INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Centro de Desarrollo de Productos Bióticos Departamento de Nutrición y Alimentos Funcionales

ELABORACIÓN DE UN ALIMENTO RICO EN ANTIOXIDANTES Y EVALUACIÓN DE SU EFECTO EN HUMANOS TESIS Que para obtener el Grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos

PRESENTA Iker Rodríguez García

Directores de tesis Dr. Adrián Guillermo Quintero Gutiérrez Dra. Guillermina González Rosendo

Yautepec de Zaragoza, Morelos; Diciembre 2014.

El presente trabajo se realizó en el Departamento de Nutrición y Alimentos Funcionales, algunos estudios se llevaron a cabo en el Laboratorio de Proteínas del Departamento de Biotecnología y en el Laboratorio de Control de Calidad del Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Adrián Guillermo Quintero Gutiérrez y la Dra. Guillermina González Rosendo. Se realizó una estancia de investigación en el Centro Robert M. Kerr de Alimentos y Productos Agrícolas (Robert M. Kerr Foods & Agricultural Products Center) de la Universidad de Oklahoma, USA; bajo la dirección de la Dra. Patricia Rayas Duarte. Para la realización de los estudios se contó con apoyo económico del CONACYT (Becario No. 478658) y Beca de Estímulo Institucional de Formación de Investigadores del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado para los proyectos SIP 20130590 Perfil de lípidos en escolares obesos de la región oriente del estado de Morelos y SIP 20140570 Desarrollo de un alimento rico en fibra y antioxidantes para la prevención y control de sobrepeso y obesidad. Los estudios realizados en la estancia de investigación fueron patrocinados por el Ayuntamiento del Municipio de Jojutla, Morelos bajo la aprobación de la Lic Hortencia Figueroa Peralta y Regidores.

AGRADECIMIENTOS Al Dr. Adrián Guillermo Quintero Gutiérrez y a la Dra. Guillermina González Rosendo por su dirección y apoyo brindado; pero sobre todo por su gran calidad humana y su confianza en la realización este trabajo de tesis. A los integrantes de mi comité tutorial y comisión revisora de tesis Dr. Antonio Ruperto Jíménez Aparicio, Dra. Martha Lucía Arenas Ocampo, Dra. Perla Osorio Díaz y Dr. Javier Villanueva Sánchez, porque sus aportaciones fortalecieron y enriquecieron este trabajo. Un especial agradeciemiento a la M. en C. Guadalupe Bravo Rivera por su esfuerzo, dedicación y paciencia para apoyarme en la realización de este trabajo. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y al Instituto Politécnico Nacional (IPN), por las becas otorgadas durante la maestría. A todo el personal del Departamento de Nutrición y Alimentos Funcionales por la inmensa colaboración para realizar este trabajo. A todo el personal del CeProBi porque siempre me brindaron el apoyo y servicio cuando fue solicitado. A Sandra, Liz, Nayeli, Rafael y Jimmy que participaron como voluntarios en este trabajo de tesis, muchas gracias por su tiempo y entusiasta colaboración en las pruebas realizadas de gran relevancia en este estudio. Al molino de arroz San José de Jojutla, Morelos y al Sr. Jésus Sólis Alvarado por las muestras de salvado de arroz proporcionadas para la realización de este trabajo. A la empresa Molinos y Mezcladoras Pulvex, S.A. de C.V. y al Lic. David Alarcón por su apoyo y disposición en la realización de las pruebas de acondicionamiento del salvado de arroz. A la Lic. Hortencia Figueroa Peralta y Regidores del Ayuntamiento de Jojutla, Morelos; por su apoyo económico y confianza en el proyecto de Arroz de Morelos. A la Universidad de Oklahoma y en especial a la Dra. Patricia Rayas-Duarte por brindarme la gran oportunidad de realizar mi estancia de investigación en el FAPC y enriquecer mi trabajo de tesis. A mis compañeros de generación B12 por su apoyo incondicional, con quienes compartí gratos momentos y nuevas amistades. With God all things are possible. Thank you very much Ph .D. Lawrence M. Hynson III for your kindness. I had a wonderful stay in Stillwater, OK. I take for granted that I met you in a very special day for some special purpose that Lord has showed me in the best summer in my life.

I

DEDICATORIAS

Dedico esté trabajo a todas las personas que luchan día a día sin rendirse. A las que luchan por una mejor calidad de vida; a las que luchan por lograr sus metas, sueños y anhelos y muy en especial a todas las personas que luchan por la justicia y la vida misma. Dedicaroria especial para mi abuela Aurora Piedra, el diamante que ha irradiado luz a mi vida a través de su inmeso amor, cariño y oraciones que me han permitido ver nuevos horizontes y el comienzo de un nuevo día. A mi madre Delfina y mis hermanos Alejandro y Dulce que han luchado ante la adversidad de las enfermendades. A mis tios Pety y Victor, quienes me han brindado su apoyo incondicional como unos verdaderos padres que luchan por un mejor futuro para sus hijos. A mis hermanos Alejandro, Faby, Raúl y Arturo, y mis sobrinos Alejandro, Antonio, Axel, Franco, Mauro y Ángela, a quienes exhorto a luchar por sus sueños, ahnelos y metas sin rendirse nunca.

IKER

II

ÍNDICE Página Agradecimientos

I

Dedicatoria

II

Índice

III

Índice de cuadros

VI

Índice de figuras

VIII

Abreviaturas

IX

I. Resumen

XI

II. Abstract

XII

1. INTRODUCCIÓN

1

2. REVISIÓN DE LITERATURA

3

2.1 Alimentos funcionales y salud 2.1.1 Ingredientes funcionales

3 5

2.1.1.1 Antioxidantes

7

2.1.1.2 Capacidad antioxidante total (CAT)

9

2.1.1.3 Métodos de extracción de antioxidantes

13

2.1.2 Evaluación del efecto de ingredientes funcionales

14

2.1.2.1 Métodos de evaluación in vitro

15

2.1.2.2 Métodos de evaluación in vivo

17

2.1.3 Formulación de alimentos ricos en antioxidantes

20

2.1.3.1 Diseño de mezclas

21

2.1.3.2 Calidad y evaluación sensorial

22

2.2 Arroz: Salvado de arroz 2.2.1 Generalidades

23 23

2.2.1.1 Origen y distribución

24

2.2.1.2 Clasificación

24

2.2.2 Proceso de obtención

25

2.2.2.1 Blanqueado de arroz

25

2.2.2.2 Estabilización

26

2.2.3 Composición química del salvado de arroz

29 III

2.2.4 Antioxidantes potenciales en el salvado de arroz

31

2.2.5 Efectos benéficos en la salud

34

3. JUSTIFICACIÓN

39

4. OBJETIVOS

40

4.1 Objetivo general

40

4.2 Objetivos específicos

40

5. MATERIALES Y MÉTODOS

41

5.1 Materiales y participantes

41

5.2 Métodos

41

5.2.1 Formulación de la bebida instantánea

42

5.2.1.1 Acondicionamieto del salvado de arroz

42

5.2.1.2 Diseños de mezclas y evaluación sensorial

45

5.2.1.3 Caracterización del SAE y la bebida instantánea

46

5.2.1.4 Extracción de antioxidantes y vida de anaquel

47

5.2.2 Evaluación de la CAT in vitro

49

5.2.2.1 CAT in vitro del salvado de arroz estabilizado

49

5.2.2.2 CAT in vitro de la bebida instantánea

50

5.2.3 Evaluación de la CAT en humanos

50

5.2.3.1 Selección de sujetos voluntarios

50

5.2.3.2 Estandarización del consumo de antioxidantes

52

5.2.3.3 Evaluación de la CAT in vivo de la bebida

52

5.3 Análisis estadístico de datos 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Formulación de la bebida instantánea

53 54 54

6.1.1 Acondicionamiento del salvado de arroz

54

6.1.2 Diseño de mezclas y evaluación sensorial

57

6.1.3 Caracterización del SAE y la bebida instantánea

60

6.1.4 Extracción de antioxidantes y vida de anaquel

69

6.2 Evaluación de la CAT in vitro

72

6.2.1 CAT in vitro del salvado de arroz estabilizado

72

6.2.2 CAT in vitro de la bebida instantánea

76 IV

6.3 Evaluación de la CAT en humanos

81

6.3.1 Selección de sujetos voluntarios

81

6.3.2 Estandarización del consumo de antioxidantes

82

6.3.3 Evaluación de la CAT in vivo de la bebida

83

7. CONCLUSIONES

91

8. PERSPECTIVAS

92

9. LITERATURA CITADA

93

10. ANEXOS

110

10.1 Anexo 1 Metodología ACW

110

10.2 Anexo 2 Metodología ACL

112

10.3 Anexo 3 Formato de evaluación sensorial

114

10.4 Anexo 4 Invitación para el estudio de la CAT en humanos

115

10.5 Anexo 5 Historia nutricia

117

10.6 Anexo 6 Historia clínica

120

10.7 Anexo 7 Carta de consentimiento informado

123

10.8 Anexo 8 Lista de alimentos ricos en antioxidantes

125

10.9 Anexo 9 Formato para el registro de consumo de alimentos

126

V

ÍNDICE DE CUADROS Número

Cuadro

Página

1

Composición química del salvado de arroz

29

2

Estudios del efecto del salvado de arroz realizados en

35

humanos 3

Diseños de mezclas para la formulación de la bebida

45

instantánea 4

Propiedades fisicoquímicas del salvado de arroz

54

Morelos A-2010 5

Actividad de la lipasa del salvado de arroz Morelos A-

56

2010 a diferentes tiempos de estabilización 6

Fórmula de la bebida instantánea a base de salvado

57

de arroz Morelos A-2010 estabilizado 7

Análisis

estadístico

de

fórmula

de

la

bebida

59

instantánea a base de salvado de arroz Morelos A2010 estabilizado 8

Análisis químico proximal para salvado de arroz

60

Morelos A-2010 estabilizado 9

Análisis químico proximal de la bebida instantánea a

61

base de salvado de arroz Morelos A-2010 estabilizado 10

Análisis microbiológico de la bebida instantánea a

62

base de salvado de arroz Morelos A-2010 estabilizado 11

Contenido total de tocoferoles y tocotrienoles para

64

salvado de arroz Morelos A-2010 estabilizado 12

Contenido total de compuestos fenólicos para salvado

65

de arroz Morelos A-2010 estabilizado

VI

13

Aporte nutrimental de la bebida instantánea a base de

67

salvado de arroz Morelos A-2010 estabilizado 14

Capacidad antioxidante total in vitro del salvado de

73

arroz Morelos A-2010 estabilizado para diferentes tiempos y temperaturas de almacenamiento 15

Capacidad antioxidante total in vitro para salvado de

75

arroz Morelos A-2010 estabilizado 16

Capacidad antioxidante total in vitro de la bebida

77

instantánea a base de salvado de arroz Morelos A2010 estabilizado 17

Características basales de los participates

18

Consumo

promedio

de

nutrimentos

81 de

los

82

participantes comparado con la recomendación de ingesta para su edad y género 19

Capacidad antioxidante total in vivo de la bebida

85

instantánea a base de salvado de arroz Morelos A2010 estabilizado

VII

ÍNDICE DE FIGURAS Número

Figura

Página

1

Estructura de la semilla de arroz

23

2

Oxidación de lípidos del salvado de arroz

26

3

Etapas del trabajo

42

4

Equipo para pulverizar salvado de arroz

43

5

Prototipo para estabilizar salvado de arroz por calor

44

húmedo 6

Extracción sólido-líquido de antioxidantes hidrofílicos y

48

lipofílicos 7

Diseño de evaluación de la CAT in vivo

52

8

Extracción de plasma

53

sanguíneo en tubo con

anticoagulante (EDTA-K3) 9

Apariencia del salvado de arroz.

55

10

Variables de respuesta de la evaluación sensorial de

58

la bebida instantánea a base de SAE 11

Actividad de la lipasa en SAE por calor húmedo con

70

15, 30 y 45 días de almacenamiento 12

Curva de calibración ACW

73

13

Curva de calibración ACL

74

14

Evaluación de la ACW in vitro de la bebida

76

15

Evaluación de la ACL in vitro de la bebida

77

16

Evaluación de la ACW en humanos de la bebida

84

17

Evaluación de la ACL en humanos de la bebida

85

VIII

ABREVIATURAS AACC

American Association of Cereal Chemists

ABTS

2,2-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico)

ACL

Lipid-soluble Antioxidant Capacity

ACW

Water-soluble Antioxidant Capacity

ADN

Ácido desoxirribonucleico

AG

Ácidos grasos

AL

Actividad de lipasa

ARN

Ácido ribonucleico

AWA

Solución acetona/agua/ácido acético

CAT

Capacidad antioxidante total

CI

Cereales integrales

DM2

Diabetes mellitus tipo II

DPPH

2,2-difenil-1-picrilhidazil

DSS

Dextrán sulfato de sodio

EAF

Equivalentes de ácido ferúlico

EAG

Equivalentes de ácido gálico

ECNT

Enfermedades Crónicas No Trasmisibles

ESL

Extracción sólido-líquido

ET

Electron Transfer

F-C

Folin-Cioacalteu

IX

FRAP

Ferric Reducing Antioxidant Power

FUFOSE

Functional Food Science in Europe

HAT

Hydrogen Atom Transfer

HDL

High Density Lipoprotein

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ILSI

International Life Sciences Institute

IMC

Índice de Masa Corporal

LDL

Low Density Lipoprotein

OMS

Organización Mundial de la Salud

ORAC

Oxygen Radical Absorbance Capacity

PCL

Photochemiluminescence

RNS

Reactive Nitrogen Species

ROS

Reactive Oxygen Species

RSS

Reactive Sulfur Species

SA

Salvado de arroz

SAE

Salvado de arroz estabilizado

TEAC

Trolox Equivalent Antioxidant Capacity

TGI

Tracto gastrointestinal

TOSC

Total Oxyradical Scavenging Capacity

TRAP

Total Reactive Antioxidant Potential

VDL

Very Density Lipoprotein

X

I. RESUMEN El salvado de arroz es un subproducto poco aprovechado en la elaboración de alimentos, es altamente nutritivo y rico en antioxidantes, que le confieren gran capacidad antioxidante total (CAT in vitro). Actualmente el sobrepeso, la obesidad y la diabetes, son enfermedades crónicas en aumento; donde los antioxidantes presentes en el salvado de arroz son importantes para contribuir en la prevención y el control de las mismas. Sin embargo, aún no se sabe con certeza si su CAT in vitro, se ve reflejada en plasma humano (CAT in vivo). El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad antioxidante total in vitro e in vivo por fotoquimioluminiscencia de una bebida instantánea elaborada a base de salvado de arroz de Morelos. Se acondicionó salvado de arroz Morelos A-2010 (SAE), se le realizó un análisis químico proximal, se determinaron antioxidantes potenciales por HPLC y.se evaluó la vida de anaquel mediante la CAT por el método de fotoquimioluminiscencia (PCL). Posteriormente se desarrolló una fórmula base en polvo de SAE mediante un diseño de mezclas y se evaluaron sensorialmente tres bebidas instantáneas de sabor, con un panel de 75 evaluadores para pruebas de aceptación. Se caracterizó la bebida de mayor aceptación y se determinó su análisis químico proximal, microbiológico y evaluación de la CAT in vitro por el método PCL. Para la evaluación in vivo se seleccionaron 5 adultos sanos para medir la CAT por el método PCL. Se obtuvo un SAE pulverizado con una vida de anaquel de 60 días y un 33.3% de pérdida de la CAT. Con un contenido de 12.9% de lípidos, 14.2% de proteínas, 22.2% de fibra total; respecto a antioxidantes, 9.1 mg/g de γ-oryzanol, 339.0 μg/g de vitamina E y 721 mg EAF/100 de compuestos fenólicos totales; con una CATSAE de 1601.8 μg/g. Se obtuvo una bebida instantánea sabor café moka con un IDS de vitamina E del 92% y un IDR de fibra del 34.7% con una CATBEBIDA de 1228.2 μg/g. Para la evaluación de la CAT in vivo después de la ingesta de dos dosis de bebida de 35.5 g no se encontraron diferencias significativas respecto al tiempo y la línea basal que fue considerada como blanco, reportando los siguientes valores: CAT0h, 51.8μg/g; CAT2h, 50.7 μg/g; CAT4h, 47.4 μg/g; CAT6h, 48.1 μg/g, con lo anterior se concluye que podría existir estrés oxidativo en los sujetos debido a la dieta y se requiere determinar otros marcadores plasmáticos de estrés oxidante. XI

