CARACTERIZACIÓN DE UNA VARIANTE DEL VIRUS MOSAICO DEL PEPINO (CMV) ASOCIADA CON LOS SÍNTOMAS DE MOTEADO AMARILLO DE LA AZUCENA (Hippeastrum×hybridum Leopoldii) EN MÉXICO CHARACTERIZATION OF A CUCUMBER MOSAIC VIRUS (CMV) STRAIN ASSOCIATED WITH YELLOW MOTTLE SYMPTOMS OF AMARYLLIS (Hippeastrum×hybridum Leopoldii) IN MÉXICO Cleopatra Gutiérrez-Villegas1, Roberto Ruiz-Medrano2, Elías Piedra-Ibarra3 y Rodolfo De La Torre-Almaráz3 1

Universidad Autónoma Chapingo. Departamento de Parasitología Agrícola. Carretera México-Texcoco km. 38.5. 56230, Chapingo, México. 2Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. Departamento de Biotecnología y Bioingeniería. Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508. 07300, San Pedro Zacatenco. 3FES-IZTACALA-UNAM. Unidad de Biotecnología y prototipos (UBIPRO). Avenida de los Barrios 1. 54090, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla. Estado de México. ([email protected])

RESUMEN

ABSTRACT

Se caracterizó una variante del virus mosaico del pepino (CMV. Cucumovirus.), perteneciente al subgrupo CMV-Ib, como el agente causal del moteado amarillo de la azucena (Hippeastrum× hybridum Leopoldii), procedente de viveros comerciales y jardines particulares en el Estado de México. La caracterización se realizó por amplitud de hospedantes indicadoras, morfología y tamaño de la partícula viral al microscopio electrónico y por la determinación del tipo de inclusión celular, pruebas serológicas (ELISA) y análisis electroforético de ARN viral de doble cadena (ARN-dc). Se caracterizó además, mediante reverso transcriptasa acoplada a reacción en cadena de la polimerasa (rt-PCR), utilizando dos juegos de oligonucleótidos específicos que amplifican los genes que codifican la proteína de la cápside (CP-3) y la proteína del movimiento (MP-3) del género Cucumovirus. Los síntomas del moteado amarillo de la azucena se reprodujeron parcialmente en el invernadero en plantas sanas de azucena por inoculación mecánica del CMV puro, separado de las plantas de azucena recolectadas en campo con los síntomas de moteado amarillo.

A strain of Cucumber Mosaic Virus (CMV, Cucumovirus), belonging to the subgroup CMV-Ib, was characterized as the causal agent of yellow mottle diseases in Amaryllis (Hippeastrum× hybridum Leopoldii) from commercial nurseries and home gardens in the State of México. The characterization was performed by indicator host range, morphology and size of viral particle under an electron microscope and determination of cellular viral inclusions, serological tests (ELISA) and electrophoretic analysis of viral dsRNA. It was also characterized by reverse transcriptase coupled to polimerase chain rection (rt-PCR), using two sets of specific primers that amplify the genes that codify the capsid (CP3) and movement protein (MP-3) genes of the Cucumovirus genus. The amaryllis yellow mottle symptoms were partially reproduced in healthy amaryllis plants under greenhouse conditions by mechanical transmission of pure extracts of CMV isolated from original amaryllis plants with yellow mottle collected in the field. Key words: CMV, ornamental plants, virus.

INTRODUCTION

Palabras clave: CMV, plantas ornamentales, virus.

I

INTRODUCCIÓN

n the Mexican Republic, ornamental horticulture is the most profitable activity within the agricultural sector. Around 270 species of plants are produced for ornamentals. Outstanding among the producer regions are the States of México, Morelos, Puebla, Veracruz and the Federal District, due to the value and volume of production (INEGI, 1998). An ornamental species that stands out for the variety and beauty of its flowers is amaryllis (Hippeastrum spp.), native to America and distributed from México to southern Brazil and Argentina; it is estimated that there are around 65 different species (Rees, 1992). In México they are found wild in almost all of the States of the Republic, and some domesticated species or hybrids are used to adorn public and private gardens. Amaryllis is cultivated

E

n la República Mexicana la horticultura ornamental es la actividad de más alta rentabilidad dentro del sector agrícola. Alrededor de 270 especies de plantas se producen con fines ornamentales destacando los Estados de México, Morelos, Puebla, Veracruz y el Distrito Federal, por el valor y el volumen de la producción (INEGI, 1998). Una especie ornamental que destaca por la variedad y belleza de sus flores son las azucenas (Hippeastrum spp.), originarias de América, que se distribuyen desde Recibido: Enero, 2003. Aprobado: Abril, 2004. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 38: 343-354. 2004.

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México hasta el sur de Brasil y Argentina; se calcula que existen alrededor de 65 especies diferentes (Rees, 1992). En México se encuentran en forma silvestre en prácticamente todos los Estados de la República, y algunas especies o híbridos ya domesticados se utilizan para adornar jardines públicos y privados. Las azucenas se cultivan a campo abierto, en invernadero o en viveros, produciéndose alrededor de 48,549 plantas anualmente, sobresaliendo por el volumen de producción los Estados de Tabasco y Veracruz (INEGI, 1998). Durante 2002 en viveros comerciales, jardines públicos y en algunos privados del Estado de México, se recolectaron plantas de azucena (Hippeastrum×hybridum Leopoldii) afectadas por una enfermedad de origen desconocido, cuyos síntomas principales fueron la presencia de un rayado o moteado de color amarillo intenso, en partes o en el total de las hojas (Figura 1A y B), posteriormente necrosis y defoliación total. Los daños fueron particularmente intensos antes y durante la floración, por lo que plantas pequeñas o jóvenes no presentaron síntomas. Se desconoce la distribución geográfica y los daños económicos directos que causa esta enfermedad en México. El análisis y diagnóstico patológico de hojas, tallos y raíz de las plantas afectadas, no mostraron signos de que esta enfermedad fuera causada por hongos, bacterias o nemátodos (datos no mostrados). Por tanto, se concluyó que el posible agente patógeno podría ser alguna clase de virus. En diferentes países donde se cultiva la azucena, se ha reportado sólo cuatro virus que afectan a esta planta: virus mosaico del Hippeastrum (MhiV. Potyvirus), virus

in open fields, greenhouses or nurseries, producing 48 549 plants a year; the States of Tabasco and Veracruz are outstanding for their volume of production (INEGI, 1998). In 2002, amaryllis (Hippeastrum×hybridum Leopoldii) plants affected by a disease of unknown origin were collected from commercial nurseries, and public and some private gardens in the State of México. The main symptoms were the presence of intense yellow streaks or mottle on parts or all of the leaf (Figure 1A and B), later necrosis and total defoliation. Damage was particularly intense before and during flowering, and thus small or young plants had no symptoms. The geographic distribution and the direct economic damage the disease causes in México are unknown. Pathological diagnosis and analysis of the leaves, stems and roots of affected plants revealed no sign that the disease was caused by fungi, bacteria or nematodes (data not shown). Threfore, it was concluded that the possible pathogen could be a type of virus. In different countries where amaryllis cultivated, only four viruses have been reported to affect this plant: Hippeastrum mosaic virus (MhiV. Potyvirus), Nerine latent virus (NeLV. Carlavirus), tomato spotted wilt virus (TSWV. Tospovirus), and cucumber mosaic virus (CMV. Cucumovirus) (Pirone, 1978; Schubert and Herwiing, 1990; Brunt et al., 1996; Albouy and Devergne, 2000). In México no information was found concerning diseases and pathogens that affect amaryllis; therefore, the objectives of this study were to identify and characterize the causal agent of yellow mottle on this plant.

