GUIA DE PROBLEMAS

2013

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ESTERILIZACIÓN 1) ¿Qué consideraciones debe tener en cuenta para cargar el autoclave con material a esterilizar? 2) ¿Qué método utilizaría para esterilizar cada uno de los siguientes materiales y soluciones? Placas de Petri descartables, material de cirugía, ropa de cama hospitalaria, solución fisiológica, suero fetal bovino, vitaminas, antibióticos, etanol, glicerol. 3) Una solución salina se fraccionó en partes iguales en dos frascos A y B. La fracción A se esterilizó en autoclave en una atmósfera conteniendo 100% de vapor; la fracción B se esterilizó también en autoclave pero en una atmósfera que contenía 60% de vapor y 40% de aire, durante el mismo tiempo. ¿Cuál de los dos procedimientos asegura la eliminación total de esporas? ¿ Por qué? 4) ¿ Qué características de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la elección de un método de esterilización ?. 5) ¿ Por qué se requiere mayor tiempo de esterilización en horno que en autoclave ?. ¿ Cuál es el agente esterilizante en cada caso ?. 6) ¿ Cómo decontaminaría un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus cereus y uno utilizado para crecer Escherichia coli ?. 7) Un tubo conteniendo medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente incubado a 37 °C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detectó crecimiento de microorganismos. a) ¿Qué parámetros debería controlar para que el proceso de esterilización se lleve a cabo de manera adecuada?. b) Una vez solucionado el inconveniente, ¿Cómo determinaría si dicho medio está efectivamente estéril?. 8) ¿ Cómo realizaría un control de esterilización y un control de esterilidad ?. 9) Ud. dispone en su laboratorio de un mechero, autoclave, una solución de etanol 70 %, un horno y una lámpara de UV y necesita preparar y esterilizar los siguientes medios de cultivo: Caldo M9, agar nutritivo y agar Mossel con yema de huevo y polimixina B. Además necesita esterilizar una membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm, placas de petri de vidrio, el rastrillo y el ansa. a) Indique que método de esterilización y/o desinfección de los que se dispone en su laboratorio utilizaría para cada uno de los materiales mencionados. b) ¿ Necesita disponer de algún otro método de esterilización?. ¿Por qué?

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DIVERSIDAD MICROBIOLÓGICA 1) ¿Qué tipos de bacterias se encuentran asociadas con las zonas de color púrpura y verde de la columna de Winogradsky? 2) ¿En qué zona de la columna esperaría encontrar un anaerobio estricto? 3) Describa una sucesión microbiana en la columna de Winogradsky 4) Qué gradientes se forman en la columna de Winogradsky?. Qué elementos se utilizan en el laboratorio para garantizar la formación de los mismos?. 5) a) Indique que función cumplen cada uno de los elementos agregados en la columna de Winogradsky. b) Ubique en relación al gradiente de SH2 a los siguientes microorganismos: bacterias reductoras de sulfato, bacterias verdes del azufre, bacterias púrpuras del azufre, cianobacterias, diatomeas. c) En base a que otro/s parámetro/s ambientales podría ubicarlas. Justifique en todos los casos. 6) A partir de libros de texto, citas bibliográficas o búsquedas a través de internet, recabar más información sobre el metabolismo y los requerimientos de oxígeno de los organismos que pueden estar presentes en la columna de Winogradsky. Muchos de estos microorganismos se mencionan más abajo. Utilizando la información obtenida, dibujar una columna de Winogradsky y ubicar los microorganismos en el lugar apropiado. Thiobacillus sp., Clostridium sp., Algae, Desulfovibrio sp., Cyanobacteria, Chromatium sp., Rhodospirillum sp., Chlorobium sp. 7) Los siguientes 4 tipos metabólicos se encuentran presentes en la columna de Winogradsky: fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimiolitoautótrofos y quimioorganoheterótrofos. a) Mencione un ejemplo de cada uno de estos microorganismos que pueda ser encontrado en una columna de Winogradsky típica. En base a los ejemplos por usted seleccionados señale: b) Qué microorganismos participan en el ciclo del azufre y qué transformaciones realizan de ese compuesto. c) Ubique espacialmente c/u de los microoganismos seleccionados en función del gradiente de O2.

