UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR          

INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE  MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS  HEREDITARIAS.  RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA  ANTISENTIDO. 

Cristina Aguado Esteban TESIS DOCTORAL Madrid, 2008

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR          

INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE  MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS  HEREDITARIAS.  RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA  ANTISENTIDO. 

Directora de Tesis: Dra. Lourdes Ruiz Desviat           Memoria presentada por la licenciada Cristina Aguado Esteban para optar al grado de Doctor en Ciencias

El  presente  trabajo  ha  sido  realizado  en  el  laboratorio  de  la  Prof.  Magdalena  Ugarte,  Catedrática  del  Departamento  de  Biología  Molecular, en el Centro de Biología Molecular  “Severo Ochoa” de la Universidad Autónoma  de Madrid, y durante una estancia breve en el  laboratorio  de  la  Prof.    Ruma  Banerjee,  en  el  Centro  Redox  de  Biología,  Departamento  de  Bioquímica,  en  la  Universidad  de  Nebraska,  EEUU,  con  la  ayuda  de  una  beca  predoctoral  concedida  por  el  ministerio  de  Educación  y  Ciencia. 

AGRADECIMIENTOS   En primer lugar quiero agradecer a Dios la vida y la gente tan genial que ha puesto  en mi camino durante estos cinco años. Gracias por los buenos y malos momentos, porque  nunca me he sentido sola, por ese amor tan grande que me muestra siempre.  Gracias a la Profesora Magdalena Ugarte por darme la gran oportunidad de realizar  la  tesis  doctoral  en  su  laboratorio.  Por  su  gran  ejemplo  profesional  y  humano.  Por  presentarme a varios de sus niños.   Gracias a cada una de las personas del laboratorio 201‐210/204 porque me he sentido  muy querida y muy cuidada y porque de cada uno he aprendido mucho, por poder hacer la  tesis junto a ellos:  A  Lourdes  por  ser  mi  directora  de  tesis,  por  haber  escuchado  siempre  mis  teorías,  porque  eso  ha  hecho  que  me  ilusione  este  mundo.  Por  transmitirme  mucha  confianza  y  tranquilidad,  por  corregirme  y  regañarme  en  los  momentos  adecuados,  por  tener  siempre  una  solución,  por  acertar  siempre  los  resultados,  por  ser  como  eres;  inteligente,  práctica,  clara y fuerte.    A  Belén  por  ser  la  primera  persona  del  laboratorio  con  la  que  hablé,  por  la  fuerza,  seguridad e inteligencia que transmite.    A las dos por su ejemplo como investigadoras, por esa capacidad de integrar  tantos temas  científicos a la vez, por trabajar de forma tan complementaria.   A Rosa por ser tan buena gente, una de las mejores que conozco, por los mil detalles  que ha tenido conmigo, por defenderme siempre, por escucharme aquel día a las tres de la  mañana, por ser tan buena amiga.   A Ascen porque fue la primera persona con la que compartí poyata, por todo lo que  me ha enseñado, por su paciencia, porque tiene una solución para cualquier problema, por  sus buenos consejos.    A  Fa  por  los  viajes  en  el  tren,  por  ser  tan  elegante  trabajando,  porque  eres  la  única  persona que me ha visto medio llorar, por las zapatillas de estar por casa, por estar atenta a  lo que me pasaba, por escucharme siempre.  A las tres Ascen, Fa y Rosa por la seguridad y unión que transmitís en el laboratorio.  A Ana Rincón por los cinco años compartiendo tesis, por ser mi ONG personal, por  soportar mi enano gruñón, por “es un señor....”, por el intento de libro, por algún que otro  secreto.  A Ana Vega por su sinceridad y franqueza siempre, por querer siempre entender lo  que haces, por el viaje a Barcelona, por tu humor y por intentar enseñarme a bailar.  A  Patricia  porque  me  parece  que  te  conozco  desde  hace  mucho  más  tiempo,  por  aquel “me caes muy bien” después de la cena de Navidad, por compartir tus sentimientos,  por la confianza que me transmites.  A Ana Jorge por ser tan trabajadora y luchadora.  A  Celia  y  a  Begoña  por  contestar  siempre  mis  preguntas,  por  transmitirme  lo  maravilloso que es el diagnóstico de las enfermedades metabólicas.  A  Carmen  por  ser  ejemplo  de  fuerza,  por  enseñarme  tanto,  por  todas  las  conversaciones en el cuarto de cultivo, por preocuparte tanto por la gente..  A Pilar por ser una de las mejoras profesoras que tuve en la carrera y por todos sus  buenos consejos.  A Marga por hacerme siempre un hueco en el aparato, por explicarme tantas cosas.  

A  Palo  por  dejarme  cotillear  en  los  picos  de  los  aminoácidos  y  por  tantas  conversaciones. A Fer por ser tan dispuesto y amable.  A  Rocío  alias  “Irene”,  por  la  tranquilidad  que  transmite,  por  aguantar  mis  bromas,  por preguntarme y fiarte de mi.   A Irene y el niño porque fueron mis avanzados, por todas las historias que he vivido  con ellos, por dejarse enseñar, por la paciencia con mis largas explicaciones, por los bollitos  de su pueblo Rubén, por las historias con su hermano, por llevar tan bien lo del aire que le  dio. Irene, por ser un ejemplo en empeño y paciencia hasta conseguir un experimento.  A  los  dos  informáticos  Julio  y  Gonzalo,  por  su  paciencia  con  mis  estropicios  informáticos  y  por  su  gran  humor,  por  las  discusiones  de  religión,  por  los  partiditos  al  baloncesto y por las cañas en los dardos.  A Sonia, a MA y a Ángel  mis becarios predecesores por luchar cada uno a su manera  por conseguir vuestros sueños Sonia por las bromas en los primeros tiempos, por acogerme  en tu casa tras una comida de Navidad, por tus mil consejos, por los  viajes en el tren, por  llamarme cuando estaba en Nebraska. A María Ángeles por los cines por su dulzura y por  su  sinceridad.  A  Pey  por  enseñarme  con  tanta  precisión,  por  ser  un  enamorado  de  su  trabajo.  A Isaac por los partidos de baloncesto, por las partidas de dardos, porque aunque en  muchas cosas pensamos diferente siempre me has escuchado, por tus bromas.  A Pedro por todas las conversaciones en el laboratorio y fuera de el, por los teatros  compartidos,  las  cañas  y  porque  siempre  he  aprendido  cuando  he  hablado  contigo,  por  tu  humor.  A Gema, María, Charo, Yolanda, Nuria, María Jesús por tantas conversaciones en el  lado  de  diagnóstico,  por  los  experimentos  que  me  habéis  enseñado,  por  vuestra  paciencia  cuando me dejaba cosas en vuestro lado.  A la Richi por su sonrisa perenne, por contestar siempre mis preguntas y por ser tan  cercana.  A  las  biosecre  (Ana,  Isa,  Eva  y  Julia)  por  tener  siempre  una  sonrisa  aunque  nos  coláramos  en  la  impresora  con  las  secuencias  y  a  la  Juli  en  especial,  por  su  humor,  por  su  capacidad teatral, por comer con nosotras a las tres, por presentarme a un amigo común, por  preocuparte por mi.  A  Maja,  Abel  y  Lorena  porque  aunque  habéis  estado  poco  conmigo  habéis  hecho  muy  agradable el día a día en el laboratorio.  Gracias  a  la  gente  de  los  diversos  laboratorios  y  de  los  distintos  servicios  del  CBM    cuya  ayuda ha sido importante para esta tesis.     OS VOY A ECHAR MUCHO DE MENOS    No  se  puede  hacer  una  tesis  sin  una  familia  y  unos  amigos  que  te  apoyen,  quieran  y  acompañen durante los cinco años que dura este camino.  Por supuesto y en primer lugar gracias a mis padres, a mi padre por su ejemplo de  trabajo, honradez y humor, a mi madre por su ejemplo de atención, detallismo y dulzura.   A los dos gracias  por la confianza que siempre habéis tenido en mi, por apoyarme siempre  durante  la  carrera  y  durante  estos  cinco  años  de  doctorado,  pero  sobre  todo  gracias  por  quererme tanto y siempre, porque  no creo  que me merezca unos padres tan buenos. A mi  hermana,  por  su  ejemplo  de  entrega  total,  por  su  fuerza  y  decisión,  por  que  cada  día  descubro  la  gran  suerte  de  tenerla,  de  poder  hablar  con  ella,  de  que  esté  en  ese  pequeño 

convento  rezando  por  todos.  A  mi  hermano  por  ser  tan  trabajador  y  por  tener  tan  buen  corazón.  A Raquel por los 24 años de amistad, por los tres años de compartir piso, por abrir tu  corazón siempre, por tu fuerza de voluntad, porque hemos compartido mucho   A mis compis de piso del último año y medio, por las conversaciones del salón, por  la libertad de esta casa, a María por los paseos de los últimos tiempos, por ese disco que me  grabaste y que nunca dejaré de escuchar, a Ana Merino por los intentos de magdalenas y el  triunfo del bizcocho, por tantas conversaciones espirituales, por ser tan alegre y vivaz, a Ana  Barquero por su humor, por preocuparte por mi a altas horas de la madrugada, a Bea por ser  tan generosa, por dar sin preguntar, ojala todo el mundo pudiera tener unas compañeras de  piso tan geniales como ellas.  A  los  chavales  de  Fundamipf    sobre  todo  Quique,  Irene  (Lala)  y  Laurita  porque  conocerles es una de las mejores cosas que me ha pasado en la vida y de las que más me ha  cambiado, porque si he hecho la tesis en este laboratorio es gracias a encontrarme con ellos.  Al  grupo  de  San  Jorge, a  los  chavales,  por  la  felicidad  que  transmitís, por  todas  las  sonrisas,  besos  y  abrazos  que  me  habéis  regalo  durante  estos  dos  años,  por  los  campamentos, por el club de los martes y las celebraciones de los domingos. Gracias a los  padres  y  a  todos  los  monitores  con  los  que  he  aprendido  a  cuidar  y  disfrutar  de  estos  chavales tan especiales.  A mis amigos de Segovia por los más de 10 años que llevamos juntos, porque cada  vez que vuelvo a Segovia es como si nunca me hubiera ido.  A la gente de lokos por hacerme disfrutar en cada viaje y en cada partido.  A  mi  comunidad  de  Mirto  con  la  que  he  crecido  espiritual  y  humanamente  estos  años, a Pablo, Marisa, Gabriella, María José, María “Kika”, Jorge, Vanesa, Abraham, Noemí,  María Casado, Carmen, Quique, Javi, David,Pepa. 

  En fin, muchas gracias a todos. 

                                                  A  mis  padres:  Hilario y Pilar                       

SUMMARY In  this  work,  we  have  investigated  specific  mutation  therapies  in  metabolic  genetic diseases, specifically we have analyzed the mechanisms underlying cofactor and  coenzyme  responsiveness  in  phenylketonuria  (PKU),  propionic  acidemia  (PA),  methylcrotonylglycinuria  (MCG)  and  methylmalonic  aciemia  (MMA)  and  splicing  therapies in PA.    We have identified the mutations present in Spanish PKU patients who respond  to  BH4  and  we  have  selected  some  mutations  associated  to  responsiveness  for  expression  analysis.  We  have  analyzed  in  total  14  missense  mutations  using  different  prokaryote,  eukaryote  and  cell‐free  systems.  Five  mutations  were  expressed  in  vitro  in  E.coli  as  MBP‐PAH  fusion  proteins,  we  have  determined  PAH  steady‐state  kinetic  properties  in  order  to  detect  possible  defects  in  BH4  affinity.  The  majority  of  the  mutations  affected  kinetic  and  regulatory  properties.  Only  one  mutation  showed  slightly  reduced  affinity  for  the  cofactor  under  steady‐state  conditions.  We  have  also  measured  the  degradation  rates  of  11  mutant  PAH  proteins  expressed  in  a  cell‐free  system, using pulse‐chase analysis and presence or absence of BH4 and determined the  amount of three of the mutant proteins after transfection in Hep3B as FLAG‐PAH fusion  proteins in presence of different levels of BH4. The results show that high concentrations  of  BH4    protect  some  mutant  proteins  against  degradation  and  result  in  an  increase  in  the steady‐state amounts of protein in hepatoma cells. In the hepatoma cellular model,  BH4 levels don’t affect the expression of the PAH gene.  In  MMA  cblB  type  we  have  selected  two  mutations  previously  associated  with  responsiveness  to  OHcobalamin.  We  have  expressed  the  ATR  protein  in  E.  coli  to  determine steady‐state kinetic properties in order to detect possible defects in cobalamin  affinity.  The  results  suggest  a  stability  defect  for  one  of  the  mutant  proteins,  with  reduced  enzymatic  activity  but  with  K(m)  for  ATP  and  Kd  for  cob(I)alamin  similar  to  wild‐type values.   The  last  coenzyme  analyzed  in  this  work  was  biotin,  for  which  there  is  no  consensus in the literature if it affects the expression of biotin‐dependent carboxylases.  In  Hep3B  cells  we  have  analyzed  the  effect  of  different  levels  of  biotin  in  the  activity,  amount  of  functional  active  protein  and  mRNA  levels  of  two  carboxylases,  PCC  and  MCC, that when defective cause PA and MCG, respectively. In our model, biotin does  not affect the expression of the enzymes but favours the conversion of apocarboxylase to  holocarboxylase.    Finally, we describe the use of antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) to  restore normal splicing caused by intronic molecular defects identified in PA. The two  point  mutations  described  in  deep  intronic  regions  increase  the  splicing  score  of  pseudoexonic regions or generate consensus binding motifs for splicing factors, such as  SRp40, which favour the intronic inclusion in PCCA (r.1284ins84) and PCCB (r.654ins72)  mRNAs. AMOs were targeted to the 5´ and 3´ cryptic splice sites of the pseudoexons to  block  the  access  of  the  splicing  machinery.  Using  this  antisense  therapeutics,  we  have  obtained correctly spliced mRNA that was efficiently translated and PCC activities were  rescued  in  patients´fibroblasts.  Our  results  demonstrate  that  the  aberrant  inclusions  of  the intronic sequences are disease‐causing mutations in these patients and that the use  of AMOs is an effective therapeutic strategy in this genetic disorder. 

