II.2.2. Difracción de rayos X (RX). Cristalografía II.2.2.1. Introducción. II.2.2.2. Dispersión de RX por un electrón. II.2.2.3. Dispersión de RX por un átomo. II.2.2.4. Dispersión de RX por un cristal monodimensional. II.2.2.5. Dispersión de RX por un cristal bidimensional. II.2.2.6. Dispersión de RX por un cristal tridimensional. II.2.2.7. Ley de Bragg. II.2.2.8. El problema de la fase. II.2.2.9. Métodos para obtener difractográmas de RX Método de Laue Método de Weissenberg Método de precesión Método de oscilación II.2.2.10. Etapas para determinar la estructura de una macromolécula.

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II.2.2. Difracción de rayos X (RX). Cristalografía II.2.2.1. Introducción

”Si una imagen vale más que 1000 palabras la estructura macromolecular no tiene precio para un bioquímico-físico”. La difracción de RX es la técnica más poderosa actualmente disponible para estudiar la estructura de grandes moléculas. En muchos casos los estudios de difracción de RX sobre cristales de proteínas o ácidos nucleicos han resuelto completamente sus estructuras terciarias a un nivel de resolución de 2 Å o mejor. Como es de esperar una técnica que puede proporcionar tantos detalles estructurales debe ser intrínsecamente bastante compleja. Vamos a omitir cuantos aspectos complicados sea posible y tratar de enfocar nuestra atención sobre los hechos esenciales del método. Así los átomos serán tratados como estáticos, es decir sin movimiento, aunque en los cristales haya un movimiento apreciable a temperaturas finitas. Los cristales son tratados como ordenamientos perfectos, incluso sabiendo que el orden sólo alcanza dominios locales; la radiación X es tratada como monocromática, aunque en la práctica se use una distribución de longitudes de onda; finalmente consideraremos que los datos de difracción son muy precisos, aunque los errores experimentales a menudo son problemas importantes en la práctica. Para comprender la difracción de RX se debe conocer cómo es la interacción entre esta radiación electromagnética y los átomos, así como la manera en que los átomos están organizadas en los cristales. La mayoría de las descripciones y tradicionales de esta técnica comienza con el estudio de la simetría y estructura de los cristales y se describe la difracción de RX en términos de reflexiones sobre planos del cristal. No obstante nosotros vamos a usar un enfoque diferente. Explicaremos la infracción la dispersión de RX producida por un simple átomo; entonces creciendo en complejidad describiremos la dispersión que produce un hipotético cristal monodimensional, continuando con un cristal bidimensional y finalmente con el ordenamiento tridimensional propio de los cristales reales. Aunque este tratamiento requiere mayor soporte físico-matemático nos permite profundizar y comprender mejor esta compleja técnica experimental.

132

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II.2.2.2. Dispersión de RX por un electrón. La interacción entre los RX y la materia consiste en la dispersión que los electrones de los átomos producen sobre esta radiación. Los RX dispersados por los electrones de los átomos de una muestra cristalina sufren fenómenos de interferencias dando lugar a procesos de difracción y la información estructural subyace en los patrones de difracción. Comenzamos por considerar un electrón en el origen de coordenadas, sobre el cual incide la radiación que proviene de una fuente de RX en la dirección del eje x, y un detector en una dirección de observación que forma un ángulo con el eje x al que por conveniencia consideremos 2θ (θ será el ángulo mitad del considerado), figura II.2.2.1.A. A las direcciones de incidencia y de observación le corresponden los vectores unitarios sˆ0 y sˆ . La dispersión, como ya sabemos, es una función del ángulo de observación, pero también depende de la posición relativa del centro porque la fase depende del camino óptico. Así, si suponemos que el electrón está en una posición diferente a la del origen de r coordenadas, dada por el vector de posición r , figura II.2.2.1.B. Si la fuente y el detector están suficientemente alejados del electrón, el ángulo de observación es prácticamente el mismo para las diferentes posiciones que podamos considerar en la proximidad del origen de coordenadas. La única diferencia entre la dispersión producida en el origen y otra posición es la diferencia de camino óptico. En la figura II.2.2.1.C se indica como esta diferencia es debida a los segmentos no comunes a las dos posiciones consideradas que corresponden a los r r r r productos escalares r ⋅ s0 y r ⋅ s0 , respectivamente. La diferencia de camino óptico será r entonces (sˆ − sˆ0 ). r . Es conveniente, matemáticamente y conceptualmente, introducir un vector de dispersión, figura II.2.2.2 definido por la diferencia:

r sˆ sˆ s= − 0

λ

λ

[II.2.2.1]

La longitud de este vector (su módulo) se deduce a partir del producto escalar del vector por si mismo: 2 r r sˆ 2 + sˆ0 − 2 sˆ ⋅ sˆ0 2(1 − cos 2θ ) 4 sen 2θ s ⋅s = = = 2 2 2

λ

r 2 senθ s =

λ

133

λ

λ

[II.2.2.2]

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Detector

A

Y

F U E N T E

sˆ

2θ

x

sˆ0

Detector

Y

B

sˆ

sˆ0

F U E N T E

2θ

r r x Detector

C Y F U E N T E

sˆ0 sˆ0

r r ⋅ sˆ0 sˆ

r r

sˆ

r r ⋅ sˆ

x

Figura II.2.2.1. A: Dispersión elástica de rayos por un electrón en el origen de coordenadas. B: Dispersión elástica de rayos por un electrón en la posición determinada r por el vector de posición r . C: Diferencia de caminos opticos entre la dispersión desde el r origen y la posición determinada por el vector de posición r .

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Y

sˆ

r s

−

λ

sˆ0

λ

sˆ0

X

r s

r s

1λ r s

sˆ

r r r s s s (0,0)

sˆ0

r s r r s s

r

Figura II.2.2.2. Izquierda: Definición del vector dispersión, s . Derecha: Para la dirección de incidencia de los RX fija en el eje x, los posibles vectores de dispersión según la dirección de observación, describen una esfera a la que llamaremos de esfera de reflexión o esfera de Ewald. Este vector de dispersión es función del ángulo observación y tiene dimensiones de longitud inversa; su valor nos da el número de ciclos de radiación por unidad de longitud. Para fijar este vector en el espacio necesitamos unas coordenadas en las que los ejes tengan dimensiones de longitud inversa, es decir un espacio reciproco. Posteriormente relacionaremos este vector con los parámetros que definen las redes cristalinas. Volviendo al caso planteado anteriormente y representado en la figura II.2.2.1.B la diferencia de camino óptico puede expresarse como:

(sˆ − sˆ0 ). rr = sr ⋅ rr

[II.2.2.3]

λ

r Si llamamos E (s ) a la intensidad de campo eléctrico de la radiación dispersada por el electrón en el origen de coordenadas y en el espacio reciproco, el campo de la radiación

dispersada por el electrón en el punto determinado por el vector de posición Apendice I: Repaso de las matemáticas de las ondas periódicas):

r r

será (ver

r 2π i sr ⋅rr E ( s )e r

Introducimos ahora la idea de factor de estructura, F (s ) , como la razón entre la radiación dispersada por cualquier muestra real y la dispersada por un simple electrón en el origen de coordenadas. Así para el caso del electrón en el punto determinado por el vector de posición factor de estructura será: rr r rr r E ( s )e 2π i s ⋅r F (s ) = = e 2π i s ⋅r r E (s )

r r el

[II.2.2.4]

Los electrones no son cargas puntuales localizadas en un determinado punto del r espacio, es mas adecuado tratarlos como una densidad electrónica continua ρ (r ) . En 135

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cualquier punto del espacio en el que consideremos un elemento de volumen dV = dx ⋅ dy ⋅ dz solo tendremos una fracción del electrón reescribirse como:

r

ρ (r )dV por lo que el factor de estructura podrá

rr r r F ( s ) = ρ (r ) e 2π i s ⋅r dV

[II.2.2.5]

Para una muestra con muchos centros dispersantes discretos el factor de estructura será la suma de muchos términos como el de la ecuación II.2.2.5. Para una distribución continua de electrones, la suma se convierte en la integral extendida a toda la muestra:

r r 2π i sr⋅rr F ( s ) = ∫ ρ (r ) e dV

[II.2.2.6]

Esta es la ecuación básica que gobierna la dispersión y la consecuente difracción de los RX. Si la distribución de la densidad electrónica se conoce es posible calcular el factor de estructura, y a partir de éste calcular la dispersión para cualquier forma de la densidad electrónica. La forma matemática de la ecuación II.2.2.6 corresponde a una transformación integral r de Fourier; podemos entonces decir que el factor de estructura, F (s ) , es la transformada de Fourier de la densidad electrónica de la muestra. Una consecuencia inmediata es que la densidad electrónica es la transformada inversa de Fourier del factor de estructura:

r

rr

r

ρ (r ) = ∫ e −2π i s ⋅r F ( s )ds

[II.2.2.7]

