I. INTRODUCCIÓN El sistema inmune es capaz de reconocer estructuras de superficie de macromoléculas con pesos moleculares mayores de 5000. Sin embargo, la proporción contra la cuál va dirigido el anticuerpo, es decir, el determinante antigénico, comprende solamente una parte menor de la molécula. Las macromoléculas que estimulan la formación de anticuerpos se denominan inmunogénicas. Otras moléculas pequeñas no inmunogénicas, pero que son reconocidas por los anticuerpos, denominadas haptenos, pueden desencadenar una respuesta inmune si se acoplan a moléculas mayores, generalmente denominadas portadoras. El anticuerpo que reconoce un determinante antigénico específico es un miembro de la familia de proteínas séricas denominadas inmunoglobulinas. Cada molécula de inmunoglobulina es un complejo de cuatro polipéptidos que forman una estructura simétrica a modo de Y, y contiene dos cadenas idénticas de bajo peso molecular llamadas cadenas ligeras, y otras dos de alto peso molecular, también idénticas, llamadas cadenas pesadas. Las cadenas están unidas por puentes disulfuro. Hacia el segmento amino−terminal cada cadena presenta una posición variable, que es por donde reconoce al antígeno y donde tiene lugar la reacción antígeno!anticuerpo. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que se diferencian por las cadenas pesadas que poseen. El tipo de anticuerpo que se produce a gran escala en la respuesta secundaria, y que se utiliza fundamentalmente para todas las técnicas inmunocitoquímicas, es la IgG. La molécula de IgG se separa frecuentemente en fragmentos proteolíticos para estudiar los fragmentos de unión al antígeno (Fab) comparados con la que une al complemento (Fc). Las propiedades de estas técnicas son: • Alta especificidad, por lo que se unen fuertemente. • Alta selectividad, por lo que pueden diferenciar dos antígenos muy similares. • Alta sensibilidad, porque pueden detectar cantidades muy bajas de antígeno. • Estequiometricidad, existe una proporción entre la cantidad de antígeno y la cantidad de reacción antígeno !anticuerpo. El propósito de estas técnicas es el de localizar el complejo específico antígeno!anticuerpo, ya que éstos no son visibles directamente al microscopio. Se han desarrollado varios métodos, directos e indirectos, para la detección del complejo Ag!Ac. Así, mientras que en los métodos directos el marcador se acopla al anticuerpo específico, en los métodos indirectos el complejo antígeno!anticuerpo se detecta con un anticuerpo secundario marcado, dirigido contra el anticuerpo primario específico. A. TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA Las pruebas de inmunofluorescencia (IF) se basan en que, cualquier antígeno, puede ser marcado específicamente con un fluorocromo coloreado, a través de un anticuerpo (Ac) específico. Cuando se irradia este elemento con luz ultravioleta o azul se hace fluorescente. Dos de los métodos utilizados son: • Método directo En este método se utiliza antisuero marcado para cada sustancia que se investigue (bacteriano, vírico o proteico); así, cuando el suero antisalmonela fluorescente se aplica a una extensión, procedente de un cultivo que contenga microorganismos del género Salmonella, reacciona con el antígeno homólogo, demostrándose una reacción específica antígeno!anticuerpo por fluorescencia de las bacterias 1

