Universidad de Chile Facultad de Medicina Escuela de Kinesiología

INTERACCIÓN DE DEXKETOPROFENO Y DICLOFENACO EN LA MODULACIÓN DE LA NOCICEPCIÓN TRIGEMINAL

CRISTIAN EDUARDO HORMAZÁBAL ARAVENA RODRIGO CARLOS URBINA VARELA

Santiago, Chile 2007

INTERACCIÓN DE DEXKETOPROFENO Y DICLOFENACO EN LA MODULACIÓN DE LA NOCICEPCIÓN TRIGEMINAL

Tesis Entregada a la UNIVERSIDAD DE CHILE En cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de LICENCIADO EN KINESIOLOGÍA FACULTAD DE MEDICINA

Por CRISTIAN EDUARDO HORMAZÁBAL ARAVENA RODRIGO CARLOS URBINA VARELA

2007

DIRECTOR DE TESIS. Dr. FERNANDO SIERRALTA GARCÍA

PATROCINANTE DE TESIS SYLVIA ORTIZ ZÚÑIGA

FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE CHILE INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE LICENCIATURA Se informa a la Escuela de Kinesiología de la Facultad de Medicina que la Tesis de Licenciatura presentada por: CRISTIAN EDUARDO HORMAZÁBAL ARAVENA RODRIGO CARLOS URBINA VARELA

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Licenciado en Kinesiología, en el examen de defensa de Tesis rendido el 07 de Diciembre de 2007.

DIRECTOR DE TESIS Dr. FERNANDO SIERRALTA GARCÍA COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS. NOMBRE

FIRMA

DEDICATORIA A mis padres, por toda la ayuda que siempre me brindaron, por su apoyo cuando creía que todo se derrumbaba, y por alentarme para lograr todas mis metas por difíciles que éstas parecieran. Hoy, ya más tranquilo les ofrezco mi Seminario, fruto de esfuerzo y que simboliza el fin de un gran camino que me ayudó a madurar. Gracias su hijo Cristian Hormazábal

A mi Madre María Angélica por su incondicional apoyo y fe ciega en que sería capaz de superar todos los obstáculos; por su palabra cariñosa y optimista en los momentos en que todo parecía perdido; por su entrega y amor sin igual. A mi Padre Valentín por hacerme sentir de manera tácita lo orgulloso que está de mí; por creer que soy capaz de hacer realidad mis sueños; por enseñarme que hay distintas formas de amar y que la distancia no es más que un concepto. A mi Abuelo Carlos porque no hay día en que no sienta que está a mi lado y de algún misterioso modo se manifiesta en el momento y la forma precisa. A mi Abuela Angelina por su ternura, cariño y esa sabiduría que sólo dan los años, que encontraron en mí un corazón agradecido y oyente. A mi Hermana Catalina cuyas

palabras

pueden

llegar

a

ser

devastadoramente

profundas

y

conmovedoras, quien me obliga a dar lo mejor de mí siempre sin excusa, pues tengo el privilegio de representar un ejemplo para ella. A mis Hermanos Valentín y Ximena por su cariño y orgullo implícitos... no hacen falta palabras. A mi Novia Natalia sin cuyo infinito amor no habría podido lograrlo, por vivir mi proceso como si fuera suyo; por mostrarme que dos almas pueden ser una... por ser la mujer que había soñado “...” Rodrigo Carlos Urbina Varela

AGRADECIMIENTOS

Al profesor Fernando Sierralta por su incondicional apoyo, quien nos mostró que las enseñanzas son un fracaso, por más que iluminen nuestra mente, si es que a la postre no iluminan nuestro corazón. A los Ayudantes José López Durán y Alejandro Correa Macaya por su alegría, cariño y ayuda desinteresada. Al profesor Gianni Pinardi, por su gran paciencia y disposición, así como también por su particular humor que tantas risas y alegría nos causó. A mi compañero y amigo Rodrigo Urbina porque juntos comprendimos que al estar ascendiendo siempre es bueno extender la mano y ayudar al otro a subir, ya que con este gesto afianzaremos nuestra permanencia en la cima. A mi compañero y amigo Cristian Hormazábal por enseñarme que no es difícil reír aún cuando las cosas parecen estar mal; por su alegre compañía que hacía más ameno el trabajo.

ÍNDICE:

ABREVIATURAS RESUMEN ABSTRACT

i ii iii

INTRODUCCIÓN

1

• •

Definición del problema en estudio Importancia del problema en estudio y posibles limitaciones

MARCO TEÓRICO • •

• • • • • • •

•

• • •

Definición de dolor Anatomía del dolor - Transmisión de estímulos periféricos - Transmisión a través de vías centrales del dolor - Modulación del dolor a nivel del SNC Fisiología del dolor - Transducción - Funciones neuroefectoras Definición de inflamación Mediadores químicos del dolor e inflamación Fármacos utilizados en analgesia Antiinflamatorios no esteroidales Características generales - Propiedades diferenciales - Mecanismo general de acción Acciones farmacológicas - Acción analgésica - Acción antipirética - Acción antiinflamatoria - Acción antiagregante plaquetario - Acción uricosúrica Reacciones adversas - Gastrointestinales - Renales - Hematológicas - Hipersensibilidad Diclofenaco Dexketoprofeno Interacción de fármacos

HIPÓTESIS OBJETIVO GENERAL

1 1 3 3 3 4 5 6 7 7 8 8 9 10 11 12 12 12 15 15 16 16 17 17 17 18 18 18 19 19 20 21 23 23

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

23

MATERIALES Y MÉTODOS

24

• • • • • • •

Test de la formalina orofacial Fármacos Análisis de interacciones Análisis estadístico Tipo de investigación Obtención de la muestra Variables

RESULTADOS • Grupo Control Salino • Grupo Dexketoprofeno

• • • • •

- FIGURA 1 - FIGURA 2 Grupo Diclofenaco - FIGURA 3 - FIGURA 4 Mezcla DE50 de Dexketoprofeno/Diclofenaco primera fase - FIGURA 5 Mezcla DE50 de Dexketoprofeno/Diclofenaco segunda fase - FIGURA 6 Análisis isobolográfico: Dexketoprofeno y Diclofenaco fase algésica - FIGURA 7 Análisis isobolográfico; Dexketoprofeno y Diclofenaco fase inflamatoria - FIGURA 8