La utilidad de esta ecuación radica, como se indica en la figura II.2.2.3, en que establece la conexión entre los datos experimentales y la estructura de las moléculas de la muestra, a través de la densidad electrónica. La conexión es la transformada rápida de Fourier, FFT (“Fast Fourier Transform”), un algoritmo que nos permite pasar, en este caso particular, del dominio del espacio reciproco (el difractograma) al dominio de la distribución espacial de la densidad electrónica. Finalmente se optimizan las coordenadas de todos los átomos para el mejor ajuste a la densidad electrónica. No obstante, el proceso aparentemente sencillo está complicado por el llamado “problema de la fase”. El factor de estructura es un número complejo y como consecuencia para especificarlo es preciso una parte real y una parte compleja, o bien, según la representación vectorial de un número complejo, se precisa un módulo y un ángulo de fase, figura II.2.2.4. El módulo se obtiene experimentalmente de la intensidad de la radiación dispersada, que está dada por el cuadrado del factor de estructura:

r r r 2 I (s ) = F (s ) ⋅ F * (s ) = F

[II.2.2.8]

sin embargo la fase queda indeterminada y sin conocer su valor no es posible usar las ecuaciones II.2.2.6 o II.2.2.7. Esto ha conducido al desarrollo de métodos para determinar la fase que estudiaremos posteriormente.

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Cristales de proteína.

Difractometro de Rayos X

El difractograma

Transformada rápida de Fourier Factor de estructura

r F (s )

FFT

Espacio reciproco

Optimización algoritmica de la estructura molecular

Mapa de densidad electrónica de una hélice α

Modelo molecular

Figura II.2.2.3. Ilustración del método de determinación de la estructura tridimensional de biopolímeros por difracción de rayos X.

Eje imaginario

r F = F e iφ

r F = Fr + iFi

F

φ = arctag

Fase, φ Eje real

F cos φ

Figura II.2.2.4. Representación vectorial del factor de estructura.

137

Fi Fr

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II.2.2.3. Dispersión de RX por un átomo.

El siguiente paso en la descripción del fenómeno de difracción de RX es considerar la dispersión de esta radiación por un átomo. Como en el caso del electrón consideraremos en primer lugar al átomo en el origen de coordenadas, y en segundo lugar en un punto fuera del origen. La resolución en los experimentos de difracción de RX no es lo suficientemente elevada para poder distinguir la forma detallada de la distribución de electrones en el átomo, en diferentes orbitales atómicos y moleculares. Así es una aproximación aceptable considerar que los electrones de un átomo forman una distribución esférica alrededor del núcleo. Una consecuencia inmediata de esta aproximación es, como se ilustra en la figura II.2.2.5., que la densidad electrónica por simetría es independiente de la dirección considerada, y solo es función de la distancia al núcleo.

Figura II.2.2.5. Distribución esférica de la densidad electrónica. Por razón de simetría la función de distribución espacial dependiente del vector de posición del punto r considerado (izquierda), ρ (r ) , se reduce a una función en el plano del módulo del vector de posición, es decir, de la distancia al origen de coordenadas, ρ (r ) . r El factor de estructura, función del vector de dispersión, s , por la razones de simetría que acabamos de considerar, se convierte en una función del módulo del vector de r r dispersión, s = S , pasando a llamarse factor de dispersión atómica: F ( s ) → f ( S ) .

Utilizando las coordenadas polares indicadas en la figura II.2.2.6 se deduce, a partir de la ecuación II.2.2.6, la siguiente expresión de f (S ) : ∞ ⎛ sen 2π S r ⎞ ⎟⎟ dr f ( S ) = 4π ∫ ρ (r )r 2 ⎜⎜ 0 ⎝ 2π S r ⎠

138

[II.2.2.9]

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θ

r s

Figura II.2.2.6. Coordenadas polares para deducir la ecuación II.2.2.9.

φ

Para átomos reales la densidad electrónica puede considerarse aproximadamente como , donde z es el una distribución Gausiana de la distancia al núcleo: ρ ( r ) = zPe número de electrones, P es una constante de normalización y k está relacionada con la anchura de la Gausiana. Con esta densidad electrónica podemos integrar la ecuación II.2.2.9 para, teniendo en cuenta la ecuación II.2.2.2, obtener: − kr 2

f ( S ) = ze −π

2

⋅S 2 k

= ze − 4π

2

( senθ λ )2

[II.2.2.10]

Esta ecuación nos muestra que el máximo de la intensidad de la radiación dispersada, I ( S ) = f ( S ) 2 , corresponde a un ángulo entre dirección de incidencia y observación es nulo, es decir, dispersión en la misma dirección de incidencia. Y que el factor de dispersión cae rápidamente al aumentar el ángulo. En la figura II.2.2.7 se representa la I (S ) en función de senθ para un átomo de Helio en el origen, con una longitud de onda de 1’2 Å.

λ

Figura II.2.2.7. Factor de dispersión atómica para un átomo de He y una longitud de onda de los RX de 1’2 Å, según la ecuación II.2.2.10.

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Consideremos ahora al átomo fuera de origen de coordenadas, como se representa en la figura II.2.2.8. De forma análoga al caso de un simple electrón puede demostrarse que: r r r F ( s ) = f ( S ) e 2π i s ⋅rn

[II.2.2.11]

r r

donde es el vector de posición del átomo y el producto escalar s ⋅ rn en el exponente representa la diferencia de camino óptico entre la dispersión desde el origen y la dispersión desde la posición indicada por

r rn .

Figura II.2.2.8. Átomo, representado por una distribución esférica de la densidad electrónica, fuera del origen. Para un juego de N átomos, cada uno localizado en una posición dispersión atomica f n (S ) , el factor de de estructura total será:

r rn , con factores de

N rr r F ( s ) = ∑ f n ( S ) e 2π i s ⋅rn

[II.2.2.12]

n =1

Si todos los átomos pertenecen a la misma moléculas el factor de estructura dado por r la anterior ecuación será el factor de estructura molecular, Fm (s ) . II.2.2.4. Dispersión de RX por un cristal monodimensional.

Un hipotético cristal monodimensional consiste en una fila de 2N +1 átomos idénticos. La posición de cada átomo en el cristal se obtiene desde el átomo vecino por la traslación r determinada por un vector a , cuyo módulo corresponde al espaciado del cristal:

r a -5a

-4a

-3a

-2a

a

-a

2a

3a

4a

5a

Figura II.2.2.9. Cristal mono dimensional de espaciado a.

140

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r

Así la posición del enésimo átomo en el cristal será na y el factor de estructura de este átomo será: r r r 2π i n ⋅ s ⋅ a Fn ( s ) = f ( S ) e

[II.2.2.13]

De esta forma la dispersión de cualquier átomo en el cristal monodimensional puede expresarse en términos del factor de dispersión atómica para un átomo en el origen. El factor de estructura para el cristal completo puede escribirse como: N r r r 2π i ⋅ n ⋅ s ⋅ a FTotal ( s ) = f ( S ) ∑ e

[II.2.2.14]

n=− N

De forma análoga podemos tratar cualquier cristal monodimensional de moléculas generado por simple traslación (sin rotación), y la ecuación anterior será válida sustituyendo r el factor de dispersión atómica por el factor de dispersión molecular Fm (s ) .

r

La intensidad de dispersión total, [FTotal (s )] , es entonces el producto de la intensidad

de

2

la dispersión producida por un simple átomo en el origen,

[ f (S )] 2 ,

y el término

2

⎡ N 2π i⋅n⋅ sr⋅ar ⎤ ⎢∑e ⎥ . Éste último es una función periódica que recibe el nombre de “Función ⎣ n=− N ⎦ Franja”.

Veamos algunos ejemplos sencillos para consolidar estas ideas.

Caso de dos átomos en las posiciones n= 0 y n=+1. Figura 2,2,10, panel superior.

(

rr rr r F (s ) = f ( S ) ⋅ e 0 + f ( S ) ⋅ e 2π ⋅i⋅s ⋅a = f ( S ) 1 + e 2π ⋅i⋅s ⋅a

)

La intensidad de dispersión será el cuadrado de este factor de estructura (y recordando que e±i.x = cos x ± i. sen x):

(

)(

)

rr rr r r 2 r r 2 2 I (s ) = [F (s )] = [ f ( S )] 1 + e 2π ⋅i⋅s ⋅a 1 + e −2π ⋅i⋅s ⋅a = 2[ f ( S )] [1 + cos 2π s ⋅ a ]

Caso de tres átomos en las posiciones n=-1, n=0 y n=+1. Figura II.2.2.10, panel central.