revestidas con el anticuerpo. B. Método indirecto El antisuero (por ejemplo el de antisalmonela preparado en conejo) no se marca, sino que se emplea conjugado con suero antiglobulina fluorescente, a través de una técnica en dos tiempos. La extensión con la bacteria en cuestión se inunda con el suero conejo antibacteriano. Después de 10−30 minutos, el suero que no haya reaccionado se elimina mediante lavado, tratándose a continuación con globulina anticonejo fluorescente. Las células bacterianas que hayan reaccionado con el antisuero, estarán revestidas con el anticuerpo (globulina) de conejo, y en consecuencia, reaccionarán con la globulina anticonejo marcada, de tal manera que se pueden identificar por la fluorescencia. Cuando es preciso detectar el antígeno, la elección entre estos métodos, están en parte determinada por el número de microorganismos diferentes, que hayan de ser identificados en la muestra, por ejemplo, los corpúsculos rábicos cerebrales sólo tienen un antígeno, y en consecuencia, se debe emplear el método directo. Los virus respiratorios de las secreciones tienen muchos antígenos, por lo que estaría más indicado el método indirecto, ya que, si no se hace así, sería preciso conjugar cada suero. Si todos los antisueros empleados, en los métodos indirectos, se obtienen en el mismo huésped, únicamente será necesario un conjugado antiespecie. El método indirecto es más sensible que el directo porque tiene mayor número de sitios para que se produzca la combinación, al mismo tiempo que, permite la identificación de anticuerpos específicos. El isotiocianato de fluoresceína es el conjugado más empleado, presenta una banda de adsorción primaria de 495nm y produce la emisión verde a un máximo de 520nm. INMUNOFLUORESCENCIA EN EL DIAGNÓSTICO DE SÍFILIS La prueba emplea la técnica indirecta antes explicada y cuyos reactivos son antígeno, Treponema pallidum (cepa de Nichols) cultivado en testículos de conejo, el conjugado fluorescente, suero de cabra (antiglobulina humana) unido al isotiocianato de fluoresceína, y el suero problema, tomado del paciente e inactivado a 56°C durante 30 minutos. La prueba, denominada FTA−200 por utilizar suero del paciente diluido a 1:200, si bien es de gran utilidad en la sífilis temprana, no lo es en la enfermedad tardía, debido a la alta dilución del suero que es necesario lograr para evitar resultados falsos positivos y que, sin embargo, alcanzan hasta 20 por ciento. Con la llamada FTA−ABS se eliminan los falsos positivos, absorbiendo previamente con el treponema de Reiter los anticuerpos treponémicos inespecíficos, creados por el organismo en respuesta a especies saprófitas. De existir anticuerpos específicos, los treponemas aparecen fluorescentes (reactiva o positiva), con variación desde moderada hasta fuerte. En caso de ausencia de anticuerpos específicos, los treponemas no mostrarán fluorescencia o lo harán apenas débilmente (no reactiva o negativa). La sensibilidad de la prueba FTA−ABS se estima de 80% en la sífilis primaria y 100% en la secundaria. En la tardía es tan específica como la prueba de inmovilización del treponema y más sensible. II. REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA En la práctica vamos a utilizar el método de inmunofluorescencia indirecta para averiguar si en un suero problema dado existen anticuerpos frente a Treponema pallidum. • MATERIALES Disponemos de un porta con diez pocillos en cuyo interior hay T. pallidum inmovilizado; control positivo, que contiene anticuerpos frente a T. pallidum; control negativo, sin anticuerpos frente a T. pallidum; tampón BABS, conjugado antiinmunoglobulina G marcado con fluoresceína, que cuando se 2

estimula con luz ultravioleta emite fluorescencia verde. • MÉTODO DE REALIZACIÓN • Cubrimos dos de las extensiones con 10l de tampón BABS (testigo conjugado), otros dos con 10l de sorbente (testigo sorbente). Cubrimos las otras extensiones con 10l de cada dilución de los sueros problemas y los sueros testigos. • Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. Lavamos en PBS−Tween 2 veces durante 5 minutos. Enjuagamos rápidamente en un baño de agua destilada. Escurrimos y dejamos secar. • Cubrimos cada extensión de 10l de globulina anti−humana diluida en tampón BABS. • Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. Lavamos los portas en PBS−Tween 2 veces durante 5 minutos. Pasamos rápidamente por un baño de agua destilada. Dejamos secar. • Observación de los resultados en microscopio de campo oscuro. • RESULTADOS Resultados esperados En los pocillos en los que se añadió suero con anticuerpos frente a T. pallidum éstos se unirán a los antígenos de T. Pallidum contra los que son específicos, y al añadir el complejo antiinmunoglobulina G marcado, se unirá a los anticuerpos. Al mirar en el microscopio de campo oscuro. Se observará fluorescencia. En los pocillos en los que el suero añadido no lleva anticuerpos frente a T. Pallidum no se unirá al antígeno, y al añadir la antiinmunoglobulina G marcada éste tampoco se unirá al anticuerpo. No se observará fluorescencia. Resultados observados Podemos observar en el microscopio de campo oscuro células treponémicas de color verde debido a la fluorescencia; por tanto, concluiremos decidiendo que Se observan treponemas en las muestras estudiadas ELISA O INMUNOABSORCIÓN LIGADA A ENZIMAS • INTRODUCCIÓN La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) constituy uno de los inmunoensayos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971, y posteriormente, aplicados por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia de su mayor sensibilidad ya que, el enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir la densidad óptica de la coloración final. Existen dos importantes variaciones en relación con ELISA. En rimer lugar, que los anticueros o antígenos soluble se pueden hacer insolubles por adsorción a una fase sólida, como pueden ser las placas de microtitulación o los tubos de poliestireno. La adsorción depende también dl tiempo, temperatura y pH. Algunos métodos precisan que las placas se mantengan durante toda la noche a 4° C, en un tampón de pH elevado. En segundo lugar, los antígenos o anticuerpos se pueden conjugar al enzima sin pérdida de actividad. Se han utilizado toda una variedad de enzimas, entre los que citaremos la fosfatasa alcalina, la peroxidasa dl rábano picante y la glucosa−oxidasa. El 4−nitrofenil fosfato o sustrato usado para la fosfatasa alcalina no es peligroso, a diferencia del ácido 5−aminosalicílico o sustrato de la peroxidasa del rábano, que se considera carcinognético. La hidrólisis de éstos sustratos da, respectivamente, un color amarillo (: 405nm) y oscuro (: 450nm). 3