MATERIALS AND METHODS A

B

Because of the possibility that the causal agent or agents of the yellow mosaic and mottle on amaryllis were viruses unknown in México, a series of diagnostic methods were used to characterize some of their biological properties (Dijkstra and De Jager, 1998) and appropriate taxonomic identification (Francki, 1991). Separation of virus and susceptibility tests in indicator hosts

Figura 1. Síntomas de moteado amarillo foliar en azucena (H.×leopoldii) en campo. Figure 1. Leaf yellow mottle symptoms in amaryllis (H.×leopoldii) in the field.

Portions of amaryllis leaves with symptoms, collected in the field, were macerated in a buffer solution (sodium phosphate 0.02 M, pH7). With a cotton-tipped stick, the macerate was rubbed onto the leaves of 18 different species of healthy seedlings with two true leaves, previously dusted with carborundum. The inoculated leaves were washed with water to eliminate macerate and carborundum residues. The separation of virus and the determination of its host range were replicated three times (May, 1985; Dijkstra and De Jager, 1998). The inoculated plants were incubated in a greenhouse at 25-35 oC, with a photoperiod of 12 h and relative humidity of 79-80%, until symptoms appeared, after 20 to 30 d. The seedlings of the inoculated indicator species were Nicotiana glutinosa L., N. benthamiana Domin.,

GUTIÉRREZ-VILLEGAS et al.: UNA VARIANTE DEL CMV ASOCIADA CON MOTEADO AMARILLO DE LA AZUCENA

latente del Nerine (NeLV. Carlavirus), virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV.Tospovirus), y virus mosaico del pepino (CMV. Cucumovirus) (Pirone, 1978; Schubert y Herwiing, 1990; Brunt et al., 1996; Albouy y Devergne, 2000). En México no se encontró información acerca de las las enfermedades y patógenos que afectan a la azucena; por tanto, los objetivos del presente trabajo fueron identificar y caracterizar al agente causal del moteado amarillo en esta planta.

MATERIALES Y MÉTODOS Por la posibilidad que el o los agentes causales del mosaico y moteado amarillo en azucena fueran virus desconocidos en México, se utilizó un conjunto de métodos de diagnóstico que permitieran la caracterización de algunas de sus propiedades biológicas (Dijkstra y De Jager, 1998) y su adecuada identificación taxonómica (Francki, 1991). Separación de virus y pruebas de susceptibilidad en hospedantes indicadoras Porciones de hojas de azucena con síntomas, recolectadas en campo, fueron maceradas en solución amortiguadora (fosfato de sodio 0.02 M, pH 7). El macerado se frotó utilizando un hisopo de algodón en hojas de 18 diferentes especies de plántulas sanas con 2 a 4 hojas verdaderas, previamente espolvoreadas con carborundum. Las hojas inoculadas fueron lavadas con agua para eliminar los residuos del macerado y del carborundum. La separación de virus y la determinación de su amplitud de hospedantes se repitió en tres ocasiones (May, 1985; Dijkstra y De Jager, 1998). Las plantas inoculadas se incubaron en invernadero a 25-35 oC, con un fotoperíodo de 12 h y humedad relativa de 70 a 80%, hasta la aparición de síntomas después de 20 a 30 d. Las plántulas de las especies indicadoras inoculadas fueron: Nicotiana glutinosa L., N. benthamiana Domin., N. rustica L., N. occidentalis Wheeler, N. tabacum var xanthi L., Capsicum annuum L., Lycopersicum esculentum M., Physalis ixocarpa B., Datura stramonium L., Cucurbita pepo L., Cucumis sativus L., Phaseolus vulgaris L., Pisum sativum L., Vicia faba L., Vigna unguiculata (L.) Walp. Tvu 612, Chenopodium amaranticolor Coste & Reyn., Ch. quinoa Willd., Gomphrena globosa L. (Kaper y Waterworth, 1981; Daniels y Campbell, 1992). Detección por serología (DAS-ELISA) Se utilizó la técnica de inmunoadsorción enzimática en fase sólida de doble sándwich (DAS-ELISA), durante dos días (Clark y Adams, 1977), con el fin de detectar infecciones virales en muestras de campo, hospedantes indicadoras y de virus purificados. Se utilizaron antisueros policlonales comerciales (Agdia, Co), para la detección de posibles infecciones de los virus mancha anular del tabaco (TRSV), mosaico del pepino (CMV), jaspeado del tabaco (TEV), mosaico de la alfalfa (AMV), marchitez manchada del tomate (TSWV) y el causante de la mancha necrótica del impatiens (INSV), virus que por su

