HCG-ELISA KAPD1469

DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium

: 110225/1

HCG ELISA KAPD1469 USO DIAGNÓSTIVO IN VITRO DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2 B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium -Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90 1

INTRODUCCION

1.1 Uso Previsto DIAsource HCG ELISA es un inmunoensayo enzimático para la medición cuantitativa in vitro de la hormona Gonadotropina Coriónica Humana (hCG) en suero. 1.2 Resumen y Explicación La Gonadotropina Coriónica (hCG) es una hormona glicoprotéica la cual es producida normalmente por la placenta durante el embarazo. Después de la concepción, la concentrac ión de hCG aumenta r ápidamente y alcanza su pico máx imo al final del primer tr imestre. Se obs ervan Altas concentrac iones a lo lar go del embar azo. Des pués del parto, los niveles de hCG dis minuyen r ápidamente y se vuelve indetectable a los pocos días . Estructuralmente la molécula de la hCG intacta se compone de una subunidad Alf a y una subunidad Beta con un peso molecular de 38.4 kDa. La subunidad Alf a es casi idéntica a la subunidad Alfa de otras hormonas glicoprotéicas, tales como la Hormona Estimulante de la Tiroides (TSH), la Hormona Luteinizante (LH); y la Hormona Folículo estimulante (FSH); se dif erencia de la subunidad Beta de las mencionadas hormonas en su especif icidad biológica y dif erencias inmunoquimicas. Los antic uerpos monoclonales de la prueba, reconocen la cadena Beta de la molécula hCG que es exclusiva frente a la de las otras hormonas (TSH, FSH, LH). La determinación de hCG es usada para la detección temprana del embarazo. 1.

Además de encontrar niveles elevados de hCG durante el embarazo, se observan concentraciones elevadas asociadas en casos de neoplasias de origen trofoblástico y no-trofoblástic o tales como la mola hidatiforme, carcinoma de células corionepiteliales embrional, entre otras. La hCG se eleva normalmente en los diferentes tumores testic ulares y es usado como marcador tumoral para la detección de tumores testic ulares junto con la AFP. Esta y los niveles de hCG ayudan a ver la respuesta al tratamiento. En el cáncer de células germinales extragonadales con ausencia de anormalidades clínicas o ultrasonografías se observa bien. Cerca del 50% de los pacientes con insulinomas malignos, tienen elevados niveles de hCG: la hormona no se detecta en asociación con adenomas benignos. La secreción ectópica de hCG también la encontramos en un pequeño porcentaje de pacientes con adenocarcinomas de ovario, páncreas y estomago, hepatomas y carcinoma de células islóticas.

2. 3.

2 PRINCIPIO DE LA PRUEBA El Kit DIAsource HCG ELISA es un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas en fase sólida (ELISA) basada en el principio de sandwich. Los pozos de microtitulación son recubiertos con anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos a un único antígeno de la molécula de hCG. Una alícuota de la muestra del paciente contiene hCG endógeno el cual se incuba en los pozos que contienen la enzima conjugada, tales anticuerpos monoclonales se unen con las cadenas Alfa de la hCG conjugada con peroxidasa de rábano picante. Pasado el tiempo de incubación, el conjugado que no se ha unido es removido en el lavado. La cantidad de peroxidasa conjugada es proporcional a la concentración de hCG que se encuentra en la muestra. Agregando un substrato, la intensidad del color generado es proporcional a la cantidad de hCG en la muestra del paciente.