24 25 26 27 28 28 30 31 31 31 32 32 33 33 34 34 35 35 36 36 37 37 38

DISCUSIÓN CONCLUSIONES PROYECCIONES REFERENCIAS

39 42 43 44

ANEXOS • TABLAS - TABLA 1

49 49 49

ABREVIATURAS

•

IASP: Asociación Internacional para el Estudio del Dolor

•

AINEs: Antiinflamatorios no esteroidales

•

SNC: Sistema nerviosos central

•

CGRP: Péptido relacionado con el gen de la calcitonina

•

ATP: Trifosfato de adenosina

•

INE: Interneurona excitatoria

•

INI: Interneuronas inhibitorias

•

FNT: Factor de necrosis tumoral

•

COX 1: ciclooxigenasa 1

•

COX 2: ciclooxigenasa 2

•

COX 3: ciclooxigenasa 3

•

NMDA: N-METIL-D-Aspartato

•

GI: Gastrointestinal

•

PG: Prostaglandina

•

PGE2: Prostaglandina E2

•

I.P.: Intraperitoneal

•

I.I.: Índice de Interacción

•

DE50: Dosis efectiva 50

•

ES: Error estándar

•

S.C.: subcutáneo

i

RESUMEN Los antiinflamatorios no esteroidales son fármacos de gran uso a nivel mundial en el tratamiento de dolor e inflamación. Conocer los beneficios de sus interacciones sinérgicas nos presenta un horizonte de gran interés en la clínica porque ello implica disminuir las dosis mejorando la tolerancia por parte del paciente.

El presente trabajo evaluó el tipo de interacción farmacológica entre el dexketoprofeno y el diclofenaco tanto en su actividad antinociceptiva como antiinflamatoria, utilizando el test algesiométrico de la formalina en ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus). Los animales controles fueron inyectados vía intraperitoneal, con una solución salina, 30 minutos antes del test, así como los grupos inyectados con las drogas dexketoprofeno y diclofenaco disueltas en solución salina.

La evaluación se realizó registrando la respuesta conductual esperada en el animal, durante los 5 minutos inmediatos a la inyección, fase algésica aguda. Luego se cuantificó durante 10 minutos, a partir de los 20 desde la aplicación de la formalina, y hasta los 30 minutos, correspondiente a la fase inflamatoria. Se construyeron curvas dosis-respuesta a partir de las cuales se calculó las DE50 experimentales y mediante un análisis isobolográfico se comparó las distintas combinaciones con cálculos teóricos para determinar el tipo de interacción entre los fármacos.

Los resultados de este análisis concluyeron que el tipo de interacción entre Dexketoprofeno y Diclofenaco, solo es aditiva en su fase algésica, siendo sinérgica en la fase inflamatoria de dicho test.

ii

ABSTRACT Non-steroidal anti-inflammatory drugs are compounds used worldwide as a treatment of pain and inflammation. To know the benefits of their synergistic interactions presents a horizon of great interest in the clinic practise because it involves decreasing doses, improving tolerance by the patient.

The present work assessed the type of pharmacologic interaction between dexketoprofen and diclofenac both in its antinociceptive and antiinflammatory activity, using the orofacial formalin test in CF/1 (Mus musculus). The control animals were injected intraperitoneally with a saline solution 30 minutes before the test, as well as groups injected with drugs dexketoprofen and diclofenac dissolved in saline solution.

The evaluation was performed by recording the behavioral response expected in the animal during the immediate 5 minutes post-injection (acute algesic phase). Then it were measured during 10 minutes, as from 20 since the application of formalin, and up to 30 minutes, corresponding to inflammatory phase. It were built dose-response curves from which we estimate the experimental ED50 and through an isobolographic analysis we compared different combinations with theoretical calculations to determine the type of interaction between the drugs.

The results of this analysis concluded that the type of interaction between Dexketoprofen and Diclofenac is additive in its algesic phase, being synergic in the inflammatory phase of the test.

iii

INTRODUCCIÓN

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA EN ESTUDIO ¿Existe acción sinérgica entre el dexketoprofeno y diclofenaco en su efecto antinociceptivo y antiinflamatorio? IMPORTANCIA DEL PROBLEMA EN ESTUDIO Y POSIBLES LIMITACIONES El dolor y la inflamación han sido un motor importante en la búsqueda de nuevas sustancias que supriman esos signos a lo largo de la historia médica, desde los inicios de la humanidad. En el estudio histórico de cualquier civilización siempre encontraremos referencias de estos conceptos y de diferentes drogas utilizadas para combatir sus desagradables consecuencias. En la antigüedad, las concepciones de dolor y su tratamiento estaban ligadas a la cultura y eventos mágico-religiosos (Gutiérrez y Cadena, 2001). Por otro lado, en el siglo primero de nuestra era se describió el cuadro de la inflamación según sus manifestaciones locales más aparentes: enrojecimiento, tumefacción, aumento local de la temperatura y dolor. Posteriormente, Virchow asoció otra característica: la perdida de función o impotencia funcional del tejido u órgano afectado (Martínez, 2004). En los últimos años se han producido avances prometedores tanto en el conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos de los síndromes clínicos dolorosos e inflamatorios, como en el conocimiento de los factores culturales y emocionales que influyen en la percepción del dolor. Por todo lo anterior, este trabajo está orientado a contribuir en la búsqueda de nuevas estrategias en el uso de fármacos; esfuerzos tendientes a estudiar

1

posibles interacciones positivas entre distintos principios activos. Es en este sentido que la combinación de fármacos para conseguir efectos sinérgicos, promete abrir nuevas perspectivas en el tratamiento del dolor y la inflamación, así como en la obtención de un perfil con mayor seguridad y tolerabilidad. Esto se justifica en la medida que dos drogas con asociación sinérgica, requerirán de una dosis menor para lograr un mismo efecto, y en consecuencia sus reacciones adversas también tenderán a disminuir (Qiu y cols., 2006; Picazo y cols., 2006). Como todo estudio en animales, las limitaciones se refieren a las extrapolaciones de los posibles resultados, en la población humana, por lo cual deberían efectuarse estudios clínicos pertinentes a futuro.