(

)

rr rr r r r F (s ) = f ( S ) 1 + e 2π ⋅i⋅s ⋅a + e −2π ⋅i⋅s ⋅a = f ( S )(1 + 2 cos 2π s ⋅ a ) r r r I (s ) = f 2 ( S )(1 + 2 cos 2π s ⋅ a ) 2

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Caso de cuatro átomos en las posiciones n=-1, n=0, n=+1 y n =+2. Figura II.2.2.10, panel inferior.

(

)

rr rr rr r F (s ) = f ( S ) 1 + e 2π ⋅i⋅s ⋅a + e −2π ⋅i⋅s ⋅a + e 4π ⋅i⋅s ⋅a r r r r r r r F (s ) = f ( S )((1 + 2 cos 2π s ⋅ a + cos 4π s ⋅ a ) + i (sen 4π s ⋅ a ))

Parte real

Parte imaginaria

[

r r r r r r r I (s ) = f 2 ( S ) (1 + 2 cos 2π s ⋅ a + cos 4π s ⋅ a ) 2 + sen 2 4π s ⋅ a

]

Caso de cinco átomos en las posiciones n=-2, n=-1, n=0, n=+1 y n=+2 Figura II.2.2.11, panel superior.

r F (s ) = f ( S )(1 + e 2π ⋅i⋅s ⋅a + e −2π ⋅i⋅s ⋅a + e 4π ⋅i⋅s ⋅a + e −4π ⋅i⋅s ⋅a ) = r r r r f ( S )(1 + 2 cos 2π s ⋅ a + 2 cos 4π s ⋅ a ) rr

rr

rr

rr

r r r r r I (s ) = f 2 ( S )(1 + 2 cos 2π s ⋅ a + 2 cos 4π s ⋅ a ) 2 Caso de nueve átomos en las posiciones n=-4, …, n=0, …, n=+4 Figura II.2.2.11, panel inferior.

(

rr rr rr rr rr rr rr rr r F (s ) = f ( S ) 1 + e 2π ⋅i⋅s ⋅a + e −2π ⋅i⋅s ⋅a + e 4π ⋅i⋅s ⋅a + e −4π ⋅i⋅s ⋅a + e 6π ⋅i⋅s ⋅a + e −6π ⋅i⋅s ⋅a + e8π ⋅i⋅s ⋅a + e −8π ⋅i⋅s ⋅a

r r r r r r r r r F (s ) = f ( S )(1 + 2 cos 2π s ⋅ a + 2 cos 4π s ⋅ a + 2 cos 6π s ⋅ a + 2 cos 8π s ⋅ a ) r r r r r r r r r2 I (s ) = f 2 ( S )(1 + 2 cos 2π s ⋅ a + 2 cos 4π s ⋅ a + 2 cos 6π s ⋅ a + 2 cos 8π s ⋅ a ) Como puede observarse en la figura II.2.2.11 con solo nueve átomos la dispersión de r r la radiación en valores no enteros de s ⋅ a es ya muy pequeña. Si consideramos un cristal monodimensional de longitud usual en los cristales reales, el número de átomos sería del r r orden de 106, en cuyo caso la radiación dispersada para valores enteros de s ⋅ a sería muy intensa, mientras que para valores no enteros sería prácticamente nula. El significado físico de este resultado es que solo para ciertas orientaciones de la muestra y de la dirección del detector se observará radiación dispersada. Este resultado se conoce como condición de von Laue, y la expresamos así:

r r s ⋅ a = h;

donde h = 0, ± 1, ± 2, ± 3, ... r

Si fijamos la orientación del cristal, es decir fijamos el vector a , la condición de von Laue para un cristal monodimensional puede representarse por un juego de planos paralelos, r perpendiculares a la dirección del vector a , el plano central en el origen y los restantes en las posiciones ±1/a, ±2/a, ±3/a, …. Estos planos son los lugares geométricos de los extremos de r r los vectores s cuyas proyecciones sobre la dirección del vector a valen ±1/a, ±2/a, ±3/a, … . Ver figura II.2.2.12.

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)

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-4a

-5a

-3a -2a

a

-a

2a

4a

3a

5a

I n t e n s i d a d

r r s ⋅a -4a

-5a

-3a -2a

a

-a

2a

5a

4a

3a

I n t e n s i d a d

r r s ⋅a -5a

-4a

-3a -2a

a

-a

2a

3a

4a

5a

I n t e n s i d a d

r r s ⋅a Figura II.2.2.10. Dispersión de RX por un hipotético cristal monodimensional de dos, tres y cuatro átomos, con las posiciones indicadas en el dibujo. Izquierda: Intensidad resultante, r r r I (s ) , frente al producto s ⋅ a . Derecha: Mapas bidimensionales de la Intensidad dispersada en función de los índices h y k.

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-5a

I n t e n s i d a d

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-4a

-3a

-2a

a

-a

2a

3a

4a

5a

r r s ⋅a

r r s ⋅a r r s ⋅a -5a

-4a

-3a

-2a

-a

a

2a

3a

4a

5a

I n t e n s i d a d

r r s ⋅a

Figura II.2.2.11. Dispersión de RX por un hipotético cristal monodimensional de cinco y nueve átomos, con las posiciones indicadas en el dibujo. Izquierda: Intensidad resultante, r r r I (s ) , frente al producto s ⋅ a . Derecha: Mapas bidimensionales de la Intensidad dispersada en función de los índices h y k. Conforme a lo que hemos descrito anteriormente, para observar dispersión de la r radiación los vectores de dispersión s deben cumplir dos condiciones, por un lado sus extremos deben pertenecer a la la superficie de la esfera de reflexión, figura II.2.2.2, y por otro lado deben pertenecer a los planos de la condición de von Laue. Como consecuencia solo se observará radiación dispersada en las orientaciones del detector (relativas a la dirección de r incidencia de los RX) que correspondan a los vectores s cuyos extremos caigan sobre los círculos que resultan de la intersección de los citados planos y la esfera de reflexión, como se indica en la figura II.2.2.13. 144

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Figura II.2.2.12. Conjunto de planos paralelos representando las condiciones de von Laue para un cristal monodimensional de espaciado a. La parte inferior de la figura es una vista lateral o corte transversal de los planos y algunos vectores de dispersión que cumplen la condición de von Laue.

r

Aunque s es muy útil para describir el fenómeno de difracción de RX, como hemos podido comprobar en lo expuesto hasta ahora, la dirección de este vector de dispersión no es la dirección en la que el detector observará radiación dispersada. No obstante, es muy fácil obtener esta última dirección a partir de los vectores de dispersión y de la dirección de incidencia de RX; para ello es suficiente considerar la composición vectorial de la definición r de s dada en la figura II.2.2.2. Veamos a continuación la dispersión por un cristal monodimensional, tal como se vería en el laboratorio si el experimento fuera factible. Comencemos por analizar la dispersión por un átomo en el origen de coordenadas con la configuración planteada en la figura II.2.2.14. En este hipotético experimento los RX inciden a lo largo del eje x y la detección se hace con una película fotosensible cilíndrica con eje z. El desarrollo de esta película revela un patrón de dispersión acorde con el factor de dispersión atómica anteriormente estudiado, obteniéndose la máxima intensidad de radiación dispersada en la dirección de incidencia. La forma elipsoidal del patrón obtenido es consecuencia de la geometría cilíndrica de la película, si hubiéramos usado una película plana habríamos obtenido un patrón circular. 145

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+4/a +3/a

r sˆ0 a

r a

+2/a +1/a 0

sˆ0

-1/a -2/a -3/a -4/a

-8/a -7/a -6/a -5/a -4/a -3/a -2/a -1/a 0

Figura II.2.2.13. Intersección de los planos paralelos, que representan la condición de von Laue, con la esfera de reflexión de Ewald (círculo de trazo discontinuo). Todo vector de dispersión cuyo extremo sea un punto de cualquiera de los círculos resultantes nos dará una dirección de observación en la que habrá radiación dispersada.

Figura II.2.2.14. Izquierda: Un átomo en el origen de coordenadas; los RX inciden a lo largo del eje x y la radiación dispersada se detecta con una película fotosesnsible cilíndrica con eje z. Derecha: Desarrollo de la película resultante apareciendo un patrón elíptico de dispersión.