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N. rustica L., N. occidentalis Wheeler, N. tabacum var. xanthi L., Capsicum annuum L., Lycopersicum esculentum M., Physalis ixocarpa B., Datura stramonium L., Cucurbita pepo L, Cucumis sativus L., Vigna unguiculata (L.) Walp. Tvu 612, Chenopodium amaranticolor Coste & Reyn., Ch. quinoa Willd., and Gomphrena globosa L. (Kaper and Waterworth, 1981; Daniels and Campbell, 1992). Detection by serology (DAS-ELISA) The technique solid phase double sandwich enzyme-linked immunoadsorbent assay (DAS-ELISA) was utilized over two days (Clark and Adams, 1977), to detect viral infections in field samples, indicator hosts and purified viruses. Commercial polyclonal antiserums (Agdia Co.) were used to detect possible infections of tobacco ring spot virus (TRSV), cucumber mosaic virus (CMV), tobacco etch virus (TEV), alfalfa mosaic virus (AMV), tomato spotted wilt virus (TSWV), and impatiens necrotic spot virus (INSV), which by its distribution could be infecting the collected samples of amaryllis (Albouy and Devergne, 1000; De La Torre et al., 1998). Absorbance of the possible antigen-antibody reactions were recorded in a Microlector with a 492 nm filter, about 20 to 30 min after the addition of the substrate. The reaction was considered positive if absorbance was equal to or above the reading of the positive control for the tested viruses. Pathogenicity tests Five amaryllis plants cultivated in the greenhouse with 30 cm long leaves were selected. A piece of one leaf per plant was used for the ELISA serological detection tests, using the polyclonal antiserums for specific detection of TEV, CMV, AMV, TRSV, INSV, and TSWV. After determining that none of the plants was infected by virus, all were inoculated mechanically with the macerate of the N. rustica leaves with symptoms of mosaic and concentric rings, which had been inoculated 25 d before with extracts of amaryllis plants with yellow mottle. The plants were kept under greenhouse conditions 25-35 oC, with a photoperiod of 12 h and relative humidity of 70-80% until symptoms appeared (Dijkstra and De Jager, 1998). Purification of virus, production and titration of specific antiserum The virus causing yellow mottle and mosaic in amaryllis was purified by differential double centrifuge (Scott, 1963), utilizing N. rustica tissue inoculated by mechanical transmission 20 d before purification with the virus separated from amaryllis plants with yellow mottle symptoms. The specific antiserum for this virus was obtained by intramuscular injections of 0.5 mL of the purified virus mixed with 0.5 mL of the Freud adjuvant into a New Zealand rabbit (weighing approximately 2 kg) on five successive occasions at intervals of 8 d. Eight days after the last injection, the rabbit was totally bled, and the antiserum was obtained by coagulation and centrifugation of the hematic liquid, which was kept in glass tubes at –20 °C for its later titration by means of double diffusion in agar (DDA) tests. As positive controls macerates

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distribución en México podrían estar infectando a las muestras de azucena recolectadas (Albouy y Devergne, 2000; De La Torre et al., 1998). La absorbencia de las posibles reacciones antígeno-anticuerpo se registraron en un Microlector con filtro de 492 nm, alrededor de 20 a 30 min después de la adición del sustrato. La reacción se consideró positiva si la absorbencia era igual o superior a la lectura del control positivo para los virus probados. Pruebas de patogenicidad

of amaryllis leaves with yellow mottle symptoms were used, and as negative controls, N. rustica leaf extracts (Ball, 1990; Brakke, 1990). Electron microscopy A drop (50 mL) of purified virus was placed on a copper grid covered with forvan. The sample was fixed with glutaraldehyde and dyed with uranyl acetate. Observations of viral particles were made with an electron microscope Mod. JEOL 100 CX (Kijkstra and De Jager, 1998).

Se seleccionaron cinco plantas de azucena cultivadas en el invernadero con hojas de unos 30 cm de longitud, y un trozo de una hoja por planta se usó para las pruebas de detección serológica de ELISA, utilizando los antisueros policlonales para detección específica de TEV, CMV, AMV, TRSV, INSV y TSWV. Después de determinar que ninguna planta estaba infectada con virus, todas se inocularon mecánicamente con el macerado de hojas de N. rustica, con síntomas de mosaico y anillos concéntricos, las cuales se inocularon 25 d antes con extractos de plantas de azucena con moteado amarillo. Las plantas se conservaron en invernadero a 25-35 oC, con un fotoperíodo de 12 h y

The type of viral inclusions was determined in N. rustica plants that were inoculated mechanically with extracts of sap from amaryllis plants with symptoms of yellow mottle, utilizing strips of epidermic tissue submerged 5 min in Triton×100. Later, they were dyed with methyl green rodamin for 15 min. The tissue strips were washed with distilled water and mounted on a slide and slide cover with a drop of glycerin for later observation under a compound microscope (Cardenas, 1999).

humedad relativa de 70 a 80% hasta la aparición de síntomas (Dijkstra y De Jager, 1998).

Extraction and analysis of double stranded RNA

Purificación de virus, obtención y titulación de antisuero específico El virus causante del moteado y mosaico amarillo de la azucena fue purificado por doble centrifugación diferencial (Scott, 1963), utilizando tejido de N. rustica, inoculada por transmisión mecánica 20 d antes de la purificación con el virus separado de plantas de azucena con síntomas de moteado amarillo. El antisuero específico para este virus se obtuvo inyectando 0.5 mL del virus purificado mezclado con 0.5 mL de adyuvante de Freud intramuscularmente a un conejo Nueva Zelanda (aproximadamente 2 kg de peso), en cinco ocasiones sucesivas y a intervalos de 8 d. Ocho días después de la última inyección, el conejo fue sangrado totalmente y el antisuero se obtuvo por coagulación y centrifugado del líquido hemático, conservándolo en tubos de vidrio a −20 oC para su titulación posterior mediante pruebas de doble difusión en agar (DDA). Como testigos positivos se utilizaron macerados de hojas de azucena con síntomas de moteado amarillo y como testigos negativos extractos de hojas de N. rustica (Ball, 1990; Brakke, 1990). Microscopía electrónica En una rejilla de cobre cubierta con forvan se colocó una gota (50 mL) del virus purificado, fijando la muestra con glutaraldehido y tiñéndola con acetato de uranilo. Las observaciones de partículas virales se realizaron con un microscopio electrónico de transmisión Mod. JEOL 100 CX (Dijkstra y De Jager, 1998). Microscopía de luz Se determinó el tipo de inclusiones virales en plantas de N. rustica inoculadas mecánicamente con extractos de savia de plantas de azucena

Light microscopy

To determine the number of viral components and to detect possible latent infections by unknown viruses (Valverde et al., 1990), double stranded RNA (dsRNA) was obtained from N. rustica leaves, a species that exhibited severe symptoms of mosaic and mottle, inoculated 25 d before with extracts of amaryllis leaves with yellow mottle. To demonstrate the nature of dsRNA of the viral nucleic acid of the inoculated plants, part of the dsRNA was treated independently, and before electrophoresis, with pancreatic DNase and RNase, using 40 µL ds-RNA from the sample and 1 µL of DNase or RNase incubated for 1 h at 35 oC, to perform electrophoresis immediately (Dijkstra and DeJager, 1998). The ds-RNA was analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gels (6%), using a minigel (1.75 mm × 7 cm × 8 cm) mounted on a double Biorad camera. The volume of the ds-RNA extract from the samples was 40 µL per track. Samples of dsRNA of CMV or TMV from tobacco (N. tabacum) plants infected naturally, were included as molecular weight markers to calculate molecular weight. The conditions of electrophoresis were 100 volts for 2:15 h at laboratory temperature. The gels were dyed with a solution of silver nitrate (0.011 M) (Valverde et al., 1990). Inverse transcription linked to the chain reaction of the polymerase (rt-PCR) Total RNA was obtained from 5.0 g of tissue from N. glutinosa, C. pepo or N. rustica, previously inoculated with sap from diseased amaryllis following the protocol proposed by Sambrook et al. (1989). For cDNA synthesis, 1 mL of RNA from the sample (concentration of 100ng) was placed in a microcentrifuge tube with 1 µL of CMV/ CPF oligonucleotide (5’-ATG GAC AAA TCT GAA TCA ACC AGT GCY GGT-3’) and 1 µL of the CMV/CPR oligonucleotide (5’-TCA