2

MARCO TEÓRICO

DEFINICION DE DOLOR En las civilizaciones egipcia y babilónica se pensaba que el dolor causado por enfermedad dependía de la influencia divina que era percibida en el corazón. Budistas e hindúes reconocen el dolor como una sensación, con importante componente emocional, que se percibe en el corazón. Durante la civilización griega, el cerebro pasa a ser el receptor de las sensaciones y del razonamiento, funciones que se pensaba hasta entonces eran desempeñadas por el corazón. Hoy en día contamos con una definición más clara. La IASP (Asociación Internacional para el Estudio del Dolor) define el dolor como una “experiencia sensorial y emocional desagradable, asociada a un daño tisular actual o potencial” o bien descrita en términos de tal daño. El dolor es, por tanto, subjetivo y existe siempre que un paciente diga que algo le duele (Martínez, 2004).

ANATOMÍA DEL DOLOR Desde el punto de vista de la neurofisiología, existen mecanismos capaces de explicar el origen de la producción del dolor, las formas de percibirlo y sus características. El dolor se origina tras un estímulo periférico (traumatismo, inflamación, isquemia) que es conducido por un nervio periférico, a través de fibras especializadas, hasta la médula espinal, desde donde asciende a través

3

de haces medulares hasta el tronco y la corteza cerebral, en la que se hará consciente (Cotran y cols, 2000). En la transmisión del dolor distinguimos tres etapas: •

Transmisión de estímulos periféricos.

•

Transmisión a través de las vías centrales del dolor.

•

Modulación del dolor a nivel del SNC.

Transmisión de estímulos periféricos a través de sistema aferente primario Las fibras nerviosas aferentes contienen los axones de las neuronas que tienen sus cuerpos celulares en los ganglios de la raíz dorsal de la médula espinal. Estas neuronas pueden ser aferentes primarias y postganglionares simpáticas. El axón de estas neuronas está bifurcado, llegando una prolongación a los tejidos inervados y otra a la médula espinal. Las fibras nerviosas aferentes primarias se clasifican por su diámetro y grado de mielinización (factores determinantes de la velocidad de conducción), en: •

Fibras A-beta: Presentes en la piel. Son las de mayor diámetro (alta velocidad de conducción). Habitualmente su estímulo no transmite dolor, sino sensaciones mecánicas.

•

Fibras A-delta (nociceptores mecánicos de umbral alto o nociceptores mecano termales): De pequeño diámetro (1 a 6 micras) y mielinizadas. Se activan sin mediación de intermediarios químicos.

Tienen escasa

capacidad de adaptación, la intensidad y estímulo son proporcionales. Realizan la transmisión del dolor rápido y de corta duración (1er dolor).

4

Su estimulación desencadena una reacción de retirada, flexora, rápida. El dolor se percibe con carácter punzante. •

Fibras C (nociceptores polimodales o mixtos): De pequeño diámetro (0,2 a 1 micra) y amielínicas. Están mediados por la liberación de histamina, sustancia P, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), serotonina, bradicinina, prostaglandina, iones hidrógenos, ATP, y potasio. Realizan la transmisión del dolor lento y permanente (2º dolor). El dolor se percibe con carácter urente o de quemazón (Guyton, 2006). Las fibras A-delta y C están presentes en la piel y en las estructuras

viscerales y somáticas profundas corresponden a los nociceptores propiamente tales (Guyton, 2006). Se caracterizan por poseer un umbral de estimulación alto, en comparación a las fibras de grueso calibre que son de umbral muy bajo, ya que ellas transmiten el tacto suave o ligero. Su bloqueo producirá la abolición del impulso doloroso. Las fibras A y C terminan en neuronas de segundo orden en el cuerno dorsal de la médula espinal.

Transmisión a través de las vías centrales del dolor Las fibras tipo A-delta terminan en las láminas I y V de Rexed y las fibras tipo C lo hacen en las láminas II y III. La lámina II y III corresponde a la sustancia gelatinosa, que originan las células de tracto espinorreticular (paleoespinotalámico), mientras que en la lámina I se conforma el tracto dorsolateral de Lissauer, que conduce información nociceptiva de segmentos espinales. Las fibras A y C terminan en interneuronas que pueden ser de tipo interneurona excitatoria (INE) o interneuronas inhibitorias (INI). El cuerpo celular

5

de las neuronas aferentes primarias se encuentra en los ganglios de la raíz dorsal. De la lámina I emergen fibras que forman el haz espinotalámico directo (neoespinotalámico) que cruza la sustancia blanca anterolateral del lado contrario (contralateral) y asciende hacia la región ventrobasal del tálamo que se proyectan hacia la corteza somato-sensorial.

Modulación del dolor a nivel del SNC Del tálamo ventrobasal salen múltiples proyecciones hacia la corteza cerebral, principalmente a las áreas somestésicas primaria y secundaria, a la ínsula y la parte anterior del giro del cíngulo. Las características del impulso nociceptivo que son transmitidas son de dolor agudo (localización, intensidad, cualidad). La vía paleoespinotalámica es un sistema algo más antiguo y conduce el dolor sordo y crónico a partir de las fibras tipo C (Paeile, 2005). Solo una parte de las fibras llegan hasta el tálamo, las demás terminan en una de las tres áreas siguientes: •

Los núcleos reticulares del bulbo, el puente y el mesencéfalo.

•

El tectum del mesencéfalo.

•

La sustancia gris que rodea el acueducto de Silvio. Estas regiones inferiores del encéfalo ayudan a distinguir los diversos tipos

de dolor. Las vías descendentes que modifican la actividad de todos los sistemas ascendentes son las fibras corticoespinales, originadas en el lóbulo parietal y terminan en el cuerno dorsal, y el tracto rafespinal, que se origina en neuronas de los núcleos del rafe de la formación reticular de la médula espinal, su mayor 6

parte proviene del núcleo magno del rafe. Los axones amielínicos de este tracto atraviesan la parte dorsal del funículo lateral de la médula espinal.