ABREVIATURAS    ACC:  AdoCbl:  ADP:  AON:  AP:  ATP:  ATR:  BH4:   BPS:  BSA:  cAMP:  Cbl:  CBR:  cDNA:  DAHP:  DMSO:  DNA:  dNTP:  DTT:   EDTA:  EGTA:  EMH:  ESE:  FAS:   FBS:  FPLC:   GAPDH:  gDNA:  h:   HCS:  Hepes:   HPLC:   HFA:   IPTG:  IVS:  kb:  Kd:   kDa:  Km:   LB: 

Acetil‐CoA carboxilasa  Adenosilcobalamina  Adenosina difosfato  Oligonucleótiodo antisentido   Acidemia propiónica  Adenosina trifosfato  ATP: cobalamina adenosil transferasa  (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina   Secuencia de ramificación (branch point sequence)  Albúmina de suero bovino  Adenosina monofosfato cíclica  Cobalamina  Región de unión del cofactor  DNA complementario  2,4‐Diamino‐6‐hydroxypyrimidine  Dimetil sulfóxido.  Ácido desoxirribonucleico  Desoxinucleótido trifosfato  1,4‐ditio‐L‐treitol  Ácido etilen‐diamino‐tetraacético  Ácido etilen‐glicol‐tetraacético  Enfermedades metabólicas hereditarias  Secuencia exónica potenciadora de splicing (exonic splicing enhancer)  Sulfato amónico ferroso   Suero fetal bovino.  Sistema de separación rápida de proteínas por cromatografía de  líquidos  Gliceraldehído‐fosfato deshidrogenasa  DNA genómico  Índice o coeficiente de Hill  Holocarboxilasa sintetasa  Ácido N‐2‐hidroxietilpiperazina‐N´‐2‐etanosulfónico  Cromatografía líquida de alto rendimiento  Hiperfenilalaninemia suave o benigna  Isopropil 1‐tio‐β‐D‐galactopiranósido  Intrón (Intervening Sequence)  Kilobases  Constante de disociación  Kilodaltons  Constante de Michaelis‐Menten  Medio Luria Broth 

L‐Phe:   L‐Tyr:   MBP:   MBP‐PAH:  

L‐Fenilalanina  L‐Tirosina  Proteína de unión a maltosa  Proteína de fusión, proteína de unión a maltosa‐fenilalanina  hidroxilasa  MBP‐PAHtet:  Proteína de fusión, proteína de unión a maltosa‐fenilalanina      hidroxilasa tetramérica  MCC:  3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa  MCG:  Metilcrotonilglicinuria  MCM:  Metilmalonil‐CoA mutasa  MeCbl:  Metilcobalamina  MEM:  Medio mínimo esencial de Eagle  Met:  Metionina  MMA:  Acidemia metilmalónica  mRNA:  RNA mensajero  Na‐Hepes:   Hepes 20 mM NaCl 200 mM pH 7.0  NBCS:  Suero de ternera recién nacida  NMD:  Sistema de (nonsense mediated decay)  nt:   Nucleótido   OH‐Cbl :  Hidroxicobalamina  PAH:   Fenilalanina hidroxilasa  PAHtet:   Fenilalanina hidroxilasa tetramérica  pb:   Par de bases  PBS.  Tampón fosfato salino  PC:  Piruvato carboxilasa  PCC:  Propionil‐CoA carboxilasa.  PCR:  Reacción en cadena de la polimerasa  PDB:  Banco de datos de proteínas (Protein Data Bank).  PKU:   Fenilcetonuria  PMSF:  Fenilmetilsulfonil fluoruro  PVDF:  Fluoruro de polivinilo  Pm:  Peso molecular  qRT‐PCR:  Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa  RNA:  Ácido ribonucleico  RT‐PCR:  Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa  S0,5:   Concentración de velocidad semi‐máxima  SDS:  Dodecilsulfato sódico  SDS‐PAGE:   Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS  Vida media  t1/2 :   TAE:  Tris acetato‐EDTA  TBE:  Tris borato‐EDTA  TCA:  Ácido tricloroacético  Tm:   Temperatura de semidesnaturalización 

TNT:  Tris:  Vmax:   wt:  

Sistema transcripción‐traducción acoplada  Tris (hidroximetil) aminometano  Velocidad máxima o limitante  Salvaje o normal 

   

Algunos  términos  ingleses,  ampliamente  utilizados  en  Biología  Molecular  y  sin clara traducción en castellano, se presentan en cursiva. 

                                   

ÍNDICE 

 

1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1    1.1. ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH) .......................... 2    1.2. RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ............................................................. 5    1.2.1. FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA  (BH4) ................................................................................................................ 7  1.2.1.1. Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa .................... 10  1.2.1.2. El cofactor tetrahidrobioterina ....................................................... 12    1.2.2. ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A  COBALAMINA ............................................................................................ 14  1.2.2.1. Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina  adenosiltransferasa (ATR)............................................................... 15    1.2.3. ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y  RESPUESTA A  BIOTINA........................................................................... 18  1.2.3.1. Estructura y función de la propionil‐CoA carboxilasa y  metilcrotonil‐CoA carboxilasa........................................................ 21  1.2.3.2. El cofactor biotina............................................................................. 21    1.3. SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS ................................................... 24   

2 OBJETIVOS ............................................................................................................ 26   

3 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 28    3.1. MATERIALES.......................................................................................................... 29  3.1.1. Reactivos y aparatos..................................................................................... 29  3.1.2. Material biológico......................................................................................... 30  3.1.2.1. Pacientes.............................................................................................. 30  3.1.2.2. Líneas celulares establecidas................................................................ 31  3.1.2.3. Cepas bacterianas ................................................................................ 31  3.1.2.4. Vectores plasmídicos............................................................................ 31    3.2. MÉTODOS................................................................................................................ 31  3.2.1. Tratamiento de ácidos nucleicos ................................................................ 31  3.2.2. Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) ... 35  3.2.3. Expresión y purificación de proteínas en E. coli ...................................... 35  3.2.3.1. Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH............ 35 

3.2.3.2. Expresión y purificación de la proteína hATR.................................... 36  3.2.4. Cromatografía en gel ................................................................................... 38  3.2.5. Electroforesis, transferencia  y detección de proteínas ........................... 38  3.2.5.1. Electroforesis, transferencia e  inmunodetección de la proteína   PAH .................................................................................................... 38  3.2.5.2. Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante  marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina ............................ 39  3.2.6. Ensayos enzimáticos .................................................................................... 39  Actividad fenilalanina hidroxilasa ...................................................... 39  3.2.6.1. Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa ............................. 40  3.2.6.2. Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA  carboxilasa ........................................................................................... 41  3.2.7. Síntesis in vitro  y pulso caza de las proteínas PAH ............................... 42  3.2.8. Cultivo celular............................................................................................... 43  3.2.8.1. Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B ............................ 43  3.2.8.2. Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en  fibroblastos........................................................................................... 44  3.2.9. Medida de pterinas ...................................................................................... 44  3.2.10. Soporte informático...................................................................................... 45   

4 RESULTADOS ..................................................................................................... 46    4.1. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA .................................................................................................................................... 47  4.1.1. Identificación de mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en  pacientes fenilcetonúricos españoles......................................................... 47  4.1.2. Expresión de proteínas PAH mutantes implicadas en la respuesta   a BH4 .............................................................................................................. 50  4.1.2.1. Análisis cinéticos................................................................................. 51  4.1.2.2. Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la   estabilidad de las  proteínas PAH  normal y mutantes.................................................... 53  4.1.3. Efecto de la BH4 sobre la transcripción y traducción del gen PAH...... 57    4.2. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12)  EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA ................................................ 61  4.2.1. Expresión de proteínas mutantes implicadas en respuesta in vitro   a B12; Análisis cinéticos............................................................................... 61    4.3. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA  PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA........................................... 66   

1

4.4. TERAPIAS MODULADORAS DE  MUTACIONES DE SPLICING EN  ACIDEMIA PROPIÓNICA.................................................................................... 71  4.4.1. Análisis del efecto de drogas sobre mutaciones de splicing    que producen niveles detectables de transcritos  normales................... 71  4.4.2. Análisis del efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la   inclusión aberrante de pseudoexones. ...................................................... 73   

5 DISCUSIÓN ........................................................................................................... 77    5.1. RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ........................................................... 78  5.1.1. Respuesta a tetrahidrobioterina en fenilcetonuria .................................. 78  5.1.2. Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada................. 84  5.1.3. Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en   metilcrotonilglicinuria ................................................................................. 86    5.2. TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN  ACIDEMIA PROPIÓNICA.................................................................................... 88  5.2.1. Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen niveles  detectables de transcritos normales........................................................... 88  5.2.2. Efecto de la terapia con oligonucleótidos sobre mutaciones de splicing  que producen inclusión de pseudoexones................................................ 89 

6 CONCLUSIONES .............................................................................................. 93   

7 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 95   

8 PUBLICACIONES ........................................................................................... 109   

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1. INTRODUCCIÓN 

1.1 ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH)    Etimológicamente  el  origen  de  la  palabra  metabolismo  procede  del  griego  metabolé  (μεταβολισμος)  que  significa  cambio,  transformación.  El  metabolismo  es  el  conjunto  regulado  y  coordinado  de  reacciones  químicas  que  tienen  lugar  en  un  organismo vivo. Las enfermedades metabólicas son aquellas patologías causadas por  alteraciones adquiridas o congénitas en las proteínas implicadas en estas reacciones.  Cuando  el  defecto  es  hereditario  hablamos  de  enfermedades  metabólicas  hereditarias (EMH).    El  análisis  sistemático  de  los  errores  innatos  del  metabolismo  lo  inició Garrod (Fig. 1), con sus estudios sobre alcaptonuria, observó que los  pacientes  con  esta  enfermedad  excretaban  grandes  cantidades  de  ácido  homogentísico  y  determinó  que  esta  acumulación  era  debida  a  una  alteración  en  una  enzima  del  metabolismo  de  la  tirosina  (Garrod  1908).  Además  determinó  que  la  herencia  de  la  enfermedad  se  podía  explicar  según  las  leyes  de  Mendel.  Garrod  definió  el  concepto  de  que  Figura 1: determinadas  enfermedades  se  producen  debido  al  fallo  o  ausencia  de  A. Garrod  una enzima que cataliza un paso específico de una ruta metabólica     Las  EMH  representan  en  su  raíz  inicial,  alteraciones  en  el  material  genético  (DNA),  cuando  se  altera  un  gen  (mutación),  el  patrón  de  su  producto  génico  específico  puede  ser  dañado,  producir  la  pérdida  de  sus  funciones  y  como  consecuencia  alterar  la  homeostasis  fisiológica  (patogénesis)  induciendo  las  manifestaciones  clínicas  y  el  fenotipo  (enfermedad).  Las  alteraciones  homeostáticas  más  comunes  que  se  presentan  en  las  enfermedades  metabólicas  hereditarias  se  deben  a  fenómenos  por  acúmulo  de  sustrato  (y  derivados  de  este)  y/o  fenómenos  por  defecto  del  producto  que  deja  de  metabolizarse.  Las  diferencias  en  las  manifestaciones  fenotípicas  dependen  del  grado  de  afectación  del  gen,  del  tipo  y  función  del  producto  génico  que  queda  alterado,  de  eventos  post‐traducción,  factores celulares, genes situados en otros loci y factores ambientales y estocásticos,   por  lo  que  las  EMH  se  comportan  frecuentemente  como  caracteres  complejos  (Pàmpols Ros 2006).    Las  EMH  se  heredan  en  forma  monogénica:  el  60%  en  forma  autosómica  recesiva,  el  20%  autosómica  dominante  y  el  12%  ligada  al  X.  Alrededor  de  un  8%  están relacionadas con alteraciones en el genoma mitocondrial (Blau et al. 2001).     Las  frecuencias  individuales  de  las  EMH  son  muy  bajas,  por  lo  que  son  consideradas  enfermedades raras (definidas  según European Organisation  for Rare  Disease (EURORDIS) y según la Unión Europea (UE) como  aquellas que afectan a  menos de 1 individuo cada 2000), sin embargo debido a que se han descrito mas de 

2

500 EMH  diferentes y se reportan nuevas casi continuamente en su conjunto afectan  a un número elevado de individuos.    Las dos características definitorias de las EMH, su gran diversidad y su baja  frecuencia  individual,  determinan  que  tanto  el  diagnóstico,  el  tratamiento  como  el  análisis  bioquímico‐molecular  sean  complejos.  La  capacidad  para  reconocer  y  diagnosticar  EMH  se  ha  incrementado  enormemente  debido  al  desarrollo  de  la  tecnología  analítica,  el  conocimiento  bioquímico  en  general  y  el  desarrollo  de  la  biología celular y de la tecnología del DNA.     En general las EMH debutan en el periodo neonatal, siendo muy característico  una sintomatología clínica aguda (convulsiones, insuficiencia  hepática,  insuficiencia  cardíaca,  hipotonía,  letargia…)  en  recién  nacidos  tras  un  periodo  de  normalidad.   Para  algunas  enfermedades  en  las  que  existe  un  intervalo  de  tiempo  cercano  a  un  mes  entre  la  presencia  de  alteraciones  bioquímicas  y  el  comienzo  de  la  sintomatología  clínica  es  posible  la  identificación  del  transtorno  metabólico  en  el  periodo  neonatal  y  en  fase  preclínica,  pudiéndose  instaurar  un  tratamiento  y  evitando la sintomatología negativa (la fenilcetonuria es un caso clásico de este tipo  de EMH).    Al  igual  que  la  capacidad  para  reconocer  y  diagnosticar  las  EMH  ha  aumentado en los últimos treinta años, el tratamiento de estas alteraciones también  lo  ha  hecho,  pero  mas  lentamente,  actualmente  el  12  %  de  los  EMH  tienen  tratamiento eficaz, un 54 % obtiene un beneficio en grado variable y en un 34 % no  hay respuesta a ningún tratamiento (Scriver and Treacy 1999).    Debido a que en las EMH el defecto primario reside en el DNA la posibilidad  de  obtener  información  clínica  relevante  sobre  la  severidad  fenotípica  de  la  enfermedad a partir del genotipo del paciente es el motor que impulsa los cada vez  más numerosos análisis genéticos. En estas y otras enfermedades genéticas, una vez  identificados  los  genes  involucrados  y  las  mutaciones  patogénicas,  la  investigación  se  centra  en  el  estudio  de  los  mecanismos  moleculares  responsables  del  defecto,  tanto a nivel de DNA y RNA (genómico y transcripcional) como a nivel de proteína,  en  la  estabilidad  y/o  funcionalidad  de  las  mismas.  Estas  investigaciones  proporcionan una base científica para establecer la relación genotipo‐fenotipo y para  el desarrollo de terapias específicas de mutación en lo que se conoce como medicina  genómica.    En la mayoría de las EMH un porcentaje muy elevado de mutaciones originan  un  cambio  de  aminoácido  (representan  cerca  del  50%  de  los  cambios  registrados  según  la  Human Gene Mutation Database (HGMD  ®)), en este caso, así como para  mutaciones  que  generan  deleciones  en  fase,  codones  de  parada  de  traducción  cercanos al original y cambios puntuales que afectan al splicing, es difícil predecir su  3