3

ADVERT ENCIAS Y PRECAUCIONES Este kit es únicamente para uso in vitro. Para uso exclusivo por profesionales. Todos los reactivos que contiene el kit contienen suero o plasma humano que ha sido examinado y confirmado negativo para HIV I/II, HBsAg y HCV por procedimientos aprobados por la FDA. Todos los reactiv os sin embargo deben ser tratados como riesgo biológico potencial. 3. Antes de iniciar el ensayo, lea completamente y con precaución las instrucciones. Lea la versión válida del inserto incluido en el kit. Asegúrese de que todo es comprendido. 4. La microplaca contiene tiras de pozos rompibles. Los pozos que no han sido usados pueden ser almacenados de 2°C a 8°C en su empaque sellado y usados cuando se requiera. 5. Las muestras y los reactiv os deben ser pipeteados lo más rápido posible en la mis ma secuencia de cada paso. 6. Use recipientes independientes para cada reactivo. Esto aplica especialmente a los contenedores de sustrato. Use un contenedor para dis pensar la solución de substrato que haya sido usado previamente dado que la solución de conjugado puede volverse de color. No mezcle los reactivos dentro de los viales para evitar la ocurrencia de contaminación del reactivo. 7. Mezcle el contenido del fondo de la microplaca para obtener buenos resultados. No reutilice los pozos. 8. No permita que se sequen los pozos durante el ensayo, agregue los reactivos inmediatamente después de completar los pasos de lavado. 9. Permita que los reactivos alc ancen una temperatura de 21°C a 26°C antes de iniciar la prueba. La temperatura puede afectar las lecturas de absorbancia durante el ensayo. Sin embargo los valores de las muestras de los pacientes no se ven afectadas. 10. Nunca pipetee con la boca y evite el contacto de las muestras y los reactiv os con la piel y las membranas mucosas. 11. No fumar, ni comer o beber, o aplicar cosméticos en las áreas donde se encuentran las muestras y reactivos. 12. Use guantes desechables de látex cuando maneje muestras o reactiv os. La contaminación microbiana de los reactivos o las muestras pueden generar resultados falsos. 13. Trabajar de acuerdo a los procedimientos definidos regulados en la Guía de Bioseguridad Nacional. 14. No use reactiv os si ya ha pasado la fecha de expiración que aparece en el kit. 15. Todos los volúmenes indicados deben seguirse de acuerdo al protocolo. Se obtienen resultados óptimos usando pipetas y lectores de microplacas que estén calibrados. 1. 2.

16. No mezcle o use los componentes de kits con diferentes números de lote. Se recomienda no intercambiar los pozos de diferentes microplacas, incluso cuando sean del mis mo lote. Los kits pueden ser transportados o almacenados bajo diferentes condiciones y las características de los pozos pueden cambiar ligeramente. 17. Evite el contacto con la Solución de parada, la cual contiene H23SO4 al 0.5 M. Esta puede provocar irritación o quemaduras en la piel. 18. Algunos reactivos contienen Proclin 300, BND y/o MIT como preservantes. En caso de que haya contacto con los ojos o la piel, lave inmediatamente con agua. 19. El substrato TMB tiene un efecto irritante en la piel y mucosas. En caso de contacto, lave los ojos con abundante agua y en la piel agregue jabón y abundante agua. Lave los objetos contaminados después de usarlos. Si es inhalado permita a la persona un espacio abierto con aire. 20. Los productos químicos y preparaciones o reactivos usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo a la Guía de Bioseguridad nacional. 21. Para mayor información sobre las sustancias peligrosas incluidas en este kit por favor referirse a las Hojas de datos de seguridad del mater ial. Las hojas de datos de seguridad del material de este producto se encuentran disponibles y se pueden solicitar directamente a DIAsourse.

4 REAGENTS REACTIVOS 4.1

Reactivos Suministrados Microplaca, tiras de 12 x 8 (separados), 96 pozos.

1.

Los pozos están recubiertos con anticuerpos monoclonales anti B-HCG 2.

CAL

N

3.

DIL

SPE

4.

Ab

HRP

5.

CHROM

TMB

6.

STOP

SOLN

HCG Calibradores. N= 1 a 5, 5 viales (liofilizados), 1 mL Concentraciones : 5; 50; 200; 500; 1000 mlU/mL Conversión: 1 pg/mL = 0.00916 mlU/mL Las concentraciones de los calibradores del DIAsource HCG Kit Calibradores están relacionadas con el Material de Referencia Internacional de Gonadotropina Coriónica. Reactivo de referencia 2001 (NIBSC Código numero 99/688). Ver “Preparación de Reactiv os” Contiene 0.03% Proclin 300, 0.015% BND y 0.010% MIT como preservantes. Diluyente de muestra, 1vial, 10 mL, listo para el uso El diluyente de muestra también es usado como punto de calibración: 0 mIU/mL Contienen 0.03 % Proclin 300, 0.015 % BND and 0.010 % MIT como preservantes. Conjugado enzim ático, 1vial, 11 mL. Listo para el uso Anticuerpo monoclonal contra la subunidad alf a conjugada con peroxidasa de rábano picante. Contiene 0.03 % Proclin 300, 0.015 % BND y 0.010 % MIT como preservativ os.