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Consideremos ahora el experimento representado en el esquema de la figura II.2.2.15. A. Como en el caso del simple átomo en el origen los RX inciden a lo largo del eje x y la detección se hace con una película fotosensible cilíndrica con eje z. Ahora el cristal monodimensional se centra en el origen de coordenadas y se orienta en la dirección del eje z. En la figura II.2.2.15.B se representa la construcción geométrica de uno de los conos de radiación dispersada a partir de los vectores de dispersión para la condición de von Laue h = 3. En este esquema podemos observar los círculos paralelos sobre la superficie de la esfera de reflexión de Ewald, que representan el lugar geométrico de los posibles extremos de los vectores de dispersión para que haya radiación dispersada, y se muestran dos vectores de dispersión en puntos diametralmente opuestos del circulo que corresponde a la condición h = 3. Es evidente que al mover el extremo de uno de estos vectores por todo el círculo se genera el cono de radiación indicado en la figura con color azul. De la misma forma se generan otros conos para los restantes valores de h, representándose el conjunto de todos ellos en la figura II.2.2.15.C. La intersección de estos conos de radiación con la película cilíndrica producirá un patrón de bandas paralelas, con separación creciente en la dirección vertical y que se atenúan horizontalmente como consecuencia del efecto introducido por el factor de dispersión atómica.

II.2.2.5. Dispersión de RX por un cristal bidimensional.

Obviamente el cristal monodimensional es un modelo teórico que no tiene utilidad práctica, pero es la base sobre la que vamos a construir el análisis del sistema real, es decir un cristal tridimensional. Todavía es conveniente extender las ideas desarrolladas en el cristal monodimensional a un modelo de cristal bidimensional.

r

r

Éste es un ordenamiento cuya periodicidad se define por dos vectores a y b , y se puede considerar compuesto por un conjunto de cristales monodimensionales de espaciado

r r r a ordenados con una separación b , o viceversa. La periodicidad en la dirección de a r r r producirá franjas de difracción de separación 1 a tal que s ⋅ a = h (siendo h = 1, 2, 3, …), r r y la periodicidad en la dirección b otro juego de franjas de separación 1 b tal que r r s ⋅ b = k (siendo k = 1, 2, 3, …).

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Figura II.2.2.15. A: Hipotético experimento de difracción de RX por un cristal monodimensional en la dirección del eje z (Los tamaños del cristal y la película están totalmente desproporcionadas). Los RX inciden sobre el cristal en la dirección del eje x y la detección se hace con una película cilíndrica. B: Construcción geométrica de uno de los conos de radiación dispersada a partir de los vectores de dispersión para la condición de von Laue h = 3. C: Conjunto de conos de radiación dispersada por el cristal y su intersección con la película cilíndrica. D: Desarrollo de la película en la que la atenuación horizontal del patrón obtenido es consecuencia del factor de dispersión atómica.

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Así en la figura II.2.2.16 se muestra un esquema de cristal bidimensional y los planos que representan las condiciones de von Laue para cada uno de las dos dimensiones. La condición de von Laue para el cristal completo implica satisfacer simultáneamente las dos

r r

r r

condiciones anteriores, s ⋅ a = h y s ⋅ b = k , y esto lo cumple el conjunto de líneas de

r r 1 b 1 ay ,

intersección de los dos juegos de planos paralelos de separación respectivamente, y que en la figura II.2.2.16 se indican con líneas de trazos.

r b

r 1 b

r a r 1 a r

r

Figura II.2.2.16. Izquierda: Cristal bidimensional definido por los vectores a y b . Derecha: Planos paralelos correspondientes a las condiciones de von Laue para cada una de los dos conjuntos de cristales monodimensionales que podemos considerar forman el cristal, de r r separación 1 a y 1 b , respectivamente. Las líneas de trazo discontinuo, resultado de la intersección de los dos conjuntos de planos representan la condición de von Laue para todo el cristal.

El patrón de dispersión que produciría un cristal bidimensional en un experimento tal como se representa en el esquema de la figura II.2.2.17.A se muestra en la figura II.2.2.17.C., como resultado de la intersección de los patrones de dispersión que producirían cristales

r

r

monodimensionales con la periodicidades generadas por los vectores a y b . El efecto del factor de dispersión atómica se refleja en la atenuación de la intensidad de la radiación dispersada al alejarnos del centro del patrón.

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Figura II.2.2.17. A: Hipotético experimento de difracción de RX por un cristal bidimensional ortogonal orientado en el plano yz (Los tamaños del cristal y la película están totalmente desproporcionadas). Los RX inciden sobre el cristal en la dirección del eje x y la detección se hace con una película cilíndrica. B: Patrón de dispersión producido por los cristales r monodimensionales de dirección a sobre la película cilíndrica sin incluir el efecto del factor de estructura atómica. C: Patrón de dispersión producido por los cristales r monodimensionales de dirección b sobre la película cilíndrica sin incluir el efecto del factor de estructura atómica. D: Patrón de dispersión producido por el cristal bidimensional completo sobre la película cilíndrica incluyendo el efecto del factor de dispersión atómica.

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II.2.2.6. Dispersión de RX por un cristal tridimensional.

En un cristal tridimensional hay una tercera dimensión en la que la periodicidad está r establecida por un vector c , figura II.2.2.18, lo que conduce a un tercer juego de franjas de r r dispersión planas dadas por la condición s ⋅ c = l , donde l = 0, ± 1, ± 2, ± 3, ... , r r r r r perpendiculares a c y de separación 1 c . Los tres vectores a , b y c definen la unidad que se

repite, conocida como celdilla unidad, de forma que el cristal tridimensional puede considerarse generado por la traslación de esta unidad en las tres direcciones de estos vectores. La condición de von Laue es ahora triple:

r r s ⋅ a = h , h = 0, ± 1, ± 2, ± 3, ... r r s ⋅ b = k , k = 0, ± 1, ± 2, ± 3, ... r r s ⋅ c = l , l = 0, ± 1, ± 2, ± 3, ...

h, k y l reciben el nombre de índices de Miller.

Satisfacen esta triple condición la red tridimensional de puntos que resultan de la intersección r r r de los tres juegos de planos de dispersión, separados por los espaciados 1 a , 1 b y 1 c , respectivamente, como se muestra en los esquemas rde la figura II.2.2.18. Esta red de puntos r r puede considerarse generada por tres vectores a∗, b ∗ y c ∗ que son los vectores inversos de r r r a , b y c , respectivamente, por lo que a esta red se le denomina red reciproca definida en el espacio reciproco x∗, y ∗ y z ∗ . En la red cristalina la posición de cualquier átomo se puede expresar en términos de r r r las coordenadas del sistema definido por los vectores a , b y c , así un vector con origen en el origen del sistema de coordenadas y el extremo en la posición del átomo o molécula, es decir el vector de posición, sería:

r r r r r = x ⋅ a + y ⋅b + z ⋅c

Donde x, y y z son números enteros porque los átomos o moléculas caen en los nudos de la red. Este vector de posición puede utilizarse para calcular la dispersión producida por la red tridimensional; así, usando la ecuación II.2.2.12, el factor de estructura será una suma extendida a todas las posiciones de los átomos o moléculas: r r r r r 2π i s ⋅(xa + yb + zc ) FTotal ( s ) = ∑∑∑ f ( S ) e x

y

z

151

[II.2.2-.15]

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Figura II.2.2.18. A: Red ortogonal cristalina en el espacio en el espacio de los vectores r r r a , b y c .B C y D: Planos de dispersión que representan la condición de von Laue para las r r r periodicidades especificadas por los vectores a , b y c .E: Red reciproca generada por los r r r vectores a∗, b ∗ y c ∗ , inversos de los anteriores.

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Introduciendo en la ecuación anterior las condiciones de von Laue:

FTotal (h, k , l ) = ∑∑∑ f ( S ) e 2π i (hx + ky + lz ) x

y

z

[II.2.2--.16]

Con la ecuación II.2.2.16 cualquier patrón de dispersión se puede calcular, es decir, cada rayo difractado se puede calcular escogiendo el correspondiente juego de valores enteros para h, k y l, y sumando para todo el cristal. Además, la ecuación II.2.2.16 es una serie de Fourier, la versión discreta de la Transformada de Fourier, y es consecuencia de la naturaleza discreta de los patrones de difracción. De la misma manera que la transformada de Fourier es un par de transformaciones autoimplicadas (una transformada implica la existencia de la transformada inversa) una serie de Fourier implica la serie inversa, así la ecuación II.2.2.16 implica la distribución de densidad electrónica de la red cristalina:

⎛ 1 ⎞ ∞ ρ ( x, y , z ) = ⎜ ⎟∑ ⎝ NV ⎠h = −∞

∞

∞

∑ ∑F

k = −∞ l = −∞

Total

(h, k , l )e − 2π i (hx + ky + lz )

[II.2.2-.17]

Donde V es el volumen de la celdilla unidad y N el número de átomos en el cristal. Para un cristal con un átomo por celdilla, como el dibujado en la figura II.2.2.18, NV es el volumen total del cristal. Esta última ecuación nos dice que es posible calcular la densidad electrónica del cristal a partir del patrón de difracción, si, y solo si de alguna manera conocemos la fase del número complejo en la sumatoria. II.2.2.7. Ley de Bragg.