La preparacion de conjugados se consigue, en el caso de la fosfatasa alcalina, mediante la unión covalente con glutaraldehido. La fracción inmunoglobúlinica de la globulina antiespecie se aisla por precipitación salina. Ésta se combina con el enzima en la proporción 3:1. La mezcla se incuba con glutaraldehído al 0.2% durante 2−4 horas a temperatura ambiente. El glutaraldehído libre se elimina por diálisis. Se debe añadir un estabilizante enzimático antes de proceder a su conservación a 4°C, quepud prolongarse hasta 12 meses. Las técnicas ELISA tienen numerosas aplicaciones en bacteriología, parasitología y virología. • Método indirecto • Añadir sobre cada excavación de la placa de microtitulación 200l de antígeno a la concentración óptima. Incubar toda la noche a 4°C con tampón para baño. • Aclarar dos veces en tampón para lavado, manteniendo la duración del enjuagado entre 5 y 10 minutos. • Adicionar 200l de suero diluido e incubar a temperatura ambiente , durante 2 horas. Repetimos el punto 2. • Añadir 200 l de antiglobulina fosfatasa alcalina a la concentración óptima. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Repetir el punto 2. • Adicionar 200l de sustrato con fosfatp en tampón dietanolamina, bien permitiendo que la reacción tenga lugar hasta que presente el color adecuado, al compararlo con un control positivo, bien manteniéndola a lo largo de 30 minutos. • Para la reacción añadir 50l de NaOH 3 M. • El nivel de hidrólisis o de cambio de color es proporcional a la cantidad de anticuerpo de la muestra problema. Este cambio de color se puede comparar con los controles y efectuar la lectura directamente o se lee en un espectrofotómetro a 405nm. • Método del sandwich con doble anticuerpo para la detección de antígenos. Es similar a la técnica anterior con la excepción de que el anticuerpo se fija a la placa. Se añade la solución problema con el antígeno, así como un enzima marcado con un anticuerpo específico. • ELISA de competencia para detección de antígenos El anticuerpo se adsorbe a la placa y se comparan los resultados de dos series de pruebas, una de ellas se prepara con antígeno marcado con el enzima y, la otra, con antígeno marcado con el enzima, más antígeno problema o desconocido. En este último caso se produce competencia entre el antígeno marcado y el antígeno problema, con respecto al sustrato representado por el anticuerpo. Resultados Se pueden expresar de diversas formas: • Positivo o negativo, determinando el umbral de absorbacia, mediante pruebas con varios negativos conocidos. • Título, en el que la dilución final se considera equivalente a una serie de muestras negativas conocidas. • Proporcional a un grupo de negativos conocidos. • Mediante un valor de absorbancia, haciéndose la prueba bajo condiciones normalizadas y definitivas. 2. REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA Nosotros vamos a utilizar el método competitivo. Tenemos una serie de tubos que están sensibilizados frente al antígeno que queremos detectar. En el método competitivo adicionamos al mismo tiempo el 4

suero problema y el conjugado. In antiT4 tubes (R1) In EIA tubes Dispense: Standars (R2) Control (R3) Samples Conjugate solution

Standars 50 l _ _ 500 l

Control _ 50 l _ 500 l

Samples _ _ 50 l 500 l

Reagent blank _ _ _ _

• Mover en un Vortex o equivalente. • Incubar 1 hora a 18−25° C alejado de la luz. • Tirar el líquido sobrante. • Rápidamente (en menos de 2 minutos) dispensar la solución de lavado. • Tirar el líquido sobrante. • Repetir el procedimiento de lavado. Color working solution 500 l 500 l 500 l 500 l − Incubar durante 30 minutos a 18−25 °C en la oscuridad. Stopping reagent

500 l

500 l

500 l

500 l

• Mover en un Vortex o equivalente. • Leer a 492 nm frente al blanco. • RESULTADOS Tubos

Control

1

2

3

4

5