II. ABSTRACT Rice bran is a by little used in food processing; highly nutritious and rich in antioxidants, which confer high total antioxidant capacity (TAC in vitro). Currently overweight, obesity and diabetes are chronic diseases on the rise; where the antioxidants present in the rice bran are important to contribute to the prevention and control.However, it is not yet clear whether the TAC in vitro, is reflected in the amount found in human plasma (TAC in vivo). The aim of this study was to evaluate the total antioxidant capacity by photochemiluminescent in vitro and in vivo detection of instant drink made of Morelos rice bran. Morelos rice bran A-2010 was conditioned in a Pulvex200 mill and stabilized by the method of wet heat, for proximate analysis methods performed AACC, main antioxidants were determined by HPLC and the Folin-Ciocalteu method. TAC and the shelf life was evaluated by PCL method. Subsequently a base formula was developed with SAE powder using a mix design for sensory evaluation of three flavored instant drinks with a panel of 75 assessors for acceptance testing. Drink more acceptance was characterized and its proximal chemical and microbiological analysis under COFEPRIS was determined. TAC was determined in vitro by the PCL method. And finally, five healthy adults were selected to measure the TAC in vivo by the PCL method. SAE flour was obtained with a shelf life of 60 days and 33.3% loss of the TAC. Containing 12.9% lipids, 14.2% protein and 22.1% of total fiber. The antioxidant content was 9.1 mg / g of γ-oryzanol, 339.0 mg / g of vitamin E and 721 mg EAF / 100 g of the total phenolic compounds with a TACSAE of 1601.8 μg / g. Drink instant coffee mocha flavor with vitamin E IDS 92% and fiber IDR 34.7% with a TACBEBIDA of 1228.2 μg / g was obtained. For the evaluation of the TAC in vivo after intake of two doses of 35.5 g drink no significant differences were found with respect to time and the baseline, reporting the following values TAC0h 51.8μg / g, TAC2h 50.7 μg / g, TAC4h 47.4 μg / g, TAC6h 4809 μg / g, whereby it is concluded that there may be an oxidative stress in subjects due to diet and other required determine plasma markers of oxidative stress.

XII

1. INTRODUCCIÓN

En la actualidad, los expertos coinciden en que el mundo enfrenta en forma global tres grandes retos de salud; el primero, disminuir la mala nutrición por deficiencias y enfermedades infecciosas; el segundo, disminuir la incidencia de enfermedades crónicas, como las enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo II, obesidad y cáncer y el tercero, recuperar el consumo de las dietas tradicionales o disminuir marcadamente el de comida rápida o chatarra (Dipti et al., 2012).

Existe evidencia acerca de que el arroz podría ser un vehículo efectivo para enfrentar los problemas claves de salud y nutrición en países con recursos limitados ya que es una excelente fuente de vitaminas, minerales y antioxidantes; sin embargo, se ha investigado muy poco en el proceso de desarrollo de variedades de arroz particulares para un impacto potencial sobre enfermedades crónicas (Dipti et al., 2012, Sharif et al., 2014.).

El salvado de arroz es un subproducto de bajo costo y se obtiene en grandes volúmenes; no obstante, es poco aprovechado para el consumo humano a pesar de que contiene antioxidantes de gran interés para la comunidad científica, principalmente γ-oryzanol, vitamina E y compuestos fenólicos que han sido estudiados con mayor frecuencia (Goufo y Trindade, 2014).

Sin embargo, se desconoce si la cantidad de este tipo de antioxidantes medida in vitro se ve reflejada en plasma u otros tejidos; por lo que se hace necesario estudiar si los alimentos a base de salvado de arroz muestran un efecto significativo en humanos (Fardet et al., 2008).

El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad antioxidante total in vitro e in vivo por fotoquimioluminiscencia de una bebida instantánea elaborada a base de salvado de arroz Morelos A-2010.

1

Para lo cual, fue necesario formular y seleccionar un alimento a base de salvado de arroz de gran impacto, bajo costo y de gran aceptación para la población de estudio. Se realizó una estabilización y caracterización de salvado de arroz Morelos A-2010 para obtener las mejores aplicaciones alimenticias y se determinó su capacidad antioxidante total in vitro e in vivo.

Para realizar la determinación del efecto en humanos de la bebida, se propusieron los protocolos más estudiados en la actualidad (Prior et al., 2003; 2005), incluyendo la firma de la carta de consentimiento informado. Participaron voluntarios sanos que cumplieran con los criterios de inclusión establecidos; para ello, se llevaron a cabo evaluaciones antropométricas, nutricionales, clínicas y de laboratorio. Dos días previos a la evaluación de la capacidad antioxidante, los sujetos seleccionados interrumpieron el consumo de alimentos ricos en antioxidantes.

A los sujetos participantes, se les realizó la medición de las respuestas de la capacidad antioxidante total in vivo, la primera se realizó antes del consumo de la bebida, posteriormente a las 2, 4 y 6 horas; cabe mencionar que a las 4 horas se realizó otro consumo de la bebida.

Al finalizar las extracciones de plasma se determinó la capacidad antioxidante hidrofílica (ACW) y la capacidad antioxidante lipofílica (ACL) de los cuatro tiempos para obtener la CAT in vivo y evaluar el efecto en humanos de la capacidad antioxidante total de la bebida.

2

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Alimentos funcionales y salud La dieta es una de las influencias más importantes sobre la salud en las sociedades modernas (Katz y Meller, 2014). Lo que representa un reto para el desarrollo de la tecnología de alimentos, en el diseño y el procesamiento de nuevos productos con una mejor calidad nutricional, además de un efecto benéfico sobre la salud (Réquillart y Soler, 2014).

Los cambios de los patrones de alimentación de la población, han ocasionado alteraciones en la salud. Los cambios en los hábitos alimentarios se asocian al desarrollo demográfico, económico y tecnológico ocurridos en el mundo durante la última mitad del siglo, que además han contribuido a la diminución de la actividad física y en conjuno favorecer la presencia de enfermedades crónicas no trasmisibles (ECNT) (Caballero B., 2014).

Algunas de estas ECNT asociadas con la dieta y el estilo de vida son responsables de más de la mitad de todas las muertes en el mundo (Dipti et al., 2012; Réquillart y Soler, 2014). De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), más de 17 millones de personas murieron por enfermedades cardiovasculares en el 2008 y se espera que para el año 2030, esta cifra incremente a 25 millones. A pesar de ello, la investigación al respecto escasea y sólo algunos países cuentan con programas de salud pública que atiendan directamente esta problemática (Whatson et al., 2014).

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), han indicado la necesidad de considerar los siguientes factores claves en el desarrollo de nuevos productos alimenticios: evidencia científica en la relación dieta-salud, la influencia de la dieta en los problemas de salud pública, patrones del consumo de alimentos de la población en general, requerimientos nutricionales, fuentes potenciales de alimentos, la composición de los alimentos incluyendo las buenas prácticas de manufactura, la 3

biodisponibilidad de nutrimentos, factores socioculturales que relacionan la selección y accesibilidad de los alimentos y los bajos costos de los mismos (Uauy et al., 2014).

Desde los orígenes de la humanidad, la alimentación ha sido un factor crítico para su desarrollo. Durante siglos, los seres humanos han consumido alimentos suficientes para la supervivencia. Sin embargo, el mundo enfrenta actualmente una epidemia de sobrepeso y obesidad, la cual ha desencadenado un incremento dramático de enfermedades crónicas (Caballero B., 2014).

En el año 1997, la OMS reportó la obesidad como un problema grave de salud pública (Dipti et al., 2014) que ha incrementado en niños de 0 a 5 años de edad; la prevalencia de sobrepeso y obesidad en este grupo de edad ha ido del 4.2% en 1990 al 6.7 % en 2010 (equivalente a 43 millones de niños). Para el año 2020, se espera que 60 millones de niños cursen con sobrepeso u obesidad (9.1%) (Caballero B., 2014).

Por otro lado, se predice un drástico incremento en la población mayor de 60 años, lo cual está asociado con un aumento en el número de personas con alto riesgo a padecer enfermedades crónicas (Berdanier et al., 2014). Se estima que para el año 2030, 70 millones de personas serán mayores de 60 años y para el año 2050, la población adulta mayor de 65 años está proyectada a 88.5 millones (Chernoff, 2014).

Es evidente que un buen estado de nutrición promueve la salud y mejora la calidad de vida; para ello, la nutrición debe integrarse a todos los aspectos de promoción de la salud, prevención y manejo de la enfermedad, a través de distintos enfoques, entre ellos la tecnología de alimentos y el desarrollo de nuevos alimentos funcionales (Réquillart y Soler, 2014).

La Organización Mundial de la Salud (OMS), ha enfatizado la importancia nutricional de los cereales integrales (CI) como fuente potencial para una dieta saludable (Vaclavik y Christian, 2014) y como ingrediente para el desarrollo de nuevos 4

alimentos. Esto ha propiciado su incorporación en fórmulas para infantes, alimentos geriátricos y productos de panadería que incluyen fuentes importantes de fibra y antioxidantes como ingredientes funcionales que promueven la salud (Patel, 2012).

Durante las dos últimas décadas, el conocimiento de la influencia dietética sobre la salud y el bienestar, se ha incrementado y se ha dirigido hacia el diseño de alimentos saludables que en conjunto con ciertas condiciones, podrían reducir el riesgo de varias enfermedades crónicas (Kaur y Das, 2011).

Diversos estudios sustentan la inclusión de los CI en la dieta para la prevención de enfermedades crónicas (Borneo y León, 2012; Dipti et al., 2012; Devlin et al., 2013), como diabetes, enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer (Fardet et al., 2008; Rondanelli et al., 2011; Patel, 2012; Esa et al., 2013; Eshak et al., 2014; Goufo y Trindade, 2014; Hajihashemi et al., 2014; Kazemzadeh et al., 2014; Martins y Binosha, 2014; Sharif et al., 2014 Shimabukuro et al., 2014).

2.1.1 Ingredientes funcionales Los cereales integrales han sido por mucho tiempo considerados fuentes de antioxidantes menos importantes que las frutas y verduras; sin embargo, diversos estudios los señalan como los mejores ingredientes funcionales con una gran cantidad de nutrimentos y compuestos antioxidantes (Fardet et al., 2008; Borneo y León, 2012; Goufo y Trindade, 2014; Sharif et al., 2014).

El conocimiento de los ingredientes funcionales y su efecto en la salud, permite entender mejor su aplicación potencial en la promoción y prevención de enfermedades (Patel, 2012).

Los ingredientes funcionales de los alimentos son componentes bioactivos conformados por estructuras micro y macromoleculares de orígen animal, vegetal o mineral que pueden clasificarse en dos grandes grupos: macronutrimentos y micronutrimentos (Aluko, 2012). 5

Macronutrimentos Los grupos más relevantes son los hidratos de carbono, los lípidos y las proteínas. Los hidratos de carbono más importantes son los polisacáridos o fibra dietética que incluyen a la celulosa, hemicelulosa, beta-glucanos, ligninas, pectinas, gomas, inulina, fructooligosácaridos y oligosacáridos (Rondanelli et al., 2011; Borneo y León, 2012; Martins y Binosha, 2014).

Dentro del grupo de los lípidos se encuentran los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), los ácidos grasos de cadena corta (butirato), los ácidos grasos de cadena media (caprílico y cáprico) y los ácidos grasos monoinsaturados (oleico, linoléico, docosahexanoico, araquidónico y eicosapentanoico) (Champagne, 2004; Sharif et al., 2014).

Micronutrimentos Los ingredientes funcionales de los cereales integrales incluyen iones orgánicos como fósforo (P), potasio (K), magnesio (Mg), calcio (Ca), sodio (Na), zinc (Zn), hierro (Fe), etc. (Champagne, 2004; Fardet et al., 2008) y las fracciones de salvado y germen, son una fuente importante de vitaminas B y E (Aluko, 2012).

Las vitaminas del complejo B más importantes son tiamina (B 1), riboflavina (B2), niacina (B3), ácido pantotenoico (B5) y piridoxina (B6). También son una fuente moderada de folatos, derivados del ácido fólico o vitamina (B 9) y biotina (Vitamina H o B7) (Champagne, 2004; Fardet et al., 2008). Los productos de cereales representan la segunda fuente más importante de vitamina E y la primer fuente de tocotrienoles en la dieta humana (Hamaker, 2008; Borneo y León, 2012; Sharif et al., 2014).

Los alimentos funcionales ofrecen nuevas alternativas y herramientas para la salud que prometen efectos específicos relacionados con ingredientes funcionales específicos. La demanda de alimentos y bebidas funcionales, se ha incrementado, al igual que los costos del cuidado de la salud, las expectativas de vida y el deseo por una mejor calidad de vida. (Ozen et al., 2012). 6

Existen muchas definiciones del término “alimento funcional”, el cual fue introducido en Japón a mediados de los 80s. Sin embargo, no se ha establecido una definición universal, aunque la más aceptada fue propuesta por la FUFOSE (The European Commission Concerted Action Group on Functional Food Science in Europe), a través del ILSI (The International Life Sciences Institute), quienes lo han definido como: “un alimento puede considerarse funcional si se demuestra satisfactoriamente que afecta a una o más funciones corporales específicas, más allá de sus efectos nutritivos intrínsecos, de modo que resulte apropiado para mejorar el estado de salud y el bienestar, reducir el riesgo de enfermedad o ambas cosas” (Kaur y Das, 2011; Ozen et al., 2012).

