XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental

III-131 - AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS HIDROCARBUROLÍTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A BIORREMEDIACIÓN María Gabriela Altamirano(1) Licenciada en Ciencias Biológicas. Becaria de Pefeccionamiento (UNC) y ASD de la Cátedra de Microbiología. Insituto Universitario en Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional del Comahue. María Graciela Pozzo Ardizzi Lic. en Química. Ms S. en Ciencias del Suelo.

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Dirección(1): Buenos Aires 1400 - Neuquén - CP 8300 - Provincia de Neuqén - Argentina - Tel: (54) 99-4490376 - e-mail: [email protected] RESUMEN En el presente trabajo se identificaron seis especies bacterianas: Pseudomonas vesicularis, Sphingomonas paucimobilis, Micrococcus sp., M. varians, M. roseus y M. sedentarius mediante el empleo del sistema informático Apilab Plus (Biomerieux). Asimismo se determinó la capacidad de desarrollarse en presencia de diversos hidrocarburos aromáticos como única fuente de carbono y energía. Las cepas mencionadas fueron aisladas a partir de muestras de suelo provenientes de un predio de 8 hectáreas sometido a biorremediación durante un año; este sitio había sido empleado durante años a la disposición del agua de producción, residuo generado por la industria hidrocarburífera, en las cercanías de la localidad de Catriel (Río Negro) en la Patagonia Argentina. Dicho residuo lleva como contaminantes alto contenido de hidrocarburos de petróleo y sales. Las especies mencionadas han sido aisladas previamente por otros autores a partir de sitios contaminados y reportadas por su capacidad de degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos. PALABRAS-CLAVE: Biorremediación, Bacterias Hidrocarburolíticas, Pseudomonas Sp., Micrococcus Sp., Sphingomonas Sp.