GUTIÉRREZ-VILLEGAS et al.: UNA VARIANTE DEL CMV ASOCIADA CON MOTEADO AMARILLO DE LA AZUCENA con síntomas de moteado amarillo, utilizando tiras de tejido epidérmico sumergidas por 5 min en Tritón×100. Posteriormente se tiñeron con rodamina verde de metilo por 15 min. Las tiras de tejido se lavaron con agua destilada y se montaron en un porta y cubreobjetos con una gota de glicerina, para posteriormente observarlas al microscopio compuesto (Cárdenas, 1999). Extracción y análisis de ARN de doble cadena Con el objeto de determinar el número de componentes virales y para detectar posibles infecciones latentes por virus desconocidos (Valverde et al., 1990), se obtuvo ARN de doble cadena (ARN-dc) a partir de hojas de N. rustica, especie que mostró síntomas severos de mosaicos y moteados, inoculadas 25 d antes con extractos de hojas de azucena con moteado amarillo. Para demostrar la naturaleza del ARNdc del ácido nucleico viral obtenido de las plantas inoculadas, parte del ARN-dc y previo a la electroforesis, fue tratado independientemente con DNasa y RNAsa pancreática, utilizando 40 µL de RNAcd de la muestra y 1 µL de DNasa o RNasa, incubado por 1 h a 35 oC, para inmediatamente realizar la electroforesis (Dijkstra y De Jager, 1998). El ARN-dc se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida (6%), utilizando un minigel (1.75 mm × 7 cm × 8 cm) montado en una cámara Biorad doble. El volumen del extracto de ARN-dc viral de las muestras fue 40 µL por carril. Se incluyeron como marcadores de peso molecular muestras de ARN-dc de CMV o TMV, procedentes de plantas de tabaco (N. tabacum) infectadas naturalmente, para calcular el peso molecular. Las condiciones de electroforesis fueron a 100 voltios por 2:15 h a temperatura de laboratorio. Los geles fueron teñidos con solución de nitrato de plata (0.011 M) (Valverde et al., 1990). Transcripción inversa ligada a la reacción en cadena de la polimerasa (rt-PCR) Se obtuvo ARN total de 5.0 g de tejido de N. glutinosa, C. pepo o de N. rustica, previamente inoculadas con savia de azucena enfermas, utilizando el protocolo propuesto por Sambrook et al. (1989). Para la síntesis de cDNA se colocó en un tubo de microcentrífuga 1 mL de ARN de la muestra (concentración de 100 ng), 1 µL del oligonucleótido CMV/CPF (5’-ATG GAC AAA TCT GAA TCA ACC AGT GCY GGT- 3’) y 1 mL del oligonucleótido CMV/CPR (5’- TCA RAC TGG AGC ACC CCA GAY GTG GGA ATA-3’), concentración de 10 mM, que amplifican un fragmento de 650 pb de la proteína de la cápside de CMV. En otra reacción se usó 1 µL del oligonucleótido CMV/MPF (5’-ATG GCT TTC CAA GGT ACC AGT AGG-3’) y 1 µL del oligonucleótido CMV/MPR (3’-CTA AAG ACC GTT AAC CAC CTG CGA-5’), concentración de 10 mM, que amplifican un fragmento de 850 pb de la proteína del movimiento de CMV. Ambos pares de oligonucleótidos fueron diseñados en nuestro laboratorio utilizando secuencias conservadas de la región de la proteína de la cápside (CP-3) y de la proteína del movimiento (MP-3) de las variantes de CMV disponibles en el GenBank (NCBI, 2000). La mezcla se incubó a 72 oC durante 10 min, se centrifugó por 30 s a 6500 g, y se incubó en hielo. En otro tubo de microcentrífuga se

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RAC TGG AGC ACC CCA GAY GTG GGA ATA-3’), concentration of 10 mM, which amplify a fragment of 650 pb of the CMV capsid protein. In another reaction 1 µL of the CMV/MPF oligonucleotide (5’-ATG GCT TTC CAA GGT ACC AGT AGG-3’) and 1 µL of the CMV/MPR oligonucleotide (3’-CTA AAG ACC GTT AAC CAC CTG CGA-5’), concentration of 10 mM, were used; they which amplify a 850 pb fragment of the CMV movement protein. Both pairs of oligonucleotides were designed in our laboratory using sequences conserved from the region of the capsid protein (CP-3) and from the movement protein (MP-3) of the CMV variants available in the GeneBank (NCBI, 2000). The mixture was incubated at 72 oC for 10 min and centrifuged for 30 s at 6500 g, and it was incubated on ice. In another microcentrifuge tube a second mixture was prepared with 2 µL of first-chain buffer for superscript (Invitrogen) 5x, 1 µL 20 mM of DTT, 1 µL of dNTP’S at 10 mM per nucleotide. The mixture was added to the first tube and 1 µL of transcriptase inverse Superscript II (Invitrogen) was added. The total mixture was incubated at 42 oC for 90 min (Sambrook et al., 1989). The polymerase chain reaction (PCR) was carried out by mixing, in a 250 mL tube, 2.5 µL of PCR 10x buffer solution (Tricine-KOH, pH 9, 40 mM, Kac 15 mM, MgAc 3.5 mM, BSA 3.75 µg mL−1), 20 µL water, 0.5 µL oligonucleotide CMV/CPF, 0.5 µL oligonucleotide CMV/CPR, 2.5 µL dNTP’S 10 mM, 2 µL cDNA, and 1 µL Tac polymerase (Perkin-Elmer). The mixture was placed in a thermocycler (Gene Amp PCR System 2400), using the following program of amplification: denaturalization for 2 min at 95 oC, pairing for 2 min at 56 oC, and extension for 2 min at 72 oC, for 31 cycles. The products of PCR were analyzed by electrophoresis in 1.0% agarose gels, and their molecular weight was calculated by comparison with the molecular weight marker 1kb plus (GIBCO BRL) that was included in the same gel. The conditions of electrophoresis were 65 volts/80 min at laboratory temperature (Sambrook et al., 1989).