Los alimentos funcionales encontrados con mayor frecuencia en el mercado pertenecen a los grupos de lácteos, panadería, confitería, bebidas y alimentos para bebés (Menrad, 2003). Los tipos más prominentes de alimentos funcionales contienen ingredientes antioxidantes de origen animal, vegetal o mineral y han sido diseñados para reducir el riesgo de padecer enfermedades crónicas como: enfermedades

relacionadas

con

la

obesidad,

diabetes,

enfermedades

cardiovasculares y cáncer; siendo los alimentos ricos en antioxidantes, la categoría de alimentos funcionales de mayor demanda global (Charalampopoulos et al., 2002; Ozen et al., 2012; Williams L. A., 2013). Por otra parte, la mayoría de las enfermedades crónicas han sido relacionadas con los efectos de los radicales libres causantes de problemas graves de salud en la población mundial (Tsao y Deng, 2004). 2.1.1.1. Antioxidantes Los radicales libres son átomos, moléculas o iones con un electrón desapareado altamente inestable y con gran actividad en reacciones químicas con otras moléculas como proteínas, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), azúcares y lípidos (Lu et al., 2010; Craft et al., 2012; Carocho y Ferreira, 2013).

Existen tres grupos de radicales libres: especies reactivas de oxígeno (ROS), especies reactivas de nitrógeno (RNS) y especies reactivas de sulfuro (RSS). Siendo 7

el grupo ROS la mayor fuente de radicales libres anión superóxido (O2-*), radical hidroperóxido (HO2*) y radical hidroxilo (*OH) que tienen un efecto sobre las enfermedades crónicas (Tsao y Deng, 2004). Los radicales libres se producen internamente como parte normal del metabolismo dentro de la mitocondria y factores externos como contaminantes ambientales, radiación, drogas, pesticidas, solventes industriales y ozono Existen numerosos estudios relacionados con radicales libres, pro-oxidantes y antioxidantes con el fin de elucidar la importancia de los antioxidantes en los alimentos como agentes que aportan beneficios a la salud. (Cicero y Gaddi 2001; Becker y Nissen 2004; Huang et al., 2005; Prior et al., 2005; Fardet et al., 2008, Lobo et al., 2010; Carocho y Ferreira, 2013; Goufo y Trindade, 2014). Actividad antioxidante El término antioxidante no tiene una definición internacional aceptada. Halliwell y Gutteridge, (1995) definieron a los antioxidantes como “cualquier sustancia que, cuando presenta bajas concentraciones comparada con la de un sustrato oxidable, retarda o inhibe significativamente la oxidación del sustrato”. Más tarde se definió como “cualquier sustancia que retarda, previene o elimina el daño oxidativo de una molécula específica” (Halliwell, 2007). Según Goufo y Trindade, (2014), definen a los antioxidantes como “moléculas orgánicas que promueven la salud y protegen las células del cuerpo del daño causado por los radicales libres de especies reactivas de oxigeno que pudieran ejercer efectos metabólicos dañinos” El sistema antioxidante humano se divide en dos grupos principales: antioxidantes enzimáticos que a su vez se subdividen en defensas enzimáticas primarias (glutatión peroxidasa, catalasa y superóxido dismutasa) y secundarias (glutatión reductasa y glucosa-6 fosfato deshidrogenasa) (Gamble y Burke, 1984; Rahman, 2007) y antioxidantes no enzimáticos (vitaminas, iones inórganicos, polifenoles y otros micronutrimentos) (Fardet et al., 2008; Carocho y Ferreira, 2013).

Los cereales integrales contienen una gran variedad de compuestos con un gran potencial antioxidante (Fardet et al., 2008). Los ácidos fenólicos son la mayor fuente 8

de compuestos antioxidantes de manera libre y ligada con ésteres unidos a ácidos grasos, azúcares y paredes celulares de polisacáridos (Hamaker, 2008; Min et al., 2011; Goufo y Trindade, 2014). Los ácidos fenólicos más abundantes en los cereales son el ferúlico, el ρ-cúmarico y el sinápico; también pueden encontrarse el caféico, el vanílico, el ρ-hidroxibenzoico, el benzoico, el gálico, lignanos, isoflavonas, flavonoides,

flavonoles,

flavonas,

flavanonas,

chalconas,

proantocianidinas,

olígomeros de proantocianidinas, quinonas, fitoesteroles, fitoestanoles, esteril ferulatos, entre otros compuestos amino fenólicos. (Fardet et al., 2008; Hamaker, 2008).

El estudio de los antioxidantes y sus efectos positivos ha sido demostrado en varios alimentos y bebidas; sin embargo, se ha cuestionado su importancia, al tratar de entender los mecanismos por medio de los cuales los radicales libres generan el estrés oxidativo y la relación que guardan con los antioxidantes, la cantidad ingerida y el efecto pro-oxidante.

La controversia radica en la cantidad y los beneficios que pueden aportar los alimentos elaborados con antioxidantes que han sido evaluados in vitro y cómo pueden verse reflejadas dichas cantidades y beneficios en estudios in vivo (Cicero y Gaddi 2001; Becker y Nissen 2004; Huang et al., 2005; Prior et al., 2005; Fardet et al., 2008; Goufo y Trindade, 2014). 2.1.1.2 Capacidad antioxidante total (CAT) En general, los compuestos antioxidantes se pueden dividir en dos fracciones, hidrofílica y lipofílica, aunque no hay una demarcación definida entre ambos, las propiedades fisicoquímicas de estos dos grupos de componentes son bastante diferentes; sin embargo, la gran mayoría de los métodos de evaluación de antioxidantes son designados por componentes hidrofílicos y podrían no ser apropiados para las evaluaciones lipofílicas. No obstante, con el fin de obtener una buena evaluación de la CAT, se ha propuesto que los componentes lipofílicos necesitan separarse de los hidrofílicos empleando principios químicos similares (Prior

9

et al., 2003; Wu et al., 2004; Besco et al., 2007; Jang y Xu, 2009; Balogh et al., 2010; Min et al., 2011; Zielínski et al., 2012).

Existen diferentes términos para describir la capacidad antioxidante. El término “capacidad” antioxidante total, puede referirse a los términos de eficiencia, poder, parámetro, potencial, potencia y actividad; sin embargo, la “actividad” de un compuesto químico sería bajo condiciones de una reacción en específico; como presión, temperatura, medio de reacción y puntos de referencia, debido a que “la actividad antioxidante” medida por un ensayo individual refleja sólo la reactividad química bajo condiciones específicas de dicho ensayo, por lo que el término “actividad antioxidante total” es inapropiado. La capacidad antioxidante total se refiere a la suma de actividad antioxidante de las fracciones hidrofílicas y lipofílicas de los componentes antioxidantes de un material (Huang et al., 2005; Wu et al., 2004; Besco et al., 2007; Balogh et al., 2010; Zielínski et al., 2012). Dependiendo de los mecanismos de reacción para evaluar la capacidad antioxidante, éstos pueden clasificarse en dos grandes grupos: métodos basados en mecanismos de reacción por transferencia de átomos hidrógeno (HAT) y métodos basados en mecanismos de reacción por transferencia de un electrón (ET) (Prior et al., 2005; Huang et al., 2005).

Métodos de transferencia de atómos hidrógeno (HAT) Los métodos para evaluar la CAT por el mecanismo de reacción de HAT, miden la habilidad de un antioxidante para atrapar un radical libre por la donación de un átomo de hidrógeno Dentro de este grupo se encuentran los métodos de: capacidad de absorbancia

de

radical

oxígeno

(ORAC),

parámetro

antioxidante

total

de

atrapamiento de radical (TRAP), capacidad oxidante total de excavación (TOSC), quimioluminiscencia (CL), fotoquimioluminiscencia (PCL), oxidación de lipoproteína de baja densidad (LDL) (Prior et al., 2005, Huang et al., 2005)

Método ORAC: El método ORAC se fundamenta en los trabajos realizados por Glazer, Ghiselli y Cao et al., (Cao et al., 1993; Ghiselli 1995; Glazer 1999). Este método evalúa la inhibición antioxidante de fitoquímicos mediante la transferencia de 10

un átomo de hidrógeno al radical peroxilo (Ou et al., 2001), el cual reacciona con una prueba fluorescente (fluoresceína o diclorofluoresceína) para formar un producto no fluorescente que puede ser cuantificado. La CAT es determinada por un índice en el decremento y la cantidad de producto formado sobre el tiempo. Los valores de ORAC se expresan en micromoles de equivalentes de trolox por litro o por gramo de muestra (µmol TE/g o µmol TE/L) (Ishige et al., 2001; Prior et al., 2003). El método ORAC tiene la ventaja de ser una fuente controlable de radicales peroxilo de reacciones modelo de antioxidantes lipídicos en alimentos y sistemas fisiológicos. El principio del método ORAC pude ser adaptado para utilizar otras fuentes de radicales y detectar antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos. Es un método fácilmente automatizado; sin embargo, es altamente sensible a la temperatura, los reactivos fluorescentes son muy sensibles y requieren de equipos fluorométricos de difícil acceso en los laboratorios analíticos. El tiempo de análisis es de una hora aproximadamente (Prior et al., 2003).

Método PCL: Fue descrito por Popov y Lewin (Popov y Lewin, 1994, 1999 y 2001) y ha sido comercializado por Analytik Jena AG (Jena, Alemania) como un sistema completo bajo el nombre de PhotochemMR. Este ensayo involucra la generación fotoquímica

del

radical

superóxido

O2.,

combinado

con

la

detección

de

quimioluminiscencia. Se inicia con la excitación óptica de un fotosensibilizador, que genera el radical anión superóxido (Popov y Lewin 2001). Existen dos tipos de radicales presentes en el sistema de medición PCL: anión superóxido y radicales de luminal, quienes en un estricto sentido de la capacidad antioxidante representan una capacidad antiradical. Los radicales libres son detectados con un reactivo quimioluminiscente, luminol, quien actúa como un fotosensibilizador al mismo tiempo que como un reactivo para la detección de radicales de oxígeno. El ACW y ACL, son sistemas de reactivos comercializados por el mismo fabricante, los cuales son empleados

para

medir

la

actividad

antioxidante

hidrofílica

y

lipofílica,

respectivamente, de muestras biológicas y alimentos (Besco et al., 2007; Balog et al., 2010; Zielínski et al., 2012). El ácido ascórbico y el trolox son los reactivos de calibración más comunes para medir la actividad antioxidante hidrofílica y lipofílica 11

respectivamente, en intervalos de medición de 0-3 nmol. En contraste con otros métodos de ensayo de la CAT, el método PCL no es restringido a un valor de pH específico o un intervalo de temperatura. El sistema es comercializado como un método efectivo en tiempo y costo para la determinación de la CAT a través de anión superóxido. Los reactivos para los ensayos hidrofílicos y lipofílicos están disponibles sólo por el fabricante (Cho et al., 2005).

Métodos de Transferencia de un Electrón (ET) Estos ensayos incluyen el método más común para evaluar la CAT, con frecuencia mal entendido por el nombre de ensayo de fenoles totales con el reactivo de FolinCioacalteu (F-C). Además, también están agrupados en esta categoría los métodos de capacidad antioxidante de equivalentes de trolox (TEAC), poder antioxidante reductor del ion férrico (FRAP), el ensayo de N, N-dimetil-p-fenilenediamina (DMPD) y el ensayo de capacidad de reducción de Cu II (Huang et al., 2005; Prior et al., 2005). Método Folin-Ciocalteu: Se ha empleado durante mucho tiempo para la evaluación de compuestos fenólicos totales en productos naturales, su mecanismo básico es una reacción de óxido-reducción. Este método fue desarrollado en 1927 con reactivos químicos utilizados para el análisis de tirosina, en donde la oxidación de compuestos fenólicos se lleva a cabo por un reactivo de molibdenotungstofosfórico que produce un producto colorido de 745-750 nm. El método es simple, sensible y preciso (Prior et al., 2005). Para llevar a cabo estas reacciones se emplean diferentes concentraciones de reactivos y condiciones de incubación. Se han reportado estándares de referencia de ácido gálico que son remplazados por equivalentes de catequina, ácido tánico, ácido clorogénico, ácido cafeico, ácido vanílico y ácido ferúlico.

La falta de métodos estandarizados puede conducir a diferentes órdenes de diferencias en magnitudes de compuestos fenólicos detectados. El ensayo F-C tiene muchas interacciones con otras sustancias (principalmente azúcares, aminas aromáticas, dióxido de sulfuro, ácido ascórbico, enedioles, ácidos orgánicos y 12

reductores Fe II) (Shahidi et al., 2009; Jang y Xu, 2009; Lai et al., 2009; Zhang et al., 2010; Arab et al., 2011; Min et al., 2011, 2012 y 2014; Goufo et al., 2014b; Schmidt et al., 2014; Ti et al., 2014; Wanyo et al., 2014). Un factor clave a considerar en la selección de un método para evaluar la CAT está relacionado con el mecanismo de reacción y su relación con la aplicación del objeto de estudio. Para reacciones antioxidantes clásicas, un mecanismo HAT es mejor que un mecanismo ET, ya que el radical peroxilo es predominante en la oxidación de lípidos en alimentos y sistemas biológicos; sin embargo, también es importante desarrollar nuevos ensayos empleando otras fuentes de radicales como el hidroxilo, anión superóxido y peroxinitrito, debido a que estos radicales libres están activos en células y tejidos de plantas y animales (Prior el at., 2005).

2.1.1.3 Métodos de extracción de antioxidantes Previo a la evaluación in vitro e in vivo de los antioxidantes, es importante la selección del método de extracción para la óptima obtención de los compuestos antioxidantes. Para lograr una mayor eficiencia de extracción se debe considerar tanto la naturaleza de los materiales, como de los compuestos antioxidantes presentes en el producto a evaluar (Tsao y Deng, 2004).

Existen diferentes métodos para la extracción de compuestos antioxidantes; sin embargo, la extracción con solventes o extracción sólido-líquido (ESL) referida también comúnmente como lixiviación, es una de las técnicas más convencionales, la cual consiste en remover un componente deseado (soluto) de un alimento usando un líquido (normalmente un solvente orgánico) capaz de disolver el soluto (Fellows, 2000).

La extracción sólido-líquido, es uno de los métodos más empleados debido a su fácil manejo, eficiencia y aplicabilidad a un gran número de muestras. La eficiencia de la extracción depende del tipo de solvente y su polaridad, el tiempo y temperatura de extracción, el radio muestra-solvente, así como también la composición y las

13

características físicas de la muestra (Lai et al., 2009; Zhang et al., 2010; Arab et al., 2011; Min et al., 2011, 2012, 2014; Goufo et al., 2014a; Schmidt et al., 2014)

El metanol es uno de los solventes más empleados por su alta eficiencia de extracción; sin embargo, dependiendo del tipo de antioxidantes a evaluar dependerá la selección del mismo. Se han empleado diferentes técnicas de extracción empleando el método ESL, mediante el uso de agua, solventes orgánicos y gas líquido o combinaciones de ambos bajo diferentes condiciones de temperatura y presión (Tsao y Deng 2004).

Estas técnicas han sido asociadas con altos consumos de solventes, largos tiempos de extracción y un incremento de riesgo de degradación térmica de compuestos lábiles. La extracción Soxhlet es una de las técnicas más empleadas; aunque en comparación con el resto de técnicas, ésta requiere de largos tiempos de extracción (24 horas o más) y un alto consumo de energía (Ballard, 2008); sin embargo, se están desarrollando nuevos procedimientos de extracción con el fin de reducir tiempo y consumo de solventes; algunas de estas técnicas incluyen la extracción de fluido supercrítica, de solvente acelerado, la micro-extracción en fase sólida, la asistidaultrasónica y la asistida de microondas (Tsao y Deng, 2004; Ballard, 2008).