Solución de Sustrato, 1 vial, 14 mL. Listo para uso. Tetrametilbenzidina (TMB) Solución de parada, 1 vial, 14 mL. Listo para uso. Contiene 0.5 M H2SO4. Evitar el contacto con la solución de parada. Puede causar irritación de piel y quemaduras

BND = 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane MIT = 2-metil-2H-isotiazol-3-one Note: Diluyente de muestra para dilución de estas es disponible bajo demanda. 4.2

4.3

Material requerido pero no provisto Lector de absorbancia para ELISA (450 ±10 nm) Micropipetas de precisión variables calibradas Destilador de agua desionizada Cronometro Papel semi logar ítmico o softw are para reducción de datos. Condiciones de Almacenamiento

Cu an do los re act iv os no a bi ertos s e al m ac en an a 2 °C - 8 °C es tos s on v iab les has ta la f ec ha de ex pir ac ión. NO us ar los r eac tiv os des pués de es ta f ec ha. Los r eac tiv os abier tos deben s er almac ena dos a 2 °C - 8 °C. Los poz os de mic r opoz os deben s er almac enados a 2 °C - 8 °C. Una v ez de bols a de alu minio ha s ido abier to, tenga la pr ec auc ión de c err ar la de nuev o.

Catalogo No: KAP D1469

P .I. Numero: 1701234/en

Revisión No. : 110225/1

4.4 Preparación de los reactivos Llevar todos los reactivos y el número requerido de tiras a temperatura ambiente previo a su uso.

Ca libra dores Reconstituir los contenidos liofilizados del vial de calibrador con 1.0 mL Agua destilada. Nota: Los calibradores reconstituidos son estables durante 2 meses a 2 °C - 8 °C. Para almacenamiento durante periodos de tiempo más largos se debe congelar a -20°C.

4.5

Elim inación del kit

La eliminac ión del kit debe realizarse de acuerdo con las regulaciones nacionales. La infor mación especial para estos productos esta dada en las Hojas de Segur idad. 4.6 Kits de prueba dañados En caso de cualquier daño severo del kit o sus componentes. DIAsource debe ser informado de manera escrita, por lo menos una semana después de recibido el kit. Diversos componentes sencillos dañados no pueden ser usados para realizar corridas. Estos deben ser almacenados hasta que se encuentre una solución final. Luego de estos, estos deben ser eliminados de acuerdo a las regulaciones oficiales. 5 RECOLECCIÓN DE MUEST RA Y PREPARACIÓN Puede ser usado muestras de suero para este ensayo. No usar muestras hemolizadas, ictéricas o lipémicas Nota: muestras contienen ázida de sodio no se deben usar en el ensayo. 5.1 Recolección de muestra Suero: Recolectar sangre por medio de venopunción (e.g. Sarstedt Monovette # 02.1388.001), permitir la formación de coagulo, y separar el suero por centrifugación a temperatura ambiente. No centrifugar antes de la formación completa del coagulo. Los pacientes que reciben terapia anticoagulante pueden llegar a requerir mayor tiempo para la formación de coagulo. 5.2 Almacenamiento y preparación de muestra Las m uestras deben ser tapadas y alm acenadas por hasta por 5 días a 2 °C - 8 °C previo a su ensayo. Las muestras que tengan periodos de tiempo mas largos deben ser congelados una vez a -20°C previo a su ensayo. Las muestras congeladas deben ser invertidas varias veces previo a su medición.

5.3 Dilución de muestra Si inicialmente un ensayo, una muestra se encuentra con una concentración mayor a la reportada para el calibrador más alto, la muestra debe ser diluida con Diluyente de Muestra y reprocesados como se describe en el Procedimiento del Ensayo. Para el cálc ulo de las concentraciones este factor de dilución ha sido tomando en cuenta así: Ejemplo: a) b)

Dilución 1.10 10 µL de Suero + 90 µL Diluyente de Muestra (mezclar fuertemente). Dilución 1:100: 10 µL dilución a) 1:10 + 90 µL Diluyente de Muestra (mezclar fuertemente).

NOTA: Suero de mujer embarazada debe ser diluido 1/100 con Diluyente de Muestra antes de iniciar el ensayo. 6 6.1

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Consideraciones generales Todos los reactivos y muestras deben llevarse a temperatura ambiente antes de su uso. Todos los reactivos deben mezclarse sin formar espuma. Una vez la prueba haya sido iniciadas, todos los pasos deben ser completados sin interrupción. Usar puntas de pipetas desechables para cada calibrador, control o muestra con el fin de evitar contaminación por reacción cruzada. La absorbancia es una función de tiempo de incubación y temperatura. Antes de iniciar el ensayo, esta recomendados que todos los reactivos estén listos con la tapas removidas, todos los pozos necesarios en soporte, etc. Esto garantizara lapsos de tiempo iguales para cada paso de pipeteo sin interrupción. Como regla general la reacción enzimática es linealmente proporcional al tiempo y la temperatura.