RESULTS AND DISCUSSION Separation of viruses and tests of susceptibility in indicator hosts Several species of indicator plants inoculated mechanically with the macerates of amaryllis leaves with yellow mottle exhibited symptoms 8 to 15 d after being kept in the greenhouse, and were associated with those typically caused by some class of virus. The virus separated from amaryllis plants affected 50% of the hosts used as indicators. In some hosts, severity of the symptoms caused by this virus was outstanding: mosaic with chlorotic rings and severe leaf deformation in N. rustica (Figure 3A), mosaic and severe leaf deformation in N. glutinosa (Figure 3B), and localized necrotic lesions in V. unguiculata (Figure 3C). However, it was significant that in other species of Solanaceas and Legumes no visible symptoms of the viral infection were manifested (Table 1).

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preparó una segunda mezcla con 2 µL de amortiguador de primera cadena para superscript (Invitrogen) 5x, 1 µL 20 mM de DTT, 1 µL de dNTPs a 10 mM por nucleótido. La mezcla se agregó al primer tubo y se adicionó 1 µL de transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). La mezcla total se incubó a 42 oC durante 90 min (Sambrook et al., 1989). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo mezclando en un tubo de 250 mL, 2.5 µL de solución amortiguadora PCR 10x (Tricina-KOH, pH 9, 40 mM, Kac 15 mM, MgAc 3.5 mM, BSA 3.75 µg mL−1), 20 µL de agua, 0.5 µL del oligonucleótido CMV/CPF, 0.5 µL del oligonucleótido CMV/CPR, 2.5 µL de dNTPs 10 mM, 2 µL de cDNA y 1 µL de Taq polimerasa (Perkin-Elmer). La mezcla se colocó en un termociclador (GeneAmp PCR System 2400), utilizando el siguiente programa de amplificación: desnaturalización 2 min a 95 oC, apareamiento 2 min a 56 oC y extensión por 2 min a 72 oC, por 31 ciclos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.0%, y su peso molecular se calculó por comparación con el marcador de peso molecular 1kb plus (GIBCO BRL) que se incluyó en el mismo gel. Las condiciones de electroforesis fueron 65 voltios/80 min a temperatura de laboratorio (Sambrook et al., 1989).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Separación de virus y pruebas de susceptibilidad en hospedantes indicadoras Varias especies de las plantas indicadoras inoculadas mecánicamente con los macerados de hojas de azucena con el moteado amarillo, mostraron síntomas entre 8 y 15 d después de permanecer en el invernadero y se asociaron a los causados típicamente por alguna clase de virus. El virus separado de plantas de azucena afectó 50% de las hospedantes utilizadas como indicadoras. En algunas hospedantes destacó la severidad de síntomas causados por este virus: mosaico con anillos cloróticos y deformación severa de hojas en N. rustica (Figura 3A), mosaico y deformación severa de las hojas en N. glutinosa (Figura 3B) y las lesiones locales necróticas en V. unguiculata (Figura 3C). Sin embargo, fue significativo que en otras especies de Solanaceas y Leguminosas no se manifestaron síntomas visibles de la infección viral (Cuadro 1). Detección por serología (DAS-ELISA) Las pruebas realizadas con esta técnica permitieron detectar únicamente infecciones por el virus mosaico del pepino (CMV) en el material de azucena afectado, obteniéndose lecturas promedio de absorbencia (0.658) mayores al testigo negativo (0.046), pero no diferentes del testigo positivo (0.594). Datos similares se obtuvieron en algunas de las plantas inoculadas con este virus y utilizadas como hospedantes indicadoras.

Detection by serology (DAS-ELISA) The tests conducted with this technique detected only infections by the cucumber mosaic virus (CMV) in the affected amaryllis tissue, obtaining average absorbance readings (0.658) higher than the negative control (0.046), but not different from the positive control (0.594). Similar data were obtained in some of the plants inoculated with this virus and used as indicator hosts. Considering the observed symptoms in N. glutinosa, C. pepo and V. unguiculata plants inoculated mechanically, used as differential species to group numerous variants of identified CMV, and that coincide even with the serological subgroups used to identify this virus, and the serological ELISA tests, it was determined that the amaryllis plants with yellow mottle symptoms were infected only by a variant of CMV, belonging to the 1b subgroup (Francki, 1991; Brunt et al., 1996; Kaper and Waterworth, 1981). The CMV variants can be associated in two groups: CMV-I and CMV-II. The first predominates in the tropics and subtropics, causing symptoms even at temperatures above 32 oC, and thus is considered thermoresistant. This group of variants can be grouped in Ia and Ib for the type of symptoms that certain hosts exhibit with mechanical transmission. C. pepo, N. glutinosa, and V. unguiculata exhibit only mosaic when inoculated with variants of the subgroup Ia, but the variants of the subgroup Ib induce Cuadro 1. Relación de virus y pruebas de susceptibilidad en hospedantes indicadoras, inoculadas con el virus mosaico del pepino (CMB-Ib) separado de plantas de azucena con síntomas de moteado amarillo. Table 1. List of viruses and susceptibility tests in indicator hosts inoculated with the cucumber mosaic virus (CMV-Ib) separated from amaryllis plants with yellow mottle symptoms. Hospedante Nicotiana glutinosa N. rustica N. occidentalis N. benthamiana N. tabacum var. Xanthi Lycopersicum esculentum Capsicum annuum Datura stramonium Physalis ixocarpa Cucurbita pepo Cucumis sativus Chenopodium amaranticolor Gomphrena globosa C. quinoa Vigna unguiculata Vicia faba Pisum sativum Phaseolus vulgaris

Síntomas Mosaico Mosaico Sin síntomas Mosaico Anillos necróticos, patrones perineales y mosaico Sin síntomas Sin síntomas Sin síntomas Sin síntomas Mosaico Mosaico Lesiones locales cloróticas Sin síntomas Lesiones locales necróticas Lesiones locales necróticas Sin síntomas Sin síntomas Sin síntomas