Para la extracción de antioxidantes de cereales integrales, se han empleado generalmente métodos ESL con solvente hexano, metanol, acetona, etanol, acetato de etilo y agua; en forma pura o en combinaciones con ácidos o álcalis en diferentes condiciones de tiempo y temperatura de extracción, radio muestra-solvente, así como también composición y características físicas de la muestra. (Shahidi et al., 2009; Jang y Xu, 2009; Lai et al., 2009; Zhang et al., 2010; Arab et al., 2011; Min et al., 2011, 2012, 2014; Goufo et al., 2014a; Schmidt et al., 2014; Wanyo et al., 2014).

2.1.2 Evaluación del efecto de los ingredientes funcionales En los humanos, las mediciones de los efectos fisiológicos de los ingredientes alimentarios con frecuencia son muy directas y tienen que ser preferentemente no 14

invasivas mediante el análisis de sangre, orina o excremento (Hamaker, 2008). Lo que ha permitido el desarrollado de diversos métodos in vitro para describir las interacciones entre los componentes del alimento, las propiedades fisiológicas de la matriz alimentaria antes, durante y después de la digestión o fermentación cólonica (Hamaker, 2008; Fardet et al., 2008; Sensoy, 2014).

2.1.1.1 Métodos de evaluación in vitro Los métodos in vitro, son relativamente de bajo costo y tienen la ventaja de no ser éticamente cuestionables, generalmente simulan el tránsito gastrointestinal entre otras funciones del organismo, son técnicas con las que se puede conseguir mayor exactitud y reproducibilidad (Sensoy, 2014).

Sin embargo, un método in vitro es apropiado sólo si sus resultados están bien correlacionados con un método in vivo (Fardet et al., 2008); esta correlación puede darse a través de la biodisponibilidad, que es la fracción de los nutrimentos ingeridos que están disponibles para su almacenamiento o fisiología en el cuerpo (Duchateau y Klaffke, 2008; Sensoy, 2014).

La biodisponibilidad de hidratos de carbono en el tracto gastrointestinal, es de las más estudiadas y pueden evaluarse mediante fracciones digeridas del alimento por métodos in vitro de las fracciones hidrolizadas y absorbidas en forma de glucosa, fructosa y galactosa. El principio de todos los métodos in vitro para analizar los hidratos de carbono es la α-amilolisis (Englyst et al., 1999); sin embargo, actualmente no se tiene un protocolo estandarizado para la evaluación de su digestibilidad in vitro existiendo diferentes variaciones en sus parámetros como pH, pureza de pepsina, pureza y radio de distribución de la proteína y método de detección (Hamaker, 2008).

El estudio in vitro de la lipolisis es mucho más complejo, debido a las propiedades hidrofóbicas y a las estructuras químicas de sus moléculas, aunque se han estudiado diversos modelos de lipolisis in vitro para investigar la disolución de sustancias ligeramente liposolubles en grados de hidrólisis controlada, como el modelo dinámico 15

que permite la evaluación de múltiples variables como la concentración de sales biliares, Ca2+ o actividad de lipasa (Zangenberg et al., 2001).

Los sistemas in vitro para minerales consisten en primera instancia en la simulación de la digestión gastrointestinal y el cultivo de células Caco-2 (Kloots et al., 2004; Perales et al., 2005; Viadel et al., 2006). También se han empleados métodos simples de evaluación gastrointestinal in vitro para predecir la biodisponibilidad de selenio y otros métodos de diálisis in vitro para medir la biodisponibilidad de hierro y zinc (Hamaker, 2008).

Evaluación in vitro de la CAT Los métodos empleados con mayor frecuencia para evaluar la CAT in vitro son los métodos ORAC, TEAC (en sustratos ABTS y DPPH) y FRAP (Fardet et al., 2008). Los productos a base de cereales tienen potenciales antioxidantes significativos que han sido medidos in vitro (Miller et al., 2000; Wu et al., 2004b; Pellegrini et al., 2006;). Miller et al., (2000) reportaron un promedio de la capacidad antioxidante de los cereales y productos a base de cereales usando el método DPPH, con valores entre 1200 y 3500 µmol TE/100 g de producto fresco, más altos que el de frutas comunes (1200 µmol TE/100 g) y vegetales (400 µmol TE/100 g), pero más bajo que el de bayas comunes (alrededor de 3880 µmol TE/100 g) (Fardet el al., 2008).

La CAT medida in vitro en cereales, está significativamente correlacionada con su contenido de ácidos fenólicos, de igual manera que en frutas y vegetales. Esto se debe principalmente al contenido de ácido ferúlico, el mayor componente fenólico de los cereales (Adom y Liu, 2002). Se estima que la capacidad antioxidante en salvado de arroz es de 24,000 µmol TE/100 g (Wu et al., 2004b).

Se han desarrollado varias pruebas in vitro (HT-29, HCT116, Caco-2 y CT-26) para evaluar las propiedades antioxidantes y anti-proliferativas de diversas moléculas de origen vegetal en humanos y modelos murinos (Tarozzi et al., 2004; Athukorala et al., 2006). El objetivo principal de los métodos de evaluación in vitro en los antioxidantes, 16

es predecir su eficiencia biológica; de tal manera que su aceptabilidad está correlacionada con la evaluación in vivo de su capacidad antioxidante (Fardet et al., 2008). 2.1.2.2 Métodos de evaluación in vivo Los métodos in vivo, en humanos o animales, proveen un dato directo de la biodisponibilidad de los nutrimentos. Generalmente, un método in vivo mide el efecto de una cierta dosis de un nutrimento después de su ingesta y los cambios de su concentración con el tiempo en el plasma sanguíneo (Sensoy, 2014); también puede evaluarse después de un periodo prolongado de consumo constante de un alimento en específico. Aunque los estudios in vivo en humanos y animales han sido éticamente cuestionados, son los más apropiados para la investigación de la biodisponibilidad de los nutrimentos a pesar de la variabilidad de los estados fisiológicos de cada individuo y su posible interacción con nutrimentos y otros componentes de la dieta (Biehler et al., 2011; Sensoy, 2014).

La evaluación in vivo en humanos voluntarios para estudiar la biodisponibilidad de los nutrimentos de los componentes alimentarios, incluye la determinación de hidratos de carbono mediante la evaluación del índice glucémico, el cual ha sido estandarizado por diversos grupos de científicos (Brouns et al., 2005).

Los estudios in vivo para la determinación de la digestión de proteínas, se realizan a través del consumo de fracciones de proteínas, etiquetadas intrínsecamente (proteína [13C] leucina-etiquetada) (Boirie et al., 1997; Dangin et al., 2002, 2003). El estudio de la digestión y absorción de emulsiones de grasa o lípidos emulsionados, se lleva a cabo a través de técnicas de aspiración gástrica y duodenal (Hamaker, 2008).

Las determinaciones de la biodisponibilidad in vivo de vitaminas (riboflavina, folato, vitamina C, vitamina B12) y minerales (hierro, zinc, cobre, etc.) de matrices complejas o micronutrimentos de suplementos dietéticos, se han llevado a cabo en voluntarios sanos por mediciones de cambios postpandriales de las concentraciones en suero y 17

plasma después de consumir los alimentos de prueba, versus el placebo (Navarro y Wood, 2003).

Se han llevado a cabo otras evaluaciones in vivo en humanos voluntarios y modelos animales, como la fermentabilidad de hidratos de carbono y el metabolismo de proteínas colónicas, propiedades prebióticas, el tiempo de tránsito y movilidad del tracto digestivo y la excreción fecal, efecto en la carcinogénesis colónica, evaluación de la saciedad inducida por el componente alimentario, entre otras. (Hamaker, 2008). Evaluación de la CAT in vivo Los efectos in vivo de los antioxidantes, no sólo son función de su concentración, también están asociados a su biodisponibilidad (Palafox et al., 2011). Las propiedades antioxidantes in vivo, han sido evaluadas en muchos modelos animales con dextrán sulfato de sodio (DSS) para desarrollar inflamación intestinal y mediante la ingesta de algunos compuestos antioxidantes que reducen el daño oxidativo en DNA, pero también reducen los niveles de ciclooxigenasa-2 y la restauración de dismutasa-2 para el control de los niveles de antioxidantes (Luceri et al., 2004).

La evaluación in vivo de la vitamina E, se ve influida por el grado de lipolisis y la ingesta del alimento cuando es administrado oralmente. Por lo que, diversos estudios han considerado la formulación de alimentos ricos en tocotrienoles en sistemas de liberación solubles en agua para incrementar su solubilidad (Fu et al., 2014).

Fairus et al., (2006) reportaron que los tocotrienoles han sido transportados en fracciones ricas de triacilglicerol y VDL, LDL y HDL, después de la administración de fracciones ricas de tocotrienoles en sujetos sanos. A diferencia de los tocoferoles, que fueron distribuidos equitativamente en todas las fracciones de lipoproteínas, los tocotrienoles fueron detectados principalmente en colesterol HDL a las 4 y 8 horas de la ingesta. Yap y Yuen, (2004) describen que las formulaciones de alimentos ricos en tocotrienoles, deberían ser en forma de dispersión coloidal para incrementar su biodiponibilidad.

18

La mayoría de las evidencias directas de biodisponibilidad de compuestos fenólicos han sido obtenidas mediante la determinación de las concentraciones en plasma y orina después de la ingestión (Scalbert y Williamson, 2000). Hollman et al., (1997) reportaron que la máxima concentración de quercetina en plasma se alcanzó a las 9 horas después de la ingestión. La gran mayoría de los flavonoides absorbidos en el intestino delgado presentan un rápido decremento de la concentración en plasma, presentando un periodo de vida corto de 1-2 horas después de la ingestión (Scalbert y Williamson, 2000).

Para mantener alta concentración de compuestos fenólicos en plasma, se requiere repetir la ingestión una y otra vez, en periodos de tiempo de 2 horas, el cual ha sido observado en voluntarios que consumen té (van het Hof et al., 1999); sin embargo, el promedio de vida de los metabolitos formados en la microflora colónica es más largo, debido al tiempo de residencia de los compuestos fenólicos en el colon. Existe evidencia de la producción de metabolitos en plasma y orina después de dos días de haber ingerido leche de soya y semilla de lino (Nesbitt et al., 1999).

Los compuestos fenólicos evaluados in vivo, no son muy biodisponibles. Por otro lado, es muy difícil de predecir la eficiencia in vivo de un antioxidante basado solamente en mediciones in vitro; por lo tanto, la relación entre la capacidad antioxidante medida in vitro y la evaluación de su efecto en humanos, no se conoce realmente. Las contribuciones de las mediciones in vivo y los modos de acción de los antioxidantes de los micronutrimentos incluidos en una base compleja del alimento siguen aún sin ser esclarecidos (Fardet et al., 2008).

La idea principal es que los antioxidantes tienen un impacto positivo en la salud; sin embargo, los antioxidantes potenciales evaluados in vitro pueden no tener un efecto significativo evaluado in vivo, lo que hace necesaria la realización de nuevos estudios en humanos sobre los efectos de los alimentos ricos en antioxidantes (Devasagayam et al., 2004). Lo anterior es debido a que las evaluaciones in vitro ignoran otras funciones biológicas, en las que los micronutrimentos antioxidantes evaluados in vivo 19

pueden incurrir, como la influencia de la actividad antioxidante enzimática, rutas metabólicas de oxidación, activación o inhibición de genes que codifican para ciertos tipos de enzimas antioxidantes y activación de rutas metabólicas. Dichas funciones biológicas pueden llevarse a cabo sólo en modelos in vivo, haciendo las evaluaciones en humanos estudios más importantes para medir el efecto de los antioxidantes. El fin de las evaluaciones in vivo, es elucidar los modos de acción de los micronutrimentos antioxidantes y su relación con la estructura compleja del alimento. Actualmente, se ha puesto gran atención en los estudios de la relación entre la estructura del alimento y la biodisponibilidad de los nutrimentos in vitro e in vivo para el desarrollo y formulación de alimentos funcionales (Sensoy, 2014).

2.1.3 Formulación de alimentos ricos en antioxidantes Las interacciones del alimento y el cuerpo humano son extremadamente complejas. Relacionan diferentes procesos fisiológicos y psicológicos, que dependen de las propiedades y la estructura del alimento inicial (McClements et al., 2008; Sensoy, 2014). La disminución del tamaño de partícula del alimento incrementa el área de contacto, permitiendo una mayor disponibilidad para la digestión y la absorción (Sensoy, 2014).

Actualmente se han desarrollado nuevas tecnologías de microencapsulación, nanoencapsulación, nanoemulsión, microemulsión y nanopartículas biopoliméricas, en sistemas de liberación solubles en agua para incrementar su absorción (Huang et al., 2012; Fu et al., 2014; Sensoy, 2014); no obstante, para una mejor liberación de los nutrimentos de los alimentos funcionales en el tracto gastrointestinal, se requiere del conocimiento y trabajo en equipo de científicos en alimentos, ingenieros, nutriólogos, médicos y psicólogos para lograr el desarrollo de una formulación efectiva (Sensoy, 2014)

En el desarrollo de nuevos productos alimenticios generalmente se utilizan diseños de mezclas, para optimizar las proporciones de los ingredientes. La forma como se analizan este tipo de diseños, es a través de una superficie de respuesta, que es la 20

que permite encontrar la formulación óptima de una serie de mezclas de prueba (Salamanca et al., 2010). Sin embargo, la valoración sensorial ha demostrado ser un instrumento de gran eficacia para el control de calidad y aceptabilidad de un alimento, además que orienta el proceso de formulación (Faccin et al., 2009).

2.1.3.1 Diseños con mezclas Los diseños con mezclas están definidos para problemas de mezclas físicas de componentes, donde no existe total independencia entre las variables, que en este caso son las proporciones de los ingredientes de una formulación dada. Los diseños con mezclas se emplean para explorar cómo los cambios en la composición de la mezcla pueden afectar las propiedades de éstas (Cornell 2002), hablando en términos de la tecnología de alimentos, cómo la variación de las proporciones inciden sobre la calidad sensorial (Salamanca et al., 2010).

Los diseños de mezclas se subdividen en dos grandes grupos. El primero incluye los diseños aplicables a problemas sin restricciones, los cuales deben entenderse como aquellos donde los ingredientes en la formulación pueden aparecer en un rango que va desde no aparecer, hasta ocupar la totalidad de la mezcla estudiada. Los diseños incluidos en este grupo son el simplex-lattice, simplex centroide y axiales (Pacheco et al., 2008; Mendiola et al., 2009; Salamanca et al., 2010).

El segundo grupo incluye los diseños que resuelven problemas con restricciones; en éstos, los ingredientes están acotados entre valores de máximo y mínimo, el diseño D-Optimal es el más empleado.

Estos diseños se basan en un criterio de óptimo, el cual garantiza que los puntos experimentales minimicen la varianza de los parámetros estimados para un modelo predefinido. En los diseños con mezclas se distribuyen los puntos experimentales en el área de muestreo, de modo que se puedan ajustar a modelos polinomiales lineales, cuadráticos y cúbicos (Huang et al., 2005).