TINCIONES 1) ¿En qué consiste una tinción diferencial?. ¿Para qué se emplea?. 2) ¿ Qué sucede si a un cultivo envejecido de Bacillus sp. se le realiza una tinción de Gram?. 3) ¿ Cómo espera observar las bacterias luego de la tinción de Gram si se olvida de realizar el paso de decoloración ?. 4) ¿ Qué sucederá si no se calienta en presencia del colorante en la tinción de esporas?.

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5) ¿ Podría utilizar un colorante básico como primer colorante en la tinción de esporas ?. 6) ¿ Qué características debe tener un colorante para ser empleado en una tinción negativa?. 7) Las tinciones de Gram y esporas permiten determinar diferencias estructurales en células de distintos géneros. ¿ Cuáles son esas diferencias y cuál es el paso de cada coloración que las pone en evidencia ?. ¿ Qué tipos de colorantes se utilizan en cada caso ?. 8) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio óptico luego de una tinción de Gram y color rosado al efectuarse una coloración de esporas. ¿ Por qué motivo el cristal violeta en el primer caso y la safranina en el segundo tiñen la bacteria de esa manera ?. 9) Indique cual o cuales de las tinciones realizadas en los trabajos prácticos ponen en evidencia diferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente. 10) Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta. a) En una tinción negativa los colorantes utilizados tienen afinidad sólo por la pared bacteriana. b) En la tinción de esporas el verde de malaquita no tiñe el citoplasma celular porque es removido por los solventes orgánicos que se utilizan en el paso de decoloración. c) Las células Gram negativas no se tiñen con cristal violeta porque el mordiente no puede atravesar la pared de peptidoglicano. 11) Se dispone de un kit de Gram y un frasco de verde de malaquita. Con estos colorantes podría realizar una tinción para determinar la ubicación de las esporas en una especie de Bacillus que se quiere identificar?. Explique. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 1) ¿ Qué tipo de medio es el agar Mossel?. ¿ Para qué sirven cada uno de sus constituyentes?. ¿ Podría reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro?. 2) Diseñe un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la maltosa con producción de ácido de los que no lo hacen. 3) Discuta las siguientes afirmaciones: a- Para determinar la carga bacteriana de una muestra debe realizarse un enriquecimiento previo. b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio líquido pues hay libre competencia por los nutrientes. c- El paso de aislamiento selectivo y/o diferencial puede hacerse en medio líquido. d- La premisa fundamental en un protocolo de aislamiento es conseguir un cultivo puro.

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4) La composición del caldo nutritivo es: extracto de carne y peptona en agua a pH 7. La composición del caldo Mc Conkey es: peptona, lactosa, sales biliares, púrpura de bromocresol y cloruro de sodio en agua a pH 7. ¿ Cuál es la función de cada uno de los componentes en cada medio?. 5) Los principales componentes del agar Rogosa utilizado en el aislamiento de Lactobacillus son: glucosa, extracto de levadura, extracto de carne, peptonas, acetato de sodio, tween 80 (pH 5,5). Explique cuál es la función de cada uno de ellos y por qué la incubación se realizó en anaerobiosis. 6) Discuta los siguientes enunciados y justifique: a) Cualquiera de los siguientes medios podría ser utilizado para diferenciar aquellos microorganismos capaces de fermentar la lactosa: Medio 1 Peptona de carne Lactosa Rojo fenol Agua Agar ----

Medio 2 Peptona de carne Extracto de carne Lactosa Rojo fenol Agua ----

Medio 3 Cloruro de amonio Lactosa Rojo fenol Agua Agar ----

Medio 4 Cloruro de amonio Lactosa Glucosa Rojo fenol Agua Agar

b) Especies del género Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar EMB. 7) En el estudio de la esporulación de Bacillus cereus, cuya espora es oval y central, se observaron al microscopio bacilos con esporas terminales características de Bacillus subtilis. Diseñe un medio de cultivo que le permita diferenciar ambos microorganismos.