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Considerando los síntomas observados en plantas de N. glutinosa, C. pepo y V. unguiculata inoculadas mecánicamente, utilizadas como especies diferenciales para clasificar en grupos y subgrupos las numerosas variantes identificadas de CMV, y que coincide incluso con los subgrupos serológicos utilizados para identificar este virus, y las pruebas serológicas de ELISA, se determinó que las plantas de azucena con síntomas de moteado amarillo, estaban infectadas sólo por una variante de CMV, perteneciente al subgrupo Ib (Francki, 1991; Brunt et al., 1996; Kaper y Waterworth, 1981). Las variantes de CMV se pueden asociar en dos grupos: CMV-I y CMV-II. El primero predomina en los trópicos y subtrópicos, causando síntomas aún a temperaturas mayores de 32 oC, por lo que se le considera termorresistente. Este grupo de variantes se puede asociar en los subgrupos Ia y Ib por el tipo de síntomas que presentan ciertos hospedantes por transmisión mecánica. C. pepo, N. glutinosa y V. unguiculata manifiestan sólo mosaico cuando se inoculan con variantes del subgrupo Ia, pero las variantes del subgrupo Ib inducen lesiones locales necróticas en V. unguiculata. Las variantes en el subgrupo II se encuentran en regiones templadas y causan síntomas a 25 oC, pero no a 32 oC, por lo que se consideran termosensibles. Inducen mosaico en C. pepo, lesiones locales necróticas severas en N. glutinosa y lesiones locales necróticas en V. unguiculata (Daniels y Campbell, 1992). La variante del virus aislado de plantas de azucena pertenece al subgrupo CMV-Ib, ya que varias de sus características coincidieron con las observadas en las plántulas inoculadas Sin embargo, el aislamiento de CMV de la azucena es una variante con características muy particulares, que la hace diferente de otros aislamientos comunes de CMV-Ib encontrados en México, ya que no causó síntomas en algunas de las especies de plantas indicadoras que son susceptibles a otros aislamientos de CMV. Por tanto, es posible que sea una variante no reportada previamente en nuestro país (De La Torre et al., 1998; De La Torre, 2002). El CMV es uno de los 10 virus de plantas más importantes en el mundo por su gran número de variantes y por su amplia distribución geográfica, favorecida por numerosas especies de áfidos vectores eficientes de este virus, así como por los daños que causa a una gran cantidad de especies de plantas de interés económico (Valverde 1984; Holcomb y Valverde, 1991; Brunt et al., 1996). No se obtuvo evidencia de la presencia de otros virus diferentes al CMV en el material de azucena con moteado amarillo, en los ensayos de transmisión mecánica a hospedantes indicadoras, en las pruebas serológicas de ELISA con los antisueros ensayados en el material original, o en los hospedantes inoculados artificialmente.

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localized necrotic lesions in V. unguiculata. The variants in subgroup II are found in temperate regions, and cause symptoms at 25 oC, but not at 32 oC, and are thus considered thermosensitive. They induce mosaic in C. pepo, severe localized necrotic lesions in N. glutinosa, and localized necrotic lesions in V. unguiculata (Daniels and Campbell, 1992). The variant of the virus isolated from amaryllis plants belongs to the subgroup CMV-Ib, since several of its characteristics coincide with those observed in the inoculated seedlings. However, the CMV isolated from amaryllis is a variant with very peculiar characteristics that make it different from other common isolation of CMV-Ib found in México, since it did not cause symptoms in some of the indicator plant species that are susceptible to other CMV isolates. Therefore, it is possible that it is a variant not previously reported in our country (De la Torre et al., 1998; De la Torre, 2002). CMV is one of the 10 most important plant viruses in the world because of it large number of variants and because of its wide geographic distribution, favored by numerous species of aphids, efficient vectors of this virus, as well as for the damage it causes to a large number of economically important plant species (Valverde, 1984; Holcomb and Valverde, 1991; Brunt et al., 1996). No evidence was obtained of the presence of other viruses different from CMV in the amaryllis material with yellow mottle, in the tests of mechanical transmission to indicator hosts, in ELISA serological tests with tested antiserums in the original material, or in the hosts inoculated artificially. The viruses reported in amaryllis in Asia, Europe and America indicate that this plant is affected by the Hippeastrum mosaic virus (MhiV. Potyvirus), Nerine latent virus (NelV. Carlavirus), Tomato spotted wilt virus (TSWV. Tosporvirus) and Cucumber mosaic virus (CMV), which are transmitted mechanically and by insect vectors to several of the host plants used in this study (Pirone, 1978; Brunt et al., 1996; Albouy and Vevergne, 2000). Pathogenicity tests Pathogenicity tests, inoculating healthy amaryllis leaves, using CMV obtained from amaryllis plants with yellow mottle symptoms, separated and increased in N. rustica plants, caused a slight mosaic with a light yellow color, irregular concentric rings, and later yellow mottle (Figure 2). In spite of the fact that these symptoms were not totally identical to those observed in amaryllis plants collected in the field and that it took more than eight months to appear in material inoculated in the greenhouse, only CMV was detected by serology (ELISA) and separated

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Los virus reportados en azucena en Asia, Europa y América indican que esta planta es afectada por los virus mosaico del Hippeastrum (MhiV. Potyvirus), latente de la Nerina (NeLV. Carlavirus), marchitez manchada del tomate (TSWV. Tospovirus) y por el mosaico del pepino (CMV), los cuales son transmitidos mecánicamente y por insectos vectores a varias de las plantas hospedantes utilizadas en este trabajo (Pirone, 1978; Brunt et al., 1996; Albouy y Devergne, 2000). Pruebas de patogenicidad Las pruebas de patogenicidad inoculando hojas de azucena sanas, utilizando el CMV obtenido de plantas de azucena con síntomas de moteado amarillo, que se separó e incrementó en plantas de N. rustica, causó un mosaico ligero de color amarillo claro, anillos concéntricos irregulares y después moteado de color amarillo (Figura 2). A pesar de que estos síntomas no fueron totalmente idénticos a los observados en las plantas de azucena recolectadas en campo y que tardaron más de ocho meses en aparecer en el material inoculado en el invernadero, se detectó por serología (ELISA) y separó únicamente al CMV sólo en las plantas inoculadas. Por tanto, se concluyó que el agente causal del moteado amarillo de la azucena es una variante del virus mosaico del pepino (CMV), perteneciente al subgrupo Ib, que coincide parcialmente con los virus reportados en esta planta en el mundo (Albouy y Devergne, 2000). El retraso en la aparición de síntomas en las plantas de azucena inoculadas en el invernadero, indicó que las condiciones ambientales en el invernadero, la edad de la planta e incluso la variedad de azucena utilizada fueron factores que afectaron la virulencia del CMV y limitaron la expresión total de los síntomas del moteado amarillo.

only in the inoculated plants. Therefore, it was concluded that the causal agent of yellow mottle in amaryllis is a variant of the cucumber mosaic virus (CMV), belonging to the subgroup IB, which coincides partially with the viruses reported in this plant over the world (Albouy and Devergen, 2000). The delay in the appearance of symptoms in inoculated amaryllis plants in the greenhouse indicated that the environmental conditions of the greenhouse, the age of the plant and even the variety of amaryllis used were factors that affected the virulence of CMV and limited the total expression of yellow mottle symptoms. Purification of the virus, preparation and titration of the specific antiserum One virus from N. rustica plants inoculated previously with CMV-Ib separated from amaryllis, was purified by differential centrifugation. However, absorbance of the final purification product was 2.81/1.9 to 260/280, respectively, indicating a low concentration of viral particles. The double diffusion assay used for titration of the antiserum obtained from the rabbit immunized with purified CMV was positive only in the 1/1 and ¼ dilutions, forming a tenuous halo of precipitation in the wells where the extract of infected amaryllis and N. rustica plants was placed. Because titration of the obtained antiserum was low, the technique of purification of this virus should be improved, since although most of the variants of CMV are immunogenic to a medium degree, they are also unstable