efecto. Además para el caso de pacientes con mutaciones de cambio de aminoácido la  heterogeneidad  es  muy  elevada  y  por  lo  tanto  la  relación genotipo‐fenotipo  es  más  compleja, ya que es necesario valorar la contribución de cada variante alélica.    Frecuentemente  se  han  empleado  para  el  análisis  funcional  de  las  variantes  alélicas de los genes distintos sistemas de expresión eucariotas (células de mamífero),  procariotas (fundamentalmente Escherichia coli (E. coli)) y libres de células (Desviat et  al.  2003b;  Waters  2003)  todos  ellos  basados  en  la  expresión  de  los  correspondientes  cDNA  clonados  en  vectores  adecuados.  Estos  sistemas  permiten  determinar  las  propiedades bioquímicas, catalíticas y estructurales de las proteínas. Se ha observado  que  las  mutaciones  missense  producen  fundamentalmente  defectos  en  la  estabilidad  (mutaciones estructurales) o defectos en las propiedades catalíticas (Cohen and Kelly  2003; Gregersen et al. 2000; Pey et al. 2003).     Este  conocimiento  ha  permitido  el  desarrollo  de  diferentes  estrategias  terapéuticas, como el uso de dosis farmacológicas de cofactores, uso de  chaperonas  químicas o uso de drogas reguladoras de la expresión génica que producen diversos  efectos sobre las proteínas mutantes. Algunos de estos efectos son: estabilización de  las  proteínas  mutantes  (uso  de  chaperonas  específicas  de  sitio  activo  (1‐ deoxigalactonojirimicin)  en  la  enfermedad  de  Fabry  (Fan  and  Ishii  2007)),  la  compensación  de  defectos  cinéticos  (uso  de  biotina  en  defectos  de  holocarboxilasa  sintetasa  (Suzuki  et  al.  1996))  o  aumento  de  la  transcripción  o  traducción  de  las  proteínas mutantes. (uso de bezafibrato en defectos de la acil CoA dehidrogenasa de  cadena muy larga (Djouadi et al. 2005)).    Aproximadamente  un  15%  de  las  mutaciones  puntuales  asociadas  a  estas  enfermedades afectan al procesamiento del mRNA. El conocimiento que el efecto que  cada  mutación  produce,  no  sólo  referente a  su  severidad  sino  también  en  términos  de  su  mecanismo  de  acción,  obtenida  de  diversos  estudios  de  expresión  como  la  utilización  de  vectores  apropiados  en  los  que  se  introducen  regiones  discretas  del  DNA genómico para generar los llamados minigenes (Clavero et al. 2004; Vockley et  al.  2000)  ha  abierto  nuevas  y  prometedoras  vías  terapéuticas  genéticas,  como  es  la  inhibición  de  la  expresión  de  determinados  transcritos  mutantes  con  oligonucleótidos antisentido (AONs) y RNA de interferencia (RNAi) o la utilización  de efectores transcripcionales y drogas que modulan la expresión de mutaciones de  splicing (Hims et al. 2007; Takeshima et al. 2006; Wood et al. 2007).    Las cuatro enfermedades estudiadas en este trabajo (fenilcetonuria, acidemia  propiónica,  metilcrotonilglicinuria  y  acidemia  metilmalónica  aislada)  pertenecen  al  grupo  de  enfermedades  metabólicas  hereditarias  que  ocasionan  intoxicación  aguda  (Saudubray et al. 2006).   

4

Los distintos estudios realizados sobre los genes asociados a estas cuatro EMH  ha  revelado  que  desde  el  punto  de  vista  genético  las  mutaciones  son  mayoritariamente  mutaciones  de  cambio  de  aminoácido  seguidas  de  pequeñas  deleciones  en  fase  y  de  mutaciones  que  afectan  al  proceso  de  splicing  (http://www.pahdb.mcgill.ca(Perez  et  al.  2003;  Ugarte  et  al.  1999;  Yang  et  al.  2004a;  Yang et al. 2004b).    La restricción proteica es la base del tratamiento a largo plazo en estas cuatro  EMH  y  su  finalidad  es  eliminar  la  formación  de  las  sustancias  tóxicas  que  se  acumulan y sus precursores,  esta estrategia terapéutica incluye la administración de  drogas que unen los metabolitos acumulados y favorecen su excreción.  Las dietas necesarias en estos tratamientos conllevan una dura carga social y  psicológica  para  los  pacientes  y  sus  familias, además en  algunos  casos  no  son  suficientes  para  una  mejora  significativa  de  los  individuos  por  lo  que  se  hace  necesaria  la  búsqueda  de  nuevas  terapias  eficaces  que  mejoren  la  vida  de  estos  enfermos.  En base al conocimiento de los efectos que las mutaciones producen a nivel de  proteína,  RNA  y  DNA  se  están  postulando  diversas  aproximaciones  terapéuticas  como  terapias  alternativas  para  estas  enfermedades,  entre  ellas  la  suplementación  con  el  cofactor  de  la  enzima  implicada  y  el  uso  de  oligonucleótidos  y  drogas  moduladoras de splicing.     

1.2 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH    En la actualidad se están utilizando dosis altas de cofactores en el tratamiento  de numerosas enfermedades genéticas humanas. La investigación en este campo está  siendo potenciada por su gran relevancia clínica ya que posibilita la implantación de  tratamientos individualizados.    Se  calcula  que  un  tercio  de  las  mutaciones  en  los  genes  asociados  a  enfermedades  hereditarias  humanas  producen  una  disminución  en  la  afinidad  (aumento  de  la  constante  de    Michaelis‐Menten  (Km))  por  el  cofactor  o  por  el  sustrato.  El  uso  de  niveles  terapéuticos  de  cofactores  aumenta  las  concentraciones  intracelulares de estos compuestos y sus derivados, compensando así la baja afinidad  de  las  enzimas  defectuosas  por  ellos  y  recuperando  la  actividad  (Ames  et al.  2002).  En  un  principio  se  pensaba  que  este  era  el  único  mecanismo  implicado  en  la  respuesta a cofactores.     Para  otros  dos  tercios  de  genotipos  asociados  a  enfermedades  hereditarias  humanas  el  defecto  responsable  de  la  enfermedad  no  es  un  defecto  de  Km.  La  respuesta a dosis farmacológicas de cofactores está asociada no sólo a mutaciones de  Km  sino  a  otras  que  presentan  una  afinidad  normal  por  el  cofactor,  por  lo  que  se  5

postulan otros mecanismos llevados a cabo por el cofactor como son la estabilización  (chaperona  química)  de  proteínas  mutantes  o  la  alteración  en    el  patrón  de  transcripción y traducción. Para algunos de estos cofactores ya se ha demostrado su  efecto regulador a nivel genético (Chauhan and Dakshinamurti 1991; Dakshinamurti  and  Li  1994;  Hyland  and  Munk‐Martin  2001)  siendo  muy  interesante  el  estudio  de  estos posibles mecanismos.    Los  cofactores  asociados  a  las  cuatro  enfermedades  estudiadas  en  este  trabajo  y  que  en  algunas  de  ellas  ya  están  siendo  utilizados  como  terapia  son,  la  tetrahidrobiopterina  (6(R)‐L‐eritro‐5,6,7,8–tetrahidrobiopterina,  BH4)  en  fenilcetonuria,  la  biotina  en  acidemia  propiónica  y  metilcrotonilglicinuria  y  la  hidroxicobalamina (OHCbl)  en acidemia metilmalónica aislada. 

6

1.2.1 FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4)    La  fenilcetonuria  (PKU;  OMIM:  261600)  es  una  enfermedad  metabólica  humana  con  base  genética  que  se  hereda  con  carácter  autosómico  recesivo  y  cuyo  origen  es  la  deficiencia  en  la  enzima  fenilalanina  hidroxilasa  (fenilalanina  4‐ monooxigenasa, PAH, EC.1.14.16.1). El defecto de esta proteína genera un aumento  patológico  en  la  concentración  de  fenilalanina  en  todos  los  fluidos  fisiológicos.  La  incidencia de esta enfermedad es dependiente de la zona geográfica de estudio, para  Europa  es de 1:10000  recién nacidos  (Scriver and Kaufman 2001) y la estimación de  portadores  por  lo  tanto  es  1  de  cada  50  individuos.  Algunas  características  de  la  enfermedad se encuentran recogidas en la Tabla 1.    La fenilalanina hidroxilasa es una monooxigenasa  de función mixta que lleva  a cabo la parahidroxilación de L‐fenilalanina a L‐tirosina. En la reacción interviene el  oxígeno molecular, como co‐sustrato y el cofactor BH4, como donador de electrones  (Fig. 2).  

L-Phe

PAH

+ O2

+H3N -OOC

-OOC

O

N

SR H N

NAD(P)+

N H

NAD(P)H

2 NAD(P)+

DHPR

2 NAD(P)H O

O

OH

H N

H2O

N

-O

6-PTP

PTPS

O

O

O

P

O P

O P

-O

-O

-O

O N H2N

H N

N

OH

PCD

N H

q-BH2 O

OH

O

O

O P O P O P OOH

N

N H

OH

H2N

O N H

N

4-OH-BH4

N

O

OH

H 2N

OH

HN N

H O

N OH

H2N

H

OH

H N

HN

BH4

OH

+H3N

H O

H 2N

L-Tyr

-O

-O

O

GTPCH

-O

7,8-DHNP

L-Phe

+

-

N H

HCOOH

2 H 2O

BH 4

N

HN

O -O

O

O

H2N

P O P O P O CH2 -O

-O

N

N

O

-O

OH

OH

GTP

Figura 2. Esquema del ciclo catalítico de la fenilalanina hidroxilasa (PAH) en presencia del cofactor  natural BH4 (en rojo), en el que se incluyen las rutas principales de biosíntesis de BH4 (en azul) y de  reducción  del  cofactor  oxidado  (en  verde).  Se  indica  la  regulación  ejercida  por  L‐Phe  (+)  y  BH4  (‐)  sobre  la  etapa  limitante  en  la  biosíntesis  de  BH4.  Las  enzimas  implicadas  en  estos  procesos  se  muestran en recuadros.  Abreviaturas: BH4.‐ (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina; 4‐OH‐BH4.‐ 4α‐ carbinolamin‐tetrahidrobiopterina;  q‐BH2.‐  7,8‐dihidrobiopterina  quinoinoide;  6‐PTP.‐  6‐piruvoil‐ 5,6,7,8‐tetrahidropterina;  7,8‐DHNP.‐  7,8‐dihidroneopterina‐trifosfato;  PCD.‐  4α‐carbinolamin‐ tetrahidropterina  deshidratasa;  DHPR.‐  dihidropteridina  reductasa;  SR.‐  sepiapterina  reductasa;  PTPS.‐6‐piruvoil‐5,6,7,8‐tetrahidropterina sintasa; GTPCH.‐ GTP ciclohidrolasa I 

7

Tabla 1: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA   FENILCETONURIA (OMIM 261600)  CLÍNICA 

BIOQUÍMICA   

•

En los casos más graves, no tratados, se produce alteración  en las funciones y desarrollo cerebrales  

™ Hiperfenilalaninemia   ™ Elevación de metabolitos derivados de la fenilalanina: ácido  mandélico, o‐hidroxifenilacético, fenilpirúvico, fenilláctico    

DIAGNÓSTICO    ¾ ¾ ¾ ¾        

Niveles de fenilalanina y otros aminoácidos en plasma.  Análisis de pterinas, aminoácidos y ácidos orgánicos en orina  Medida de actividad DHPR en sangre total o en papel.  Análisis de mutaciones en el gen PAH.   GEN 

cDNA 

PAH (GenBank:  NM_000277) ,  PAH (GenBank: NM_000277)  171 Kb,  2,4 Kb, codifica para una  13 exones  proteína de 51,7 KDa.   12q22‐q24.1 

GENÉTICA  Mas  de  500 mutaciones  descritas:  63% de cambio  de  aminoácido,  13%  pequeñas deleciones  y  11% afectan al procesamiento del mRNA (http://www.pahdb.mcgill.com).  El mecanismo patogénico más frecuente parece ser la inestabilidad conformacional (Cohen and  Kelly 2003; Desviat et al. 2003b; Gamez et al. 2000).  TRATAMIENTO 

El tratamiento clásico es una restricción en la dieta del aminoácido fenilalanina.  Dosis farmacológicas de tetrahidrobiopterina  o derivados (en fase clínica dosis farmacológicas de sapropterina)(Levy et al. 2007)  En fase de estudio: Terapia de reemplazamiento enzimático con la enzima recombinante fenilalanina amonio‐liasa (PAL) y terapia génica. 

8

El  sistema  de  hidroxilación  de  la  fenilalanina  a  tirosina  es  también  dependiente  de  otra  serie  de  enzimas  implicadas  en  la  regeneración  y  síntesis  del  cofactor  BH4    (Fig  3).  La  regeneración  del  BH4  desde  la  forma  oxidada  pterin‐4α‐ carbinolamina  mediante  su  deshidratación  y  posterior  reducción  es  llevada  a  cabo  por  las  enzimas  pterin‐4α‐carbinolamina  dehidratasa  (PCD)  y  dihidropteridina  reductasa (DHPR). Por otro lado la  ruta de  biosíntesis del  BH4,  a  partir de  GTP, es  llevada  a  cabo  por  tres  enzimas  GTP  ciclohidrolasa  I  (GTPCH),  6‐piruvoil‐5,6,7,8‐  tetrahidropterina  sintasa  (PTPS)  y  sepiapterina  reductasa  (SR).  Existe  además  una  ruta  de  síntesis  minoritaria  a  partir  de  sepiapterina  en  la  que  está  implicada  la  sepiapterina  reductasa  y  la  DHFR  (dihidrofolato  reductasa).  El  principal  punto  de  regulación  de  la  síntesis  del  cofactor  es  la  primera  enzima  de  la  ruta,  la  GTPCH,  siendo modulada positivamente por niveles elevados de L‐Phe y negativamente por  niveles elevados de BH4. Aunque el defecto en cualquiera de las actividades de estas  rutas puede conducir a una hiperfenilalaninemia, las mutaciones en el gen de la PAH  son  la  causa  más  frecuente  de  la  enfermedad,  representando  un  98  %  de  los  casos  descritos (Scriver and Kaufman 2001; Thony et al. 2000)    El diagnóstico neonatal de la fenilcetonuria y la implantación temprana de la  restricción proteica permiten una prevención total de la sintomatología clásica de la  enfermedad recomendándose una continuación durante toda la vida de la dieta y en  especial en el caso de madres afectadas por la enfermedad, cuyos fetos pueden sufrir  hiperfenilalaninemia materna.      Los  pacientes  con  fenilcetonuria  por  defectos  en  el  gen  PAH  se  clasifican  en  grupos  fenotípicos  en  base  a  la  ingesta  diaria  de  L‐Phe  que  toleran  para  mantener  niveles  plasmáticos  en  un  rango  terapéutico  (Scriver  and  Kaufman  2001)  normalmente por debajo de 400 μM y en base a los niveles de L‐Phe en sangre en el  momento  del  diagnóstico.  En  general  se  distinguen  4  grupos  fenotípicos  PKU  (Desviat et al. 1997) (Tabla 2). 