INTRODUCCIÓN Como resultado de las diferentes actividades humanas se han introducido al ambiente gran cantidad de residuos orgánicos de origen domiciliario e industrial. Particularmente estos últimos presentan distinto grado de toxicidad según sea su complejidad química o su unión con distintos metales. Gran parte de ellos, especialmente los relacionados estructuralmente con compuestos naturales son degradados por los microorganismos del suelo y del agua. Sin embargo una importante proporción de moléculas contaminantes, sobre todo aquellas con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la naturaleza son catabolizados lentamente y así se acumulan y persisten en el ecosistema. Surge así el concepto de biorremediación, que consiste básicamente en estimular las capacidades degradativas de los microorganismos indígenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o bien convertirlos en especies químicas menos tóxicas y así menos nocivas. El objetivo del presente trabajo es identificar bacterias con capacidad de degradar hidrocarburos, aisladas a partir de muestras de suelo provenientes del biotratamiento de 8 hectáreas contaminadas con aguas de producción. Este tratamiento se llevó a cabo en un yacimiento petrolífero situado en las proximidades de la ciudad de Catriel, provincia de Río Negro, en la Patagonia Argentina (27). El predio al que se hace referencia fue durante años sitio de disposición del agua que acompaña al petróleo en su extracción, por lo que además de hidrocarburos contiene alta concentración de sales. La estrategia para realizar el biotratamiento se basó en el laboreo agronómico para proveer oxígeno y aumentar la biodisponibilidad del contaminante; asimismo se aseguró un grado adecuado de humedad mediante el riego, no siendo necesario el empleo de la bioaumentación.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental MATERIALES Y MÉTODOS Medios de cultivo Se empleó Medio Mínimo para Microorganismos Hidrocarburolíticos (Pozzo Ardizzi, G.; comunicación personal) que consiste básicamente en una solución salina mineral con el agregado de micronutrientes y rojo fenol como indicador de pH. En las muestras de suelo tomadas se realizó, previamente al aislamiento, el recuento de los microorganismos heterotrofos mesófilos aerobios totales e hidrocarburolíticos en medio líquido (Altamirano, M.G., en redacción), utilizando la técnica del Número mas Probable (NMP) (7, 11). Para ello se tomó un gramo de suelo y se lo suspendió en un tubo de ensayo conteniendo 9 ml de agua destilada estéril. A partir del sobrenadante se realizaron diluciones sucesivas desde 10-1 hasta 10-10 con cuyas alícuotas se sembraron los tubos de ensayo conteniendo Medio Mínimo con kerosén como única fuente de carbono y energía. De los tubos que arrojaron resultados positivos (turbidez y viraje del indicador del rojo al amarillo) se realizaron los aislamientos en Medio Mínimo agarizado (1.5 %) en placa de petri. En este caso el hidrocarburo estéril se incorpora asépticamente en sendos papeles de filtro, que previamente han sido colocados en la tapa de la caja antes de su esterilización. Una vez aisladas, las cepas se mantienen en agar nutritivo. Una alternativa a la mencionada es sembrar 10 g de suelo en 100 ml de Medio Mínimo con 5 ml kerosen estéril como única fuente de carbono y energía; se incuba a temperatura ambiente hasta que el cultivo haya desarrollado turbidez y el indicador haya virado color rojo al amarillo. Posteriormente se realizan diluciones en tubos con Medio Mínimo y aislamientos en Medio Mínimo agarizado en placa. Pruebas Bioquímicas A las cepas aisladas se les realizó la tinción de Gram; luego se estudió morfología y agrupación. Según los resultados obtenidos se seleccionaron las tiras API (Biomerieux) para la caracterización bioquímica. También se realizaron las pruebas de catalasa, oxidasa y movilidad. Para el análisis de los perfiles bioquímicos se contó con la asistencia del programa informático Apilab Plus (Biomerieux) que consiste en una base de datos para identificar bacterias. Además del género o especie correspondiente a cada perfil de resultados, el sistema asigna para cada caso, un porcentaje de identificación (% Id) y una calificación que varía desde perfil inaceptable hasta muy buena identificación, así como también sugiere pruebas bioquímicas complementarias.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el presente trabajo se considera a las bacterias degradadoras de hidrocarburos como sinónimo de bacterias hidrocarburolíticas. Algunos autores emplean en forma genérica los términos petroleolítico (26) e hidrocarbonoclástico (23) para señalar la capacidad de los microorganismos de crecer a expensas de uno o varios hidrocarburos. Análogamente se llama degradadoras de hidrocarburos a aquellas poblaciones microbianas que son capaces de desarrollarse en medios de cultivo con diversos hidrocarburos como única fuente de carbono y energía. El sustrato suplementado puede ser el petróleo crudo (28, 4), o bien algún producto de su destilación como el combustible jet fuel JP48 (2), diversos PAH en forma individual (29) o nhexadecano (13). En ningún caso se afirma que tales microorganismos puedan emplear todos los hidrocarburos presentes en los sustratos mencionados cuando se trata de mezclas. La fuente de carbono empleada en el presente trabajo para realizar los aislamientos, el kerosén, es una compleja combinación de hidrocarburos desde C9 a C16 cuya temperatura de destilación va desde los 150 a los 290 °C. El kerosén esta compuesto por 68.6 % de alcanos saturados y 19.4 % de hidrocarburos aromáticos. Esto implica que los microorganismos que han sido capaces de crecer con kerosén como única fuente de carbono y energía, denominados en conjunto hidrocarburolíticos o degradadores de hidrocarburos, serían asimismo capaces de emplear al menos una fracción de los hidrocarburos que componen la mezcla contaminante presente en el suelo de la Laguna de Evaporación. Los resultados obtenidos a partir de las pruebas bioquímicas se expresan en las tablas a continuación. La Tabla 1 agrupa a los cocos Gram positivos y la Tabla 2 a los bacilos Gram negativos.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental Tabla 1.- Características e identificación de cocos gram positivos. Micrococcus sp Micrococcus roseus Micrococcus sedentarius Micrococcus varians roja rojo-rosado amarilla amarilla COLONIA cocos cocos coco/cocobac cocos FORMA positivo positivo positivo positivo GRAM + ++ + ++ MOVILIDAD + + fuertemente +fuertemente + fuertemente CATALASA negativo negativo negativo negativo OXIDASA negativo positivo negativo positivo GLU negativo positivo negativo positivo FRU negativo negativo negativo positivo MNE negativo negativo negativo positivo MAL negativo negativo negativo positivo LAC negativo negativo negativo positivo TRE negativo negativo negativo positivo MAN negativo negativo negativo positivo XLT negativo negativo negativo negativo MEL negativo positivo negativo positivo NIT negativo negativo negativo positivo PAL positivo positivo positivo positivo VP negativo negativo negativo negativo RAF negativo positivo negativo positivo XYL negativo negativo negativo positivo SAC negativo negativo negativo negativo MDG negativo negativo negativo positivo NAG negativo negativo negativo positivo ADH negativo negativo negativo negativo URE Muy Buena Buena Muy Buena Muy Buena Calificación