Purificación de virus, elaboración y titulación de antisuero específico Se purificó por centrifugación diferencial a un virus de plantas de N. rustica, inoculadas previamente con el CMV-Ib separado de azucena. Sin embargo, la absorbancia del producto final de la purificación fue de 2.81/1.9 a 260/280, respectivamente, lo que indicó una baja concentración de partículas virales. El ensayo de doble difusión utilizado para la titulación del antisuero obtenido del conejo inmunizado con CMV purificado, fue positivo sólo en las diluciones 1/1 y 1/4, formándose un ligero halo de precipitación en los pozos donde se colocó el extracto de plantas de azucena y N. rustica infectadas con el virus. Por el bajo título del antisuero obtenido, se debe mejorar la técnica de

Figura 2. Síntomas de moteado amarillo foliar en azucena inoculado mecánicamente, en invernadero. Figure 2. Yellow mottle symptoms on amaryllis leaf mechanically inoculated in a greenhouse.

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A

B

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C

Figura 3. Síntomas causados por el virus aislado de plantas de azucena con “moteado amarillo”: A) Moteado y mosaico en N. rustica; B) mosaico en N. glutinosa; C) lesiones locales necróticas en V. unguiculata. Figure 3. Symptoms caused by the virus separated from amaryllis plants with “yellow mottle”: A) Mottle and mosaic on N. rustica; B) mosaic on N. glutinosa; C) localized necrotic lesions on V. unguiculata.

purificación de este virus, ya que aunque la mayoría de las variantes de CMV son medianamente inmunogénicas, también son inestables durante el proceso de purificación; esto al parecer influyó en el bajo título del antisuero obtenido. Microscopía electrónica Las preparaciones hechas en rejillas de cobre a partir del virus separado y purificado de azucena mostraron un solo tipo de partícula, con simetría icosahédrica y aproximadamente 30 nm de diámetro (Figura 5), que corresponde a las características descritas para CMV (Brunt et al., 1996). No se observaron partículas de varilla flexible o rígida, o partículas isométricas que pudieran corresponder a virus reportados en otras partes del mundo para la azucena, como algunas especies de Potyvirus, Carlavirus o Tospovirus (Albouy y Devergne, 2000). Microscopía de luz Las muestras de epidermis procesadas a partir de N. rustica inoculadas con el CMV de la azucena, presentaron únicamente inclusiones de tipo cristalinas localizadas en el citoplasma y en el núcleo, con bordes angulosos (Figura 4). Sin embargo, para este virus se reportan inclusiones de otros tipos, incluyendo las cristalinas, amorfas, nucleonales, vacuolares y citoplásmicas (Cárdenas, 1999). Aunque el diagnóstico con inclusiones celulares inducidas por una infección viral no es definitivo por sí solo, éste permite aproximaciones sobre la identidad del virus asociado a una enfermedad. En el caso del virus separado de la azucena con síntomas de moteado

during the process of purification; this apparently had an influence on the low titration of the antiserum obtained. Electron microscopy The preparations on copper grids of the virus separated and purified from amaryllis showed only one type of particle, with icosahedric symmetry, approximately 30 nm in diameter (Figure 5), which corresponds to the characteristics described for CMV (Brunt et al., 1996). No particles with flexible or rigid rods, or isometric particles that could correspond to viruses reported in other parts of the world for amaryllis, such as some species of Potyvirus, Carlavirus or Tospovirus (Albouy and Devergne, 2000), were observed. Light microscopy The samples of epidermis processed from N. rustica inoculated with CMV from amaryllis only had inclusions of the crystalline type localized in the cytoplasm and the nucleus, with angular edges (Figure 4). However, for this virus inclusions of other types are reported, including crystalline, amorphous, nucleolar, vacuolar and cytoplasmic (Cardenas, 1999). Although the diagnosis with cellular inclusions induced by a viral infection is not definitive in itself, this allows approximations to the identity of the virus associated with a disease. In the case of the virus separated from amaryllis with chlorotic mottle, the type of cellular inclusions indicated a very close approximation that these corresponded to CMV and that no inclusions of other common plant viruses were found.

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A

B

Figura 4. Inclusiones cristalinas citoplásmicas (A) y cristalinas nucleares (B) inducidas por CMV en N. rustica, separado de azucena con síntomas de moteado amarillo. Figure 4. Crystalline cytoplasmic (A) and nuclear (B) inclusions induced by CMV in N. rustica separated from amaryllis with yellow mottle symptoms.

Figura 5. Partículas virales del tipo icosahédrica, 30 nm, de CMV en N. rustica, separado de azucena con síntomas de moteado amarillo. Figure 5. Icosahedric type viral particles, 30 nm, of CMV on N. rustica, separated from amaryllis with yellow mottle symptoms.

clorótico, el tipo de inclusiones celulares indicaron con mucha aproximación que éstas correspondían al CMV y que no se encontraban inclusiones de otros virus comunes en plantas.

Analysis of double stranded RNA (dsRNA)

Análisis de ARN de doble cadena (ARN-dc) El análisis electroforético en geles de poliacrilamida al 6% de ARN-dc extraído de plantas de N. rustica, con síntomas de mosaico con anillos cloróticos, producto de la inoculación con extractos de hoja de azucena con síntomas de origen viral, mostró un perfil electroforético compuesto de cuatro bandas de ARN-cd, cuyos pesos fueron 2.0, 1.9, 1.3 y 0.5 x 106 Daltons (Figura 6 carril A). El patrón electroforético de cuatro bandas de ARNdc fue similar al del ARN-cd de un aislamiento de CMV que se colocó como muestra positiva (Figura 6 carril D). No se observó ninguna banda cuando se agregó RNasa a los extractos de ARN-dc obtenidos de N. rustica con síntomas de mosaico con anillos cloróticos (Figura 6 carril B). El patrón electroforético de cuatro bandas, típico de CMV, se conservó aún con el tratamiento de DNasa (Figura 6 carril C). Finalmente, los análisis electroforéticos de hojas de azucena con síntomas moteado amarillo, mostraron únicamente el patrón de cuatro bandas de ARNdc característico de CMV. No se observaron patrones electroforéticos diferentes al de CMV, por lo que se estableció que el genomio del virus, separado de plantas de azucena con síntomas del moteado amarillo, coincide con el patrón electroforético típico de CMV (Valverde et al., 1990).