El tratamiento más simple, aunque incompleto y limitado, del fenómeno de la difracción de RX es la interpretación que hizo Bragg W.L. (Premio Nobel de Física en 1915). Por su sencillez suele utilizarse en muchos textos para describir la difracción de RX por lo que merece la pena revisarlo y demostrar que el tratamiento hecho aquí conduce fácilmente a la ley de Bragg. Comencemos por considerar lo que se entiende como planos cristalinos. Éstos son un juego de planos equidistantes y paralelos construidos de forma que todos los puntos de la red (vértices de la celdilla unidad) caen en alguno de los planos del juego. Estos planos pueden especificarse mediante los índices de Millar; así en la figura II.2.2.19 se representan algunos casos de estos planos para diferentes pares de índices de Millar. La descripción de Bragg del fenómeno de difracción de RX considera que la radiación incidente “se refleja” en los planos cristalinos de índices h k l y espaciado d. La condición de Bragg para que haya radiación dispersada es que la diferencia de camino óptico entre los rayos “reflejados” por dos planos cristalinos adyacentes sea un múltiplo entero de la longitud de onda. De acuerdo con el esquema de la figura II.2.2.20 esta condición puede expresarse mediante la ecuación:

2 d senθ = nλ

153

[II.2.2-18]

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(h = 1, k = 1)

(h = 3, k = 1)

(h = 1, k = 2 )

r a

r b Figura II.2.2.19. Tres juegos de planos cristalinos en una representación bidimensional. La red cristalina está representada por la malla de color negro y los planos cristalinos por las líneas paralelas de color azul.

Rayo incidente

Rayo dispersado

θ

θ

d

Planos cristalinos

d sen θ

θ

θ

Figura II.2.2.20 Difracción de RX interpretada como una “reflexión” de la radiación desde planos cristalinos adyacentes separados por un espaciado d.

La ley de Bragg es un resultado que se predice fácilmente desde el enfoque más riguroso que hemos adoptado para explicar el fenómeno de la difracción de RX. Para deducir esta ley consideremos un plano cristalino que corte a los tres ejes de la celdilla unidad en

r r r r a h, b k y c l , figura II.2.2.21. Para que haya dispersión el vector s debe cumplir la

condición de von Laue, que podemos expresar como:

r r r r a r b r c s ⋅ = s ⋅ = s ⋅ =1 l k h

r

r

Es decir que el plano considerado es perpendicular al vector s . Cualquier vector r trazado r r desde el origen hasta un punto cualquiera del plano cumplirá la condición s ⋅ r = 1 y su

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proyección sobre la dirección de

r r s valdrá 1 s

. Un plano cristalino adyacente al plano

propuesto pasará por el origen, y el espaciado entre estos dos planos, d, será el módulo del r vector r0 trazado desde el origen perpendicularmente al plano, tal y como se representa en el esquema de la figura II.2.2.21. Este vector es la proyección de cualquier vector con extremo en el plano sobre la dirección del vector

r r 1 s , es decir: d = r0 = r ; pero de acuerdo con la s

1 2 senθ , o bien: 2 d senθ = λ , que es la ley de Bragg para n=1. Si = λ d r r consideramos un plano definido por s ⋅ r = n podemos de forma análoga obtener la ecuación II.2.2.18.

ecuación II.2.2.2 ,

aˆ

r a h

r s

r r0

r s

aˆ

r r

bˆ

r b k

r c l

r a r h r0 rr r b k

bˆ

cˆ r r

Figura II.2.2.21 Un plano cristalino definido por el producto escalar s ⋅ r = 1 que corta a los

r

r

r

tres ejes de la celdilla unidad en a h, b k y c l . A la derecha una vista lateral a lo largo

r

del eje c .

II.2.2.8. El problema de la fase.

El problema central en cristalografía de RX es determinar la distribución de la densidad electrónica y para ello disponemos de la ecuación II.2.2.17, que repetimos aquí:

⎛ 1 ⎞ ∞ ρ ( x, y , z ) = ⎜ ⎟∑ ⎝ NV ⎠h = −∞

∞

∞

∑ ∑F

k = −∞ l = −∞

Total

(h, k , l )e − 2π i (hx + ky + lz )

No obstante, tropezamos con un problema práctico de mucha importancia. Como se mencionó anteriormente el factor de estructura es un número complejo que requiere para quedar completamente determinado una amplitud y una fase; pero solo el cuadrado de la amplitud puede determinarse experimentalmente y las fases, que puede demostrarse ser el parámetro mas útil, no pueden medirse. Es necesario entonces utilizar algún método que nos

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permita estimar con suficiente exactitud la fase del factor de estructura para poder calcular la densidad electrónica. Es necesario tener presente que la estimación de la fase no es exacta y ocasionalmente podemos obtener estructuras incorrectas. Antes de estudiar los métodos de estimación de la fase vamos a introducir una función que no presenta el problema de la fase, porque se define a partir de las intensidades de radiación dispersada medidas experimentalmente, y que es útil para pequeñas moléculas y juega un papel importante en los métodos de estimación de la fase en grandes moléculas. Esta función es conocida como función de Patterson y es la transformada de Fourier inversa de la intensidad: +∞

+∞

−∞

−∞

rr r r P = ∫ I ( s )e −2π i s ⋅r ds =

r ∗ r −2π i sr⋅rr r F ( s ∫ ) F (s )e ds

[II.2.2-.19]

Dado el carácter discreto de los datos de intensidad la integral de la ecuación anterior puede reemplazarse por una suma:

P ( x, y , z ) =

∞

∞

∞

∑ ∑ ∑ F (h, k , l )

2 −2π i ( hx+ ky +lz )

e

h=−∞ k =−∞ l =−∞

[II.2.2-.20]

r Como ya hemos estudiado la transformada de Fourier de F (s ) es la distribución de r r densidad electrónica ρ (r ) ; también podemos demostrar que la transformada de F ∗ (s ) es la r densidad electrónica invertida a través del origen de coordenadas ρ (−r ) ; por ello la función de Patterson puede reescribirse como: N

P ( x, y , z ) = ∑

N

∑

j =1 k =1

r

r

ρ j (r j ) ρ k (−rk )

[II.2.2-.21]

donde los índices j y k se extiende a todos los átomos de la celdilla unidad. Así la función de Patterson es el juego de todos los vectores diferencia de los vectores de posición de pares de átomos en la estructura; en un mapa de contorno aparecerán picos en las posiciones marcadas por estos vectores diferencia. La figura II.2.2.22 ilustra dos casos sencillos para dos y tres átomos en la celdilla unidad. El mapa de Patterson contiene información más que suficiente para determinar la estructura. ¿Resuelve esto el problema y hace innecesario el uso de los factores de estructura? Una molécula que contenga n átomos en la celdilla unidad, el mapa de Patterson mostrará N2 picos correspondientes a los posibles vectores interatómicos entre cada uno de ellos. De esos, N picos estarán en el origen donde se concentran los vectores interatómicos nulos procedentes de la relación de un átomo consigo mismo. Los restantes N2- N picos se distribuyen por la celdilla unidad, que mantiene las dimensiones de la original por lo que los picos están más densamente repartidos que los máximos de la densidad electrónica. Si N = 1000, como puede ser el caso de una proteína, aparecerían 999000 picos fuera del origen en el mapa de Patterson y asignar cada pico al par de átomos que corresponde se hace imposible. No obstante, la función de Patterson es de gran utilidad en los métodos de estimación de la fase en grandes moléculas.

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Y

A

r rA

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Y

r r rA − rB r rB B

r r rA − rB

X

r r rB − rA

X

B Y

Y A

r rA

r rB

r r rA − rC

C

r rC X

r r rA − rB r r rC − rB

r r rB − rC r r rB − rA r r rC − rA

X

Figura II.2.2.22. En la parte superior: A la izquierda, celdilla unidad con dos átomos y los vectores de posición correspondientes, así como el vector diferencia de estos vectores. A la derecha, mapa de Patterson correspondiente. En la parte inferior: Lo mismo que en la parte superior pero para una celdilla unidad con tres átomos.