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental Tabla 2.- Características e identificación de bacilos gram negativos. Sphingomonas Pseudomonas paucimobilis vesicularis naranja amarilla COLONIA bacilos bacilos FORMA negativo negativo GRAM + + MOVILIDAD + + fuertemente CATALASA negativo negativo OXIDASA negativo positivo NO3 negativo negativo TRP negativo negativo GLU negativo negativo ADH negativo negativo URE positivo positivo ESC positivo negativo GEL positivo positivo PNPG positivo negativo GLU positivo negativo ARA positivo negativo MNE negativo negativo MAN negativo negativo NAG negativo negativo MAL negativo negativo GNT negativo negativo CAP negativo negativo ADI negativo negativo MLT negativo negativo CIT negativo negativo PAC Buena Buena Calificación

Las especies identificadas corresponden a tres géneros diferentes: Micrococcus sp., Sphingomonas sp. y Pseudomonas sp. que son conspicuos en ambientes naturales tanto en suelo como en agua. Las bacterias pertenecientes al género Pseudomonas son bacilos rectos o curvos, gram negativos, no esporulados, cuyo tamaño oscila entre 0.5 y 1 µm de ancho por 1.5 y 4 µm de largo, no poseen vainas ni apéndices. Su metabolismo es respiratorio, nunca fermentativo. Algunas especies son litotróficas pudiendo emplear H2, entre otros, como único dador de electrones. Asimismo pueden emplear el NO3- como aceptor de electrones en anaerobiosis. La prueba de oxidasa es generalmente positiva y catalasa lo es siempre (9). Son muy numerosas las publicaciones en las que se hace referencia a distintas Pseudomonas sp. capaces de sobrevivir e incluso degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos, como pesticidas, diversos compuestos halogenados, e hidrocarburos derivados del petróleo (14, 22, 3, 21, 24, 10, 29, 19, 20, 25, 8, 17, 18). El género Sphingomonas, comparado con Pseudomonas putida, P. fluorescens y P. aeruginosa, presenta mayor especificidad y velocidad de degradación frente a diferentes hidrocarburos aromáticos polinucleares, así como también se ha detectado su capacidad de producir bioemulsificantes (12). La cepa aislada en el presente trabajo e identificada como Sphingomonas paucimobilis, citada previamente como Pseudomonas paucimobilis, ha sido reportada por su capacidad de mineralizar el fenantreno, fluorantreno, xileno, tolueno, bifenilos, salicilato y hasta pesticidas como el lindano (15, 1, 5).

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental Respecto de Pseudomonas vesicularis ha sido aislada por Zanardini y col. (30) a partir de superficies de mármol expuestas al exterior durante años, e identificada con la misma metodología empleada en el presente trabajo; se demostró asimismo que esta especie es capaz de crecer en concentraciones altas de plomo (hasta 1500 ppm de Pb3O4). Los microorganismos pertenecientes al género Micrococcus poseen células esféricas, que pueden agruparse de a pares, tetradas o en forma irregular. Las colonias son pigmentadas. Son aerobios estrictos, su metabolismo es respiratorio con escasa o nula producción de ácido, y crecen bien en medios simples. La prueba de la catalasa es positiva, la de la oxidasa frecuentemente lo es aunque débilmente. En el caso de M. roseus, M. sedentarrius y M. varians, la prueba de la oxidasa es negativa (6). Son relativamente resistentes a un reducido potencial agua, toleran bien la desecación y la presencia de alto contenido en sales (hasta 7.5 %), característica que comparten con el género Pseudomonas (3, 9). Estas características son coincidentes con las del suelo del ambiente patagónico del que han sido aisladas las cepas identificadas en el presente trabajo. El género Micrococcus fue previamente aislado a partir de suelos contaminados con petróleo (21), a partir de muestras de suelo provenientes de una refinería y reportado por su capacidad de degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos (3). Asimismo se ha descripto la capacidad de este género de vivir en altas concentraciones de petróleo (8) así como la de degradar otros compuestos orgánicos como malatión y clorpirifos (20).

CONCLUSIONES En el presente trabajo se identificaron seis especies bacterianas: Pseudomonas paucimobilis, Sphingomonas vesicularis, Micrococcus sp., M. sedentarius, M. varians y M.roseus. El sistema informático Apilab Plus empleado probó ser una herramienta útil para la rápida identificación de las cepas mencionas. Dichas especies fueron aisladas a partir de muestras de suelo provenientes de un sitio que había sido destinado durante años a la disposición de agua de producción proveniente de la industria hidrocarburífera, y actualmente sometido a rehabilitación por biotratamiento. Los géneros mencionados son pobladores frecuentes de suelos y aguas sin contaminar. No obstante ello han sido reportados por su capacidad de degradar hidrocarburos así como también fueron aislados, como en este caso, de sitios contaminados con diferentes compuestos orgánicos presentes en los residuos de petróleo.

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