0,13 ± 0,15
11,4 ± 0,95
14,65 ± 0,07
+3,24 ± 0,88
0,25
11,59 ± 0,01
7,59 ± 0,19
-4,00 ± 0,21
11,93 ± 0,18
13,95 ± 1,20
-2,02 ± 1,01
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous • El explosivo hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) es tóxico para todo tipo . de organismos y un posible carcinógeno. Su degradación ambiental es muy lenta . y su presencia en suelos y napas de agua constituye un problema grave. • El RDX es tóxico para las plantas. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las . bacterias del género Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no . desarrollan suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradación. • La molécula responsable de la degradación es un citocromo P450. Como prueba . de concepto, se aisló el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus . rhodocochrous y se lo expresó en plantas de Arabidopsis thaliana. Las plantas . . fueron utilizadas en ensayos de detoxificación de suelos contaminados con RDX. Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
4-nitro-2,4-diazabutanal
Ruta de degradación de RDX por el citocromo P450 codificado por el gen XplA de R. rhodocochrous y ensayos de actividad realizados con proteína expresada en E. coli. Los controles fueron realizados con proteína sometida a 100oC.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous Caracterización de plantas transgénicas que expresan el gen XplA
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
a) Análisis de Northern y Western blot de líneas de A. thaliana que expresan el gen XplA en forma constitutiva. b) Captación de RDX de medio acuoso por plántulas de A. thaliana. Los resultados son el promedio de repeticiones de cinco experimentos.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
Estudios en suelos contaminados con RDX empleando plantas wild type y transformadas con 35S::XPLA. Se cultivaron plantas de A. thaliana de 8 semanas de edad en suelo conteniendo 50, 250, 500 y 2000 mg de RDX/Kg de suelo. Se muestran las mediciones de biomasa (tallos y raíces) obtenidos en las diferentes condiciones experimentales (promedio de cinco ensayos).
El ciclo biogeoquímico del mercurio y de la biomagnificación de metilmercurio
Principales interconversiones del mercurio en el medio ambiente
Agrobiotecnología Fitorremediación Hg(0): mercurio elemental Hg(II): mercurio iónico libre RSHg: mercurio unido a azufre MeHg: metilmercurio
Expresión de los genes merA y mer B de Desulfovibrio desulfuricans en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana
• No se conocen plantas capaces de detoxificar Hg. • En cambio, existen microorganismos presentes en los sitios contaminados que poseen dos enzimas (organomercúrico liasa, gen merB, y mercúrico reductasa, gen merA) que permiten convertir metilmercurio en Hg elemental, detoxificado este metal. • Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con los dos genes mencionados aislados de Desulfovibrio desulfuricans.
R-CH2-Hg+ + H+ Hg(II) + NADPH
MerB MerA
R-CH3 + Hg(II) Hg(0) + NAD+ + H+
Agrobiotecnología Fitorremediación
MerB: organomercúrico liasa MerA: mercúrico reductasa
Expresión de los genes merA y mer B de Desulfovibrio desulfuricans en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana
merB merA/B-1 merA NT
merB merA/B-1 merA NT
0 µM
1 µM
NT
A/B-1
A/B-2 A/B-3
NT A/B-1 A/B-2
5 µM
10 µM
A/B-3
Fenotipos de resistencia a mercurio orgánico de plantas control y de 3 líneas transgénicas para merA/merB 0 µM PMA
5 µM PMA A/B-4 A/B-5 A/B-6
pg Hg(0).min-1/mg de tejido
Fitorremediación
merB merA/B-1 merA NT
Plantas NT y transgénicas creciendo en medios con mercurio orgánico.
A/B-4 A/B-5 A/B-6
Agrobiotecnología
merB merA/B-1 merA NT
Tasas de volatilización de Hg(0) en plantas control y en 6 líneas transgénicas de A. thaliana
Líneas de plantas
Tomado de: Bizily et al., Nature Biotechnology, 2000.
Fitorremediación de organomercuriales vía transformación de cloroplastos (genes merA y mer B de Desulfovibrio desulfuricans)
Se transformaron cloroplastos de tabaco con dos versiones de esta construcción con y sin región 3´ no traductible (3´ UTR) portando el operón MerAB 16S→ →
aadA
merB
trnA→ →
merA
P
3´UTR
Efecto de la concentración de acetato de fenilmercurio en el crecimiento de plantas de tabaco controles (NT) y transgénicas (5A y 9) NT
5A
9
Concentración de PMA
Agrobiotecnología
trnI→ →
Fitorremediación
Tomado de: Ruiz et al., Plant Physiol., 2003.