FISIOLOGÍA DEL DOLOR El proceso de transducción es el proceso primario en la fisiología del dolor, es llevado a cabo por los nociceptores; los cuales son activados en presencia de daño tisular o inflamación, liberando una gran cantidad de sustancias que también actúan sobre los receptores; el efecto neto de todas estas sustancias y estímulos es excitar a la neurona y mover el potencial de membrana para llevar al umbral de disparo hacia el potencial de acción. Los nociceptores poseen un alto umbral, y cuando éste se alcanza, se produce un potencial de acción, impulsos que es conducido a la médula espinal donde son liberados neurotransmisores excitadores, los cuales, mediante vías específicas como la espinotalámica, espinorreticular y espinomesencefálica llegan al sistema nervioso central a partir del cuerno posterior de la médula espinal, donde se libera

también

un

gran

número

de

sustancias

neurotransmisoras

y

neuromoduladoras, muchas de las cuales son neuropéptidos que no son encontrados en otras fibras nociceptoras. De ahí son enviados al tálamo, y de allí, a diferentes lugares de la corteza, las cuales son activadas en respuesta al dolor. El tráfico de impulsos hacia el sistema nervioso central también es controlado por vías descendentes a nivel de los cuernos posteriores, las cuales ya fueron mencionadas (Guyton, 2006).

Transducción Los nociceptores tienen canales y receptores específicos que no son encontrados en otro tipo de fibras sensoriales mielinizadas del SNC. Poseen un

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gran número de canales iónicos compuerta ligando y compuerta de voltaje, los cuales están acoplados a proteínas G. Todas estas particularidades y los neurotransmisores y mediadores liberados parecen ser los responsables de que los impulsos conducidos sean característicos de dolor.

Funciones neuroefectoras Tal vez la causa más importante de dolor clínico es la inflamación, la cual da lugar a cambios químicos bien definidos que ocurren en el lugar donde ocurrió daño tisular y en los procesos de enfermedad. El pH bajo y una variedad de mensajeros llamados algógenos son los causantes del dolor, las sustancias son: citocinas, Prostaglandinas, Histamina, 5-hidroxitriptamina, péptidos, acetilcolina, etcétera. Los nociceptores cuando son activados por estímulos nocivos, liberan neuropéptidos en sus cuerpos celulares, es decir, en el cuerno dorsal (sustancia P, CGRP) que actúan en la periferia, pero también las células nociceptoras aferentes primarias estimulan a las neuronas simpáticas posganglionares para que liberen NE, ATP, y otras sustancias ya mencionadas (Paeile, 2005).

DEFINICIÓN DE INFLAMACIÓN Todas las células tienen la capacidad de reaccionar ante un estímulo agresivo con manifestaciones de adaptación y de reparación, pero sólo los componentes del tejido conectivo y los elementos de la microcirculación tienen la propiedad de actuar organizadamente en una respuesta que constituye la reacción inflamatoria.

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La respuesta inflamatoria como proceso es la mejor defensa del huésped (Cotran y cols., 1999), pero en exceso provoca una reacción dañina en el organismo, a pesar de los mecanismos naturales que la controlan. Cualquier tipo de agresión local en un tejido induce una respuesta de iniciación aguda por parte de la microcirculación sanguínea regional y de los elementos del tejido conectivo. (Guyton, 2006). La inflamación participa en la patogenia de muchas enfermedades. No constituye una enfermedad, sino una reacción generalmente benéfica que predispone a la reparación del daño. Sin embargo, al ser un proceso que se desarrolla con importantes alteraciones locales y sistémicas, lleva implícito el riesgo de transformarse en un fenómeno pernicioso para el organismo. En algunas enfermedades gran parte del daño de los tejidos resulta justamente de la respuesta inflamatoria. (Cotran y cols., 2000) Si bien la reacción inflamatoria parece tener la propiedad de mantener estrictamente focalizadas, las manifestaciones del daño recibido y de las reacciones evocadas, los pacientes con procesos inflamatorios muestran varias manifestaciones sistémicas de este cuadro las más evidentes son la fiebre y la leucocitosis. Otro efecto es el aumento de la velocidad de sedimentación de los eritrocitos, atribuible a una alteración en la composición de las proteínas del plasma.

MEDIADORES QUÍMICOS DEL DOLOR Y DE LA INFLAMACIÓN Como ya dijimos uno de los principales causantes del dolor es la inflamación, por lo tanto los elementos celulares que participan en el efecto nociceptivo y en la inflamación se repiten.

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Cuando se produce una lesión tisular por cualquiera de los mecanismos ya nombrados, los tejidos dañados liberan múltiples sustancias mediadoras. Estas se originan a partir de componentes normales del plasma, y son liberadas por células que las contienen preformadas en su citoplasma, durante el desarrollo del proceso doloroso o inflamatorio. Entre ellas destacan: histamina, eicosanoides,

bradicinina,

interleukina-1,

FNT,

interferones,

protones,

serotonina, adenosina, sustancia P, péptido relacionado con el gen de la calcitonina, oxido nítrico, entre los principales.(Cotran y cols, 2000).

FÁRMACOS UTILIZADOS EN ANALGESIA En la actualidad, existe un número importante de sustancias capaces de producir analgesia, inhibiendo de algún modo la neurotransmisión dolorosa, tanto a nivel preclínico en animales, como a nivel clínico en el hombre. Sin ir más lejos, el presente estudio indaga acerca de la interacción de dos fármacos en la inhibición de un estímulo nociceptivo particular. A este respecto, es que se pueden mencionar los fármacos inhibidores de la ciclooxigenasa (COX), antagonistas de NMDA, antidepresivos, antiepilépticos, anestésicos locales, agonistas α-adrenérgicos, colinérgicos y opiodes (Martin y Eisenach, 2001). Sin lugar a dudas, de todas las clases de fármacos antes mencionados, los inhibidores de la COX, mejor conocidos como analgésicos no esteroidales (AINEs) son los más ampliamente difundidos, estudiados y usados por el personal de salud, ya sea en cuadros agudos como crónicos. No obstante, independientemente de su eficacia, presentan una serie de reacciones adversas que exigen buen criterio al administrarlos terapéuticamente. Dentro de ellas, la irritación gástrica y la patología renal son las de mayor importancia (Pradilla, 2004).