21

2.1.3.2 Calidad y evaluación sensorial El ”Institute of Food Technologists” (IFT), define la evaluación sensorial como “la disciplina científica utilizada para evocar, medir, analizar e interpretar las reacciones a aquellas características de alimentos y otras sustancias, que son percibidas por los sentidos de la vista, olfato, gusto, tacto y oído” (Hernández 2005; Tuorila y Monteleone, 2009). El principio de la evaluación sensorial se caracteriza por la definición de los atributos primarios como el aspecto (tamaño, forma, color), sabor (aroma, gusto), textura y por el desarrollo y adaptación de las evaluaciones sensoriales al control de la calidad de los alimentos (Sancho et al., 2002).

Pruebas de aceptación o hedónicas La evaluación hedónica se aplica cuando se han de hacer comparaciones con varias muestras, sin exceder 20 muestras y un total de evaluadores de entre 60 y 100 en el análisis sensorial. Las muestras son calificadas sobre una escala de nueve puntos que va de extremadamente agradable a extremadamente desagradable (Sancho et al., 2002). El análisis de estos datos se realiza con varias pruebas estadísticas y en la actualidad se apoya en paquetes estadísticos.

Existen evidencias de que el consumo de cereales ha incrementado a nivel mundial (Ozen et al., 2012), probablemente como consecuencia de la preocupación social por la alta incidencia de enfermedades crónicas no transmisibles que afectan a gran parte de la población mundial, atribuyendo que su alto contenido de micronutrimentos y fibra en las fracciones de germen y salvado, tienen un gran potencial antioxidante en beneficio de la salud (Dipti et al., 2012, Ozen et al., 2012; Patel, 2012; Goufo y Trindade, 2014). Por tanto, los productos a base de salvado tienen una prometedora aplicación como ingredientes nutricionales; permitiendo el diseño y formulación de nuevos productos para despertar el descubrimiento de su enorme potencial como promotor de la salud (Patel, 2012).

Algunas de las aplicaciones más comunes son: botanas, productos de panadería, cereales, galletas, pastas, acondicionadores de masa, bebidas, alimentos libres de 22

gluten y suplementos alimenticios. Por la experiencia acumulada en su uso, se sugiere la incorporación del salvado de arroz estabilizado (SAE) intacto en la elaboración de productos alimenticios, ya que al igual que sucede con otros alimentos, su efecto es mejor que el obtenido fortificando con fracciones de salvado de arroz concentradas o de compuestos aislados (Kahlon, 2014).

2.2 Arroz: Salvado de arroz El salvado de arroz (SA), es un subproducto del proceso industrial para obtener arroz comercial, poco utilizado para el consumo humano a pesar de su excelente calidad nutricional, hipoalergenicidad y potencial como fuente rica de compuestos antioxidantes benéficos para la salud (Lima et al., 2002).

2.2.1 Generalidades El SA, es un material fino y harinoso de color café claro (beige) que resulta del pulido o blanqueado del arroz café (arroz integral) para convertirlo en arroz blanco (arroz comercial). Comprende la parte externa del arroz y está constituido por capas que cubren al grano y al germen, así como también algunas cantidades de endospermo (Kim et al., 2014). El SA contiene el 10% del peso total del arroz y comprende las capas del pericarpio, aleurona, capa de la semilla, capa nucelar, germen pulverizado y trazas de endospermo, como se muestra en la figura 1 (Orthoefer, 2001).

Figura 1. Estructura de la semilla de arroz. Adaptado de Champagne, (2004).

23

Cuando estas capas son removidas durante el pulido, los lípidos del SA entran en contacto con enzimas lipasas que son causantes de la hidrólisis de los aceites neutros del SA, haciéndolo inestable al provocar una rancidez hidrolítica y oxidativa que modifica sus propiedades funcionales y atributos sensoriales; por lo que su uso ha sido limitado sólo como ingrediente de alimento para ganado o como fertilizante. Sin embargo, esto se puede evitar mediante un proceso alterno de estabilización de las lipasas (Kim et al., 2014).

2.2.1.1 Origen y distribución Estudios recientes de modelos demográficos basados en datos de polimorfismo de un solo nucleótido, dan evidencia de que el arroz domesticado tiene un solo origen (Lim, 2013); otros estudios que han empleado análisis Bayesianos filogenéticos, indican lo mismo; ambos estudios sugieren que el arroz fue cultivado por primera vez entre 8,200 y 13,500 años en el valle de Yangtze, China (Lim, 2013). Hoy en día el arroz es cultivado en Europa, África, Asia, Australia, América del Norte y América del Sur; los productores líderes mundiales de arroz son China, India, Indonesia, Bangladesh, Vietnam, Myanmar, Tailandia, Filipinas, Brasil, Estados Unidos, Japón y Cambodia (Lim, 2013).

2.2.1.2 Clasificación El arroz (Oryza Sativa L.) se clasifica de manera general en dos subespecies, Índica y Japónica. Las variedades de arroz Índica generalmente crecen en áreas tropicales, son plantas vigorosas, altas, tienen hojas largas y granos firmes para la cocción; mientras que las variedades de arroz Japónica crecen en zonas templadas, son más productivas, de tamaño corto a intermedio, tienen bajo contenido de amilosa y granos suaves para la cocción (Goufo y Trindade, 2014). El salvado de arroz se ha categorizado en 7 clases de colores: blanco, beige, café pardo, café, rojo, morado y morado pardo (Min et al., 2011). El salvado beige es el más común, es astringente, ligeramente dulce, aceitoso y tiene un sabor a nuez tostada. Su textura y consistencia varían de un polvo fino a pequeñas hojuelas, dependiendo del proceso de estabilización.(Sharif et al., 2014). 24

2.2.2 Proceso de obtención

2.2.2.1 Blanqueado de arroz El blanqueado de arroz se puede definir de manera general como un proceso para separar el salvado y el germen del endospermo del grano de arroz, mediante el cual los operadores utilizan maquinaria sofisticada para remover materiales extraños, cáscara, grano quebrado, salvado y germen, con el fin de obtener una presentación comercial (Ragaee et al., 2014). Aunque el proceso de blanqueado es complicado, se lleva a cabo en solo cuatro etapas: 1) limpieza, la remoción del material extraño del arroz; 2) producción de arroz integral, la remoción de la cáscara del grano de arroz; 3) remoción del salvado, la remoción selectiva de las capas de salvado y germen del grano de arroz y 4) clasificación, la remoción de los granos quebrados del arroz blanqueado. Durante este proceso se obtienen principalmente tres subproductos cascarilla, salvado y arroz quebrado (Champagne, 2004).

El pulido como tal, también llamado blanqueado o refinado; es la etapa en la cual el arroz integral (arroz café) es sometido a un proceso de abrasión para eliminar la cutícula que recubre al grano y al germen con el fin de obtener un arroz blanco o pulido y un salvado de arroz color beige como subproducto (Champagne, 2004). Muchos estudios han demostrado que la concentración de compuestos fenólicos en las capas exteriores de los cereales que se obtienen en el salvado como un subproducto del proceso de pulido, son fuentes potenciales de antioxidantes y su concentración disminuye drásticamente durante el proceso de refinación del grano de dicho cereal (Jang y Xu, 2009; Ragaee et al., 2014; Wanyo et al., 2014).

La concentración de nutrimentos y el contenido de antioxidantes son influenciados por el grado de abrasión o el tiempo de pulido del grano de arroz. Estudios recientes han reportado que los contenidos de proteínas y minerales del arroz, disminuyen en función del grado de pulido, mientras que su contenido de almidón incrementa (Laokuldilok et al., 2013). Rohrer y Siebenmorgen, (2004) estudiaron el efecto de los tiempos de pulido sobre el contenido de antioxidantes en salvado de arroz, 25

reportando que la concentración más alta de vitamina E se obtiene a los 10 segundos del segundo proceso de pulido, mientras que el contenido más alto de gamma-oryzanol se obtiene a los 10 segundos del primer proceso de pulido (Laokuldilok et al., 2013).

2.2.2.2 Estabilización Cuando las capas del SA son removidas del endospermo durante el proceso de blanqueado, los lípidos en el SA entran en contacto con enzimas reactivas como las lipasas, las cuales están presentes endógenamente en el SA, causando la hidrólisis del aceite del SA en ácidos grasos libres y glicerol (Figura 2), provocando la rancidez hidrolítica que contribuye a una baja calidad sensorial y al incremento de su acidez (Kim et al., 2014).

Figura 2. Oxidación de los lípidos del salvado de arroz. (Interredu, 2014).

La inestabilidad del SA ha sido reconocida desde hace mucho tiempo; aproximadamente desde hace 100 años que la actividad de la lipasa (AL) del SA fue identificada. La AL es altamente dependiente de la temperatura y la humedad (Champagne, 2004). La temperatura óptima de la lipasa es de 35 a 40°C; en cambio, a temperaturas de congelación no hay actividad de lipasas. El SA también contiene lipooxigenasa y peroxidasa, ambas enzimas tienen un impacto negativo sobre el estado oxidativo del SA. Al 4% del contenido de humedad, la temperatura de inactivación de la lipoxigenasa es de 40°C, para la lipasa es de 55°C y para la peroxidasa es de 70°C (Juliano, 1985).

26

Para evitar la rancidez hidrolítica del SA, es indispensable inactivar la lipasa, por medio de diferentes métodos que deben efectuarse inmediatamente después del pulido del arroz. Esta operación se conoce como estabilización del SA. La estabilización del SA ideal para mejorar la calidad nutricional y sensorial, debe llevarse a cabo una hora después del pulido del arroz (Champagne, 2004). La estabilización del SA también inactiva otros inhibidores nutricionales eliminando su toxicidad sin causar daño a la calidad de sus proteínas, además de que destruye hongos, bacterias y otra contaminación causada por insectos, lo cual le permite incrementar su vida de anaquel y la seguridad alimentaria (Sharif et al., 2014). Los métodos utilizados para estabilizar el salvado de arroz incluyen extrusión seca, extrusión húmeda, refrigeración, modificación de pH y tratamientos químicos (Orthoefer, 2001). La degradación enzimática puede ser inhibida empleando la extrusión, tratamientos en microondas, calentamiento óhmico, tratamientos con calor seco, ‫ץ‬-irradiación, pre-cocido y tostado (Yilmaz et al., 2013).

La estabilidad de almacenamiento prolongada del SA, puede ser obtenida por varios tratamientos térmicos. Se ha reportado que los tratamientos hidrotérmicos en el SA favorecen una vida de anaquel más prolongada. El calor húmedo es efectivo para la desnaturalización permanente de las lipasas (Pradeep et al., 2014). Los tiempos de secado requerido para la estabilización van de 20 a 30 minutos, los tiempos prolongados de calentamiento ocasionan un colorido oscuro al SA (Champagne, 2004).

Los procesos de estabilización más adecuados, son aquellos donde se atacan directamente las enzimas causantes del deterioro del SA, se han estudiado muchos procesos de estabilización con tratamientos físicos, químicos, y enzimáticos, controlando la humedad de las muestras, los cuales han dado buenos resultados; sin embargo, el tratamiento que ha presentado mejores resultados desde el punto de vista de la estabilización por baja liberación de

27

ácidos grasos ha sido el realizado con calor húmedo (Pradeep et al., 2014; Sharif et al., 2014).

Estabilización por calor húmedo Es un proceso que combina diversas operaciones unitarias, como mezclado, cocción, amasado, moldeado y el secado. Es considerado como un método de alta temperatura en corto tiempo, que permite una alta versatilidad en cuanto al contenido de humedad de las muestras procesadas, su composición, la temperatura de trabajo, el rango de presión que se utilizan y otras condiciones de operación (Guy, 2001).

El SA que es sometido a este método de estabilización regularmente incrementa la densidad y el contenido de humedad disminuye entre 5 y 8%, lográndose su estabilidad aproximadamente a los 3 minutos. La extrusión puede generar inconvenientes debido a que aparecen colores oscuros producidos por las altas temperaturas, se puede originar inactivación incompleta de la enzima lipasa, como al proceso se adicionan agua o vapor, se requiere secar el salvado con aire caliente despues de la estabilización, lo cual incrementa los costos (Champagne, 2004).

Estabilización por microondas En años recientes, el uso de la energía de microondas como una fuente económica de calor para procesos térmicos de alimentos, ha ofrecido una alternativa para la estabilización del SA (Sharif et al., 2014). El calentamiento por microondas se considera que es uno de los sistemas con mayor eficiencia energética y uno de los métodos más rápidos para calentar productos alimenticios (Yoshida et al., 2003).

Este método de calentamiento ahorra tiempo y energía, una ventaja significativa es que produce el calentamiento interno de las partículas dentro de la cavidad del microondas y las moléculas de agua dipolares en el salvado de arroz son excitadas por las ondas electromagnéticas que tienden a vibrar (Malekian et al., 2000). El SA ha sido estabilizado por calentamiento en microondas por cuatro minutos hasta

28

alcanzar una temperatura interna de 110 a 115 °C para desnaturalizar las enzimas (Zhu, 2002).

2.2.3 Composición química del salvado de arroz La composición química del SA cambia proporcionalmente de acuerdo a la variedad del arroz, a los tratamientos antes del pulido, al tipo de sistema y al grado de pulido (Sharif et al., 2014). La composición del salvado de arroz que incluye al germen, es comparable con el contenido de fibra, proteína y minerales que contienen otros salvados. En el cuadro 1 se muestra la composición química del salvado de arroz. Cuadro 1. Composición química del salvado de arroz.

Constituyente

Composición ( 14% humedad)

Proteína cruda (%N x 6.25)

12.0 - 15.6

Lípidos (%)

15.0 - 19.7

Hidratos de carbono (%)

31.1 - 52.3

Cenizas (%)

6.6 - 9.9

Calcio (mg/g)

0.3 - 1.2

Magnesio (mg/g)

5.0 – 13.0

Fósforo/Fitina (mg/g)

9.0 – 22.0

Sílice (mg/g)

6.0 – 11.0

Zinc (µg/g)

23.0 – 258.0

Tiamina (B1) (µg/g)

12.0 – 24.0

Rivoflavina (B2) (µg/g) Niacina (B3) (µg/g)

1.8.0 - 4.3 267.0 – 499.0

Fuente: Champagne, 2004.

En el salvado de arroz se encuentran notablemente lípidos, fósforo y sílice; además de grandes cantidades de vitaminas del complejo B y tocoferoles, pero contiene pequeñas cantidades de vitaminas A y C. El contenido de nitrógeno en salvado de arroz es de 1-3% (base seca), en su gran mayoría corresponde a nitrógeno de 29

proteínas. Las mayores fracciones proteicas corresponden a albúmina y globulina (Champagne, 2004).

La composición de SA estabilizado es de 21-27% de fibra total, 12-16% de proteína y de 18-22% de lípidos, de los cuales comprenden 41% de ácidos grasos monoinsaturados, 36% de ácidos grasos poliinsaturados, 19% de ácidos grasos saturados y 4% de lípidos no saponificables (LNS). Los lípidos no saponificables contienen más del 43% de fitoesteroles (campesterol, stigmasterol, 13-sitosterol, entre otros), 28% de alcoholes triterpeno (24-metileno cicloartanol y cicloartenol) y menos del 19% de compuestos polares como alcoholes alifáticos y otros hidrocarburos y 10% 4-metilesteroles. El gamma-oryzanol, una mezcla de ácido ferúlico y ésteres de alcoholes triterpenoides, está compuesto de un 20% a un 30% de LNS y 1.1 a 2.60 % del aceite del salvado de arroz (Kahlon, 2014).