Para resolver el problema de la fase existen diferentes métodos. Unos implican perturbar el sistema introduciendo en la red cristalina algún átomo pesado (muchos electrones) que produce intensidades de radiación dispersa mucho más grande que los átomos “ligeros”;como los métodos de Remplazamiento isomorfo múltiple y Dispersión anómala de múltiple longitud de ondas. Otros, calculan la fase a partir de un modelo que se acepta como una buena aproximación, como el método Remplazamiento molécular. El modelo se extrae de otra molécula similar de estructura conocida, por ejemplo de una proteína relacionada con la proteína de estructura a resolver, o de la misma proteína en diferente forma cristalina, etc. Nosotros vamos a describir aquí el método de Remplazamiento isomorfo múltiple, por ser uno de los más ampliamente utilizados, especialmente en la resolución de las estructuras de proteínas y ácidos nucleicos. Este método requiere un juego de tres o mas cristales de la muestra: el cristal “padre” (cristal del biopolímero puro sin perturbar) y al menos otros dos cristales de idéntico grupo espacial y estructura molecular, excepto la

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presencia de uno o mas átomos pesados que pueden remplazar átomos presentes en el cristal padre o añadirse a la estructura. Para preparar derivados isomorfos se puede unir covalentemente el/los metal/es pesado/s a la macromoléculas en disolución y entonces cristalizar la muestra. Este procedimiento en muchos casos no es eficaz porque la presencia del metal pesado bloquea la cristalización o conduce a cristales no isomorfos respecto al cristal padre. Por ello el procedimiento al que casi siempre se recurre es partir de un cristal preformado de la macromolécula no modificada y añadir reactivos conteniendo el átomo pesado que difunde en el cristal. Los métales que se usan con mayor frecuencia son mercurio, uranio, platino, plomo y oro. r La distribución de densidad electrónica, ρ (r ) , para un derivado isomorfo es la suma r de la ρ (r ) del cristal padre y de los átomos pesados, así se habrá de cumplir que: FPH (h, k , l ) = FP (h, k , l ) + FH (h, k , l )

[II.2.2-.22]

donde FP (h, k , l ) es el factor de estructura del cristal padre, FPH (h, k , l ) el factor de estructura del cristal con el metal pesado y FH (h, k , l ) el factor de estructura del átomo pesado. Las tres cantidades en la ecuación anterior son números complejos y serán vectores en el plano complejo. La función de Patterson para el átomo pesado será:

PH = Pero FH (h, k , l )

2

∞

∞

∞

∑ ∑ ∑F

h=−∞ k =−∞ l =−∞

−2π i ( hx+ ky +lz ) H ( h, k , l ) e 2

[II.2.2-.23]

no es un dato experimental medible; no obstante FH se puede aproximar

bastante bien por FH ≈ FPH − FP .

i FPH

FH

FH ≈ FPH − FP

FP R

Figura II.2.2.23. Factores de estructura en el plano complejo del cristal padre, FP, de un cristal con una adición isomorfa de un átomo pesado, FPH, y del átomo pesado mismo, FH.

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Con esta aproximación podemos estimar FH a partir de las amplitudes medidas del cristal padre y el cristal con la adición isomorfa de un átomo pesado; entonces se puede calcular una función de Patterson de diferencia según la siguiente ecuación:

PH =

∞

∞

∞

∑∑∑

h=−∞ k =−∞ l =−∞

FPH − FP e −2π i (hx+ky+lz ) 2

[II.2.2-.24]

De los vectores entre átomos pesados del mapa de Patterson correspondiente calculamos las posiciones de los átomos pesados. Con las coordenadas de cada atomo pesado identificado se puede calcular el factor de estructura FH (h, k , l ) usando la ecuación II.2.2.16. Pero del cristal padre y del cristal isomorfo con el átomo pesado solo se conoce experimentalmente el módulo del factor de estructura FP y FPH , respectivamente. Los posibles valores para el factor de estructura FP están representados por la circunferencia de radio FP centrada en el origen, diagrama de Harker figura II.2.2.24 izquierda; los posibles valores para el factor de estructura FPH

están representados en esta figura por la

circunferencia de radio FPH , pero centrada en el extremo del vector FH para cumplir la ecuación II.2.2.22. A cada uno de los dos puntos de intersección de ambas circunferencias, A y B en la figura II.2.2.24 izquierda, le corresponde un factor de estructura que satisface la ecuación II.2.2.22. Hemos restringido así los posibles valores de la fase a los dos valores φ A y φ B , siendo todavía necesario resolver esta ambigüedad. Para resolver esta ambigüedad la solución adoptada con más frecuencia es usar un segundo derivado isomorfo de un metal pesado H’. Para el segundo derivado se debe cumplir que: FPH ′ (h, k , l ) = FP (h, k , l ) + FH ′′ (h, k , l ) .

La verdadera fase del cristal padre la define el punto común a los tres cristales, B en la figura II.2.2.22 derecha.

II.2.2.9. Métodos para obtener difractográmas de RX

Las técnicas usadas para medir los ángulos y la intensidad de los haces de difracción han evolucionado a lo largo del tiempo. En el primer experimento de difracción, Friedrich y Knipping (1912) usaron una película sensible a los rayos X, pero incluso en el mismo año, Bragg usó una cámara de ionización montada sobre un brazo rotatorio que, en general, determinaba con más precisión los ángulos y las intensidades de difracción. Sin embargo, la película presenta la ventaja de poder impresionar muchos haces difractados a la vez. Durante los primeros años de la Cristalografía estructural (desde 1920 hasta 1970) se hizo uso extensivo de los métodos fotográficos, y entre ellos se deben destacar los métodos de Laue, Weissenberg, precesión, y oscilación.

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i

i φA

A FP FPH FH

FP FPH

B

A φB

B

FP

φ

FH

R

R

FH’ FPH

FPH’

Figura II.2.2.24. Construcción de Harker para la determinación de la fase por el método de remplazamiento isomorfo,. FP: factor de estructura del cristal padre. FH y FH’: factores de estructura de los átomos pesados H y H’ (calculadas a partir de las posiciones determinadas con una síntesis de Patterson de diferencias). FPH y FPH’: factores de estructura del cristal con los metales pesados H y H’ . Las circunferencias representan el lugar geométrico de todas las posiciones posibles del extremo de los vectores FP, FPH y FPH’. Izquierda: Con el cristal padre y un solo cristal con metal pesado H se determinan dos posibles valores para la fase del cristal padre, ángulos φA y φB, en los puntos de intersección de las dos circunferencias correspondientes a FP y FPH. Derecha: Con el cristal padre y dos derivados H y H’ se determinan sin ambigüedad el valorde la fase del cristal padre. Método de Laue

En sus primeros experimentos, Max von Laue (Premio Nobel de Física en 1914) usó radiación contínua (con todas las longitudes de onda posibles) incidiendo sobre un cristal estacionario. De este modo, el cristal generaba un conjunto de haces que representan la simetría interna del cristal. En estas condiciones, y teniendo en cuenta la ley de Bragg, ecuación II.2.2.18, las constantes del experimento son los espaciados d y la posición del cristal respecto al haz incidente, y las variables son la longitud de onda λ y el entero n. Así que cada haz difractado corresponderá al primer orden de difracción (n=1) de una cierta longitud de onda, al segundo orden (n=2) de la longitud de onda mitad λ/2, al tercer orden n=3 de la longitud de onda λ/3, etc. Por lo tanto, el diagrama de Laue es simplemente una proyección estereográfica de los planos del cristal. Hay dos geometrías diferentes, dependiendo de la posición del cristal respecto de la placa fotográfica, transmisión o reflexión, figura II.2.2.25.

Figura II.2.2.25 Izquierda: Método de Laue en modo transmisión. Derecha: Método de Laue en modo reflexión.

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Método de Weissenberg

El método de Weissenberg está basado en la cámara del mismo nombre, desarrollada por K. Weissenberg (1924). Consta de un cilindro metálico que contiene en su interior una película fotográfica sensible a los rayos X. El cristal se monta sobre un eje coaxial con dicho cilindro y se hace girar de tal modo que los puntos recíprocos que intersectan la superficie de la esfera de Ewald son los responsables de los haces de difracción, figura II.2.2.26.

Figura II.2.2.26. Izquierda: Esquema de una cámara tipo Weissenberg, usada en los laboratorios de Cristalografía hasta aproximadamente 1970. Cámara desarrollada por K. Weissenberg en 1924. Estos haces generan un ennegrecimiento (mancha) sobre la película fotográfica que cuando se extrae del cilindro metálico tiene la apariencia que se muestra en la figura II.2.2.27.

Figura II.2.2.27. Esquema que explica la producción de un diagrama de Weissenberg del tipo rotación-oscilación.