Tabla  2.  Clasificación  de  los  pacientes  PKU  en  función  de  los  niveles  de  L‐Phe  plasmáticos y las cantidades diarias de L‐Phe toleradas en la dieta. Frecuencia de  fenotipos en la población española.  Phe en plasma a 

Tolerancia a la Phe b 

Frecuenciac 

>1800 μM 

1000 Ci/mmol) y el isótopo radiactivo NaH[14C]O3, con una  actividad  de  56  mCi/mmol  NaHCO3  y  2  mCi/ml  fue  suministrada  por  Amersham  Pharmacia Biotech.     Los  anticuerpos  utilizados  fueron  anticuerpo  monoclonal  comercial  anti‐ tirosina, anti‐triptófano y anti‐fenilalanina hidroxilasa PH8 (Pharmingen), anticuerpo  secundario de cabra anti‐ratón conjugado a peroxidasa (Nordic y Santa Cruz), Anti‐ Flag  M2  (Promega)  y  anticuerpo  secundario  antiratón  Ig  conjugado  a  peroxidasa  (Santa Cruz).     Los  tubos  de  filtración  empleados  para  concentrar  las  muestras  de  proteína  fueron obtenidos de Amicon.     La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) fue realizada usando los  sistemas  suministrados  por  Shimadzu  (Serie  VP)  y  Agilent  Technologies  (Serie  HP  1100), las columnas procedentes de Whatman y Agilent Technologies, y los reactivos  de alto grado de pureza (analytical grade o HPLC grade) de Merck, Scharlau y DBH  laboratories.     En  el  cultivo  celular  se  emplearon  los  siguientes  reactivos:  medio  mínimo  esencial de Eagle (MEM) y glutamina de la firma comercial GibcoBRL, suero fetal de  ternera recién nacida (NBCS), suero fetal bovino (FBS) y suero fetal bovino dializado  (FBS  dializado)  de  SIGMA.  Los  antibióticos  fueron  suministrados  por  Antibióticos  29

S.A. La tripsina y los medios de comprobación se obtuvieron de Difco Laboratorios y  la biotina de Sigma.         Promega  e  Invitrogen  proporcionaron  los  productos  necesarios  para  la  purificación  de  RNA  total.  La  purificación  de  productos  de  PCR  y  de  DNA  plasmídico  a  baja  y  alta  escala  se  llevó  a  cabo  con  los  productos  de  las  casas  comerciales Promega, Quiagen y Mbiotech. Las firmas comerciales GENTRA Systems,  Promega,  Invitrogen  proporcionaron  los  productos  necesarios  para  la  extracción  de  DNA genómico.  Los  reactivos  y  enzimas    empleados  en  las  reacciones  de  PCR,  RT‐PCR,  RT‐ PCR tiempo real y mutagénesis dirigida fueron obtenidos de las firmas comerciales  Perkin‐Elmer, Applied Biosystem, Invitrogen, Roche y Stratagene.  Las  reacciones  de  secuenciación  cíclica  directa  se  llevaron  a  cabo  con  productos  de  Promega  y  Applied  Biosystems.  Los  oligonucleótidos  sintéticos  proceden  de  la  firma  comercial  Isogen  y  los  oligonucleótidos  antisentido  tipo  morfolinos fueron suministrados por la casa comercial GeneTools.    Las  enzimas  de  restricción  fueron  proporcionadas  por  Roche  Diagnostics,  New England Biolabs y Promega.       Los  reactivos  de  purificación  de  proteínas  y  los  utilizados  para  Western  Blot  son de las casas comerciales: Amersham Pharmacia Biotech, Millipore, New England  Biolabs, Nordic Inmunology, Perkin Elmer, Pierce, Sigma y Stratagene. 

3.1.2 Material biológico    Pacientes    Se han incluido en el estudio 31 pacientes fenilcetonúricos españoles que han  sido sometidos a pruebas de sobrecarga con BH4 en un estudio en colaboración con  la Dra. Martínez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal).    El  estudio  del  efecto  de  compuestos  moduladores  de  splicing  incluyó  3  pacientes  diagnosticados  de  acidemia  propiónica  y  correspondientes  al  grupo  de  complementación  PCCA,  los  tres  de  origen  turco  enviados  por  los  Drs.  Adrian  C.  Sewell, T. Parlowsky y Art. Warman, al laboratorio para su diagnóstico genético.  El  estudio  del  efecto  de  la  terapia  con  oligonucleótidos  antisentido  incluyó  2  pacientes  diagnosticados de acidemia propiónica, uno correspondiente al grupo de  complementación  PCCA  y  el  otro  correspondiente  al  grupo  de  complementación  PCCB, ambos de origen turco enviados por el Dr. Gülden Gokcay al laboratorio para  su diagnóstico genético.  30

  Las muestras de los pacientes utilizados incluyen fibroblastos de piel, sangre  total periférica y/o muestras de sangre impregnada en papel.  Líneas celulares establecidas      La  línea  celular  de  hepatoma  utilizado  para  este  estudio  fue  Hep  3B,  cedida  por el Dr. S. R. de Córdoba.    La  línea  celular  de  linfoblastos  utilizada  fue  MCR  de  European  Collection  of   Cell Cultures (ECACC). 

  Cepas bacterianas       Las  estirpes  de  E.  coli  utilizadas  en  este  estudio  fueron  las  siguientes:  XL1‐ Blue, DH5α, JM109, TB1 y BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen)    Vectores plasmídicos      Los plásmidos utilizados en este estudio fueron: pMALc2‐PAH wt (De Lucca  et al. 1998), R68S (Zekanowski et al. 2000) ,V388M (Gamez et al. 2000),  F39L, E178G,  A300S,  A313T,  A373T  y  Y414C  (enviados  por  el  Dr.R.C.Stevens),  pFLAG‐CMV  (Sigma), pET 41a‐hATR (enviado por la Dr. R. Banerjee),  pGL3‐ luciferasa y pCMV  PRC β‐galactosidasa.

3.2 MÉTODOS    3.2.1 Tratamiento de ácidos nucleicos      Para  la  purificación  de  DNA  plasmídico  se  empleó  el  sistema  comercial  de  extracción de DNA plasmídico Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification system de  Promega.  En  las  purificaciones  a  gran  escala  se  empleó  el  sistema  de  extracción  QUIAGEN® Plasmid Maxi kit de Quiagen.   

 

Para la purificación de RNA celular se emplearon los sistemas comerciales de  extracción  de  RNA  Promega®  SV  total  RNA  Isolation  System  y  Invitrogen  “TriPure  Isolation Reagent”.    El proceso de retotranscripción (RT) se llevó a cabo a partir de 1 μg de RNA  total, utilizando los reactivos suministrados por Invitrogen (SuperScriptTM First‐Strand  Síntesis System for RT‐PCR) y siguiendo las recomendaciones del proveedor.   

31

Para  la  amplificación  de  DNA  genómico  y  de  cDNA  obtenido  tras  RT,  mediante  el  proceso  de  PCR  se  utilizaron  los  reactivos  y  las  instrucciones  descritas  por  las  firmas  comerciales  Perkin  Elmer  (AmpliTaq®  DNA  polimerasa)  e  Invitrogen  (Platinum® Taq DNA polimerasa). En las amplificaciones realizadas con los productos  de Perkin Elmer, se añadió la enzima tras incubar la mezcla de amplificación durante  15 minutos a 95ºC  (hot start).  

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 100  μl  ó  50  μl,  con  una  concentración  de  MgCl2  de  1,5  mM,  100  pmoles  de  cada  oligonucleótido, 2,5 U Taq polimerasa y entre 0,5‐1 μg de DNA genómico o 200‐500  ng  de  cDNA  obtenido  tras  RT.  La  temperatura  de  hibridación  osciló  entre  48‐55  °C  según  fuera  la  temperatura  de  fusión  o  melting  del  par  de  oligonucleótidos  empleados en cada caso.  Las  amplificaciones  se  llevaron  a  cabo  en  un  termociclador  Peltier  Thermal  Cycler PTC‐200 (MJ Research).    Los  fragmentos  exónicos  que  comprenden  toda  la  región  codificante  más  las  regiones  intrónicas  adyacentes  a  cada  exón  (secuencias  consenso  donadoras  y  aceptoras implicadas en el procesamiento del premRNA o splicing) y los fragmentos  de  cDNA  de  los  distintos  genes  estudiados  fueron  amplificadas  usando  los  oligonucleótidos descritos previamente en el laboratorio (Gravel et al. 1994; Ohura et  al. 1993; Pérez et al. 1994; Richard et al. 1999). Para algunos fragmentos del cDNA del  gen PAH se diseñaron nuevos oligonucleótidos (Tabla 6).  Tabla 6: Oligonucleótidos utilizados en la amplificación del cDNA de PAH  Nombre del   oligo    PAH 10   PAH 13   

Secuencia 5´Æ 3´ 

GGTGCTGGGCTCCTGTCATC   CTCCATCAACAGATTCACAGCT 

PCR   ( pb) 

cDNA PAHa  ENSG00000171759 

377 

1029‐1048  1384‐1405 

a 

Se  muestra  la  localización  de  cada  oligonucleótido  en  la  secuencia  del  cDNA  PAH,  siendo  el  nucleótido +1 la adenosina del ATG iniciador de la traducción. 

Para  la  purificación  de  los  fragmentos  obtenidos  tras  la  amplificación  se  utilizó  el  kit  SpinCleanTM  PCR  Purification  (Mbiotech),  en  el  caso  de  que  la  purificación se realizara a partir de los fragmentos en geles de agarosa se utilizó PCR  Preps DNA Purificación Resin (promega) y QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen).    La  secuenciación  cíclica  directa  se  realizó  empleando  el  producto  Big  DyeTM    Terminador  v3.1  Cycle  Sequencing  kit  (Applied  Biosystem)  junto  con  oligonucleótidos  sintéticos  y  los  productos  de  secuenciación    se  analizaron  en  el  secuenciador capilar ABI Prism ®3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).  32

En  las  reacciones  de  secuenciación  de  productos  amplificados  por  PCR  se  emplearon 300 ng de DNA. La secuenciación de productos amplificados por PCR se  llevó  a  cabo  con  oligonucleótidos  de  igual  secuencia  a  los  empleados  en  las  reacciones de amplificación.    Para  la  qRT‐PCR  del  mRNA  de  la  PAH  y  de  PCCA  se  utilizaron  las  sondas  Taqman  Hs00609359  y  Hs01120554‐ml  respectivamente  suministradas  por  Applied  Biosystems (Taqman Gene Expresión Assays, http://myscience.appliedbisyntesis.com  ),  para  los  mRNAs  de  PCCA,  PCCB,  MCCA,  MCCB  y  HCS  se  utilizaron  sondas  Universal  Probe  y  oligonucleótidos  específicos  diseñadas  usando  el  probeFinder  Software (Universal Probe Library) de Roche Applied Science. La retrotranscripción  se  llevó  a  cabo  con  el  Archive  kit  de  Applied  Biosystems  a  una  concentración  de  síntesis  10  ng  de  RNA/μl  y  siguiendo  las  recomendaciones  del  proveedor.  Para  la   PCR  se  utilizó  la  TaqMan  2X  Universal  PCR  Master  Mix  No  Amperese  ONG  (Applied Biosystems).  La  amplificación  y  análisis  se  realizó  en  un  aparato  ABIPRISM  7900  HT    y  utilizando el programa SPS2.1 o SDS software de Applied Biosystems.  La  eficiencia  de  la  amplificación  fue  estandarizada  mediante  la  retrotranscripción  y  posterior  amplificación  en  paralelo  del  mRNA  de  los  genes  constitutivos GAPDH o 18s rRNA.  Para  llevar  a  cabo  la  cuantificación,  una  vez  obtenidos  los  datos  de  crossing  point (Cp) o cycle threshold (Ct) de la PCR a tiempo real tanto  para el gen de interés  como  para  los  constitutivos  se  llevó  a  cabo  el  tratamiento  matemático  para  obtener   finalmente  el  parámetro  (RQ)  relative  quantity  que  nos  permite  comparar  de  forma  cuantitativa  las  cantidades  de  mRNA  en  los  distintos  extractos  celulares,  siendo  calculado según la siguiente fórmula:  RQ = 2‐ ΔΔCt  ; ΔΔCt =  (ΔCt de una muestra ‐ ΔCt  la muestra de referencia)  ΔCt = (Ct del gen de estudio ‐ Ct del gen constitutivo [GAPDH o 18s rRNA])  Para  la  mutagénesis  dirigida  mediante  el  proceso  de  PCR  se  utilizó    el  kit  QuickChangeTMSite Directed Mutagenesis de Stratagene.  La mutación PAH A309V fue introducida en el vector pFLAG‐CMV que porta  la secuencia del cDNA PAH con primers existentes previamente en el laboratorio.    Las mutaciones ATR I96T y R195H fueron obtenidas por mutagénesis dirigida  a  partir  del  cDNA  wt  de  la  hATR  en  el  plásmido  pET  41a  utilizando  los  oligonucleótidos que se detallan en la tabla siguiente. 