Cheruvanky et al., (2003) reportaron la composición química de salvado de arroz estabilizado comercial TheRiceX Company (El Dorado Hills CA, USA.) con un contenido de lípidos de 18-23%, proteínas de 12-16%, fibra total de 23-35%, hidratos de carbono de 8-36%, humedad del 4-8% y cenizas del 7-10% en un estudio de los métodos para el tratamiento de hipercolesterolemia, hiperlipidemia y arterioesclerosis por la ingesta de arroz estabilizado; donde incluyen una lista potencial de micronutrimentos destacando antioxidantes como β-caroteno 37 μg/100 g, vitamina E 25.61 mg/100 g, gamma-oryzanol 245.15 mg/100 g, fitoesteroles 302 mg/100 g y polifenoles. El salvado de arroz también contiene compuestos nutracéuticos que incluyen aproximadamente 4% de lípidos no saponificables, principalmente compuestos de antioxidantes naturales como tocoferoles, tocotrienoles y gammaoryzanol (Ju y Vali, 2005). Espinoza, (2013) ha reportado para la marca comercial RibalanceTM un porcentaje de proteínas de 15%, lípidos 22%, fibra total 23%, humedad 5%, cenizas 8%. Un contenido de micronutrimentos, en mayor proporción potasio 1615 mg/100 g, magnesio 750 mg/100 g y calcio 66 mg/100 g. Un contenido total de fitoesteroles de 30

519 μg/100 g, ‫ץ‬-oryzanol de 230 mg/100 g, β-caroteno 78 μg/100 g y vitamina E 23 mg/100 g. Otros autores mencionan que el salvado de arroz contiene 12-22% de lípidos, 11-17% de proteínas, 6-14% de fibra, 10-15% de humedad y 8-17% de cenizas. Es rico en vitaminas, entre las que destacan la E, tiamina, niacina y algunos minerales como aluminio, calcio, cloro, hierro, magnesio, manganeso, fósforo, potasio, sodio y zinc (Sharif et al., 2014).

2.2.4 Antioxidantes potenciales en el salvado de arroz Los antioxidantes más estudiados en el salvado de arroz se han categorizan en el grupo de los tocoferoles, gamma-oryzanol y otros compuestos fenólicos.

Tocoferoles y tocotrienoles Los tocoferoles y tocotrienoles son conocidos colectivamente como vitamina E o tocoles, ya que comparten una unidad estructural básica en común 6-cromanol y una cadena terpenoide en la posición 2 del anillo. La cabeza del grupo cromanol puede interrelacionarse a una cadena saturada fitil para formar tocoferoles o a una cadena insaturada geranilgeranil para formar tocotrienoles. La cabeza del grupo puede entonces ser metilada en diferentes configuraciones, resultando cuatro formas alternativas (α, β, ‫ץ‬, δ) (Arab et al., 2011; Min et al., 2011; Fu et al; 2014).

El grupo hidroxilo libre en el anillo cromanol, es reponsable de las propiedades antioxidantes de la vitamina E. En variedades de arroz no pigmentados, el promedio del contenido de vitamina E es de 14.5, 247.2 y 60.2 mg/kg para el endospermo, salvado y grano integral, respectivamente (Goufo y Trindade, 2014). Dependiendo de la fracción del grano de arroz, el ‫ץ‬-tocotrienol es el mayor contribuyente del contenido total de tocoles (27-63%), seguido por α-tocoferol (1030%), α-tocotrienol (9-19%), ‫ץ‬-tocoferol (9-14%), δ-tocotrienol (2-6%), β-tocotrienol (1-4%), β-tocoferol (1-2%) y δ-tocoferol (1-2%). Estos resultados son similares en muchos estudios realizados con anterioridad (Yu et al., 2007; Heinemann et al. 2008;

31

Imsanguan et al. 2008; Min et al., 2011, Huang y Ng, 2012; Jeng et al., 2012; Zhang et al., 2012; Pascual et al., 2013).

Gamma-Oryzanol Gamma-oryzanol es una mezcla de ferulatos de esterilo, los cuales se obtienen por esterificación del grupo hidroxilo de esteroles (campesterol, stigmaesterol, βsitosterol) o alcoholes triterpeno (cicloartanol, cicloartenol, 24-metilencicloartanol, ciclobranol) con el grupo de ácido carboxílico del ácido ferúlico (Fardet et al., 2008; Yilmaz et al., 2013; Goufo y Trindale, 2014). En base a su absorbancia máxima de 330 nm hasta ahora, se han detectado 25 componentes del gamma-oryzanol, aunque sólo cinco de ellos comprenden el 95% del contenido total de gammaoryzanol (Xu et al., 2001; Fang et al., 2003; Miller y Engel, 2006; Yilmaz et al., 2013).

En variedades de arroz no pigmentadas, el promedio de estos cinco componentes es de 58.9, 3067.1, y 288.6 mg/kg para el endospermo, salvado y grano integral respectivamente (Goufo y Trindale, 2014). La contribución de los cinco componentes más importantes del ‫ץ‬-oryzanol es como sigue en orden decreciente: 24-metilenecicloartanil

trans-ferulato

(34-44%),

cicloartenil

trans-ferulato

(19-26%),

campesteril trans-ferulato (15-23%), β-sitosteril trans-ferulato (7-17%) y stigmasteril trans-ferulato (1-7%) (Xu et al., 2001; Fang et al., 2003; Champagne, 2004).

Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos comprenden tres grupos importantes de antioxidantes que incluyen los ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas. Los ácidos fenólicos son sustancias que contienen un anillo fenólico y un grupo funcional carboxílico, con absorción máxima a 280 nm para esqueletos C6-C1 de los derivados del ácido hidrobenzoico (ácidos gálico, protocatechuico, ρ-hidroxibenzoico, vanílico, y siríngico) y a 320 nm para los esqueletos C3-C6 de los derivados del ácido hidroxicinámico (ácidos ρ-coumárico, ferúlico, cafeico, cinápico, clorogénico y cinámico) (Jang y Xu, 2009; Wanyo et al., 2014b).

32

Las propiedades antioxidantes dependen del número y la posición de los grupos hidroxilo en el anillo fenólico. Se han identificado doce ácidos fenólicos en el arroz, con un intervalo de 7.3-8.3 mg/100 g en el endospermo, 177.6 a 319.8 mg/100 g en el salvado y 20.8-78.3 mg/100 g en el grano integral dependiendo de la variedad, tipo y color del grano de arroz (Goufo y Trindade, 2014, Ti et al., 2014)

Los ácidos fenólicos más importantes en el endospermo, el salvado y el grano integral son el ácido ferúlico (56-77%), ácido ρ-cumárico (8-24%), ácido gálico (16%), ácido protocatechuico (1-4%), ácido ρ-hidroxibenzoico (1-2%), ácido vanílico (1%) y ácido siríngico (1%). Los constituyentes menores son los ácidos cafeico, clorogénico, cinnámico y elágico, cada uno representa menos del 1% del contenido total de ácidos fenólicos.

De forma general, el contenido de ácidos fenólicos del arroz está compuesto del 6189% de ácidos hidroxicinámicos y del 12-28% de ácidos hidroxibenzoicos; siendo el ácido ferúlico el de mayor presencia en el salvado de arroz. (Zhang et al., 2010; Tuncel y Yilmaz, 2011; Huang y Ng 2012; Min et al., 2012, 2014; Goufo et al., 2014a; Schmidt et al., 2014; Ti et al., 2014).

Los flavonoides consisten en un esqueleto de 15 carbonos que están organizados en dos anillos aromáticos (A y B) unidos por una cadena de tres carbonos (estructura C6-C3-C6). La mayoría de los flavonoides tienen una absorción máxima a 370 nm y pueden

clasificarse

como

flavonas,

flavonoles,

flavononoles,

isoflavonas

y

flavanonas, que generalmente se encuentran como O- o C-glicósidos. En las variedades de arroz no pigmentadas, las flavonas son el grupo más común de los flavonoides (Chi et al., 2007; Zhang et al., 2010; Hirawan et al., 2011; Deng et al., 2012; Goufo et al., 2014b). De los siete flavonoides que se han reportado normalmente para el arroz, la tricina aparece como el mayor flavonoide en el salvado, representando un 77% (131.5 mg/100 g). El resto de los flavonoides presentados se muestran como luteolina (14%), epigenina (6%), quercetina (3%),

33

isorhamnetina (menor al 1%) kaempferol (menor al 1%) y miricetina (1%). (Min et al., 2011; 2012; Goufo y Trindale, 2014; Wayno et al., 2014). Las antocianinas son otra clase de flavonoides, quienes exhiben una máxima absorbancia en el espectro verde/azul de 510 nm. Las antocianinas son glicósidos solubles

en

agua

de

polihidroxilo

y

polimetoxilo

derivados

de

sales

2-

fenilbenzopirilium o flavilium (2-fenilcromenilium). Las antocianinas existen como Oglicósidos (mono, di otri) y acilglicósidos de antocianidinas en las plantas, cerca de 18 antocianinas se han identificado para el arroz, de las cuales sólo cuatro han sido cuantificadas

(cianidina-3-O-glucósido,

peonidina-3-O-glucósido,

cianidina-3-O-

rutinósido, y cianidina-3-O-galactósido) (Sam et al., 2008; Zhang et al., 2010; Min et al., 2011, 2012, 2014; Yoshimura et al., 2011, Chen et al., 2012).

El promedio de las cuatro antocianinas en variedades de arroz pigmentado es de 1252.7 mg/100 g y 345.8 g/100 g para el salvado y el grano integral, respectivamente. Las antocianinas más predominantes en variedades de arroz pigmentado son la cianidina-3-O-glucósido y peonidina-3-O-glucósido, representando el 51-84% y 6-16% del contenido total de antocianinas, respectivamente. Las dos siguientes antocianinas más comunes en variedades de arroz pigmentado son la cianidina-3-O-rutinósido (3-5%) y cianidina-3-O-galactósido (1-2%); (Zhang et al., 2010; Min et al., 2011, 2012; Goufo y Trindale, 2014).

2.1.5 Efectos benéficos en la salud Existe una gran evidencia sobre los beneficios del uso del salvado de arroz para el control de algunas alteraciones como: disminución del riesgo de padecer diabetes tipo II, regulación del metabolismo de lípidos, control del síndrome metabólico y enfermedades

cardiovasculares,

también

ha

mostrado

una

actividad

anti-

cancerígena (Fardet et al., 2008; Patel, 2012; Lim, 2013; Borresen y Rian, 2014; Goufo y Trindade, 2014). Actualmente se han estudiado los efectos del salvado de arroz sobre la actividad inmune, específicamente en la protección de patógenos entéricos como Salmonella, lo que representa un área relevante de investigación de enfermedades infecciosas (Whatson et al., 2014). 34

El salvado de arroz ha sido estudiado en humanos para medir sus efectos hipocolesterolémicos, hipoglucémicos, gastrointestinales e inmunomodulatorios en sujetos hipercolesterolémicos y diabéticos (Miyoshi et al., 1986; Tomlin y Read, 1988; Ranhotra et al., 1989; Cara et al., 1992; Sanders y Reddy, 1992; Hegsted et al., 1993; Gerhardt y Gallo, 1998; Maeda et al., 2004; Rodrígues et al., 2005; Cheng et al., 2010). La dosis máxima de salvado de arroz probada fue de 100 g/día (Hegsted et al., 1993) y la mínima de 15 g/día (Cara et al., 1992), como se muestra en la tabla 2. El estudio más largo fue de 12 semanas (Cheng et al., 2010) y el más corto de un día (Cara et al., 1992). El salvado de arroz incrementa la viscosidad de los contenidos gastrointestinales (Dikeman et al., 2006), que disminuye la glucosa en sangre y las respuestas de lípidos. El salvado de arroz y su fibra también tienen un efecto sobre el bolo fecal, ya que promueve la regularidad intestinal (Miyoshi et al., 1986; Tomlin y Read, 1988). Cuadro 2. Estudios del efecto del salvado de arroz realizados en humanos. SUJETOS

DOSIS, g/día

DURACIÓN

ESTUDIO

REFERENCIA

11 sujetos

100 g SA vs

3 semanas

Perfil de lípidos

Hegsted et al.,

hipercolesterolémicos

harina de trigo

en sangre

1993

44 adultos

84 g de SAE vs

Perfil de lípidos

Gerhardt y

hipercolesterolémicos

almidón de

en sangre

Gallo, 1998.

Perfil de lípidos

Kestin et al.,

en sangre

1990.

Perfil de lípidos

Ranhotra et

en sangre

al., 1989.

Perfil de lípidos

Sanders y

en sangre

Reddy, 1992.

Glucosa y perfil

Cheng et al.,

de lípidos en

2010.

6 semanas

arroz 24 hombres

60 de SA

hipercolesterolémicos

conteniendo

4 semanas

11.8 g FDT 17 voluntarios

30 g de SA y 30

hipercolesterolémicos e

g de salvado de

hipertrigliceridémicos

avena

18 sujetos con niveles de

15 o 30 g de SA

6 semanas

3 semanas

colesterol normal 28 voluntarios

20 g de SAE

12 semanas

sangre

35

Sobrepeso, Obesidad y Diabetes tipo II La ingesta de arroz integral redujo la circunferencia de la cintura e incrementó los parámetros metabólicos en diabetes tipo II en un estudio realizado a 30 pacientes con diabetes, quienes fueron suplementados por doce semanas con ingestas diarias de arroz integral, logrando una reducción de la circunferencia de la cintura y brazos, así como también una tendencia en la reducción de peso, atribuyéndolo a la presencia de hidratos de carbono bioactivos como la fibra dietética, almidón resistente y oligosacáridos (Kim et al., 2011; Nanri y Mizoue, 2014; Shi et al., 2014).

Estudios epidemiológicos han demostrado que el riesgo de padecer diabetes mellitus tipo II (DM2), disminuye con el incremento de la ingesta de cereales integrales. Estudios prolongados en 90 000 mujeres y 45 000 hombres, mostraron que alta ingesta de fibra de los cereales, disminuye en un 30% el riesgo de padecer DM2, comparado

con

personas

que

tienen

una

baja

ingesta.

Otros

estudios

epidemiológicos también han demostrado que existe relación inversa entre el consumo de cereales integrales y el cambio de ciertos marcadores de la obesidad como el índice de masa corporal (IMC), la circunferencia de la cintura y la adiposidad abdominal, tanto en hombres como en mujeres (Borneo y León, 2012; Hajihashemi et al., 2014).

Estudios recientes han mostrado que el arroz integral tiene un efecto positivo sobre la obesidad, revelando que la ingesta diaria de arroz integral durante ocho semanas en comparación con la ingesta de arroz blanco, disminuye las concentraciones de insulina y glucosa y previene las disfunciones endoteliales en sujetos con síndrome metabólico (Shimabukuro et al., 2014). Otro estudio para medir el efecto hipoglucémico del ácido ferúlico en ratones con diabetes tipo II tratados con una administración oral de 50 mg/kg por día de ácido ferúlico durante 17 días, reporta significativamente niveles más bajos de glucosa en sangre en comparación con un grupo no tratado (Almeida et al., 2014).