PRUEBAS BIOQUIMICAS 1) Diga si es verdadero o falso a) En el agar EMB y en el agar Fe de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que realizan fermentación ácido-mixta de aquellos que realizan fermentación butilenglicólica. b) Las pruebas bioquímicas Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, pueden realizarse en cualquiera de los siguientes medios: i) Extracto de carne, peptona de carne, agua. ii) Peptona, glucosa, buffer fosfato, agua. 2) ¿ Qué resultados espera obtener en la prueba bioquímica de agar hierro de Kligler, para microorganismos con las siguientes características metabólicas:?. a) Aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbono b) Aerobio facultativo que no utiliza la lactosa como fuente de carbono

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c) Aerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente de carbono 3) ¿ Qué tipo de metabolismo y qué productos se ponen en evidencia al realizar las pruebas de Rojo de Metilo y Voges-Proskahuer ?. ¿ Qué precauciones debería tener para la correcta interpretación de ambas pruebas ?. 4) A partir de una muestra de agua del Río de la Plata, se obtienen cultivos puros de 5 microorganismos (A, B, C, D, E) A cada uno de ellos se le realizan las pruebas de agar hierro de Kligler, Rojo de Metilo y Voges Proskahuer, obteniéndose los siguientes resultados:

A B C D E

Kligler Ac/Ac con gas Alc/SC sin gas Alc/Ac sin gas Alc/Ac con gas ↓↓ Ac/Ac con gas

Rojo de Metilo + + -

Voges Proskahuer + +

A partir de los resultados obtenidos: a) ¿ Qué características metabólicas puede inferir para cada uno de los microorganismos aislados ?. b) ¿ De qué otra forma podría determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los cinco microorganismos ?. 5) Discuta las siguientes afirmaciones; a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos ácidos generados por la fermentación de la lactosa. b).Los resultados de las pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer a diferencia de la prueba de agar hierro Kligler son independientes del tiempo de lectura. c) La aparición de un producto coloreado en la primera parte de la prueba de reducción del nitrato se considera positiva. 6) En una placa sembrada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta contaminación con Pseudomonas aeruginosa. Indique por lo menos 3 pruebas bioquímicas y los resultados esperados de las mismas que le permitirían comprobar que se trata de estos dos microorganismos. 7) A partir de una muestra de agua se realiza un cultivo de enriquecimiento en caldo Mac Conkey, el cual es sembrado en placas de agar EMB-Levine , obteniéndose los siguientes resultados: .- Colonias transparentes. .- Colonias con centro pardo-grisáceo sin brillo metálico. .- Colonias con brillo verde metálico.

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a) Sobre la base del aspecto macroscópico de las colonias ¿qué componentes del medio de cultivo utilizan los microorganismos para su crecimiento?. Explique. b) En caso de que posean un metabolismo fermentativo, ¿podría inferir que tipo de fermentación realizan y a qué colonias corresponden los microorganismos con esas características?. Explique. c) ¿Qué pruebas bioquímicas emplearía para verificar el tipo de fermentación, qué colonias utilizaría y cuál sería el resultado de dichas pruebas en cada caso?. d) Qué características deberían tener los microorganismos aislados para poder ser identificados empleando un test multiprueba API 20 E. RASTREO DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS 1) ¿Las enzimas responsables de las hidrólisis de los sustratos ensayados en el TP 7 son exo o endocelulares? Justifique 2) ¿Puede el método ensayado dar resultados cuantitativos? ¿Qué debe tener en cuenta? 3) ¿Puede Ud sugerir un ensayo para evaluar la hidrólisis de gelatina como sustrato proteico en placa 4) ¿Qué otras actividades enzimáticas podría ensayar en placa como método de rastreo? ANTIBIOTICOS 1) Diseñe un protocolo para determinar la concentración inhibitoria mínima de un antibiótico para un determinado microorganismo. Este protocolo ¿ es aplicable en el caso de un bacteriostático, un bactericida lítico y un bactericida no lítico ?. 2) Para obtener un cesped de un microorganismo se siembra con hisopo una placa conteniendo: agar, glucosa, NH4Cl, MgSO4, K2HPO4 y se aplican distintos discos de papel embebidos con diferentes cantidades de un determinado antibiótico. Luego de 48 horas de incubación se observa un halo de inhibición alrededor del disco que contiene 5 µg de antibiótico. Cuando se hace lo mismo pero utilizando un medio que contiene agar, triptona y extracto de levadura, se observa un halo de inhibición del mismo tamaño que el anterior recién alrededor del papel que contiene 50 µg del antibiótico. Discuta las posibles explicaciones para estos resultados. 3) Diseñe un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un compuesto con actividad antibiótica. ¿ Cómo determinaría si dicho compuesto es bactericida o bacteriostático ?. 4) Se dispone de dos cultivos bacterianos: uno en estado de crecimiento estacionario y otro en estado de crecimiento exponencial. Si se agrega la misma concentración de penicilina en ambos cultivos ¿ Que resultados esperaría obtener ?. Grafique y explique. 5) Se inoculan caldos nutritivos con Staphylococcus aureus y se incuban a 37 °C, tomando alícuotas a distintos tiempos para medir número de células viables y D.O. A los 120 minutos (fase log) se agregan a cada cultivo diferentes agentes: a) penicilina, b) cloranfenicol, c) solución fisiológica. A los 240 minutos, los cultivos se centrifugan a baja velocidad, se resuspenden en un volumen igual de medio fresco y se continúa la incubación. Esquematice las curvas de crecimiento esperadas en cada caso (número de células viables y D. O.). Justifique.