6.2 Procedim iento de la prueba Cada corrida de incluir una curva de calibración NOTA: Sueros de mujeres embarazadas deben ser diluido 1/100 en Diluyente de Muestra antes de iniciar el ensayo (s. 5.3.)

1.

Asegurar que el numero deseado de pozos de la microplaca estén dentro del soporte

2.

Dispensar 25 µL de cada Calibrador, Control y muestras con puntas desechables nuevas dentro de los pozos apropiados.

3.

Dispensar 100 µL Conjugado Enzimático dentro de cada pozo. Mezclar fuertemente durante 10 segundos. Es importante tener una mezcla completa en este paso.

4.

Incubar durante 30 minutes a temperatura ambiente.

5.

Rápidamente sacudir el contenido de los pozos. Lavar los pozos 5veces con agua destilada (400 µL por pozos). Golpee los pozos firmemente en papel absorbente para remover los residuos. Nota importante: La sensibilidad y precisión de este ensayo esta influenciado marcadamente por el desempeño correcto del procedimiento de lavado! Adic ionar 100 µL de Solución de Sustrato dentro de cada pozo.

6. 7.

Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

8.

Detener la reacción enzimática adicionando 50 µL de Solución de Parada dentro de cada pozo..

9.

Determinar la absorbancia (OD) de cada pozo a 450 ± 10 nm con un lector de microplaca. Se recomienda que los pozos sean leídos dentro de 10 minutos después de adicionar la Solución de Parada .

6.3 Procedim iento de la prueba(Método cualitativo) Este ´procedimiento diferencia las muestras positivas (embarazo) de las negativas por comparac ión de los niveles de hCG con el Diluyente de Muestra y Calibrador 2 (50 mIU/mL). Las muestras de pacientes deben procesarse en paralelo con el Diluyente de muestra (0 mIU/mL) y 50 mIU/mL del Calibrador 2. El procedimiento del ensayo es idéntico al Método Cuantitativo pero el paso 8 y 9 son omitidos. 6.4 Calculo de los resultados (Cuantitativo) 1. Calcular el promedio de los valores de absorbancia de cada juego de calibradores, controles y muestras de pacientes. 2. Usar un papel semilogarítmico para la grafica, construir una curva de calibración grafic ando las medias de absorbancia obtenidas de cada calibrador contra su concentración con el valor de absorbancia en el eje vertical (Y) y la concentración en el eje (X). 3. Usando el valor de la absorbancia media de cada muestra se determina la concentración de la curva de calibración Método automatizado: El resultados en el Inserto han sido calculados automáticamente usando una construcción de curva 4 PL (4 Parámetros Logísticos) 4.Los parámetros Logístic os es el método preferido. Otros datos de funciones de reducción puede dar resultados ligeramente diferentes. 5.La concentración de las muestras puede ser leídas directamente desde la curva de calibración. Las muestras con concentraciones mayor a las de calibrador mas alto han sido diluidas o reportadas como > 1000 mIU/mL. Para el calculo de las concentraciones este factor de dilución se ha tenido en cuenta. 6.4.1

Ejemplo de una Curva de Calibración Típica

La siguiente informac ión es para demostración únicamente, y no puede ser utilizada en lugar de la generación de datos en tiempo real con el ensayo. Ca libra dor Calibrador 1 (5 mIU/mL ) Calibrador 2 (50 mIU/mL) Calibrador 3 (200 mIU/mL) Calibrador 4 (500 mIU/mL) Calibrador 5 (1000 mIU/mL)

6.5

Unidades ópticas (45 0 nm) 0.05 0.14 0.43 0.94 1.54

Resultados Cualitativos

Para el análisis cualitativo del niv el de hCG el desarrollo de color de la muestra es comparado con el color del Diluyente de Muestra (0 mIU/mL) and Calibrador 2 (50 mIU/mL). Si el color azul es menos intenso que el color del Calibrador de 50 mIU/mL, la muestra es considerada como negativa. Si el color azul es mas intenso o igual al color del Calibrador de 50 mIU/mL, la muestra es considerada como positiva. 7 VALORES NORMALES ESPERADOS Está ampliamente recomendada que cada laboratorio debe determinar sus propios valores normales y anormales. Los resultados solo no deben ser la únic a razón de las consecuencias terapéutic as. El resultado debe ser correlacionado con otras observaciones clínicas y pruebas diagnostic as.

7.1

Adultos normales sanos, no embarazados

Un estudio conducido con adultos aparentemente normales, usando el kit DIAsource HCG ELISA se encontraron los siguientes valores como se observa: E da d Población Valido N hCG [mIU/mL] (añ os) Hom bre

Mujer

7.2

< 50 > 50

40 10