36

Fracciones ricas en tocotrienoles de SA, han sido evaluadas en modelos murinos para medir el efecto glucémico y la función renal de ratas diabéticas tipo I, mostrado que después de ochos semanas de haber sido tratadas con fracciones ricas en tocotrienoles de salvado de arroz (200 mg/kg por día), mostraron un incremento de su estatus glucémico y su función renal (Almeida et al., 2014).

Enfermedades Cardiovasculares Estudios de tocotrienoles presentes en los lípidos del salvado de arroz, han sido reportados como inhibidores en la síntesis de colesterol, reduciendo los niveles de colesterol en suero de varios modelos animales. El gamma-oryzanol disminuye de igual forma los niveles de colesterol y la actividad antiinflamatoria (Almeida et al., 2014). Un estudio realizado en un modelo animal sometido a un estrés oxidativo mediante actividad física, reporta que tras la ingesta de una emulsión de gammaoryzanol de concentración conocida, se incrementa la regulación de la expresión de los genes asociadas con el estrés oxidativo en comparación con otro grupo al que no le fue administrado (Almeida et al., 2014).

Un estudio realizado a 40 mujeres adultas con sobrepeso y obesidad muestra que existe un efecto sobre los marcadores inflamatorios y el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares tras la ingesta de arroz integral por 14 semanas, mostrando una disminución de la proteína C-reactiva de alta sensitividad (hs-CRP) en comparación con el consumo de arroz blanco (Kazemzadeh et al., 2014). Estudios de intervención han mostrado que un alto consumo de cereales integrales está asociado con un riesgo menor de hipertensión. Mientras que otro estudio en más de 300 sujetos, en quienes se estudiaron sus hábitos alimenticios durante 10 a 20 años y el riesgo de padecer enfermedades del corazón; se atribuye que el riesgo de padecer enfermedades del corazón fue reducido por la alta ingesta de fibra de cereales (Borneo y León, 2012).

El aceite del salvado de arroz es una fuente natural rica en oryzanoles, que pueden ayudar a disminuir el colesterol en plasma, bajar la concentración de colesterol en 37

suero y disminuir la agregación de plaquetas. El gamma-oryzanol ha sido empleado para el tratamiento de hiperlipidemia, desórdenes de la menopausia y el incremento de la masa muscular (Liang et al., 2014).

Efectos antioxidantes El ácido ferúlico no tiene efecto sobre el nivel de tocoferoles en el plasma, hígado o pulmones, mientras que otras sustancias han mostrado diferentes interacciones con α-tocoferoles y ‫ץ‬-tocoferoles. También se ha encontrado que el ácido ferúlico incrementa la concentración de colesterol de las lipoproteínas de alta densidad en el plasma (Ou y Kwok, 2004). Estudios recientes en modelos murinos, han demostrado que el ácido ferúlico presente en extractos de salvado arroz, tiene un efecto neuroprotector que promueve la recuperación del daño isquémico a través de la expresión de genes de antioxidantes (Baek et al., 2014). Extractos de salvado de arroz, tienen un efecto benéfico sobre los parámetros fisiológicos e inmunológicos al disminuir el grado de infección de S. mansoni por la presencia y actividad antioxidante (Mossalem y Mossa, 2014).

Un estudio realizado en modelo murino con azoximetano y tratado con extractos de ácido fítico de salvado de arroz, mostraron representativamente la mayor reducción en la formación de tumor de colon (Almeida et al., 2014). El estudio de los antioxidantes en el salvado de arroz, se ha incrementado en los últimos años a partir de que Hudson et al., (2000) establecieran una relación positiva de la baja incidencia de enfermedades crónicas en la población asiática, debido al consumo de arroz como fuente potencial de antioxidantes (Goufo y Trindade, 2014).

38

3. JUSTIFICACIÓN

Actualmente, las enfermedades crónicas no transmisibles, son consideradas un problema de salud pública, e incluso, son la causa del mayor número de muertes en el mundo. Ante esta problemática, el estudio de los antioxidantes ha adquirido gran relevancia científica, porque es una alternativa en la lucha contra algunos de los factores de riesgo que ocasionan esas enfermedades.

Existe evidencia de que el salvado de arroz es un alimento potencial para la solución a esta problemática, por su alto contenido de antioxidantes y fibra. Sin embargo, no siempre los antioxidantes presentes en un alimento son biodisponibles, por lo que resulta necesario saber si la CAT de un producto evaluada in vitro, puede verse reflejada in vivo.

El salvado de arroz en su subproducto industrial de bajo costo y disponible en gran volumen a nivel mundial. Su alto contenido en antioxidantes, ha despertado el interés de numerosos estudios científicos en los que se ha reportado su CAT medida in vitro; pero poco se sabe de su evaluación in vivo y aún menos en humanos que permita elucidar sus beneficios. De tal manera que su aprovechamiento industrial es bajo, las tecnologías de su transformación poco estudiadas, las metodologías de medición de su CAT in vivo no están aún esclarecidas y las propuestas para el desarrollo de nuevos productos a base de salvado de arroz son pocas.

39

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general Evaluar la capacidad antioxidante total in vitro e in vivo por fotoquimioluminiscencia de una bebida instantánea elaborada a base de salvado de arroz de Morelos A-2010. 4.2 Objetivos específicos 1.

Obtener una fórmula de bebida instantánea a base de salvado de arroz

estabilizado. 2.

Evaluar la capacidad antioxidante total in vitro de salvado de arroz estabilizado

y de la bebida instantánea diseñada. 3.

Evaluar la capacidad antioxidante total de la bebida instantánea en humanos.

40

5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Materiales y participantes Se utilizaron ingredientes básicos para formulaciones de bebidas instantáneas como se describe a continuación.

Salvado de arroz Se utilizó como ingrediente principal salvado de arroz café claro (SA), obtenido inmediatamente del primer pulido del grano de arroz integral (Oryza sativa índica) variedad Morelos A-2010, que fue procesado en el Molino San José, ubicado en el municipio de Jojutla, Morelos. Espesante Como aditivo texturizante se adicionó goma guar en polvo AFG250F malla 200, viscosidad 5000 CPS, marca ALTRAFINE GUMS®, código 7524, distribuido por AFHER FOODS S.A. DE C.V. Edulcorante Se utilizó un endulzante sin calorías. Marca comercial Splenda ® de McNeil Nutritionals, LLC. Composición de sucralosa 1.2 g/100 g. Saborizantes Se emplearon tres sabores para preparación de bebidas tradicionales de marca comercial Essencefleur con el fin de seleccionar el de mayor aceptación: ES. CAJETA GL, ES. CAJETA QUEMADA #2289 y ES. CAFÉ MOKA # 2456; fabricados y distribuidos por Aceites y Esencias, S. A. de C. V.

Participantes Se invitó a toda la comunidad del CeProBi para participar en la evaluación sensorial y el estudió en humanos.

41

5.2 Métodos El trabajo de investigación se realizó en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, CeProBi, IPN y el Centro de alimentos agroindustriales, FAPC (Food and Agricultural Products Center), OSU (Oklahoma State University).

El estudio constó de tres etapas; la formulación de la bebida instantánea, la evaluación de su CAT in vitro y la evaluación de su CAT in vivo, como se muestra en la figura 3. Cada etapa a su vez se subdividió en distintos apartados dependiendo de su amplitud.

Figura 3. Etapas de trabajo.

5.2.1 Formulación de la bebida instantánea Primero se acondicionó el salvado de arroz Morelos A-2010, en seguida se realizaron diseños de mezclas y evaluaciones sensoriales para obtener una fórmula de bebida instantánea a base de SAE, posteriormente se caracterizó el SAE y la fórmula de bebida instantánea obtenida y finalmente se realizaron extracciones de antioxidantes del SAE y de la fórmula de bebida instantánea para evaluar la CAT como indicador de vida de anaquel.

5.2.1.1 Acondicionamiento del salvado de arroz Para la elaboración de la bebida instantánea, fue necesario acondicionar el salvado de arroz Morelos A-2010 (pulverización y estabilización) en base a la Norma Oficial Mexicana NOM-247-SSA1-2008, relativa a cereales, harinas de cereales, sémolas o semolinas.

42

Se determinó la presencia de sustancias extrañas y el porcentaje de retención de salvado de arroz en malla 60 emplenado la metodología de Flores et al, (2002). Una muestra de 100 g de salvado de arroz se colocó en un tamiz con las mallas: No. 20 (0.850 mm), No.50 (0.300 mm), No. 60 (0.250 mm) y No. 100 (0.150 mm). Después de agitar durante 20 minutos se separaron y observaron las fracciones retenidas en las diferentes mallas para identificar la presencia de sustancias extrañas. Se pesaron las fracciones retenidas en la malla No. 60 para determinar el porcentaje de retención Se

analizaron

características

las propiedades físicoquímicas de

apariencia,

color,

olor,

del salvado de

sabor

y

textura

se

arroz.

Las

evaluaron

sensorialmente. Para la determinación de pH se suspendieron 10 g de muestra de SA en 90 ml de agua y se midió su pH con un potenciómetro (Flores et al., 2002).

Pulverización del salvado de arroz Luego, se homogenizó el tamaño de partícula que era heterogénea; entre otras cosas, debido a la presencia de pequeños gránulos de endospermo y fibra; se obtuvo una harina con granulometría No. 60 (0.250 mm) de acuerdo con Pacheco et al., (2008).

Con el fin de obtener la granulometría deseada, se realizaron pruebas de pulverización o molienda en un turbomolino PULVEX Modelo 200, México D.F. de 5 HP para muestras de 20-50 kg/h con una criba de 1 mm (figura 4).

Figura 4. Equipo para pulverizar salvado de arroz.

43

Estabilización del salvado de arroz Posteriormente, el SA se estabilizó por el método de calor húmedo para inactivar las enzimas lipasas y la presencia de microorganismos y otros probables contaminantes. El método de estabilización por calor húmedo se validó con la técnica de Rouse y Pike, (2006) y se realizó de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana, NOM-251-SSA12009, relativa a prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios.

El proceso se llevó a cabo mediante un prototipo de equipo estabilizador validado para inactivar las enzimas lipasas y eliminar los microorganismos causantes del deterioro acelerado del salvado de arroz en lotes de 1.5 kg por cada 30 min (figura 5). Se determinó la actividad de lipasas de SA a los tiempos de exposición de calor húmedo 0, 15, 30 y 45 minutos.

Figura 5.Prototipo para estabilizar salvado de arroz por calor húmedo.

Finalmente, el salvado de arroz estabilizado (SAE) se almacenó a una temperatura de refrigeración de 4-8 °C, en bolsas de polietileno metalizadas y etiquetadas con: nombre del producto, código de identificación, lote de procesamiento y fecha de caducidad. 44

5.2.1.2. Diseños de mezclas y evaluación sensorial Para el desarrollo de la formulación se empleron diseños experimentales de mezclas y pruebas sensoriales descriptivas por atributos de sabor, dulzor, olor, color, viscosidad y apariencia general como variables de respuesta en la calidad sensorial del alimento.

Diseños de mezclas La concentración de agua permaneció constante, considerando que una porción de la fórmula de la bebida instantánea en polvo de entre 20-60 g con base a estudios previos (cuadro 2), es útil para preparar una bebida con 240 ml agua y presentar un efecto en humanos.

Para la formulación de la bebida instantánea se consideraron tres diseños de mezclas: SAE/goma guar, Splenda® y saborizante (cuadro 3). Cuadro 3. Diseños de mezclas para la formulación de la bebida instántanea.

Diseño

Variable independiente

Mínimo

Máximo

20/0

60/2

1

SAE*/Goma guar (g)

2

Splenda®(g)

0

4

3

Saborizante (g)

0

4

*SAE, Salvado de arroz Morelos A-2010 estabilizado

Cada variable independiente representó un diseño de mezclas, el cual fue evaluado en un intervalo de valores mínimo y máximo, establecido con base a las recomendaciones de los proveedores de materias primas y al cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana, NOM-218-SSA1-2011 para bebidas saborizadas no alcohólicas y productos concentrados para prepararlas.

En el primer diseño se evaluó el contenido de la relación SAE/Goma manteniendo el resto de las variables independientes constantes en su valor mínimo. En el segundo diseño se evaluó el contenido del endulzante sin calorías (Splenda ®), manteniendo constantes el contenido de la relación SAE/Goma del diseño 1 en su mejor variable 45

de respuesta y la variable independiente del diseño 3 en su valor mínimo. Finalmente, en el tercer diseño se evaluaron los contenidos de tres saborizantes manteniendo constantes las variables independientes del diseño 1 y 2 con sus mejores variables de respuesta, con el fin de obtener tres bebidas instantáneas para realizar la evaluación sensorial final. Evaluación sensorial Para obtener la fórmula de mayor preferencia se realizaron pruebas de análisis sensorial de aceptación con una escala hedónica de nueve puntos (Anexo 3), evaluando los atributos de sabor, dulzor, olor, color, viscosidad y apariencia general de tres bebidas instantáneas de sabor cajeta, cajeta quemada y café moka. Se llevó a cabo con un panel de 75 evaluadores no entrenados de la comunidad del CeProBi, en el Departamento de Nutrición y Alimentos Funcionales del CeProBi, IPN (Pacheco et al., 2008, Faccin et al., 2009).

5.2.1.3 Caracterización del SAE y la bebida instantánea Se realizaron análisis químicos proximales, microbiológicos y evaluaciones cuantitativas de antioxidantes potenciales.

Análisis químico proximal Los análisis para el SAE se realizaron en el Laboratorio de Control de Calidad del Departamento de Desarrollo Tecnológico del CeProBi, IPN. Para una muestra de SAE se determinaron los parámetros de acuerdo a los métodos de la AACC: humedad 44-19 AACC, cenizas 08-18 AACC, proteínas 146-13 AACC, lípidos 30-25 AACC, fibra dietética 32-07 AACC. Todos los análisis se realizaron por triplicado.Los análisis para la bebida fueron realizados por LABORATORIO FERMI, S.A. DE C.V., México, D.F. para 2 muestras de fórmula en polvo de bebida instantánea y 2 muestras de bebida instantánea preparada con base a la COFEPRIS: humedad (Método Gravimétrico, NOM116-SSA1-1994), cenizas (Método Gravimétrico, NMX-F607-NORMEX-200), proteínas (Método Kjeldahl, NMX-F-608-NORMEX-201), lípidos (Método Gravimétrico, NOM-086-SSA1-1994), fibra total (Método EnzimáticoGravimétrico, NOM-086-SSA1-1999). 46

Análisis microbiológicos Fueron determinados para la bebida instantánea por LABORATORIO FERMI, S.A. DE C.V., México D.F., con acreditación de la COFEPRIS No. TA-13-11 vigente al 13 de Junio de 2015.

Evaluación de antioxidantes potenciales Tocoferoles y tocotrienoles (α, β, ‫ץ‬, y δ) La evaluación se llevó a cabo por los laboratorios Brunswick, MA, USA. Se utilizó cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) empleando la metodología de Chun et al., (2006).

Gamma-oryzanol total La evaluación se llevó a cabo por los laboratorios Brunswick, MA, USA. Mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) empleando la metodología de Azrina et al., (2008).