Aumento de la acumulación y tolerancia a selenio en plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan la enzima selenocisteína liasa I de ratón
Agrobiotecnología Fitorremediación
• La toxicidad del selenio (Se) se debe a la . incorporación inespecífica de selenocisteína . (Se-Cys) a las proteínas.
• Estrategia: Expresar el gen de la selonocisteína liasa de ratón en citoplasma y cloroplastos de Arabidopsis thaliana
Se-Cys
Se-Cys liasa
Se elemental + alanina
Agrobiotecnología
Incorporación de Se a proteínas en brotes de Arabidopsis thaliana no transgénicas (NT) y transgénicas (citosólicas y plastídicas) Control
1
µg Se g protein -
NT
cit SL
cp SL
Control 50 µM Se-Cys
Tolerancia a Se-Cys selenato y selenito de brotes de Arabidopsis no transgénicos y transgénicos.
50 µM Se-Cys
Largo de raíces (mm)
Aumento de la acumulación y tolerancia a selenio en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana
25 µM SeO2-3
25 µM SeO2-3 50 µM SeO2-4
Fitorremediación 50 µM SeO2-4
Tomado de: Pilon et al., Plant Physiol., 2003.
NT
cyt SL cp SL
Fitoestimulación • Las plantas proveen el hábitat para el incremento en el tamaño y actividad de poblaciones microbianas. • Los exudados vegetales estimulan las transformaciones efectuadas por las bacterias (inducción enzimática). • La síntesis de carbón orgánico aumenta la tasa de mineralización microbiana (enriquecimiento de sustrato). • El oxígeno que difunde con las raíces asegura un medio adecuado para las transformaciones . aeróbicas. Agrobiotecnología Fitorremediación
• Los hongos micorríticos asociados a las raíces vegetales metabolizan contaminantes orgánicos.
Fitoestimulación • Empleado en el tratamiento de contaminación orgánica causada por pesticidas (atrazina), compuestos . aromáticos, e hidrocarburos aromáticos policíclicos . (PAHs) • Se basa en la liberación por la planta de exudados entre los que se incluyen: - ácidos orgánicos de cadena corta - compuestos fenólicos - bajas concentraciones de enzimas y péptidos • Plantas típicas empleadas en fitoestimulación:
Agrobiotecnología Fitorremediación
- Liberadoras de compuestos fenólicos (mora, manzano, Maclura pomífera) - Pastos con raíces fibrosas (centeno, festuca) para contaminantes hasta 1 metro de profundidad - Arboles freatófitos para contaminantes hasta 3 metros de profundidad - Plantas acuáticas para sedimentos
Fitoestabilización
• Empleada en el tratamiento de contaminación por: - Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, As2+, Cu2+, Se2+, U) - Compuestos orgánicos hidrofóbicos: hidrocarbonos aromáticos policiclícos (PAHs), bifenilos policlorados (PCBs), dioxinas, furanos, pentaclorofenol, DDT, dieldrina • Características deseables en la planta: - Debe tolerar altos niveles de metales tóxicos - Debe inmovilizar los metales vía captura y posterior precipitación y reducción - Debe acumular bajas concentraciones en las raíces • Plantas típicas empleadas en fitoestabilización:
Agrobiotecnología Fitorremediación
- Arboles freatrófitos que transpiren grandes volúmenes de H2O - Pastos con raíces fibrosas que estabilicen la erosión del suelo - Plantas con sistemas radiculares robustos capaces de absorber/unir contaminantes
Referencias
1.
Pilon-Smits. Phytorremediation. Annual Review of Plant Biology, 56:15-39. 2005.
2.
Eapen and D’Souza. Prospects of genetic engineering of plants for phytoremediation of toxic metals. Advances in Biotechnology, 23:97-114, 2005.
3.
Mejáre, M. and Bulow, L. Metal binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals. Trends in Biotechnology, 19:67-73, 2001.
4.
Kovalchuk, O., Titov, V. Hohn, B. and Kovalchuk, I. A sensitive trangenic plant system to detect toxic inorganic compounds in the environment. Nature Biotechnology, 19:568-572, 2001.
5.
Salt, D. E., Smith, R.D., and Raskin I. Phytoremediation. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 49:643-668, 1998.
6.
http://www.hawaii.edu/abrp/Technologies
7.
http://www.envirotools.org/factsheets/phytoremediation.shtml
Agrobiotecnología Fitorremediación