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6) ¿ Qué efecto espera obtener si se agrega en forma combinada un bacteriostático y un antibiótico de acción sobre síntesis de pared a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial ?. 7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibición 3 veces mayor para el antibiótico A que para el antibiótico B. ¿ Qué conclusión se puede extraer de esta prueba ?. Justifique. 8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por síntesis química con presunta actividad antimicrobiana para bacterias gram negativas. a) ¿Cómo determinaría cual de las tres presenta mayor actividad?. b) ¿Qué parámetros debería tener en cuenta en el ensayo experimental?. c) ¿Cómo determinaría su mecanismo de acción?. 9) a) A qué se debe la aparición de colonias dentro de la zona de inhibición del crecimiento en un ensayo de concentración inhibitoria mínima? b) Qué resultados esperaría obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas colonias en relación a las que crecen por fuera del halo de inhibición? Cómo la calcularía? Nota: Ud. esta trabajando con un cultivo puro 10) Debido al recorte presupuestario, la Cátedra de Microbiología no pudo comprar las tiras de E-Test Penicilina para la determinación de la CIM (concentración inhibitoria mínima). ¿Qué metodología alternativa podría emplear para calcularla?. Explique detalladamente el método por Ud. propuesto. Nota: Se dispone de todo el material de laboratorio necesario. 11) Un antibiótico A que actúa por unión reversible a la subunidad menor del ribosoma bacteriano se modifica químicamente obteniéndose una serie de compuestos distintos: B, C y D. Al realizar una prueba de sensibilidad en agar para un determinado microorganismo se obtuvieron los siguientes diámetros (d en mm) en los halos de inhibición: dA 25, dB 6, dC 30 y dD 6. a) ¿Qué conclusiones se pueden obtener a partir de estos resultados?. Justifique. b) ¿Cómo comprobaría que C tiene más actividad que A?. Explique brevemente. Al determinar el mecanismo de acción de C se obtuvieron las siguientes curvas de DO600 nm (--) y log UFC/ml () en función del tiempo: c) ¿Qué tipo de actividad presenta C?. Justifique brevemente. d) ¿Cambió respecto de A?. Explique. Nota: la flecha indica el tiempo de agregado de C. FAGOS 1) ¿ Cuál es el título de un stock de fagos a partir del cual se cuentan 38 placas de lisis en la dilución 10-5 ?. Volumen de inóculo 0,1 ml.

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2) Si un lisado de título 5 x 108 UFP/ml se utilizó para infectar a una moi = 20 ¿ Qué cantidad de bacterias fueron necesarias para la infección ?. 3) Se dispone de 5 ml de un stock de fago T4 para titular, el cual es diluido 1 : 5 . A partir de esta dilución se realizan diluciones seriadas al décimo ( 10-1 a 10-8) y se siembran 0,2 ml en agar blando, por duplicado. Los resultados obtenidos fueron: Dilución 10-5 10-6 10-7 10-8

Número de placas de lisis 520-480 60-54 3-6 0-1

a) Calcule el título del stock de fago. ¿ Qué esperaría observar en las placas correspondientes a diluciones menores que 10-5 ?. b) ¿ Qué diluciones haría a partir del cultivo original para obtener 35 placas de lisis en una placa de Petri ?. 4) Se preparan dos lisados del fago virulento P1. Del primero se obtienen 20 ml que se titulan en placa con un recuento de 50 playas de lisis en la dilución 10-6. Del segundo se obtienen 2.5 ml que se diluyen al medio con solución fisiológica y se titula en placa con un recuento de 200 playas de lisis en la dilución 10-6. Cuál de los dos lisados tiene mayor número de UFP totales? (Volumen de inóculo = 0,1 ml). Si es necesario infectar a una m.i. = 5 Qué cantidad de bacterias utilizaría para cada uno de los lisados?. (Considere volumen de inóculo = 0,1 ml para fagos y bacterias). 5) Se prepara un nuevo stock de fagos utilizando un cultivo bacteriano susceptible cuyo recuento en placa es de 108 UFC/ml y un viejo stock cuyo título es 1010 UFP/ml, de manera de aumentar el título. Protocolo: Volumen de cultivo bacteriano infectado: 10 ml. Inóculo del viejo stock: 0.1 ml de una dilución 10 –1. Tiempo de incubación a 37 °C: 5 horas. El lisado obtenido es centrifugado y filtrado. a) Qué rango de 3 diluciones debería plaquear para poder verificar que el título aumento un orden?. b)