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Tabla  7:  Oligonucleótidos  sintéticos  diseñados  para  la  mutagénesis  dirigida  del  cDNA  MMAB  clonado en el vector pET 41a  Mutación 

Nombre del  oligo 

I96T 

MMAB I96Tsense  MMAB I96Tantisense 

R195H 

MMAB R195Hsense  MMAB R195Hantisense 

Secuencia 5´→ 3´ a 

cDNA MMABb  ENSG00000139428 

AGTTCAGCTACTGGGTTTGCTCTG  CAGAGCAAACCCAGTAGCTGAACT 

277‐290  290 ‐277 

GCCGAGAGACATGTGGTGCCTCTTG  CAAGAGGCACCACATGTCTCTCGGC 

574‐598  598‐574 

La base que introduce la mutación en la reacción de mutagénesis dirigida se muestra en negrita.  Se muestra la localización de cada oligonucleótido en la secuencia del cDNA, siendo el nucleótido +1  la adenosina del ATG iniciador de la traducción.  a 

b 

Para  el  clonaje  del  cDNA  de  la  PAH  en  el  vector  pFLAG‐CMV  y  de  las  regiones reguladoras de transcripción y traducción de la PAH en el vector pGL3 las  dianas escogidas fueron NotI y SalI en el primer caso y SacI y HindIII en el segundo.  Estas dianas fueron creadas mediante PCR a partir de DNA genómico o cDNA de la  PAH  clonado  en  el  plásmido  pMALc2‐PAH  utilizando  oligos  que  contenían  la   secuencia de corte para cada enzima y cuya secuencia se describe en la Tabla 8. De  esta  manera  se  obtuvieron  los  mutantes  para  PAH  Y414C  y  V388M  en  el  vector  pFLAG‐CMV y la construcción pGL3‐PrUTRPAH en el vector pGL3. 

Tabla  8:  Oligonucleótidos  sintéticos  diseñados  para  el  clonaje  de  la  región  codificante  del  cDNA  de  la  PAH  y  las  regiones  reguladoras  de  transcripción  y  traducción de la PAH.  Nombre  del  oligo 

Secuencia 5´Æ 3´ 

cPAH1  cPAH2 

TTTTGCGGCCGCGATGTCCACTGCGGTCCTGG  AAAAGTCGACGGCTTTACTTTATTTTCTGGAG 

  PrPAH1    PrPAH5   

TAAAGAGCTCTTAAAACCTTCCAGCAAGGT  TTTAAGCTTCTGGCTCCCCGGGAGT 

cDNA PAHa  ENSG00000171759  +1/+19  +1341/+1361 

‐731 / ‐710  ‐2 / ‐17 

Se  muestra  la  localización  de  cada  oligonucleótido  en  la  secuencia  del  cDNA  PAH,  siendo  el  nucleótido ‐1 el primer nucleótido previo a la  adenosina del ATG iniciador de la traducción y +1 el  nucleótido A del ATG iniciador de la traducción.  a 

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3.2.2 Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE)    El  rastreo  inicial  de  mutaciones  en  el  gen  de  la  PAH  se  realizó  mediante  la  técnica  de  electroforesis  con  gradiente  de  desnaturalización  (DGGE)  según  se  describe  en  (Pérez  et  al.  1997).  Esta  técnica  está  basada  en  las  propiedades  de  desnaturalización  del  DNA,  determinadas  por  su  secuencia,  que  permiten  separar  moléculas de DNA que difieren en una sola base nucleotídica debido a su diferente  migración  electroforética  en  geles  con  gradiente  de  desnaturalización  (Lerman  and  Silverstein 1987).  La  amplificación  se  llevó  a  cabo  utilizando  primers  con  colas  GC  en  su  extremo  5’  ó  3’  terminal  previamente  descritos  y  la  electroforesis  se  desarrolló  en  geles de poliacrilamida al 6 % con un gradiente de desnaturalización del 0 % al 80 %  de urea‐formamida, en los que el 100 % corresponde a una concentración de urea 7 M  y 40 % de formamida. La electroforesis se realizó a 150 V durante 5 h en TAE (0,04 M  Tris‐acetato, 1 mM EDTA, pH 8) a una temperatura constante de 60 °C en un aparato  de la casa CBS Scientific CO.  La presencia de varias bandas debidas a la formación de heteroduplex indica  la  presencia  de  mutaciones  que  fueron  posteriormente  identificadas  por  secuenciación.  3.2.3 Expresión y purificación de proteínas en E. coli    Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH      La expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH se llevó a cabo  esencialmente siguiendo el protocolo descrito por (Martínez et al. 1995). A lo largo de  todo el proceso de purificación se empleó un tampón Hepes 20 mM  NaCl 200 mM  pH 7.0 (Na‐Hepes).    El  cultivo  de  las  cepas  de  E.  coli  transformadas  con  los  plásmidos  pMALc2‐ PAH  normal  y  mutantes  se  realizó  en  medio  LB  en  presencia  de  ampicilina  (0,1  mg/ml). Cuando estos cultivos alcanzaron una A600nm≈ 0.6, se indujo la expresión de  las  proteínas  MBP‐PAH  normal  y  mutantes,  mediante  la  adición  de  IPTG  1  mM,  adicionándose  también  0,2  mM  de  sulfato  amónico  ferroso  (FAS)  como  fuente  del  cofactor metálico necesario para la actividad PAH.    Tras  ser  incubados  los  cultivos  a  37ºC  durante  16‐21  h,  las  células  fueron  sedimentadas  por  centrifugación,  resuspendidas  en  tampón  Na‐Hepes  en  presencia  de  0,2  mM  Pefabloc®  (como  inhibidor  de  proteasas)  y  posteriormente  lisadas  por  sonicación.  El  extracto  proteico  soluble  fue  obtenido  tras  centrifugación.  Las  proteínas  de  fusión  totales  (MBP‐PAH)  normal  y  mutantes  fueron  purificadas  mediante cromatografía de afinidad en columnas de amilosa (New England Biolabs),  equilibradas  en  tampón  Na‐Hepes.  La  elución  se  realizó  empleando  una  disolución  10  mM  de  maltosa  en  Na‐Hepes.  Las  proteínas  de  fusión  totales  así  obtenidas  se  35

mantuvieron a 4ºC hasta su utilización o fueron congeladas inmediatamente después  de la purificación en N2 líquido y almacenadas a ‐80ºC.  La  separación  de  las  distintas  formas  oligoméricas  para  obtener  la  forma  tetramérica  presente  en  la  proteína  de  fusión  total  (MBP‐PAH)  purificada  de  E.  coli  fue  realizada  mediante  cromatografía  de  exclusión  molecular  a  4ºC  usando  la  plataforma integrada AKTA®PRIME (Amersham Pharmacia Biotech) para desarrollar  y monitorizar la separación cromatográfica.        El  desarrollo  cromatográfico  se  realizó  a  4ºC,  empleando  como  fase  móvil  tampón  Na‐Hepes  previamente  desgasificado,  usando  un  flujo  de  0,38  ml/min,  el  volumen  de  muestra  aplicado  fue  de  2  ml,  tomándose  fracciones  del  eluido  cada  5  min  (≈  1,9  ml/fracción).  La  detección  se  realizó  espectrofotométricamente  a  280  nm  usando  una  célula  de  flujo  continuo.  Una  vez  eluida  la  forma  tetramérica,  las  fracciones  correspondientes  (según  indicó  la  señal  espectrofotométrica  registrada)  fueron  concentradas  usando  tubos  CENTRIPLUS  YM‐50  (Amicon)  y  congeladas  en  N2 líquido, almacenándose posteriormente a ‐80ºC hasta su utilización.    La  concentración  de  proteína  total  de  las  proteínas  de  fusión  totales  purificadas  se  determinó  siguiendo  el  método  de  Bradford  (Bradford  1976)  empleando  el  reactivo  Bio‐Rad  Protein  Assay  (Bio‐Rad).  En  el  caso  de  las  formas  tetraméricas purificadas de la proteína de fusión (MBP‐PAHtet), la concentración de  proteína se determinó espectrofotométricamente a 280 nm empleando ε =1,6 (ml.mg‐ 1.cm‐1)  para  la  MBP‐PAHtet.  Para  la  cuantificación  de  concentraciones  en  mol/l,  se  empleó como peso molecular 92,3 kDa para la subunidad de MBP‐PAHtet.       Expresión y purificación de la proteína hATR.    La expresión y purificación de la proteína ATR se llevó a cabo esencialmente  siguiendo el protocolo descrito por (Leal et al. 2004).  La proteína hATR se expresó en la cepa de E. coli BL21 StarTM (DE3) One Shot  Cell (Invitrogen) a partir del plásmido pET 41a que tiene el cDNA de la ATR sin el  péptido mitocondrial. La cepa E. coli  fue crecida en LB suplementado con 30‐60 mg/L  de  kanamicina  a  37ºC  y  con  agitación  a  275  rpm.  Cuando  el  cultivo  alcanzó  A600nm≈  0,6  se  indujo  la  expresión  de  la  proteína  mediante  la  adición  1mM  de  IPTG  a  una  temperatura de 25ºC o 37ºC durante 3‐5 horas. Una vez transcurridas las 3‐5 horas las  células fueron recogidas por centrifugación a 6000 K durante 10 minutos, pesadas y  guardadas a ‐70ºC durante al menos 12 horas.    El pellet celular congelado se resuspendió a una concentración 0,25 mg/ml en   buffer 50 mM fosfato de potasio (KPB) (pH: 8), 100‐300 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM  PSMF, 1 mM EDTA, 0,05 mg/ml DNAse I, 0,3 mg/ml lisozima durante 1 hora a 4ºC  36

con  agitación.  El  homogenado  obtenido  fue  sonicado  durante  10  minutos  con  la  secuencia 10´´ sonicación (p=5) y 20´´ descanso.  El extracto celular crudo fue centrifugado a 18000 K durante 1 hora, el sobrenadante  obtenido tras la centrifugación se diluyó en buffer 50 mM fosfato de potasio (pH=8),  1 mM DTT y 300 mM KCl. Se determinó la cantidad de proteína siguiendo el método  de Bradford.    Una vez diluido el extracto a una concentración de 1mg/ml se  añadió un 22%  (p/v) de sulfato de amonio para producir la primera precipitación, se dejó a 4ºC con  agitación  durante  7‐12  horas,  tras  este  tiempo  se  centrifugó  a  8000K  durante  una  hora, el sobrenadante se recogió y en frío y con agitación se le añadió un 11% (p/v) de  sulfato de amonio para producir la segunda precipitación, una vez disuelto el sulfato  se  quitó  la  agitación  y  se  mantuvo  durante  16  horas  a  4º,  posteriormente  se   centrifugó  a  8000K  durante  una  hora,  el  sobrenadante  se  descartó  y  el  precipitado,  donde se encuentra la hATR, se diluyó sin agitación ni pipeteo en 5‐10 ml de Tris 10  mM pH:8, DTT 1 mM.    Una vez resuspendido el segundo precipitado se eliminó el sulfato de amonio  mediante  diálisis,  para  ello  se  utilizó  una  membrana  de  diálisis  5,1  ml/cm.  en  cuyo  interior se pusieron las proteínas resuspendidas, la membrana se metió en 5L de Tris  10 mM pH: 8, DTT 1 mM durante 12 horas en agitación y en cámara fría.  Al día siguiente se cambiaron los 5L por otros 3L nuevos del mismo buffer, Tris 10  mM pH:8, DTT 1 mM y se volvió a dejar al menos 12 horas en agitación.    Una vez eliminado el sulfato de amonio se filtró la proteína con un filtro 0,45  μM y se introdujo en una columna de sefarosa Q (previamente equilibrada con Tris  10 mM pH: 8) para llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico.    El desarrollo cromatográfico se realizó a 4ºC, empleando como fase móvil un  gradiente Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM KCl 20 mM hasta Tris 10 mM pH: 8, DTT 1  mM  KCl  220  mM  y  tomándose  fracciones  del  eluido  de  12  ml  con  un  colector  de  fracciones.    La  concentración  de  proteína  total  de  las  fracciones  obtenidas  se  determinó  siguiendo  el  método  de  Bradford.  Para  seleccionar  las  fracciones  en  las  que  se  encontraba  la  ATR  se  realizó  electroforesis  SDS‐PAGE  con  las  fracciones  con  una  mayor concentración de proteína.    Posteriormente con las fracciones en las que se detectó la ATR se llevó a cabo  cromatografía de exclusión molecular utilizando una columna de hidroxiapatita para  obtener una mayor purificación de la proteína. El desarrollo comatográfico se realizó  a 4ºC y se utilizó como fase móvil un gradiente desde 10 mM KPB pH: 8, KCl 5 mM  37

hasta  400  mM  KPB  pH:  8.,  KCl  5  mM  Las  fracciones  obtenidas  con  un  colector  automático fueron de 7 ml.     La  concentración  de  proteína  total  de  las  fracciones  obtenidas  tras  esta  cromatografía también se determinó siguiendo el método de Bradford.  Las fracciones con la hATR se concentraron mediante columnas Amicon para  obtener una concentración de 10 μg/μl  3.2.4 Cromatografía en gel     Para estudiar el estado de oligomerización de la hATR wt y mutante se utilizó  una  columna  Superdex  200  (1,2cm  x  92cm)  con  un  flujo  2,0  ml/min  buffer  50  mM  Tris‐HCl  pH:8  con  100  mM  KCl.  Se  utilizaron  estándares  para  calcular  la  masa  molecular  de  la  proteína  (molecular  standard  marker  (Biorad)).  La  cantidad  de  proteína utilizada fue de 100μg.      3.2.5 Electroforesis, transferencia  y detección de proteínas 

  Electroforesis, transferencia e  inmunodetección de la proteína PAH    La  transferencia  e  inmunodetección  de  la  proteína  PAH  y  de  las  proteínas  FLAG‐PAHwt y mutantes procedentes de hepatoma se realizó sometiendo 50‐300 μg  de los extractos proteicos solubles (obtenidos por congelación‐descongelación de los  precipitados celulares resuspendidos en el buffer Na‐Hepes 20 mM con Pefabloc 0,2  mM)  a  electroforesis  discontinua  en  gradiente  desnaturalizante  (SDS‐PAGE)  (Davis  1964; Laemmli 1970; Ornstein 1964)  La  proteínas  separadas  por  SDS‐PAGE,  fueron  transferidas  a  membranas  de  nitrocelulosa (Western blot) y detectadas mediante tinción con Rojo Poinceau (Harlow  and  Lane  1988).  La  inmunodetección  de  proteínas  se  realizó  utilizando  anticuerpos  monoclonales comerciales anti‐tirosina, anti‐triptófano y anti‐fenilalanina hidroxilasa  (PH8;  Pharmingen)  de  ratón  y  para  las  proteínas  de  fusión  Flag‐PAH  se  utilizó  el  anticuerpo  primario  Antiflag  M2  (Sigma),  y  como  anticuerpos  secundarios,  anticuerpos  de  cabra  anti‐ratón  GAM/Ig  (Nordic  y  Santa  Cruz)  conjugados  a  peroxidasa,  ambos  anticuerpos  a  una  dilución  1/5000  (V/V).  La  visualización  de  los  complejos  formados  se  llevó  a  cabo  mediante  el  desarrollo  de  una  reacción  quimioluminiscente en presencia del reactivo ECL™ (Amersham Pharmacia Biotech)  durante 1 min y posterior impresión de una película fotográfica durante 1 min. para  las proteínas FLAG‐PAH y entre 15 y 30 min. para la PAH endógena del hepatoma.      La  cuantificación  de  los  niveles  de  proteína  inmunorreactiva  se  realizó  mediante densitometría láser, utilizando el densitómetro Bio‐Rad GS‐710 Calibrated  Imaging Densitometer (Bio‐Rad).  38

 

  Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con  avidina conjugada a fosfatasa alcalina. 