10

La categoría de los AINES es un grupo heterogéneo de compuestos, con estructuras químicas diferentes. A pesar de esta diversidad estructural, estas drogas comparten propiedades farmacológicas. De ellas, las de mayor relevancia clínica son sus capacidades analgésica y antiinflamatoria. En este estudio, se indaga acerca de la actividad sinérgica entre el dexketoprofeno y el diclofenaco. Los seres humanos han usados los AINEs en varias formas por más de 3500 años (Vane, 2000). En la actualidad, cientos de formulaciones de AINEs están disponibles en el mercado y son consumidas de forma habitual en la mayoría de los países. Sin embargo, a pesar de la larga historia y el gran volumen de uso, aún el entendimiento de cómo estos analgésicos logran sus efectos es incompleto El primer progreso real en el entendimiento de los mecanismos de acción de los AINEs ocurrió hace 30 años, cuando se reveló que todas estas drogas químicamente diversas reducían la formación de prostaglandinas (Warner y Mitchell, 2002). Los AINEs producen su actividad antinociceptiva primariamente por inhibición de la COX, la cual convierte el ácido araquidónico en prostaglandinas.

ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDALES Como ya se ha dicho, los AINEs constituyen un grupo farmacológico muy heterogéneo que tienen en común su mecanismo de acción, caracterizado por inhibir la síntesis de eicosanoides, los cuales ejercen un importante papel tanto en la sensibilización de los nociceptores, como en la mediación de los procesos inflamatorios, fiebre e interferencia de la agregación plaquetaria y algunos de ellos,

con

propiedades

uricosúricas.

Por

esta

razón

son

usados

11

terapéuticamente

como

analgésicos,

antiinflamatorios,

antipiréticos

y

antiagregantes plaquetarios. También poseen efectos quimiopreventivos sobre el cáncer colorectal (Baek y cols, 2002). Del mismo modo, poseen reacciones adversas en común dado que tienen mecanismos de acción similares.

CARACTERÍSTICAS GENERALES

Propiedades Diferenciales Aunque la mayoría de los componentes de este grupo comparten las tres acciones que los definen (analgésica, antiinflamatoria y antipirética), su eficacia relativa puede ser diferente. Lo mismo pasa con su toxicidad, que puede coincidir con la del grupo o ser más o menos específica. De ahí que su uso clínico preferente, dependa de su eficacia analgésica y/o antiinflamatoria, así como de su vía de administración, pero también de sus efectos adversos (Flórez y cols, 2003)

Mecanismo General de Acción Los principales efectos terapéuticos y muchas de las reacciones adversas de los AINEs se pueden explicar por su efecto inhibidor de las ciclooxigenasas (COX), enzimas que convierten el ácido araquidónico, en endoperóxidos y luego en prostaglandinas y tromboxanos. Las prostaglandinas pertenecen a un grupo de compuestos conocidos como eicosanoides, los cuales participan en el proceso de la inflamación, dolor y fiebre; cuando las membranas celulares son dañadas, el ácido araquidónico es liberado al citoplasma donde sirve como sustrato para las lipooxigenasas, ciclooxigenasas y otras enzimas (Betolini y cols., 2001). La inhibición de la síntesis de prostaglandinas por los AINEs sería

12

responsable de su actividad terapéutica, aunque dada su participación en determinados procesos fisiológicos, dicha inhibición sería también responsable de diversas reacciones adversas características de estos fármacos. Las prostaglandinas son potentes mediadores hiperalgésicos que modulan múltiples sitios a lo largo de las vías nociceptivas y mejoran tanto la transducción (efecto de sensibilización periférica) como la transmisión (efecto de sensibilización central) de la información nociceptiva. La inhibición de la formación de prostaglandinas en sitios centrales y periféricos por los AINEs, por tanto conduce a la normalización del umbral del dolor asociado con la inflamación. La contribución de los mecanismos centrales y periféricos en la acción antinociceptiva de los AINEs depende de varios factores incluyendo la localización de los puntos de acción de los fármacos, el sitio de liberación del fármaco y la absorción y distribución al sitio de acción (Burian y Geisslinger, 2005). Los AINEs inhiben las COXs, y actualmente se ha demostrado la existencia de tres isoformas de estas enzimas: COX-1, COX-2 y COX-3. La COX-1 es una isoforma constitutiva, producto de un gen que transcribe en forma estable y continua. Ésta es producida por muchos tejidos y participa en el mantenimiento

de

funciones

fisiológicas

como

protección

de

mucosa

gastrointestinal, mantenimiento del flujo sanguíneo renal, hemostasia, entre otras

(Bertolini

y

cols.,

2001).

La

inhibición

de

la

COX-1

gástrica

constitutivamente expresada, resulta en el mayor efecto colateral indeseado visto en los pacientes (Willoughby y cols., 2000). La COX-2 es el producto de un gen con un elevado nivel de regulación, y cataliza la producción local de prostaglandinas

en

situaciones

fisiológicas

y

patológicas.

Aunque

en

condiciones basales su expresión está restringida, se pueden detectar niveles elevados en SNC y corteza renal. Además, la expresión de COX-2 es inducida por diversos mediadores asociados con la inflamación y crecimiento celular,

13

desempeñando un rol esencial en la inflamación, dolor, fiebre y proliferación celular normal y patológica (Flórez, 2003). Vasodilatación, cambios en la permeabilidad capilar, potenciación de otros mediadores químicos de la inflamación, quimiotaxis e hiperalgesia son todos aspectos de la inflamación que son iniciados y perpetuados por la presencia de prostaglandinas relacionadas con COX-2 (Curry y cols., 2005). La COX-3 es codificada por el mismo gen de la COX-1, pero la diferencia radica en que un intrón de su mRNA es retenido. En el ser humano, la COX-3 es abundante en la corteza cerebral y tejido cardíaco (Chandrasekharan, 2002). En investigaciones realizadas con animales menores, se comprobó que la COX-3 es inhibida selectivamente por acetaminofeno (paracetamol) y dipirona (metamizol), y es potencialmente inhibida por otros AINEs (Schwab y cols., 2003). Se ha sugerido que esta tercera forma de COX aparecería 48 horas después de iniciado el proceso inflamatorio y participaría en la producción de prostaglandinas involucradas en la resolución de la inflamación (Davies y cols., 2004). La

mayoría

de

los

AINEs

actualmente

disponibles

inhiben,

a

concentraciones terapéuticas, en forma no-selectiva las isoformas COX-1 y COX-2, como en el caso del dexketoprofeno. Basados en la naturaleza y acciones fisiológicas de las enzimas COX-1 y COX-2, los AINEs que bloquean preferentemente la COX-2 pueden ser clínicamente superiores a esos con menor selectividad por esta enzima. Los antiinflamatorios no esteroidales que inhiben la COX-2 pueden ser terapéuticamente mejores, porque ellos inhiben la formación de prostaglandinas catalizadas por COX-2, que son responsables de los signos clínicos asociados con la inflamación, y porque ellos no tienen mucho efecto sobre las prostaglandinas catalizadas por COX-1, las cuales tienen muchas propiedades homeostáticas. Las propiedades terapéuticas