Qué multiplicidad de infección utilizó al preparar el stock?

6) Se dispone de un stock de fagos con un título de 106 UFP/ml. Se desea preparar un nuevo stock de mayor título teniendo en cuenta que cada bacteria sensible produce 300 fagos. Para ello se cuenta con un cultivo de bacterias en fase exponencial con 5x109 bacterias/ml. La preparación de dicho stock se realiza mezclando 1 ml del stock original con 1 ml de la dilución del cultivo bacteriano que garantice un fago por bacteria ( mi = multiplicidad de infección = 1). a) ¿ Qué diluciones tendría que realizar para obtener una mi = 1 ?. Indique los volúmenes. b) ¿ Qué diluciones del nuevo stock de fagos haría para determinar el título viral ?. Indique los volúmenes.

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RECUENTO DE BACTERIAS 1) Se dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 108 UFC/ml. ¿ Qué diluciones debería realizar para contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilución ?. 2) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 108 UFC/ml : ¿ Cómo procedería para obtener 80 colonias en una placa de agar nutritivo ?. Indique los volúmenes a utilizar. 3) ¿ Qué dilución debería realizar para obtener 2 ml de una suspensión de bacterias que contenga 2 x 105 UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml ?. 4) Un cultivo bacteriano se diluye 1/4. A partir de esa dilución se realizan diluciones seriadas al décimo. Se siembra 0,1 ml de cada dilución en placas de agar nutritivo por triplicado obteniéndose los siguientes resultados: Número de colonias Dilución

Placa 1

Placa 2

Placa

3 10-4 10-5 10-6

621 64 5

546 56 9

356 68 4

¿ Qué dilución elegiría para calcular las UFC del cultivo original ?. Justifique su elección. 5) Un cultivo bacteriano de 10 ml tiene un recuento de 250 UFC cuando se plaquea 0,1 ml de la dilución 10-4 . Si 2 ml de ese cultivo se inoculan en 100 ml de medio fresco para realizar una curva de crecimiento: ¿ Cuál es la concentración bacteriana inicial ?. ¿Qué diluciones realizaría del mismo para contar 100 colonias si sembrara 0,1 ml ?. 6) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 106 bacterias lácticas viables / ml. ¿ Qué método de recuento utilizaría para corroborar ese número ?. Describa el protocolo, condiciones y materiales que utilizaría para realizar dicha determinación. 7) Enumere las ventajas y desventajas de los siguientes métodos de recuento de bacterias: i) turbidez, ii) recuento en placa, iii) conteo directo al microscopio. 8). Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibración de recuento en placa vs. turbidez (D.O. leída a 600 nm). A partir de la misma se establece una relación UFC./ml por unidad de D.O. de 4. 107 a) Qué ventajas tiene realizar una curva de calibración de recuento vs. turbidez? b) Que diluciones debería realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo sembrada con 0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5. 9) Un investigador dispone de una curva de calibración de DO vs UFC/ml para E. coli en caldo nutritivo. ¿ Podría utilizar la misma curva para un cultivo de: Bacillus megaterium y otro de Micrococcus luteus ?. Justifique su respuesta.

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10) Un cultivo de Klebsiella pneumoniae en fase exponencial tiene una DO = 0,2 medida a 600 nm. Al realizar un recuento en placa se contaron 40 colonias al sembrar 0,2 ml de la dilución –4 del cultivo original. a) Calcular las UFC/ml b) Calcular las UFC totales si el volumen del cultivo original es de 3 ml. c) ¿Qué diluciones debería realizar a partir del mismo cultivo de Klebsiella pneumoniae cuando alcanza una DO = 0,5 para contar en una placa 100 colonias. d) ¿En un cultivo exponencial de Baccillus megaterium que tiene una DO = 0,5 esperaría obtener más o menos UFC/ml que en el cultivo de Klebsiella pneumoniae que tiene igual DO?. ¿Por qué?. 11) En un laboratorio un técnico realiza el análisis de una muestra de agua debiendo informar el Nº más probable (NMP) de coliformes totales/100 ml. Para ello el técnico usó el método de Wilson empleando el caldo McConkey como indicador de coliformes: Diluciones de la muestra

TC -1

-2 -3 -4

Tubos sembrados

3

3

2

2

2

Volumen sembrado (ml.)