  Para la detección de la proteína α‐PCC las mitocondrias de fibroblastos fueron  aisladas  por  homogenización  y  centrifugación  diferencial  a  4°C  en  una  solución  25mM sacarosa, 10 mM Tris‐HCl, 2 mM EDTA pH 7,4 y 0,2 mM PMSF, siguiendo el  protocolo descrito por (Bergman et al. 1989) y posteriormente  resuspendidas en 20‐ 50  μl  de  una  solución  25  mM  sacarosa,  10  mM  Tris‐HCl  y  2  mM  EDTA  pH  7,4.  La  determinación  de  la  concentración  de  proteínas  se  llevó  a  cabo  mediante  cuantificación  por  el  método  de  Bradford.  La  misma  cantidad,  25‐100  μg  de  las  fracciones mitocondriales fue sometida a SDS‐PAGE.       Tras  la  electroforesis,  las  proteínas  procedentes  de  las  fracciones  mitocondriales fueron transferidas a membranas de PVDF (Immobilon™‐P, Millipore)  según el protocolo descrito por (Baumgartner et al. 2001a). La transferencia se realizó  empleando  una  solución  24  mM  Tris  base,  192  mM  glicina,  20%  metanol  según  el  protocolo  descrito  por  (Towbin  et  al.  1979),  en  el  aparato  Mini  Trans‐Blot  Transfer  Cell (Bio‐Rad). Una vez finalizada, la membrana fue sometida a tres lavados de 5‐10  minutos  en  PBS  y  bloqueada  durante  al  menos  una  hora  en  una  solución  PBS‐BSA  2%  (p/v).  Una  vez  bloqueada  la  membrana,  se  incubó  durante  1  hora  con  una  solución  de  PBS/BSA  0,3  %  (p/v)  a  la  que  se  había  añadido  avidina  conjugada  con  fosfatasa alcalina (Pierce) en una proporción 1:1000. Tras tres lavados sucesivos de 5  min. en PBS, se procedió al revelado de la membrana por adición del sustrato 1‐Step™  NBT/BCIP de la firma comercial Pierce y posterior desarrollo colorimétrico.      3.2.6 Ensayos enzimáticos    Actividad fenilalanina hidroxilasa      Para  determinar  la  actividad  específica  PAH  en  la  fracción  tetramérica  de  la  proteína  de  fusión  purificada  (MBP‐PAHtet)  y  en  extracto  celular  de  hepatoma  se  cuantificó la L‐Tyr formada a partir de L‐Phe en los ensayos mediante la separación  de  ambos  aminoácidos  por  cromatografía  líquida  de  alto  rendimiento  (HPLC)  y  detección fluorimétrica.       En los extractos celulares de hepatoma se eliminaron los aminoácidos antes de  llevar a cabo el ensayo de actividad utilizando los filtros ULTRAFREE®‐ MC 10,000  NMWL Filter Unit.  (Amicon) y  la concentración de proteína se determinó siguiendo  el método de Bradford.    39

La mezcla de reacción, conteniendo 0,15‐1 μg de MBP‐PAH y de MBP‐PAHtet  ó  5‐10  μg  extracto  celular  de  hepatoma  en  Na‐Hepes  a  pH  7.0,  en  presencia  de  catalasa  (0,04  mg/ml),  albúmina  de  suero  bovino  (0,5  mg/ml)  y  L‐Phe  1  mM,  fue  incubada  durante  4  min  a  25ºC,  adicionándose  posteriormente  sulfato  amónico  ferroso 100 μM, y tras 1 min de incubación, se inició la reacción mediante la adición  de BH4 75 μM en DTT 5 mM, en un volumen final de 50 μl. La reacción se desarrolló  durante  1  min  a  25ºC  en  el  caso  de  MBP‐PAHtet  y  durante  30  min.  en  el  caso  del  extracto  de  hepatoma  y  se  detuvo  usando  3  volúmenes  de  HClO4  12%  (V/V)  frío  (método de (Allen et al. 1999)). La mezcla final se incubó a 0ºC durante al menos una  hora y a ‐20ºC durante una noche, después se centrifugó durante 15 minutos en una  centrífuga  de  mesa  y  el  sobrenadante  se  almacenó  a  ‐20ºC  para  ser  aplicado  posteriormente  en  el  HPLC.  En  algunos  experimentos,  en  lugar  de  preincubarse  la  proteína  con  L‐Phe  1  mM,  ésta  se  adicionó  junto  al  BH4  al  iniciar  la  reacción.  Los  blancos de reacción se determinaron adicionando H2O (en lugar de L‐Phe) o DTT 5  mM  (en  lugar  de  BH4).  Para  determinar  la  velocidad  máxima  (Vmax)  y  la  afinidad  aparente  (Km)  por  BH4,  se  realizaron  los  ensayos  de  actividad  en  ausencia  de  preincubación  con  L‐Phe,  iniciándose  la  reacción  con  1  mM  L‐Phe  y  distintas  concentraciones de BH4 (2,5‐200 μM), mientras que la Vmax, la afinidad aparente (S0,5)  y  cooperatividad  (índice  de  Hill,  h)  por  L‐Phe  se  determinaron  en  condiciones  de  preincubación con L‐Phe (5‐4000 μM) e iniciándose la reacción con 75 μM BH4.     Los niveles de L‐Tyr formada durante los ensayos se determinaron mediante  la separación de los aminoácidos por HPLC, según el método descrito por (Allen et  al.  1999).  Se  utilizó  una  columna  de  matriz  hidrofóbica  (Eclipse®XDB  250  x  4.6  mm  Zorbax®XDB‐C18  de  Agilent  Technologies)  equilibrada  en  5%  acetonitrilo  (V/V)  en  H2O y desarrollándose la separación cromatográfica en condiciones isocráticas a 25ºC  durante 10 min, siendo los tiempos de retención de ~3,9 min para L‐Tyr y ~6,8 min  para L‐Phe. El volumen de muestra aplicado fue de 50 μl. La detección de L‐Phe y L‐ Tyr  se  realizó  usando  un  detector  fluorimétrico,  con  una  λexcitación=  274  nm  y  λemisión=304  nm.  La  determinación  de  la  concentración  de  L‐Tyr  formada  se  realizó  interpolando  las  señales  obtenidas  para  las  muestras  en  una  recta  de  calibrado  generada  usando  patrones  de  L‐Tyr  pura  (preparada  inicialmente  en  HCl  0.1  N  y  titulada usando λ275nm= 1400 M‐1 ∙ cm‐1), procesados de idéntica manera a las muestras  en cada método.       Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa  

  Los  ensayos  enzimáticos  para  la  ATR  fueron  llevados  a  cabo  siguiendo  el  protocolo descrito en (Johnson et al. 2001) con algunas modificaciones.   La  mezcla  de  reacción  utilizada  contenía  200  mM  Tris  (pH:8),  1,6  mM  KH2PO4,  2,8  mM  MgCl2,  100  mM  KCl,  0,4  mM  ATP  y  80  μM  (Cob(II)alamina  o  OHcobalamina  (Sigma)). La mezcla de reacción (800 μl) se introdujo en cubetas de metacrilato y se  40

empezó a monitorizar la absorbancia a 388 nm y 37ºC, cuando la línea fue estable se  añadieron  10  μl  de  ácido  Ti(III)citrato,  una  vez  estabilizada  la  línea  por  ultimo  se  añadieron  10‐100  μg  de  proteína  y  se  observó  la  disminución  de  la  absorbancia.  El  análisis matemático para el cálculo las actividades a partir de las gráficas obtenidas  se llevó a cabo utilizando el programa informático IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.).  Tanto la mezcla de reacción, la proteína y el ácido Ti(III)citrato se prepararon  en condiciones anaeróbicas.  Los  ensayos  enzimáticos  de  la  actividad  realizados  con  el  mismo  protocolo  anteriormente  descrito  pero  utilizando  50  μM  Cob(II)alamina  y  diferentes  concentraciones  de  ATP  (entre  0‐0,2  mM)  permitió  el  cálculo  de  Km  y  Vmax  por  ATP. El programa  informático con  el que  se  realizaron  los análisis matemáticos  fue  también IGOR Pro6(WaveMetrics Inc.).    Para  calcular  la  Kd  para  los  distintos  análogos  de  Cob(II)alamina    se  pusieron  3  ml  de  buffer  Tris  50mM  pH:  8    en  una  cubeta  de  cuarzo  y  se  midió  la  fluorescencia ( λexcitación= 280 nm y λemisión=340 y un  tiempo de integración de 2 min). A  continuación  se  añadieron  entre  40‐150  μg  proteína  y  se  volvió  a  medir  la  fluorescencia, se fueron añadiendo 1‐ 10 μl del análogo (concentración entre 2‐7 mM)  midiéndose la fluorescencia tras cada adición. El programa informático con el que se  realizaron los análisis matemáticos fue también IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.).     Para calcular la Kd por Cob(II)alamina, se midió en una cámara anaeróbica el  espectro desde 300 nm hasta 750 nm de la proteína ATR a una concentración de 2μM  en  el  buffer  Tris  50mM  pH:  8,  posteriormente  se  añadió  Cob(II)alamina  a  una  concentración  final  10μM  y  se  volvió  a  medir  el  espectro  con  el  mismo  rango  de  absorción. El experimento se repitió a distintas concentraciones de proteína hasta un  máximo  de  100  μM.  Posteriormente  se  llevo  a  acabo  el  análisis  matemático  de  los  espectros con el programa informático IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.).      Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa       La  medida  de  la  actividad  PCC  y  MCC  se  realizó  en  fibroblastos  cultivados.  Los  fibroblastos  fueron  recogidos  por  tripsinización  y  resuspendidos  en  un  buffer  Tris‐HCl 20 mM, glutation 0,025 % (p/v). Posteriormente, se sometieron a tres ciclos  sucesivos  de  congelación/descongelación  en  N2  líquido  y  a  una  centrifugación  posterior 5 min. a 13000 rpm, para obtener el extracto celular total.      La  determinación  de  las  actividades  enzimáticas  PCC  y  MCC  se  realizó  siguiendo  el  protocolo  descrito  por  (Suormala  et  al.  1985).  Cada  ensayo  se  llevó  a  cabo  en  un  volumen  final  de  200  μl,  en  la  siguiente  mezcla  de  reacción:  20  μmoles  Tris‐HCl  pH  8.0,  0,15  μmoles  DTT,  0,628  μmoles  Na2‐ATP.3H2O,  1,2  μmoles  MgCl2.6H2O, 20 μmoles KCl, 5% (v/v) Triton X‐100, 0,2 μmoles propionil‐CoA o 0,2  41

μmoles 3‐metilcrotonil‐CoA y 8 μmoles NaHCO3.   El isótopo radiactivo NaH[14C]O3  (Amersham  Pharmacia  Biotech)  utilizado  tenía  una  actividad  de    56  mCi/mmol  NaHCO3  y  2  mCi/ml,  fue  suministrado  a  la  reacción  en  una  proporción  de  1,  2  ó  3  μCi/ μmol NaHCO3.     La reacción enzimática comenzó al añadir 20 μl del extracto proteico celular y  se  llevó  a  cabo  a  30°C  durante  20  minutos  con  agitación.  La  parada  de  la  reacción  enzimática  tuvo  lugar  por  la  adición  de  140  μl  de  TCA  30%  (p/v)  y  las  proteínas  precipitadas  se  separaron  por  centrifugación  a  14000  rpm  durante  15  min.  El  sobrenadante  fue  transferido  a  un  vial  de  centelleo  y  sometido  a  evaporación    a  totalidad a temperatura ambiente, siendo posteriormente resuspendido en 500 μl de  agua  miliQ.  Posteriormente  se  añadieron  a  cada  vial  5  ml  de  líquido  de  centelleo  Optiphase  Hisafe  2  (Perkin  Elmer)  y  se  procedió  a  la  determinación  de  cpm  en  el  contador 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter (Wallac).    La cuantificación de proteínas totales en los extractos proteicos se llevó a cabo  según el método descrito por (Lowry et al. 1951).     Las actividades específicas residuales PCC y MCC se expresaron en unidades  de pmoles [14C]O2 incorporado/min/mg proteína total.      3.2.7 Síntesis in vitro  y pulso caza de las proteínas PAH       La  expresión  in  vitro  de  las  proteínas  PAH  se  realizó  empleando  el  sistema  comercial  TnT‐T7  Quick  Coupled  Transcription/Translation  System  de  Promega  siguiendo las instrucciones del proveedor.      El cDNA de la PAH se amplificó mediante PCR utilizando como molde 100 ng  de  los  plásmidos    pRc/CMV‐PAH  o  pMALc2‐PAH  wt  y  mutantes,  empleando  para  ello el oligonucleótido T7‐PAH que introduce el promotor de la RNA polimerasa T7  y  la  secuencia  consenso  Kozak  próxima  al  ATG  iniciador  (Kozak  1984)    y  el  oligonucleótido 13B, según se describe en (Gamez et al. 2000).      El experimento de pulso‐caza llevado a cabo para estudiar la vida media de la  PAH en presencia/ausencia de BH4, se desarrolló en presencia de L‐[35S]‐metionina y  L‐[35S]‐cisteína  según  se  describe  en  (Gamez  et  al.  2000).  La  reacción  de  síntesis  se  desarrolló a 30ºC durante 35 minutos, tras los cuales el proceso de síntesis se detuvo  añadiendo  RNAsa  A  (1  mg/ml)  y  DNAsa  I  (1  mg/ml).  En  este  punto  se  obtuvo  la  alícuota (10 μl) correspondiente a la síntesis y tiempo cero. El resto de la reacción se  incubó  a  37  ºC  y  se  tomaron  alícuotas  (10  μl)  cada  hora  tras  la  síntesis  hasta  las  7  horas.  Las  muestras  se  congelaron  a  ‐20ºC  hasta  su  utilización.  Para  cada  proteína  PAH se realizaron en paralelo los experimentos en presencia y ausencia de 500 μM  42