The electrophoretic analysis in 6% polyacrylamide gels of dsRNA extracted from N. rustica plants with chlorotic ring mosaic symptoms, product of inoculation with extracts of amaryllis leaves with viral symptoms, showed an electrophoretic profile composed of four tracks of ds-RNA, whose weights were 2.0, 1.9, 1.3 and 0.5×106 Daltons (Figure 6 track A). The electrophoretic pattern of four dsRNA tracks was similar to that of the dsRNA of a CMV isolation that was used as a positive sample (Figure 6 track D). No track was observed when RNase was added to the ds-RNA extracted from N. rustica with mottle symptoms with chlorotic rings (Figure 6 track B). The electrophoretic pattern of four tracks, typical of CMV, remained even with the DNase treatment (Figure 6 track C). Finally, the electrophoretic analysis of amaryllis leaves with yellow mottle symptoms exhibited only the pattern of four tracks of ds-RNA characteristic of CMV. No electrophoretic patterns different from CMV were observed, and thus it was established that the genome of the virus separated from amaryllis plants with yellow mottle symptoms coincides with the electrophoretic pattern typical of CMV (Valverde et al., 1990). Inverse transcription linked to the polymerase chain reaction (rt-PCR) The rt-PCR assay allowed us to amplify and obtain fragments whose size coincided with the expected, predicted fragments when both pairs of oligonucleotides

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B

C

D

PM×106

2.0 1.9 1.3

0.5

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were designed. A fragment of 650 pb, the expected size, was obtained from a region of the capsid protein gene when the CMV CPF/CPR oligonucleotides were used (Figure 7 track B). Also, an 850pb fragment was obtained, which was part of the movement protein gen, by using the CMV MPF/MPR oligonucleotides (Figure 7 track C) (Peden and Simmons, 1973; Owen and Palukaitis, 1988). At present, the amplified fragments of the CMV-Ib variant obtained from amaryllis plants have been recombined in vectors of bacterial clonation for its molecular characterization and to establish phytogenetic relationships with other variants of CMV obtained in other plants in our country.

CONCLUSIONS Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% (2.15 h/ 100 volts), de ARN de doble cadena de CMV separado de azucena (sa), tratado con nucleasas. Carril A) RNAdc de CMVsa sin tratamiento enzimático; carril B) RNAdc de CMVsa con RNAasa; carril C) RNAdc de CMVsa con DNAsa; carril D) RNAdc de CMV de tabaco sin tratamiento con nucleasas. Figure 6. Electrophoresis in 6% polyacrylamide gel (2.15 h/100 volts) of double stranded RNA from CMV separated from amaryllis (sa), treated with nucleases. Track A) dsRNA from CMVsa without enzymatic treatment, tract B) dsRNA of CMVsa with RNase; track C) dsRNA of CMVsa with DNase; track D) dsRNA of CMV from tobacco without nuclease treatment.

The yellow mosaic and mottle disease of amaryllis was associated with the infection of a virus of the single stranded RNA type, mechanically transmissible, with one viral particle of the icosahedric type and serologically related with the group of the cucumber mosaic virus (CMV). It was identified as a variant of the subgroup Ib (CMV-Ib), using the symptoms that it induced in indicator plants inoculated by mechanical transmission. A

B

C

Transcripción inversa ligada a la reacción en cadena de la polimerasa (rt-PCR) El ensayo rt-PCR permitió amplificar y obtener fragmentos que coincidieron en tamaño con los fragmentos esperados y predichos cuando se diseñaron ambos pares de oligonucleótidos. Se obtuvo un fragmento de 650 pb que correspondió al tamaño esperado de una región del gen de la proteína de la cápside, cuando se utilizaron los oligonucleótidos CMV CPF/CPR (Figura 7 carril B). Además, se obtuvo un fragmento de 850 pb, que corresponde a parte del gen de la proteína del movimiento, utilizando los oligonucleótidos CMV MPF/MPR (Figura 7 carril C) (Peden y Simmons, 1973; Owen y Palukaitis, 1988). Actualmente, los fragmentos amplificados de la variante de CMV-Ib obtenida de plantas de azucena, se han recombinado en vectores de clonación bacteriano, para su caracterización molecular y establecer relaciones filogenéticas con otras variantes de CMV obtenidas en otras plantas en nuestro país.

CONCLUSIONES La enfermedad del mosaico y moteado amarillo de la azucena se asoció con la infección de un virus del tipo

850 pb 650 pb

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 1.0% de los productos de RT-PCR, utilizando ARN total de N. rustica inoculada con CMV separado de plantas de azucena con síntomas de moteado amarillo. Carril A) Marcador de peso molecular 1 Kb plus (invitrogen); B) producto de rt-PCR del gen de la proteína de la cápside de CMV (650 pb); producto de rt-PCR del gen de la proteína del movimiento de CMV (850 pb). Figure 7. Electrophoresis in 1.0% agarose gel of the products of rt-PCR, using total RNA from N. rustica inoculated with CMV separated from amaryllis plants with yellow mottle symptoms. Track A) Molecular weight marker 1 Kb plus (invitrogen); B) product of rt-PCR of the capsid protein gene of CMV (650 pb); C) product of rt-PCR of the movement protein gene of CMV (850 pb).

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ARN de cadena sencilla, mecánicamente transmisible, con una partícula viral del tipo icosahédrico y serológicamente relacionado con el grupo del virus mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus. CMV). Fue identificado como una variante del subgrupo Ib (CMV-Ib), utilizando los síntomas que indujo en plantas indicadoras inoculadas por transmisión mecánica. Las pruebas de patogenicidad mediante transmisión mecánica del virus separado de plantas de azucenas con síntomas de moteado amarillo a plantas sanas de la misma especie en invernadero, confirmaron que el aislamiento de CMV-Ib es el agente causal del moteado amarillo y que algunos factores climáticos en el invernadero o propios del hospedante limitaron la expresión de síntomas. La identidad del patógeno fue confirmada mediante la amplificación de fragmentos del genoma viral, por reacción rt-PCR, en las que se utilizaron oligonucleótidos diseñados contra regiones conservadas de la proteína de la cápside (CP) y de la proteína del movimiento (MP) para el grupo de CMV. AGRADECIMIENTOS Esta investigación fue financiada por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la UNAM, México, Proyecto IN207601 y por el proyecto CONACYT 39960.

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The pathogenicity tests of the virus separated from amaryllis plants with yellow mottle symptoms transmitted mechanically to healthy plants of the same species in a greenhouse, confirmed that the isolation of CMV-Ib is the causal agent of yellow mottle and that some climatic factors in the greenhouse or inherent factors of the host limited the expression of symptoms. The identity of the pathogen was confirmed by the amplification of fragments of the viral genome by rtPCR reaction, in which oligonucleotides designed against conserved regions of the capsid protein (CP) and of the movement protein (MP) for the CMV group were used. —End of the English versión—




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