1

1

1

1

1

Positivos en McConkey 37ºC

3

3

2

0

0

A partir de estos resultados calcular el NMP de coliformes totales. 12) Con el objeto de investigar una eventual contaminación de las aguas de un afluente del Riachuelo, se tomó una muestra y se procedió a analizarla empleando el caldo Brila Fluorocult. El protocolo y los resultados fueron los siguientes: Nº de tubos sembrados 3 3 3 3 3 3 3

Vol. (ml.)

Dil.

Número de tubos positivos Caldo Brila 37 °C

10 1 1 1 10 1 1

100 100 10-1 10-2 10-3 10-3 10-4

3 3 3 1 1 0 0

Calcular el Nº más probable (NMP) de coliformes totales cada 100 ml. 13) Se realiza un recuento de Pseudomonas a partir de una muestra de agua de pozo empleando caldo M9 glicerol/asparragina, obteniéndose los siguientes resultados: Nº de tubos sembrados

Vol. (ml.)

Dil.

3 3 3 3 3

0,01 1 0,1 1 0,01

10-1 10-2 10-3 10-3 10-3

Número de tubos positivos 3 3 3 3 2

12

3 3

1 0,01

10-6 10-4

1 1

Calcular el NMP de Pseudomonas/100ml de agua. INMUNOLOGÍA 1) Indique: a) ¿Cómo procedería para verificar la efectividad del proceso de purificación de un antígeno bacteriano soluble? b) ¿Cómo procedería para cuantificar un antígeno bacteriano soluble utilizando una técnica inmunológica? 2) Un paciente con Salmonellosis concurre a un laboratorio A y le informan que el título de anticuerpos en el suero es de 64 usando la técnica de aglutinación con una suspensión de Salmonella typhi como Ag. Asustado el paciente concurre a otro laboratorio B ese mismo día donde le informan que el título es 256 usando también Salmonella typhi como Ag. para la reacción de aglutinación. El paciente está desconcertado. ¿Qué explicación le daría a Ud. a este paciente? 3) A partir de un suero humano se desea purificar la albúmina. Dicho suero es sometido a tres pasos de purificación sucesivos. ¿Cómo determinaría la concentración de albúmina después de cada paso de purificación? Nota: Ud. dispone de: antisuero anti humano total, antisuero monoespecífico anti albúmina humana, albúmina humana purificada de origen comercial de concentración conocida, agar, solución fisiológica, material de vidrio y micropipetas. 4) Se inmuniza un conejo con una suspención de Salmonella typhi. a) ¿Cómo estudiaría la cinética de aparición de anticuerpos séricos anti-flagelos a fin de determinar el momento en que se obtiene el pico máximo de la respuesta inmune? b) ¿Qué indicaría la obtención de 6 bandas de precipitación en una inmunodifusión unidimensional doble cuando se enfrenta un lisado de S. typhi. con el suero inmune obtenido? c) ¿Qué técnica emplearía para saber si S. typhi. comparte determinantes antigénicos con S.newport? Describa brevemente la técnica elegida usando como control suero normal. d) ¿Cómo determinaría la concentración del antígeno flagelar presente en varios lisados de S. typhi. obtenidos por distintos métodos? Describa brevemente la técnica que emplearía. 5) Qué metodología emplearía para: a) Detectar anticuerpos anti una proteína soluble de pneumococos en el suero de un cobayo inmunizado con dicha bacteria. Enumere y dé el fundamento de las técnicas que conoce para dicho fin. b) Determinar la concentración de IgE humana en muestras obtenidas de pacientes alérgicos.