analgésica y antiinflamatoria y las

reacciones adversas se relacionan con la cantidad de producción de

14

prostaglandinas que es impedida. El ácido araquidónico que no es metabolizado por las enzimas COXs puede entrar en la vía metabólica de la lipooxigenasa. De este modo, el uso de inhibidores de COX puede resultar en sobre representación de los efectos proinflamatorios de los leucotrienos. Esta posibilidad es de particular importancia, ya que los productos finales de la vía de la lipooxigenasa, es decir los leucotrienos, pueden jugar un rol integral en la inflamación y pueden contribuir con algunos de los efectos adversos asociados con los AINEs (Bertolini, 2001).

ACCIONES FARMACOLÓGICAS

Acción Analgésica La actividad analgésica de las AINEs es de intensidad leve a moderada, alcanzándose un techo analgésico claramente inferior al de los analgésicos opioides, pero frente a estos presentan la ventaja de no alterar la percepción. Son útiles en dolores articulares, musculares, dentarios y cefaleas. Los AINEs están indicados especialmente en ciertos dolores caracterizados por una participación destacada de las prostaglandinas. A nivel periférico, los AINEs actúan inhibiendo la síntesis de las prostaglandinas producidas por ambas isoformas de la COX, en respuesta a una agresión o lesión tisular. Por otra parte, a nivel de la médula espinal, las dos isoformas de COX son expresadas constitutivamente, con la COX-2 como forma predominante. En aquellas situaciones que originan sensibilización espinal como consecuencia de una estimulación sostenida de aferencias nociceptivas periféricas, el efecto analgésico o antihiperalgésico parece

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depender de la inhibición preferente de esta forma constitutiva de la COX-2 (Beiche y cols., 1996; Flórez, 2003).

Acción Antipirética La fiebre es una respuesta autónoma, neuroendocrina, conductual compleja y coordinada, que se desencadena ante la existencia de una infección, lesión tisular, inflamación, etc. Tiene una doble finalidad: alertar acerca de una situación anómala y potencialmente lesiva, y poner en marcha una serie de mecanismos fisiológicos para la defensa del organismo. Su manifestación cardinal es la elevación de la temperatura corporal del orden de 1 a 4º C (Flórez, 2003). Esta acción antitérmica de los AINEs se explica, principalmente, por su capacidad de disminuir las concentraciones centrales prostaglandina E2, la cual actúa como mediador de la reacción febril inducida por los pirógenos endógenos (Ranels y Griffin, 2005), mediante la inhibición directa de la actividad de la COX-3. En clínica, el acetaminofeno (paracetamol) es el AINE más popular en el mundo utilizado como antipirético (Chandrasekharan, 2002), con claras acciones inhibitorias sobre la COX-3.

Acción Antiinflamatoria La inflamación es una de las respuestas fisiopatológicas fundamentales con las que el organismo se defiende frente a agresiones producidas por gran variedad de estímulos (por ejemplo, infecciones, lesiones de diversa índole, procesos isquémicos), aunque en ocasiones, su exageración y persistencia no parezca que sirve a tal propósito.

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La capacidad de los AINEs para reducir la inflamación es variable; en general son más eficaces frente a inflamaciones agudas que crónicas. Al inhibir la síntesis de PGs y tromboxanos, los AINEs reducen su actividad sensibilizadora de la terminaciones sensitivas, así como la actividad vasodilatadora y quimiotáctica (Flórez, 2003).

Acción Antiagregante Plaquetaria Es una función que no comparten todos los AINEs, aunque sea consecuencia de su efecto inhibidor de la COX-1. Esta acción, que es utilizada terapéuticamente

en

la

prevención

a

largo

plazo

de

accidentes

tromboembólicos coronarios y cerebrales, puede asimismo facilitar la aparición de hemorragias (Flórez y cols, 2003). El fármaco más importante que presenta esta acción es la aspirina a bajas dosis.

Acción Uricosúrica Es consecuencia de la inhibición del transporte de ácido úrico desde la luz del túbulo renal hasta el espacio intersticial. Es un proceso apreciable sólo con algunos AINEs y a dosis elevadas. (Flórez, 2003).

REACCIONES ADVERSAS Los AINEs, como ya ha sido mencionado, a pesar de sus estructuras diferentes poseen las mismas propiedades terapéuticas (Baek y cols., 2002), pero también comparten sus efectos adversos en la mayoría de los casos. Los podemos clasificar en los siguientes:

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Gastrointestinales Los efectos adversos más serios asociados al uso de los AINEs son los que ocurren en el trato digestivo. Perforación, ulceración y sangrado gastrointestinal (GI) han sido asociados con la depresión de las PGE2, que median los mecanismos protectivos de la mucosa (secreción de bicarbonato y mucus, epitelización y mantenimiento del flujo sanguíneo de la mucosa) (Bertolini, 2001). A causa de que el mantenimiento de la integridad de la mucosa intestinal es el resultado de la actividad de la COX-1, es lógico pensar que los AINEs selectivos para la COX-2 estén asociados con muy pocas complicaciones GI. Las reacciones indeseables más frecuentes son: pirosis, gastritis, diarrea y estreñimiento.

Renales Los

antiinflamatorios

no

esteroidales

pueden

causar

nefropatía,

especialmente con el uso crónico. El mantenimiento del flujo sanguíneo renal al enfrentar un tono arterial aumentado se acompaña de efectos vasodilatadores de las prostaglandinas (Wright, 2002). Los AINEs pueden disminuir el flujo sanguíneo renal y la filtración glomerular, junto con producir retención de sodio potasio y agua (produciendo edema, insuficiencia cardiaca, HTA y disminuyendo la acción de fármacos antihipertensivos). La complicación más importante es la insuficiencia renal.

Hematológicas Aunque su frecuencia en conjunto es baja, el amplio uso de los AINEs y la gravedad de alguna de ellas obliga a tenerlas en cuenta. Alguna de estas

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reacciones están en relación con las propiedades ya descritas, como un efecto en exceso de la actividad antiagregante plaquetaria (Flórez y cols., 2003). Una dosis o administración inapropiada de aspirina puede resultar en un efecto antitrombótico exagerado.