BH4  en  la  mezcla  de  síntesis.  Las  diferentes  alícuotas  fueron  desnaturalizadas  y  analizadas  posteriormente  mediante  SDS‐PAGE.  Las  proteínas  marcadas  radiactivamente  fueron  visualizadas  por  fluorografía  y  cuantificadas  por  densitometría  láser  de  las    películas  fotográficas  (Gamez  et  al.  2000)  Los  resultados  fueron ajustados a una función de decaimiento exponencial.     3.2.8 Cultivo celular.      Las células de hepatoma, fibroblastos y LB  fueron cultivadas en botellas de 75  2 cm   y  en  placas  estandarizadas  de  6  pocillos  (P6)  a  37°C  en  una  atmósfera  de  humedad  relativa  del  95%  y  CO2  5%,  utilizando  como  medio  de  cultivo  MEM  suplementado con glutamina 2 mM, suero al 10% (v/v) y una mezcla de antibióticos.         Los  sueros  utilizados  fueron  suero  fetal  bovino  (FBS),  suero  fetal  bovino  dializado y suero de ternera recién nacida (NCBS).       Las  células  fueron  recogidas  con  una  solución  de  tripsina‐EDTA  y  sedimentadas mediante centrifugación.      Se  realizaron  controles  de  contaminación  de  reactivos,  medios  de  cultivo  y  cultivos celulares de forma sistemática durante todo el estudio.      Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B    Para  el  análisis  del  efecto  de  la  sepiapterina  sobre  la  transcripcion  y  traducción  de  la  PAH    se  sembraron  5x105  células  Hep3B  por  pocillo  en  placas  P6,  después de 24 horas se cotransfectaron los plásmidos pGL3UTRPrPAH y pRCCMV‐ βgal (como estándar interno para montorizar la eficiencia de la transfección) según el  protocolo  descrito  por  la  casa  comercial  para  el  Jet  PEI.  5  horas  después    de  la  transfección  se  cambió  el  medio  por  medio  control  o    con  sepiapterina  100  μM   (filtrada con  MILLEX®GS filter 0,22 μm) y 48 horas después se recogieron las células  por centrifugación y se resuspendieron en 180 μl de buffer (Reporter lysis buffer del kit  luciferase Assay System de Promega®) con 0,2 mM de pefabloc y se sometió a 2 ciclos de  congelación/descongelación  en  N2  líquido.  Los  extractos  proteicos  solubles  se  recuperaron  por  centrifugación  de  las  células  lisadas.  A  partir  de  estos  extractos  proteicos  se  procedió  a  la  medida  de  la  actividad  luciferasa  con  20  μl  de  cada  muestra,  utilizando  para  ello  un  luminómetro  Monolight  2010  (Analytical  Luminescence  Laboratory),  siendo  la  luciferina  del  kit  (luciferase  Assay  System  de  Promega®) el sustrato de la reacción.   La  medida  de  la  actividad  β‐Galactosidasa  (Nielsen  et  al.  1983)  sirvió  como  control de la eficiencia de la transfección    

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Para  el  estudio  de  expresión  transitoria  de  la  proteína  FLAG‐PAH  wt  y  mutantes se sembraron  de  4‐5x106 células de Hep3B  en botellas T75,  después  de  24  horas  se  transfectaron  según  el  protocolo  descrito  por  la  casa  comercial  para  el    Jet  PEI,  10 μg de plásmido  pFLAG‐CMVPAH normal o mutantes y 20 μl de Jet PEI. A  las  5  horas  se    cambió  el  medio  por  medio  control  o  con  sepiapterina  100  μM,  48  horas  después  se  recogieron  las  células  y  tras  su  lisis  mediante  congelación‐ descongelación se utilizaron para experimentos de Western blot.  Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos.    La secuencia de los oligonucleótidos tipo morfolinos (GeneTools) utilizados en  la modulación de splicing se muestra en la siguiente tabla.    Tabla  9:  Oligonucleótidos  tipo  morfolinos  diseñados  para  la  modulación  del  splicing en los genes PCCA y PCCB.  Nombre del  oligo 

Secuencia 5´Æ 3´ 

Ins84PCCA 

CACAGTGTTGACAAAAACTAGAAAA 

Ins72PCCB 

TCATGTAATAAAGATATGTACCTCT 

Gen diana  PCCA  ENSG00000175198  PCCB  ENSG00000114054 

    Los  fibroblastos  del  paciente  fueron  cultivados  en  placas  estandarizadas    P6,  5x10  células por pocillo, 24 horas después de la siembra se añadió el oligonucleótido  antisentido (AON) a una concentración final en el medio de 10 μM ó 20 μM. Para la  transfección del AON se utilizó Endo‐Porter (Gene Tools) a una concentración final  de 6 μM. El tiempo de cultivo tras la adición del Endo‐Porter y el AON fue de 48‐72  horas, tras este tiempo se recogieron las células y se guardó el precipitado celular a ‐ 70º hasta su utilización.    5

3.2.9 Medida de pterinas    El  análisis  de  pterinas  en  el  extracto  celular  de  hepatoma  fue  llevado  a  cabo  usando  HPLC  con  columna  modelo  HP1100  de  Agilent  technologies  y  con  un  detector  de  fluorescencia.  La  preparación  de  las  muestras  se  hizo  siguiendo  el  método de (Fukushima and Nixon 1980) y la monitorización fluorimétrica se realizó  usando un detector fluorimétrico, con una λexcitación= 360 nm y λemisión=440 nm.   

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3.2.10 Soporte informático    Los  ajustes  a  las  ecuaciones  de  Michaelis‐Menten  (para  determinar  Vmax  y  Km  por BH4) y de Hill (Vmax, S0,5 y h por L‐Phe) se realizaron mediante regresión no‐lineal,  usando los programas SPSS 11.0 (SPSS Inc.) y Origin 5.0 (MicroCal Inc.).     El  tratamiento  de  imágenes  digitales  y  densitometría  de  las  mismas  se  realizó  mediante  los  programas  Kodak  Digital  Science  1D  2.0.3.  (Kodak  Scientific  Image  Systems),y Quantity One 4.3.1 (Bio‐Rad).    El análisis estructural de las mutaciones PAH tuvo lugar a partir del modelo  de  la  PAH  full  length  generado  por  P.  Gómez  y  E.  López  de  la  Unidad  de  Bioinformática del CBM. El análisis estructural de las mutaciones ATR tuvo lugar a  partir del modelo tridimensional descrito en (Schubert and Hill 2006).    La  visualización  de  las  estructuras  tridimensionales  y  la  localización  de  los  aminoácidos mutados en las distintas variantes alélicas de los genes PAH y MMAB se  realizaron con el soporte informático DS ViewerPro5.0 de Accelrys Inc.    La  identificación  de  las  mutaciones  detectadas  en  los  genes  PCCA  y  PCCB  como  posibles  ESEs  (exonic  splicing  enhancers)  se  llevó  a  cabo  con  los  programas  informáticos  ESEfinder  versión,  Rescue‐ESE  (RESCUE‐ESE  Web  Server),  y  PESX  (PESXs Server).    La identificación de los posibles sitios aceptores y donadores de splicing en una  determinada secuencia se realizó con el programa informático Splice Site Prediction de  BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). 

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4. RESULTADOS 

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4.1 BASES  MOLECULARES  DE  LA  RESPUESTA  A  BH4  EN  FENILCETONURIA   En  el  momento  de  comenzar  este  trabajo  (año  2003)  se  había  descrito  la  respuesta positiva a BH4 en pacientes PKU en diversas poblaciones, con frecuencias  variables  y  gran  heterogeneidad  en  las  mutaciones  asociadas.  En  la  población  española  no  se  había  analizado  aún  la  respuesta  en  pacientes  PKU,  por  lo  que  en  colaboración con la Dra Martínez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal, Madrid) se inició  un estudio mediante la  aplicación  de  test  de  sobrecarga de BH4 y  el genotipado  de  los pacientes sometidos al mismo.    Por  otra  parte,  el  laboratorio  estaba  realizando  un  estudio  con  el  objetivo  de  investigar  los  mecanismos  moleculares  responsables  de  la  respuesta  in  vivo  a  BH4,  (en  colaboración  con  los  doctores  R.  Stevens  (Scripps  Research  Institute,  La  Jolla,  USA)  y  A.  Martínez  (Univesidad  de  Bergen,  Noruega)),  en  este  sentido  nos  propusimos la caracterización de la proteína PAH con algunas mutaciones asociadas  a respuesta a BH4 en sistemas procariotas, eucariotas y libres de células.  4.1.1 IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES ASOCIADAS A RESPUESTA A BH4  EN PACIENTES FENILCETONÚRICOS ESPAÑOLES    En colaboración con la Dra. Martinez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal) se llevó  a cabo un estudio piloto de sobrecarga con BH4 en 31 pacientes españoles deficientes  en  el  gen  PAH.  Para  el  genotipado  de  todos  los  pacientes  sometidos  al  test  de  sobrecarga  se  analizaron    muestras  de  DNA  genómico,  obtenidas  de  sangre  total  periférica.  Las  mutaciones  de  los  31  individuos  fueron  estudiadas  mediante  las  técnicas  de  DGGE  y  secuenciación  cíclica  directa  identificándose  un  total  de  34  mutaciones  diferentes,  previamente  descritas  en  la  base  de  datos  de  la  PAH  (http://www.pahdb.mcgill.ca).  Únicamente  en  dos  pacientes  sólo  se  determinó  la  mutación  en  uno  de  los  alelos,  por  lo  que  el  porcentaje  de  variantes  alélicas  identificadas en el total de pacientes fue de un 96,7% (Tabla 10). En aquellos casos en  los  que  se  tuvo  muestra  de  los  padres  se  confirmó  la  herencia  mendeliana  y  la  presencia de ambas mutaciones en posición trans.    De  los  31  pacientes  incluidos  en  este  estudio,  11  (5  HFA  y  6  PKU  leves)  mostraron una respuesta positiva al test de sobrecarga con BH4, considerando como  respuesta positiva una disminución  igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe  8  horas  después  de  la  sobrecarga.  Adicionalmente  3  pacientes  más  mostraron  una  respuesta lenta con una  disminución igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe  entre  12‐16 horas después de la sobrecarga.    El  90%  de  los  HFAs  y  el  50%  de  los  PKU  leves  responden  positivamente  al  test,  se  observa  por  lo  tanto  que  los  fenotipos  más  suaves  presentan  una  respuesta  47

favorable  en  un  alto  porcentaje  mientras  que  en  los  pacientes  con  fenotipos  más  graves  esta  respuesta  es  muy  poco  frecuente.  Tan  solo  un  20%  de  los  PKUs  moderados y un 13% de los clásicos responden de forma lenta.    Todos  los  individuos  estudiados  con  respuesta  favorable  son  compuestos  heterocigotos  con  al  menos  una  mutación  missense  potencialmente  asociada  a  respuesta  excepto  el  paciente  19548  que  es  homocigoto  para  la  mutación  IVS10nt‐ 3C>T (en cursiva y negrita en la Tabla 10). Las mutaciones missense de los pacientes  que  se  postulan  podrían  estar  implicadas  en  respuesta  serían  aquellas  que  tienen  actividad  residual  por  estudios  de  expresión  de  mutaciones  o  que  se  han  descrito  asociadas  a  respuesta  a  BH4  en  pacientes  en  otros  trabajos  (Spaapen  and  Estela  Rubio‐Gozalbo 2003) y aparecen subrayadas y en negrita en la Tabla 10.   El paciente 19548 es homocigoto para la mutación IVS10nt‐3C>T, este cambio  nucleotídico  altera  el  sitio  aceptor  de  splicing  del  intrón  10  y  como  consecuencia  se  produce la eliminación del exón 11 en la maduración del mensajero (Jaruzelska et al.  1995).  La  hipótesis  para  explicar  la  respuesta  a  BH4  y  el  fenotipo  HFA  en  este  paciente es la presencia de transcritos normales con el exón 11, para comprobar esto  se  llevó  a  cabo  el  estudio  del  mRNA  de  la  PAH  mediante  retrotranscripción  y  posterior  PCR  a  partir  de  RNA  de  linfoblastos  del  paciente,  rescatando  la  transcripción basal de la PAH en estas células ya que la expresión del gen de la PAH   se activa exclusivamente en hígado y riñón. La  amplificación  y  posterior  secuenciación  del  fragmento  del  cDNA  con  los  primers  PAH10  y  PAH13  permitió  observar  la  existencia  de  mRNA  normal  (Fig  9)  que podría explicar el fenotipo HFA que presenta el paciente y la respuesta a BH4.  Exón 10

Exón 11

MCR 19548

10 10

11

12

12

Exón 10

Exón 12

Figura  9:  Análisis  por  RT‐PCR  y  posterior  secuenciación  del  cDNA  de  la  PAH  utilizando  los  oligonucleótidos específicos PAH10 ‐ PAH13 a partir del RNA del paciente 19548 y utilizando la línea  celular MCR (linfoblastos control).

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Tabla  10:  Fenotipos,  genotipos  y  tipo  de  respuesta  de  los  pacientes  sometidos  al  test de sobrecarga con BH4.  Referencia  Fenotipo 

Genotipo  Mutación 1  Mutación 2 

Respuesta a BH4 a 

12710  18447  18801  18811  18930  19548 

HFA  HFA  HFA  HFA  HFA  HFA 

I65T  A300S  D415N  S87R  R176L  IVS10nt‐3C>T 

A300S  R261Q  R176X  S349P  P281L  IVS10nt‐3C>T 

+  +  +  +  +  +/‐ 

8438  8439  10806  11332  12525  12528  12556  12572  12576  12895  18236  19068 

leve  leve  leve  leve  leve  leve  leve  leve  leve  leve  leve  leve 

I65T  I65T  R68S  Y414C  IVS10nt‐11G>A Y414C  P122Q  R408Q  I65T  P275R  I65T  E390G 

IVS10nt‐11G>A  IVS10nt‐11G>A  IVS7nt3G>C  L348V  T418N  IVS4nt5G>T  F39L  L311P  P244L  L348V  R408Q  IVS12nt1G>A 

‐  ‐  ‐  +  ‐  +  ‐  ‐  +  +  +  + 

9384  11353  12324  12562  12569 

moderado  moderado  moderado  moderado  moderado 

I65T  IVS1nt5G>T  I65T  V388M  I65T 

R261Q  L348V  V388M  IVS10nt‐11G>A  S196fsdel22bp 

‐  ‐  +/‐  ‐  ‐ 

10637  11942  14116  15618  16550  16714  17045  18149 

clásico  clásico  clásico  clásico  clásico  clásico  clásico  clásico 

A309V  R261Q  IVS10nt‐11G>A IVS10nt‐11G>A R158Q  R243Q  R261X  IVS1nt5G>T

IVS1nt5G>T  R408W  ND  delF39  E280K  ND  R243Q  IVS4nt5G>T 

+/‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐ 

 +,  respuesta  positiva: disminución  igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe 8 horas después  de la sobrecarga con BH4; ‐ respuesta negativa; +/‐,  respuesta lenta: disminución igual o mayor a un  30%  en  los  niveles  de  L‐Phe  entre  12‐16  horas  después  de  la  sobrecarga  con    BH4  .  ND,  no  determinado.  En negrita y subrayado, mutaciones missense potencialmente responsables de la respuesta.  En negrita y cursiva mutación de splicing asociada a respuesta lenta.  a

49

4.1.2  EXPRESIÓN  DE  PROTEÍNAS  PAH  MUTANTES  IMPLICADAS  EN  LA  RESPUESTA A BH4    Las  mutaciones  analizadas  mediante  expresión  para  caracterizar  sus  parámetros cinéticos y/o su estabilidad han sido F39L, R68S, D129G, H170D, E178G,  V190A, A300S, A309V, A313T, A373T, V388M, E390G, P407S, Y414C. La mayoría de  las mutaciones estudiadas están presentes en el dominio catalítico y todas ellas han  sido  descritas  en  pacientes  fenilcetonúricos  americanos  (Matalon  et  al.  2004)  y  españoles que responden a BH4 .    La localización  en  la  estructura monomérica de la PAH de  las mutaciones  se  muestran en la Figura 10. Destaca el hecho de que muchas de ellas no se encuentran  ni en la región de unión al cofactor ni en las proximidades, por lo que se postula que  es difícil que todas las proteínas mutantes tengan afectada la Km por BH4, por lo que  el  efecto  positivo  de  un  aumento  en  las  concentraciones  de  BH4  podría  estar  relacionado con la estabilización de las proteínas mutantes, (que tendrían defectos de  plegamiento), actuando la BH4 como una chaperona química.   