Compuestos fenólicos totales La evaluación se llevó a cabo en los laboratorios del FAPC (Robert M. Kerr Food & Agricultural Products Center), Oklahoma State University, USA. Mediante el método de

Folin-Ciocalteu para

extractos de acetona al 70%, mediante

análisis

espectrofotométrico en una longitud de onda de máxima absorbancia a 725 nm, empleando una curva de calibración de ácido ferúlico de acuerdo a la técnica de Lui et al., (2010).

5.2.1.4 Extracción de antioxidantes y vida de anaquel Para la extracción de los antioxidantes del SAE y la bebida instantánea, se utilizó la técnica de Prior et al., (2005), que consistió en extraer una fracción lipofílica mediante lavados de la muestra con solvente no polar (hexano) y una fracción hidrofílica con una mezcla de solventes polares (acetona/agua/ácido acético (70/29.5/0.5; v/v/v); AWA), como se muestra en la figura 6.

47

Extracciones de antioxidantes lipofílicos A 1 g de muestra, se le adicionaron 10 ml de hexano en un tubo de 15 ml, se homogenizó por 1 minuto colocando el tubo en un baño con agua y hielo; se centrifugó a 10 000 RPM por 10 min, posteriormente se separó el extracto en un tubo de centrifuga graduado de 25 ml; se volvió a re-extraer el residuo con 10 ml de hexano y se centrifugó nuevamente empleando los mismos parámetros indicados. El extracto obtenido se secó con nitrógeno líquido y fue reconstituido con metanol para evaluar su CAT posteriormente.

Extracciones de antioxidantes hidrofílicos Al residuo de la muestra de la extracción lipofílica, se le adicionaron 10 ml de AWA; se homogenizó por 1 min colocando el tubo en un baño con agua y hielo; se dejó en agitación a 4°C por 1 hora; se centrifugó a 10 000 RPM por 10 min; se decantó el extracto AWA en tubo 25 ml, y se realizó una segunda extracción siguiendo los parámetros ya indicados. El extracto obtenido se utilizó para evaluar su CAT posteriormente.

PESAR 1 g SAE

MEDIR (2 Vol.) 10 mL Hexano

AGITAR 4 °C 1 min

CENTRIFUGAR 10,000 4°C 10 min

DECANTAR

CENTRIFUGAR 10,000 4°C 10 min

DECANTAR

EXTRACTO LIPOFILICO (Evaporar solvente)

MEDIR (2 Vol.) 10 mL AWA AGITAR 4 °C 60 min

EXTRACTO HIDROFILICO (Evaporar solvente)

Figura 6. Extracción sólido-líquido de antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos (Prior et al., 2005)

48

Determinación de la vida de anaquel Se determinó la CAT del SAE a los tiempos 0, 15, 30, 45 y 60 días a temperatura ambiente y refrigeración a 4 °C. Para lo cual, se realizaron extracciones totales de antioxidantes por lixiviación, emplenado metanol al 80% de acuerdo a la técnica de Shahid et al., (2006). Para la medición de la CAT se utilizó el método de fotoquimioluminiscencia. (PCL) con el equipo PHOTOCHEM® Analytik Jena, Leipzig, Alemania y se realizaron mediciones de capacidad antioxidante hidrofílica con la metodología ACW y capacidad antioxidante lipofílica con la metodología ACL. La CAT representó la suma de ambas actividades antioxidantes.

Metodología de fotoquimiolminiscencia Se utilizó el protocolo para la evaluación de la capacidad antioxidante de compuestos solubles en agua (ACW) y de compuestos solubles en lípidos (ACL) con equipo Photochem® (Anexo 1 y 2). El principio de la metodología consiste en generar radicales libres (anión superóxido) por excitación óptica (irradiación) de una sustancancia fotosensibilizadora (luminol) que forma un compuesto reactivo altamente sensible a la luz azul y que reacciona con los antioxidantes presentes en la muestra, produciendo luminiscencia que se refleja en una curva que sirve para determinar la capacidad antioxidante mediante estándares de equivalentes de Trolox para determinar la ACL y equivalentes de ácido ascórbico para la determinación de la ACW.

5.2.2 Evaluación de la CAT in vitro Se determinó por duplicado la CAT in vitro del salvado de arroz estabilizado y la CAT in vitro de la bebida instantánea a base de SAE mediante el método fotoquimioluminiscencia. 5.2.2.1 CAT in vitro de salvado de arroz estabilizado Extracción de antioxidantes Se emplearon las técnicas de extracción descritas en el apartado 5.2.1.4 para extractos lipofílicos e hidrofílicos. 49

Evaluación de la CAT Se utilizó la metodología PCL descrita en el apartado 5.2.1.4. 5.2.2.2 CAT in vitro de la bebida instantánea Extracción de antioxidantes Se emplearon las técnicas de extracción descritas en el apartado 5.2.1.4 para extractos lipofílicos e hidrofílicos.

Evaluación de la CAT Se utilizó la metodología PCL descrita en el apartado 5.2.1.4.

5.2.3 Evaluación de la CAT en humanos La evaluación de la CAT en humanos se llevó a cabo en 3 etapas: La primera etapa consistió en reclutar a los candidatos de edades entre 20 y 40 años para realizar una selección de sujetos sanos por historia clínica y dietética, determinación de su IMC y de sus parámetros de laboratorio clínico; en la segunda etapa se realizó una estandarización de los participantes respecto al consumo de alimentos ricos en antioxidantes y finalmente en la tercera etapa los voluntarios consumieron la bebida instantánea, posterior a la cual se extrajeron las muestras de sangre para su evaluación. 5.2.3.1 Selección de sujetos voluntarios Para la selección de los participantes se consideró la población del CeProBi-IPN. Los cuales fueron reclutados en base a una invitación (Anexo 4) para participar en el estudio; se consideraron los siguientes criterios de inclusión (Brouns et al., 2005; Brand-Miller, 2005):  Tener una edad entre 20 y 40 años.  No fumadores, no bebedores.  No mujeres embarazadas, ni en periodo de lactancia, ni que usaran hormonas exógenas.  No realizar actividad física intensa (deportistas de alto rendimiento). 50

 No consumir suplementos con vitaminas y minerales.  No ser alérgico o intolerante algún alimento.  No padecer enfermedades inflamatorias ni estar ingiriendo medicamentos.  Tener un Índice de Masa Corporal (IMC) adecuado para el estudio (entre 23 y 24.9 kg/m2).  Clínicamente sanos por historia dietética y clínica

La edad fue establecida para disminuir la variabilidad de las respuesta de la CAT (Prior et al., 2003). Mientras que, el IMC fue determinado como adecuado para el estudio en un intervalo de 23 a 24. 9 kg/m2, debido a la necesidad de un ayuno de 10 horas antes de la ingesta de la primera dosis de la bebida instantánea para la evaluación de la CAT en humanos. Se determinó el IMC a los candidatos por medio de un equipo analizador de composición corporal marca Tanita modelo TBF-300A Tokio, Japón.

Los posibles voluntarios fueron seleccionados en base a su IMC adecuado para el estudio y continuar con las siguientes etapas, para lo cual se determinaron parámetros de laboratorio clínico y se aplicaron una historia clínica y una dietética, donde se incluyó una encuesta alimentaria con la técnica de recordatorio de 24 horas (Anexo 5).

La evaluación clínica se llevó a cabo mediante estudios de química sanguínea (glucosa, triglicéridos, lipoproteínas de alta densidad (HDL) y colesterol total). Estos parámetros fueron evaluados en un equipo analizador semiautomatizado para química clínica y turbidimetría Spinlab 180, Barcelona, España. También se realizó un análisis sanguíneo de biometría hemática en equipo Biocode Hycel Celly 70, Francia y una historia médica (Anexo 6). Al final de este proceso se seleccionaron los sujetos que cubrieron todos los criterios, quines firmaron una carta de consentimiento informado (Anexo 7), en donde se explicó su participación, así como los posibles riesgos por la toma de muestras sanguíneas y el ayuno, que también forma parte de los protocolos para análisis clínicos. 51

5.2.3.2 Estandarización del consumo de antioxidantes Dos días previos al consumo de la bebida instantánea y con la finalidad de estandarizar y limitar el consumo de antioxidantes, se les proporcionó una lista de alimentos que no podían consumir como por ejemplo: algunos cereales, frutas, verduras, jugos, tés, café, chocolate, vino; entre otros, por ser ricos en antioxidantes (Anexo 8). Para controlar por este factor confusor, se les pidió que anotaran los alimentos que consumieran durante ese periodo, empleando la técnica de registro de alimentos (Anexo 9).

5.2.3.3 Evaluación de la CAT in vivo de la bebida En la figura 7 se muestra el diseño de la evaluación de la CAT in vivo. Se realizó una extracción de sangre que fue utilizada como línea basal después de realizar un ayuno nocturno de 10 horas posterior a la estandarización del consumo de antioxidantes. Inmediatamente se ingirió una dosis de 35.5 g de la formulación de salvado de arroz Morelos A-2010 estabilizado diluida en 240 ml de agua, a las 2 horas de la ingesta se realizó una segunda extracción de sangre. A las 4 horas se ingirió una segunda dosis de 35.5 g de la formulación de salvado de arroz Morelos A2010 estabilizado diluida en 240 ml de agua y se realizó una tercera extracción de sangre. Y finalmente a las 6 horas se realizó una cuarta extracción de sangre.

Figura 7. Diseño de evaluación de la CAT in vivo

Extracción de sangre y procesamiento La extracción de sangre se realizó en el Laboratorio de Medición de Biomarcadores, CeProBi-IPN. Las muestras se tomaron por medio de sistema vacutainer en tubo con 52

anticoagulante (EDTA-K3) para extracción de plasma. Se centrifugó a 1500 RPM por 15 min en una centrífuga Solbat J600 Puebla, México. Tras la centrifugación se observaron tres capas como se muestra en la figura 8.

Figura 8. Extracción de plasma sanguíneo en tubo con anticoagulante (EDTA-K3)

La fracción superior o sobrenadante, de color amarillo pálido (plasma) se aspiró y se vertió en viales. Previo a la dilución de plasma los viales fueron centrifugados nuevamente por 5 min a 1000 RPM (Lai et al., 2012). Finalmente, la muestra de plasma fue diluida 1:5 para análisis de CAT in vivo (Analytik Jena, 2008).

Evaluación de la CAT en humanos de bebida diseñada Se utilizó la metodología descrita en el apartado 5.2.1.4. 5.3 Análisis estadístico de datos Se presentan medias y desviación estándar de la unidades de equivalentes de trolox (TE/g) de los antioxidantes en muestras analizadas por duplicado. Se compararon resultados en función del método empleado para la determinación de CAT, ANDEVA simple para evaluación de tendencia y pruebas pos-hoc de Tukey para establecer diferencias en el efecto de las técnicas de extracción de antioxidantes. El nivel de significancia establecido fue de 0.05. Los cálculos se realizaron en los programas Microsoft Excel 2013 y SPSS v17.

53

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Formulación de la bebida instantánea Se desarrolló una fórmula de bebida instantánea a base de salvado de arroz variedad Morelos A-2010 estabilizado; obteniendo los siguientes resultados.

6.1.1 Acondicionamiento de salvado de arroz Pulverización del Salvado de arrroz El salvado de arroz sin estabilizar (SA) fue sometido a los procesos de pulverización y estabilización presentando las características que se muestran en el siguiente cuadro 4 y figura 9. Cuadro 4. Propiedades fisicoquímicas del salvado de arroz Morelos A-2010. SAa

SAEb

Polvo arenoso

Polvo fino

Café claro

Café

Maíz

Cereal cocido

Mantequilla

Nuez tostada

Fibrosa

Lisa

pH

6.7

7.1

% Retención malla No. 60

32.0

0.0

Propiedad Apariencia Color aparente Olor Sabor Textura

a.

SA= salvado de arroz sin estabilizar. b. SAE = salvado de arroz estabilizado.

El SA presentó tamaños de partícula superiores a malla No. 60 (0.250 mm), con un 32% de retención sin la presencia visual de partículas extrañas. Se le atribuyó una propiedad de polvo arenoso, debido a la presencia de gránulos de endospermo y fibra que fueron retenidos en malla No. 60 como resultado del primer pulido. Bett et al., (2012) también reportaron características similares en un estudio realizado para caracterizar diferentes tipos de salvado de arroz.

Una de las granulometrías más comunes que establece la NOM-247-SSA1-2008 referente a cereales; indica que para considerar una harina de buena calidad, esta no debería excederese en un 25 % de retención en malla No. 60 (0.250 mm) (Flores et 54

al., 2002). Además, un estudio reportó 0% retención en malla No. 60 (0.250 mm) para la elaboración y evaluación de polvos para bebidas instantáneas a base de harinas de cereales (Pacheco et al., 2008).

Champagne (2004), indica que la distribución del tamaño de partícula del SAE para mallas mayores al No. 50 (0.297 mm) debe ser menor al 48.7%, mientras que el resultado obtenido alcanza 0 % de retención en malla No. 60 (0.250 mm), haciendo eficiente el proceso de pulverización del SA al disminuir el tamaño de partícula en un 32% que fue retenido en malla No. 60 (0.250 mm) como se muestra en la figura 9.

Figura 9. Apariencia del salvado de arroz.a) crudo b) granulado (tamizado malla 60): c) pulverizado y tratado con calor húmedo (30 min). d) pulverizado y tratado con calor húmedo (45 min).

Bett et al., (2012) reportaron que salvados de arroz café presentan sabores a mantequilla y cereales cocidos con mayor definición y con menor astringencia que otras variedades de SA pigmentadas. Estas mismas características sensoriales se presentaron en el SA obtenido en este estudio. En relación a las propiedades del SAE se puede mencionar que su calidad sensorial fue modificada, logrando obtener un SAE más fino, de color más oscuro y con sabor a nuez tostada. Dichas propiedades corresponden con las reportadas por Sharif et al., (2014) para proponer al SAE color café como un ingrediente funcional de mayor aplicación en la industria alimenticia. 55

Estabilización del Salvado de Arroz Champagne (2004), indicó que el pH óptimo de las lipasas presentes en el salvado de arroz está entre 7.5 - 8.0 a una temperatura de 25 °C. Mientras que Dhingra et al., (2012) han propuesto un pH de 6.0-6.9 para las lipasas, mientras que su inactivación se puede dar a un pH de 4.

En el tiempo de estabilización, se muestra que la AL disminuyó significativamente al aplicar el método con calor húmedo. En el estudio realizado de la AL, esta se redujo en la medida que se extendía el tiempo de aplicación de calor, manteniéndose un efecto similar entre los 15 y 30 minutos sin presentar cambios significativos, tal que a los 30 minutos la reducción porcentual de la AL fue casi del 50% y llegó a reducirse al 20% después de los 45 minutos como se muestra en el cuadro 5. Cuadro 5. Actividad de la lipasa del salvado de arroz Morelos A-2010 a diferentes tiempos de estabilización.

Tiempo de aplicación de calor (min) 0 15 30 45

Actividad de lipasa (U/g) 1039.92a 683.43b 520.79b 233.29c

Control al tiempo 0. U se define como los micromoles de ácidos grasos liberados por hora. ANOVA, Análisis de Varianza. F= 47.66, valor de la razón de varianzas entre tratamientos/sin tratratamientos. p=0.001, valor de significancia estadística. a-c, letras distintas representan diferencias significativas entre tratamientos, p