Hipersensibilidad Con una frecuencia de alrededor de 1 a 2% de los pacientes bajo tratamiento con AINEs, se caracteriza como rinitis alérgica, asma bronquial, trastornos dérmicos etc. Pueden ser de carácter alérgico, de mecanismo inmunológico con anticuerpos, o seudo alérgico, que son más frecuentes y relacionado con la inhibición de la síntesis de PGs y un desvío hacia la síntesis de los leucotrienos y en conexión con una sensibilidad individual especial (Flórez y cols., 2003).

DICLOFENACO Es un derivado fenilacético con actividad analgésica, antitérmica y antiinflamatoria, y eficacia comparable a la de los derivados del ácido propiónico. A las dosis habituales interfiere menos en la agregación plaquetaria que la mayoría de los AINEs y es uricosúrico. Inhibe la síntesis de PG, pero además disminuye la concentración de ácido araquidónico en los leucocitos. Se elimina por la orina (65%) y la bilis (35%), tras sufrir hidroxilación y conjugación. Pasa al líquido sinovial, donde alcanza concentraciones menores que las plasmáticas, pero más mantenidas, lo cual explica que la duración de sus efectos sea más prolongada que lo que se deduciría de su vida media.

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Sus reacciones adversas son, en general, semejantes a la de los restantes AINES, pero su uso se asocia a una menor incidencia de alteraciones gastrointestinales. Puede generar en grado diverso: dispepsia, erosiones y ulceraciones

gastrointestinales;

alteraciones

neurológicas

en

forma

de

sedación, somnolencia, mareo o cefalea; erupciones dérmicas y diversas reacciones de hipersensibilidad. Puede aumentar el tiempo de hemorragia debido a su acción antiagregante (Flórez y cols., 2003). Sus indicaciones terapéuticas cubren un espectro que abarca desde el tratamiento agudo y crónico de los signos y síntomas de la artritis reumatoide, artrosis y espondilitis anquilosante hasta el del dolor agudo debido a procesos inflamatorios no reumáticos o la dismenorrea primaria.

DEXKETOPROFENO El

dexketoprofeno,

enantiómero

activo

del

compuesto

racémico

ketoprofeno, es un AINE de la familia de los arilpropiónicos. El dexketoprofeno actúa a través de una inhibición no selectiva de la COX, disminuyendo así la síntesis de PG. El inicio muy rápido de la acción, comparado con el ketoprofeno, sugiere que el dexketoprofeno es más apropiado para el tratamiento del dolor agudo. Se ha demostrado que la acción del S-isómero del ketoprofeno es cerca de 3000 veces más potente que el R-isómero (Ghezzi y cols., 1998). La formulación de la droga como un isómero único tiene muchas ventajas potenciales, incluyendo la posibilidad de aumentar el índice terapéutico y de simplificar el perfil farmacocinético. El uso del enantiómero activo aislado permite una reducción en la dosificación del 50%. Esto puede reducir las reacciones adversas al disminuir la carga metabólica y renal.

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El dexketoprofeno es un eficaz analgésico en el tratamiento del dolor suave a moderado, con un perfil clínico similar a otros analgésicos orales comúnmente

disponibles.

Produce

una

reducción

marcada

en

los

requerimientos postoperatorios de opioides cuando es utilizado como parte de un régimen analgésico equilibrado, de ese modo disminuye potenciales efectos secundarios inducidos por los opioides (Iohom y cols., 2002). En lo que se refiere a los efectos centrales del dexketoprofeno, también se ha demostrado que este AINE tiene la capacidad de inhibir la síntesis de PGs a nivel central, aunque se cree que es su interacción con el sistema serotonérgico la que explica la mayor eficacia de este fármaco con respecto a otros AINEs (Díaz-Reval y cols., 2004). Además, se ha visto que ratas normales (sin inflamación u otro proceso patológico) disminuye el fenómeno de wind-up (sumación de respuestas de las neuronas del asta dorsal ante la estimulación de un nervio periférico) (Mazario y cols., 1999).

INTERACCIÓN DE FÁRMACOS La interacción farmacológica entre drogas se puede considerar desde el punto de vista farmacocinético o farmacodinámico. Pues bien, cuando dos drogas se administran en forma conjunta, sus efectos pueden ser: •

Aditivos: corresponde a la suma de los efectos que produce cada una de ellas separadamente.

•

Subaditivo o antagónico: corresponde a un efecto menor que la suma de cada agente por separado.

•

Sinérgico o supraditivo: que es un efecto mayor que la suma de los efectos por separados de cada droga (Tallarida y cols., 2003).

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Es evidente que asociar drogas que produzcan sinergismo, mejor que simple aditividad, presenta un uso promisorio en el tratamiento del dolor porque ello implicaría disminuir las dosis de ambos fármacos, de modo que mejore la tolerancia por parte del paciente.

Además, se agrega el hecho de que

normalmente el sinergismo va acompañado con una significativa disminución de las reacciones adversas. Es por esta razón, que la exploración de drogas que al ser aplicadas conjuntamente produzcan una interacción sinérgica es de alto interés en farmacología. En el presente trabajo se evaluará la interacción entre el dexketoprofeno y el diclofenaco, en el modelo de dolor agudo experimental de la formalina para caracterizar el tipo de asociación entre estos fármacos.

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HIPÓTESIS El tipo de interacción que se produce al coadministrar dexketoprofeno y diclofenaco en sus acciones analgésica y antiinflamatoria es de naturaleza sinérgica, en ratones sometidos al test experimental de la formalina.

OBJETIVO GENERAL •

Evaluar el tipo de interacción que se produce al coadministrar dexketoprofeno y diclofenaco en su actividad antinociceptiva y antiinflamatoria en un ensayo experimental de dolor.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS •

Evaluar el grado de antinocicepción y antiinflamación inducida en ratones por la coadministración sistémica intraperitoneal (i.p.) de dexketoprofeno y de diclofenaco en el modelo algesiométrico agudo experimental de la formalina.