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Dé el fundamento del método elegido y esquematice el protocolo de trabajo. 7) Se inyectan 2 conejos con Salmonella newport siguiendo distintos esquemas de inmunización. Luego de la última inoculación se sangran los animales y se obtienen los sueros. Cómo determinaría cuál de los dos animales alcanzo el título más elevado de anticuerpos anti Salmonella newport? Describa brevemente la técnica empleada y cómo expresaría los resultados. 8) En el estante de una congeladora del laboratorio de Microbiología se encontraron 2 tubos rotulados de la siguiente manera: Suero anti Salmonella N° 1 y Suero anti Salmonella N° 2. a) Sabiendo que allí se trabaja con 2 especies de dicha bacteria : Salmonella schottmulleri y Salmonella typhi, ¿ Podría Ud. determinar que especie de Salmonella se empleó para obtener cada antisuero ?. ¿ Qué técnica emplearía ?. Expliquela brevemente. Describa los resultados que le permitirían identificar ambos antisueros. Nota: Las bacterias presentan los siguientes antígenos Salmonella schottmulleri: Antígeno O (determinantes antigénicos 1, 4, 5 y 12). Salmonella typhi: Antígeno O ( determinantes antigénicos 9 y 12) y Antígeno Vi. b) ¿ Cómo determinaría cual de los 2 antisueros tiene mayor título aglutinante ?. ¿ Qué técnica emplearía ?. Explique brevemente. c) Si los antisueros fueron hechos en conejo, ¿ Cómo determinaría la concentración de IgG en cada suero ?. Explique la técnica.

PROBLEMAS TIPO PARCIAL PROBLEMA 1 Se desea estudiar la efectividad de un método de irradiación para esterilizar arroz. Para ello se dispone de tres muestras de arroz esterilizadas en autoclave (5 g/ 8,5 ml), de 10 ml de un cultivo de E. coli con un recuento de 50 UFC cuando se plaquean 0,1 ml de la dilución 10-6 y de 5 ml de una suspensión de esporas de B. cereus de 4x107 esporas/ml. Cada una de las muestras de arroz esterilizadas se inoculó con 1 ml del cultivo de E. coli y con 0,5 ml de la suspensión de esporas y se sometió a una dosis diferente de radiación. Al cabo de los respectivos tratamientos se cuantificó en cada muestra el número de UFC totales de E. coli y de B. cereus sobrevivientes obteniéndose los siguientes resultados: Tratamiento E. coli B. cereus ND= no detectable.

1 2,5x104 2,5x104

2 ND 2x102

3 ND ND

a) Discuta sobre la efectividad de cada uno de los tratamientos como método de esterilización.

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b) ¿Cuál es la carga bacteriana total con que se inoculó cada muestra antes de someterlas a la radiación?. c) Describa el protocolo para hacer los recuentos de los sobrevivientes justificando los pasos que realizaría. Indique volúmenes, diluciones, medios de cultivo empleados con la función de sus constituyentes. d) Ud. dispone de una cuarta muestra de arroz esterilizada en el autoclave simultáneamente con las otras tres muestras. ¿Qué tipo de control le realizaría previamente a dicha muestra para garantizar que los sobrevivientes de las otras muestras provienen de la inoculación artificial? PROBLEMA 2 Se sembraron en agar Mossel sin polimixina B los siguientes microorganismos: Cepas patrón de ensayo Bacillus cereus Bacillus cereus variedad mycoides Bacillus subtilis Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Staphylococcus aureus

Color del medio rosadas rosadas amarillas rosadas rosadas rosadas amarillas

Precipitado + + +

a) ¿Cuál es la fuente de carbono que permite el crecimiento de cada uno de los microorganismos en este medio? ¿Cuál es la relación con el color de las mismas? b) ¿Qué paso realizado en el aislamiento del TP para Bacillus disminuye la aparición de la flora acompañante en este medio sin polimixina? PROBLEMA 3 A partir de una muestra de agua del lago de Palermo se preparó una dilución 10-2 y se sembró por rastrillado 0,1 ml de dicha dilución en tres placas con los siguientes medios: Agar nutritivo

Agar Mac Conkey

62 colonias

38 colonias

Agar Cetrimida

5 colonias

a) Indique cómo esterilizaría dichos medios. Explicar a qué se deben las diferencias observadas en el nº de colonias que aparecen en cada medio considerando que se inoculó la misma cantidad de muestra en cada uno. b) Describa todos los tipos de morfología de colonias que podrían encontrarse en la placa con agar Mac Conkey explicando a qué se deben las diferencias. c) Describa un protocolo para cuantificar el número de esporas presentes en 10 ml de la muestra de agua.