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El tipo de diagramas Weissenberg que se obtienen del modo descrito se denominan de rotación o de oscilación, dependiendo de que el giro del cristal sea de 360º o parcial (aprox. 20º), respectivamente. El montaje del cristal debe ser tal que su eje de giro coincida con un eje directo de la celdilla elemental. De ese modo, por definición de la red recíproca, existirán planos recíprocos perpendiculares a dicho eje. Es indudable que mediante este tipo de diagramas se consigue información sobre los períodos de repetición de la red directa, ya que la separación entre las líneas que contienen las manchas de difracción es proporcional a la distancia entre planos recíprocos. Sin embargo, cada plano recíproco (dos dimensiones) queda sobre una línea (una dimensión) de manchas de la película, dando lugar a solapamiento entre manchas. Este problema quedó resuelto cuando a las cámaras se les añadió la libertad de traslación del cilindro, en la dirección paralela a su eje, acoplada al giro del cristal y seleccionando mediante dos cilindros internos el cono de difracción que origina uno solo de los planos recíprocos. De este modo, un plano recíproco (dos dimensiones) quedaría impresionado en toda la superficie de la placa fotográfica (dos dimensiones), evitando con ello el posible solapamiento entre manchas. El aspecto de un diagrama de este tipo, con la “deformación geométrica” que se produce del plano recíproco, se muestra en la figura II.2.2.28. En estas condiciones, y teniendo en cuenta dicha deformación, es posible medir aisladamente cada haz de difracción, y seleccionando adecuadamente la rendija se pueden recoger todos los planos recíprocos del cristal.

Figura II.2.2.28. Izquierda: Detalle de la cámara de Weissenberg para separar un cono de haces difractados mediante dos cilindros internos que dejan una rendija. El cilindro exterior se traslada al mismo tiempo que el cristal gira, distribuyéndose las manchas de difracción, que antes estaban en una línea, sobre toda la placa fotográfica. Derecha: Diagrama de Weissenberg del plano recíproco hk2 del metaborato de cobre.

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Método de precesión

El método de precesión fue desarrollado por Martin J. Buerger, a principios de la década de 1940, como alternativa muy ingeniosa para poder impresionar placas fotográficas de planos recíprocos sin distorsionar. Al igual que el método de Weissenberg, se trata de un método en el que cristal se mueve, pero el movimiento del cristal (y como consecuencia el de los planos recíprocos solidarios) es como el de precesión de los planetas, de ahí su nombre. La película fotográfica se coloca sobre un soporte plano y se mueve solidariamente con el cristal, figura II.2.2.29. La cámara diseñada para tal efecto se muestra en la parte inferior de esta figura. El cristal debe orientarse de tal modo que el plano recíproco que se desee recoger sea perpendicular al haz directo de los rayos X, es decir, que un eje directo coincida con la dirección de los rayos X incidentes.

Figura II.2.2.29. En la parte superior: Dos visiones esquemáticas del principio en el que se basa la cámara de precesión. El ángulo m es el ángulo de precesión del plano recíproco seleccionado del cristal y de la película fotográfica, que se mantiene paralela al plano recíproco y solidaria en movimientos al cristal. En la parte inferior: Esquema y aspecto de una cámara de precesión. Los difractogramas que se obtienen con este método son mucho más simples de interpretar que los de Weissenberg, ya que muestran el aspecto de un plano recíproco sin distorsión. La separación de un plano recíproco determinado se consigue mediante el uso de pantallas (figura de arriba) que seleccionan los haces difractados de dicho plano. Del mismo modo a como ocurre en el caso de Weissenberg, se pueden medir las distancias recíprocas y las intensidades de difracción. Sin embargo, aquí es mucho más facil observar los elementos

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de simetría del espacio recíproco. La desventaja del método de precesión es consecuencia de que la película es plana en lugar de cilíndrica, y el ángulo sólido explorado es menor. Este método se ha usado con éxito durante muchos años, incluyendo la resolución de las estructuras de de las proteínas. Así en la figura II.2.2.30 se muestra un difractograma de precesión de un cristal tetragonal de Lisozima que visualiza un plano completo de la red recíproca sin distorsión.

Figura II.2.2.30. Diagrama de precesión de un cristal tetragonal de Lisozima en el que fácilmente se distingue un eje de simetría cuaternario perpendicular al diagrama y varios planos de simetría especular. Debido a que los ejes de la celdilla elemental son grandes, la separación entre los puntos recíprocos es pequeña.

Método de oscilación

Originalmente, los métodos de monocristal, con giro amplio de la muestra, como los mencionados anteriormente, se impusieron por su facilidad de interpretación. Sin embargo, cuando se llegó a experimentar con redes directas grandes, es decir, recíprocas pequeñas, los tiempos de recogida se disparaban y por lo tanto se recurrió al método de oscilación con ángulos pequeños, que permitía recoger varios niveles recíprocos a la vez sobre cada posición del cristal. Repitiendo estos diagramas, a distintas posiciones de partida del cristal, se conseguían obtener suficientes datos en un tiempo razonable. La geometría de recogida está descrita en la figura II.2.2.31.

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Hoy en día, con generadores de ánodo rotatorio o sincrotrones, y detectores de área, que aumentan la intensidad de los máximos de difracción y reducen los tiempos de recogida con gran fiabilidad, se ha impuesto este método para los estudios de macromoléculas, en particular de proteínas.

Figura II.2.2.31. En la parte superior: Esquema de la geometría de las condiciones de máximo de difracción en el método de oscilación. El cristal, y por tanto la red recíproca, están oscilando un pequeño ángulo alrededor de un eje perpendicular al plano de la figura y que pasa por el centro. En la figura de la derecha, el área que pasa por condición de máximo de difracción está denotada por el área amarillenta, delimitada por la esfera de Ewald (de radio 2 sen 90 λ ) en los dos extremos de oscilación de la red, y la esfera de resolución máxima (de radio 2senθ max λ ) que se puede alcanzar con la radiación empleada y con el detector que se haya usado.En la parte inferior: Cuando la red recíproca oscila un pequeño ángulo, alrededor del eje de giro, pequeñas zonas de los diferentes niveles de la red recíproca entran en contacto con la esfera de Ewald, alcanzando las condiciones de máximo de difracción. De este modo, sobre la pantalla del detector, la geometría de oscilación produce máximos de difracción procedentes de diferentes niveles de la red recíproca y formando lúnulas sobre el diagrama (figura de la derecha).

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Actualmente estos métodos están siendo sustituidos por difractómetros goniométricos altamente automatizados. La introducción de los computadores digitales a finales de la década de 1970, permitió el diseño de los llamados difractómetros automáticos de cuatro círculos. Estos equipos, disponen de un sistema goniométrico, con una mecánica muy precisa, que mediante tres giros permite colocar el cristal en cualquier orientación del espacio, provocando así que se cumplan los requerimientos de la construcción de Ewald para que se produzca la difracción. En estas condiciones, un cuarto eje de giro, que sustenta el detector electrónico se coloca en condiciones de recoger el haz difractado. Todos estos movimientos se pueden programar para que se realicen de un modo automático, con una mínima intervención del operador. La descripción de estos equipos queda fuera del alcance y propósito del curso; no obstante, puede encontrar información al respecto en la página Web del Departamento de Cristalografía del CSIC: www.xtal.iqfr.csic.es.

II.2.2.10 Etapas para determinar la estructura de una macromolécula.

El estudio cristalográfico de proteínas o ácidos nucleicos presenta notables diferencias con el procedimiento usual para pequeñas moléculas. Las etapas de una determinación de la estructura de una macromolécula son: 1º. Preparación de cristales adecuados de la macromolécula pura.

Obtener un cristal con una elevada perfección es el requisito imprescindible para determinar la estructura de un biopolímero, es pues uno de los pasos más importante. La cristalización se logra llevando la disolución de proteína al punto de saturación. Para muchas proteínas la saturación ocurre entre 10 y 100 mg/ml, consecuentemente es deseable bajar la concentración de saturación añadiendo un agente precipitante tal como NaCl, (NH4)2SO4, polietilen-glicol, o el disolvente metilpentandiol (MPD), que generalmente actúan reduciendo la solubilidad. Estos precipitantes deben introducirse gradualmente, manteniendo la proteína en el umbral de la saturación. Los cristales para los experimentos de difracción han de ser de un tamaño de 0.1 a 1.0 mm; esto se logra por un crecimiento lento durante un periodo de 1 a 6 semanas. Las técnicas mas frecuentemente usadas para la introducción gradual del agente precipitante son las de diálisis y difusión de vapor. En las técnicas de la diálisis, la proteína concentrada es colocada en la cámara superior de una unidad del microdiálisis, posiblemente como una gota sobre la superficie de la membrana, figura II.2.2.32 izquierda. El agente de precipitación está presente en la cámara inferior a una concentración calculada para que la disolución de proteína quede finalmente de 5 a un 30% de sobresaturación. El agente precipitando difunde despacio en la disolución de la proteína a través de la membrana de diálisis. En la difusión del vapor o la técnica de la gota colgante, aproximadamente 10 µL de la disolución de proteína se deposita sobre un cubreobjetos de vidrio con la cantidad de agente precipitante necesaria para llevar la disolución hasta un 75% de la concentración de saturación. El cubre objeto se sella con vaselina sobre un vasito("pozillo") con la gota hacia dentro quedando adherida o "colgada". El vasito contiene el agente precipitante al concentración conveniente para saturar la disolución de proteína. Con el tiempo el vapor de agua difunde despacio desde la gota colgante a la solución más concentrada debajo, hasta que ambas soluciones están a la misma concentración de agente precipitante, figura II.2.2.32 derecha.