•

Caracterizar

la

antiinflamatoria

naturaleza inducida

de

por

la la

interacción

antinociceptiva

coadministración

vía

i.p.

y de

dexketoprofeno y diclofenaco, por medio de isobologramas, usando el método algesiométrico agudo experimental de la formalina.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Se usaron ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) machos y hembras, de 28 a 30 gramos de peso, los cuales son criados de acuerdo a las condiciones estándar internacionales de experimentación, a temperatura, presión y humedad adecuados, sometidos a 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, procurando no sobrepasar el número de 9 crías (Luccarini y cols., 2006). Posteriormente, fueron habituados al ambiente del laboratorio al menos dos horas antes del experimento, teniendo libre acceso a comida y agua durante ese lapso de tiempo, para evitar ansiedad y conductas de exploración durante la realización del test. Éste se realizó de acuerdo a un protocolo aprobado por la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. Cada animal recibió solamente una dosis de las drogas; las observaciones fueron efectuadas en forma ciega y randomizada. Los animales se sacrificaron después del experimento mediante dislocación cervical.

TEST DE LA FORMALINA OROFACIAL La evaluación de la actividad antinociceptiva se efectuó utilizando el método algesiométrico agudo de la formalina. Para ello se inyectó subcutáneamente 20 μL de una solución de formalina al 5% en el labio superior, justo en la región lateral a la nariz del animal (Raboisson y Dallel, 2004). Los ratones fueron colocados en un cilindro especialmente diseñado para la observación y fue cuantificado con un cronometro digital, el tiempo total (en segundos) que ellos se frotaron con las patas delanteras o la pata trasera ipsilateral, la región perinasal, durante los 5 minutos inmediatos a la inyección, período que corresponde a la fase algésica aguda (primera fase). Luego se

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cuantificó durante 10 minutos, a partir de los 20 desde la aplicación de la formalina, y hasta los 30 minutos, el tiempo total durante el cual los animales se frotaron el área inyectada y que corresponde a la fase inflamatoria (segunda fase). Entre las fases algésica e inflamatoria existe un período de inactividad que no se contabiliza. Para el análisis de la acción analgésica y antiinflamatoria del dexketoprofeno y diclofenaco por separado, se establecieron las relaciones dosis-respuestas de los fármacos administrados por vía sistémica (i.p.) con un mínimo de 6 animales por cada una de las 4 dosis administradas.

FÁRMACOS Los animales controles fueron inyectados vía intraperitoneal (i.p.), con una solución salina al 0.9%, 30 minutos antes del test de la formalina. Los grupos experimentales con dexketoprofeno fueron inyectados en dosis de 3, 10, 30 y 100 mg/Kg; los grupos con diclofenaco fueron inyectados en dosis de 1, 3, 10 y 30 mg/Kg. Cada una de las dosis fue disuelta en solución salina en un volumen constante de 10 mL/Kg para ambos fármacos empleados. El ensayo de la formalina se realizó al momento de obtenerse el efecto máximo de cada droga. Todos los fármacos utilizados fueron suministrados por el Laboratorio de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile y corresponden a: dexketoprofeno y diclofenaco; así como también la solución salina y la de formalina.

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ANÁLISIS DE LAS INTERACCIONES La interacción entre los fármacos utilizados tanto para la fase algésica como para la inflamatoria, se evaluó llevando a cabo el análisis isobolográfico para las diferentes combinaciones. Para ello se construyó curvas dosis respuesta de los fármacos administrados por vía sistémica (i.p.) con un mínimo de 6 animales por cada una de las 4 dosis administradas. De cada una de ellas, se obtuvo, en forma computarizada las DE50 (dosis que produce una respuesta igual a la mitad de la respuesta máxima), por análisis de regresión lineal. Las interacciones entre dexketoprofeno y diclofenaco se efectuó coadministrando, en proporción 1:1, por vía i.p. 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16 de sus DE50, en un esquema de proporciones fijas. Para cada mezcla de drogas, la DE50 se determinó por análisis de regresión lineal del logaritmo de la curva dosis-respuesta y fue comparada estadísticamente con la aditividad teórica de la DE50 obtenida de la siguiente formula:

DE50 aditividad teórica = DE50 droga/ (P1 + R x P2), Donde R es la relación de potencia entre dexketoprofeno y diclofenaco, al ser administradas por sí solas; P1 es la proporción de dexketoprofeno en la mezcla; y P2 es la proporción de diclofenaco en la mezcla. Así obtenidas las DE50 experimentales, el isobolograma fue construido dentro de un sistema de coordenadas cartesianas, conectando la DE50 del dexketoprofeno trazado en la abscisa con la DE50 del diclofenaco trazado en la ordenada para obtener la línea de aditividad (Miranda y cols., 2001). La región del gráfico donde se ubica el valor experimental en relación al valor teórico determina el tipo de interacción. Si el valor se ubica bajo la línea de aditividad y es estadísticamente diferente del valor teórico, la interacción es de tipo

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sinérgica o supraaditiva (el efecto de la combinación de las drogas es más alto y estadísticamente diferente que el efecto teórico calculado de la combinación con las mismas proporciones); cuando la combinación de las drogas da una DE50 experimental que no es estadísticamente diferente a la DE50 calculada en forma teórica, se determina que la interacción tiene un efecto de simple aditividad, lo que significa que cada constituyente contribuye con su propia potencia y la droga menos potente esta actuando como si fuera meramente una forma diluida de la otra. Por otro lado, si el valor experimental se ubica sobre la línea de aditividad y es estadísticamente diferente del teórico, la interacción es de naturaleza subaditiva o antagónica. Además se calculó el Índice de Interacción (I.I.), que es un valor que confirma la naturaleza de la interacción sinérgica entre las drogas de acuerdo a la siguiente formula:

I.I. = DE50 experimental/DE50 teórica Si el valor resultante es menor que 1 corresponde a una interacción sinérgica, si resulta igual a 1, la interacción es aditiva, y si es mayor que 1, es antagónica.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados son presentados como valores promedio ± error estándar del promedio o como los valores DE50 con un intervalo de confianza de al menos 95%. Cabe decir que para el análisis de datos se practicó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con el test de Newman Keul para comparaciones múltiples, y así determinar si existían diferencias signicativas entre los grupos.

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Posteriormente, para comparar los puntos experimental y teórico en los isobologramas, la significación estadística fue examinada por análisis de varianza seguido de pruebas de t de Student. La significancia es aceptada en un nivel de p