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Disolución de proteína.

Disolución de proteína.

Membrana de diálisis.

Disolución con el agente precipitante.

Disolución con el agente precipitante.

Figura II.2.2.32. Métodos de cristalización de biopolímeros. Izquierda: Configuración de una unidad de microdiálisis para la lenta difusión del agente precipitante en la cristalización de una proteína. Derecha: Configuración para la cristalización por difusión del vapor o método de la gota colgante.

Un ensayo completo de cristalización explorará diversas variables, tales como la concentración de proteína, la concentración de agente precipitante, PH, concentración de ligandos, etc. Con cuatro o cinco variables se deben hacer cientos de ensayos, para lo cual las cajas de “vasitos” múltiples, como la mostrada en la figura II.2.2.33, son muy útiles. Una vez que se han acotado las condiciones óptimas de cristalización, se puede intentar obtener cristales de mayor tamaño, para lo que los microcristales obtenidos en los ensayos previos puede usarse como semillas para inducir la cristalización.

Figura II.2.2.33. Caja de múltiples “vasitos” (24) para realizar los ensayos de cristalización (“screening”). Por ejemplo, en las columnas de cuatro “vasitos” podrían ponerse cuatro concentraciones diferentes de proteína, y en las filas seis pHs diferentes.

Al cristal obtenido de la disolución de proteína pura le llamaremos cristal padre, para distinguirlo de aquellos otros que contengan metales pesados.

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2º. Caracterización del cristal y obtención de los difractogramas.

Una vez que se tiene el cristal padre se determina el sistema cristalino al que pertenece (triclinio, ortorombico, cúbico, etc.) y se obtienen un juego de datos de intensidad de radiación dispersada, es decir se obtienen los difractogramas necesarios usando alguno de los métodos explicados anteriormente. 3º. Preparación de varios derivados isomorfos del cristal padre con metales pesados.

Se preparan varios derivados isomorfos con átomos pesados, es decir, cristales con la misma celdilla unidad, el mismo sistema cristalino y la misma estructura que el cristal padre pero donde uno o más átomos pesados se han introducido en sitios específicos de la red. Este paso es ineludible para determinar las fases del cristal padre por alguno de los dos métodos que requieren la obtención de estos cristales derivados, a saber, el método de remplazamiento isomorfo múltiple (explicado anteriormente) y el método de dispersión anómala de múltiple longitud de ondas. Con los cristales derivados isomorfos se obtiene un nuevo conjunto de difractogramas.

4º. Se determinan la posición de los átomos pesados en los cristales isomorfos derivados.

Para ello se usa una síntesis de Patterson de diferencias, tal como se ha explicado anteriormente, usando la función:

PH =

∞

∞

∞

∑∑∑F

h=−∞ k =−∞ l =−∞

PH

− FP e −2π i (hx+ky+lz ) 2

Con la primera estimación de las coordenadas atomicas de los metales pesados se intenta refinar la posición de éstos usando la síntesis de de Fourier:

r −2π i (hx j + ky j +lz j ) FH (h, k , l ) = ∑ f j ( s ) e j

5º. Estimación de la fase del factor de estructura del cristal padre.

Mediante los diagramas de Harker se compara el factor de estructura del cristal padre con los factores de estructura de los derivados isomorfos de átomos pesados. Se estima la fase de los cristales, tal como se ha explicado anteriormente. Cuanto más derivados isomorfos se usen más precisa será la fase obtenida. Con la fases estimadas para el cristal padre es posible refinar más la posición de los átomos pesados utilizando un método de mínimos cuadrados o con técnicas de Fourier. De forma iterativa se estima mejor las fases para el cristal.

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6º. Obtención del mapa de densidad electrónica y construcción de un modelo. Refinamiento de la estructura y Resolución.

Con la fase refinada y las amplitudes para cada factor de estructura se calcula un mapa de densidad electrónica. Una vez que se dispone de este mapa se intenta construir un modelo, entendiendo por tal el juego de coordenadas atómicas que ajuste mejor el mapa de densidad electrónica. Usualmente en la primera determinación del modelo se utiliza una resolución no muy alta, de 5’5 a 7 Å. Se repite entonces los pasos anteriores (del 4º al 6º) a más alta resolución, de 2 a 3 Å, mientras sea posible construir un modelo molecular optimizado. La figura II.2.2.34 ilustra este procedimiento.

Figura II.2.2.34. Izquierda: Mapa de densidad electrónica de partida a baja resolución, de 5’5 a 7 Å. Centro: Modelo molecular que ajusta mejor el mapa de densidad electrónica. Derecha: Después del refinamiento de las fases y los factores de estructura se obtiene finalmente un mapa de densidad a mas alta resolución y el correspondiente modelo.

En el proceso de refinamiento las intensidades calculadas se comparan con las intensidades experimentales y para comprobar la calidad del modelo se usa el llamado factor cristalográfico R. Este factor se define como el cociente entre la diferencia total entre intensidades medidas y calculadas y la intensidad total observada:

R=

∑

r r Fobs − Fcalc r F ∑ obs

Idealmente R debería tender a cero. Un valor R = 0’4 es un buen punto de partida para resolver la estructura de una proteína, y un valor final de R =0’1 es un valor final de optimización suficientemente bueno para una macromolécula. Valores de 0’01 son frecuentes para pequeñas moléculas. Los factores de estructura calculados del modelo inicial incluye fases que pueden ser de mayor calidad que los determinados experimentalmente. En este caso es posible generar un nuevo mapa de densidad electrónica usando las intensidades experimentales y las fases calculadas. El proceso se reitera cíclicamente hasta que el valor del factor cristalográfico R no disminuya más; ver diagrama de flujo en la figura II.2.2.35. 169

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Patrón de difracción

Derivado isomorfo de metal pesado

Intensidades de RX dispersados

Fases del factor de estructura

Si

¿Disminuye R? Mapa de densidad electrónica

Modelo estructural xi, yi, zi

No

Fin del proceso de refinamiento

Cálculo de fases a partir del modelo

Figura II.2.2.35. Diagrama de flujo del procedimiento de refinamiento de la estructura de una macromolécula. Otra forma de medir la calidad del modelo es la resolución. Ésta nos da el tamaño de la molécula mas pequeña que podemos ver o resolver. La resolución depende de varios factores: • Radiación de Rayos X utilizada. Con anodo de Cu el espaciado mínimo que se puede medir es de 0,7709 Å. • Características del cristal, perfección, pureza, estabilidad, etc. • Cantidad de datos finales de los módulos de los factores de estructura y sus fases. • Temperatura.

Figura II.2.2.36. Mapas de densidad electrónica de la misma región de una proteína a las resoluciones de 3, 2 y 1.2 Å. La región mostrada corresponde a una fenilalanina y es evidente que del mapa a la más alta resolución se podrá ajustar un modelo molecular con mas exactitud en las coordenadas atómicas.

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Como ya hemos indicado la temperatura es una variable de la que depende fuertemente la definición de la estructura y su resolución; especialmente las regiones con mayor movilidad. La influencia es tan marcada que podemos decir que el modo más eficaz de aumentar la resolución es crioenfriar los cristales cerca de la temperatura del nitrógeno líquido. La parte izquierda y derecha de la figura II.2.2.37 corresponden a la misma región de una molécula y obtenidas las densidades electrónicas a la misma resolución; la diferencia consiste en las temperaturas de trabajo, 20 ºC el mapa de la derecha, -148 ºC el mapa de la izquierda. La notable diferencia en la estructura, pobremente definida a la temperatura ambiente y muy bien definida a la temperatura de una corriente de nitrogeno enfriado, es debido a la disminución de las fluctuaciones térmicas, es decir a la disminución de la movilidad de esa región de la estructura. Este es un claro ejemplo de las mejoras que pueden alcanzarse usando crio-técnicas.

Figura II.2.2.37. Izquierda: Mapa de densidad electrónica, obtenida a 125 K (-149 ºC) de una región de una proteína, que corresponde a una glicina y una alanita. Derecha: Mapa de densidad, obtenida a 293 K, de exactamente la misma región anterior, con la misma resolución. Refinamientos adicionales incluye: - La revisión de las longitudes y los ángulos de enlaces, que deben caer en un intervalo aceptable. - La revisión de las distancias interatómicas de pares de átomos no enlazados covalentemente, que no deben ser menores que ciertos valores umbrales. - La compatiilidad de la estructura con los impedimentos estericos, es decir, la conformidad con los mapas de Ramachandran. - Depuración final por medio de cálculos de Dinámica molecular usando campos de fuerzas adecuados.

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