Figura  10:  Estructura  en  dominios  de  un  monómero  de  PAH  y  localización  de  los  residuos  implicados  en  respuesta  a  BH4,  sometidos  a  estudios  cinéticos  y/o  de  estabilidad    La  BH4  se  muestra en rosa y blanco y los residuos implicados en respuesta a BH4  en azul y blanco. 

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Análisis cinéticos  El  procedimiento  experimental  utilizado  para  caracterizar  las  diversas   propiedades cinéticas de la PAH ha sido la expresión de la proteína de fusión MBP‐ PAH  en la bacteria E. coli y su utilización para ensayos de actividad enzimática en  forma  de  tetrámero.  La  fracción  tetramérica  activa  se  obtuvo  mediante  purificación  por cromatografía de afinidad y posterior cromatografía de exclusión molecular. En  el caso de la mutación D129G se llevaron a cabo los ensayos cinéticos con la proteína  total  obtenida  tras  cromatografía  de  afinidad  en  paralelo  con  la  proteína  normal  ensayada en las mismas condiciones     Los  ensayos  cinéticos  en  condiciones  de  estado  estacionario  han  permitido  determinar  los  parámetros  cinéticos  del  enzima  tetramérica  normal  y  mutante;  actividad específica, afinidad aparente por BH4 (Km), afinidad aparente por L‐Phe (S  0,5), cooperatividad (índice de Hill, h) y activación por L‐Phe.     Para determinar la actividad PAH se cuantificó la L‐Tyr formada durante los  ensayos mediante separación cromatográfica de L‐Tyr y L‐Phe en HPLC y detección  y  cuantificación  por  fluorimetría  tal  y  como  se  especifica  en  materiales  y  métodos.  Los datos se muestran en la Tabla 11.    Se observa que sólo una mutación (P407S) presenta  parámetros similares a los  de  la  proteína  normal,  mientras  que  las  otras  cuatro  proteínas  mutantes  presentan  alteraciones en algún parámetro cinético, dos (D129G y H170D) tienen una actividad  específica preincubando con L‐Phe disminuida, tres (D129G, H170D y V190A) tienen  una  actividad  específica  sin  preincubar  con  L‐Phe  disminuida  y  una  (E390G)  presenta  alteraciones  en  el  grado  de  activación  (A)) en  el gen  MMAB  (datos  del  laboratorio)  El  cambio  nucleótidico  c584G>A  se  encuentra  en  el  último  nucleótido  del  exón  siete  afectando  al  splicing,    como  consecuencia  se  genera  o  un  mRNA  sin  el  exón  siete  o  si  existe  splicing  correcto,  con  el  exón  siete  pero  con  la  mutación R195H (datos del laboratorio).     4.2.1 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS MUTANTES IMPLICADAS EN RESPUESTA  IN VITRO A B12; Análisis cinéticos  Para poder entender cuales son los mecanismos moleculares que determinan  la  respuesta  in  vivo  e  in  vitro  (datos  del  laboratorio)  en  acidemia  metilmalónica  aislada  tipo  cblB  se  llevaron  a  cabo  análisis  cinéticos  y  estructurales  de    la  ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa humana (hATR) normal y con las mutaciones  puntuales  (I96T  y  R195H)  mediante  expresión  en  un  sistema  procariota.  Estos  estudios se realizaron en el laboratorio de la doctora Ruma Banerjee (Centro Redox  de  Biología,  Departamento  de  Bioquímica,  Universidad  de  Nebraska,  Lincoln,  Nebraska,USA).    La  hATR  es  un  trímero  constituido  por  3  monómeros  cada  uno  de  ellos  organizado  en  5  hélices  α  y  dos  laminas  ß  (Schubert  and  Hill  2006).    La  mutación   I96T se encuentra localizada en  la  hélice α1 (Fig  16). Esta estructura secundaria es  muy importante ya que el sitio de unión a ATP se forma entre las hélices α1, α2 de  un  monómero  y  el  loop  α3  ‐α4  y  las  hélices    α4,  α5  del  monómero  adyacente.  La  unión de ATP a su sitio activo produce un cambio conformacional en el trímero que  contribuye  a  la  formación  del  sitio  de  unión  a  cobalamina.  Una  de  las  hipótesis  de  partida es que el cambio de la isoleucina por la treonina en el aminoácido 96 podría  producir un alteración en el sitio de unión a ATP y disminuir la afinidad de la hATR  por  este  sustrato,  esto  podría  producir  a  su  vez  una  alteración  en  el  cambio  conformacional  de  la  proteína  para  formar  el  sitio  de  unión  a  cobalamina  y  por  lo  tanto  también  podría  verse  alterada  la  afinidad  por  este  sustrato.  Otra  hipótesis  es 

61

que  este  cambio  nucleotídico  I96T  puede  afectar  a  la  estructura  final  del  trímero  produciendo una menor estabilidad del mismo. 

I96

ATP

Figura 16: Visualización parcial de la estructura cristalizada de la ATR humana. La figura muestra  uno de los monómeros (amarillo) con sus cinco hélices α. El aminoácido I96 (en gris) se encuentra en  la hélice α1 y el ATP en el espacio entre dos de los monómeros (amarillo y azul) de la proteína,  

La  mutación    R195H    se  encuentra  localizada  en  la    hélice  α4  (Fig.  17).  Esta  estructura secundaria junto con la hélice α1 están implicadas en la interacción entre  los  tres  monómeros  y  formación    del  oligómero.  Existen  dos  pares  arginina  glutámico (Glu84/Arg195 y Glu91/Arg191) esenciales en la formación del trímero.  

hélice α 4 R195

hélice α 1

Figura  17:  Visualización  de  la  estructura  trimérica  cristalizada  de  la  ATR  humana.  La  figura  muestra  los  tres  monómeros  (amarillo,  verde  y  azul)  con  sus  cinco  hélices  α.  El  aminoácido  R195  (morado) se encuentra en la hélice α4 en el espacio de interacción entre los tres monómeros. 

62

Con  objeto  de  determinar  las  características  cinéticas  y  estructurales  de  las  hATR  I96T  y  R195H  que  nos  permitirían  determinar  la  base  molecular  de  la  respuesta  a  cobalamina,  se  expresaron  las  proteínas  normal  y  mutantes  en    la  cepa  bacteriana BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen) utilizando el vector pET 41a  con  el  cDNA  de  la  ATR  humana  clonado  por  la  Dra  Ruma  Banerjee.  Las  dos  mutaciones I96T y R195H se introdujeron mediante mutagénesis dirigida.    Tras  la  inducción  con  IPTG  las  proteínas  normal  y  mutantes  se  purificaron  secuencialmente  mediante  precipitación  con  sulfato  de  amonio  seguida  de  cromatografía  de  intercambio  aniónico  mediante  columna  de  sefarosa  Q  y  finalmente  cromatografía  de  exclusión  molecular  utilizando  una  columna  de  hidroxiapatita. La purificación obtenida para I96T  fue de más del 95% después de la  primera cromatografía y casi del 99% tras la segunda. (Fig 18). Para R195H tras  la  primera  cromatografía  (con  columna de sefarosa Q)  se  obtuvo  una purificación del  95% (dato no mostrado) que fue suficiente para llevar a cabo el resto de los ensayos a  partir de las fracciones de esta cromatografía. a) b) c) 1

hATR

2

1 2

Kda 36 27

hATR

3

4

1 2 3 4

hATR

18

Figura  18:  Electroforesis  SDS  PAGE  de  los  extractos  y  fracciones  de  los  diferentes  pasos  de  purificación de la proteína hATR I96T. a) Extracto celular inducido a 25ºC con 1mM de IPTG (1) y  sin  inducir  (2),  b)  Fracciones  conteniendo  la  proteína  hATR  I96T  tras  cromatografía  de  intercambio  aniónico con columna de sefarosa Q (carriles 2, 3 y 4). El carril 1 corresponde a la hATR wt purificada,  c)  Fracciones  conteniendo  la  proteína  hATR  I96T  tras  cromatografía  de  exclusión  molecular  con  columna hidroxiapatita (carriles 1, 2, 3 y 4).  

  Las  fracciones  de  las  proteínas  purificadas  en  los  distintos  pasos  cromatográficos  se  concentraron  para  obtener  una  solución  con  una  cantidad  mínima de proteína de 1mg/ml que fue utilizada para ensayos enzimáticos y análisis  estructurales.    La medida de actividad para la proteína hART normal y las dos mutantes se  realizó siguiendo el protocolo descrito en métodos y los resultados se muestran en la  Tabla  18    y  en  la  Figura  19  se  muestra  un  experimento  representativo.  Los  datos  obtenidos  muestran  que  la  proteína  R195H  tiene  la  misma  actividad  que  la  wt  mientras que la I96T alcanza el 60% de la actividad salvaje.      63

  Tabla 18: Actividad específica para las proteínas hATR wt,  I96T  y R195H.   

I96T 

I96T 

R195H 

(tras cromatografía  intercambio aniónico) 

(tras cromatografía  intercambio  aniónico) 

(tras cromatografía  exclusión  molecular) 

(tras cromatografía  intercambio  aniónico) 

200 ± 10 

123 ±19 

132 ±13 

185 ±15 

Wt 

Actividad específica  (nmol min–1 mg–1) 

Todos los datos son la media de dos experimentos independientes por triplicado. 

2

1.5

1

1.0

Absorbancia  0.5

0.0

0

1

2

3

4

5

Tiempo (minutos)   Figura 19: Experimento representativo de la actividad de la proteína  hATR I96T como medida de la  disminución  en  la  absorbancia  a  388  nm  con  respecto  al  tiempo  debido  a  la  formación  de  AdoCbl  desde cob(I)alamina.  La cantidad de proteína utilizada en el ensayo fue de 10 μl a una concentración  11 μg/μl. 1‐Adición de 10 μL de ácido Ti(III)citrato. 2‐ Adición de 10μL de proteína hATR I96T.  

 La  caracterización  cinética  de  las  proteínas  mutantes  se  completó  con  la  realización  de  ensayos  que  nos  permitieron  calcular  las  Kds  para  Cob(II)alamina  y  diversos análogos y la Km y Vmax por ATP (Tablas 19 y 20).   Tanto  las    Kd  para  la  Cob(II)alamina  como  para  los  análogos  no  mostraron  diferencias  significativas,  excepto  para  la  CNCbl,  con  los  descritos  para  la  wt  en  ninguna de las dos mutaciones. La Km por ATP para la proteína hATR I96T muestra  que  no  existe  alteración  en  la  afinidad  por  el  ATP  para  la  proteína  mutante    I96T  aunque si se observa una disminución de un 30% en la Vmax.    Tabla 19: Km  y Vmax para ATP para la proteína hATR wt y I96T.    Wt  I96T

 

Km (μM) 

Vmax (nmol min–1 mg–1) 

6,2 ± 1,3 

170 ± 9 

7,8 ± 1.9 

125 ± 8 

  64

Tabla 20: Constante de disociación para la Cob(II)alamina y para los diversos  análogos para la proteína wt, I96T y R195H.   

Wt 

I96T 

R195H 

Kd (μM) 

Kd (μM) 

Kd (μM) 

AdoCbl

1,7 ± 0,4 

2,58 ± 0,62 

ND 

OHCblb 

8,5 ± 1,1 

7,8 ±1,55 

11,38 ± 2,4 

CNCblb 

7,8 ± 0,5 

13,28 ± 0,28 

14,16 ± 4,7 

Cob(II)alaminaa 

3,6± 1,6 

1,37± 0,33 

ND 

  a 

 Los datos son la media de dos experimentos independientes por duplicado.  b Los datos son la  media de un experimento  por triplicado.  a 

Por  último  analizamos  el  efecto  de  los  cambios  nucleotídicos  en  la  distribución oligomérica de la proteína. Para el caso de la proteína con la mutación  R195H  era  especialmente  interesante  este  estudio  ya  que  el  aminoácido  mutado  se  encuentra  implicado  directamente  en  la  formación  del  trímero.  Mediante  cromatografía  en  gel  a  4  ºC  en  condiciones  nativas  y  obtención  del  peso  molecular  por comparación con patrones se determinó el estado de oligomerización de las tres   proteínas  observándose  que  la  wt  se  presentaba  como  un  trímero  y  la  I96T  mayoritariamente también, aunque una pequeña proporción de la proteína aparecía  como monómero. El estado de oligomerización de la proteína R195H  correspondía  mayoritariamente a la mezcla de trímeros y monómeros (Fig 20). Trímero hATR (72KDa.) I96T

Trímero hATR (72KDa.) I96T

Monómero hATR (24 KDa.) I96T

670 KDa. 158 KDa.

44 KDa. 17 KDa.

Trímero + monómero R195H

1,35 KDa.

Figura 20: Perfil de elusión de las proteínas I96T y R195H tras cromatografía en gel. El estado de  oligomerización  se  dedujo  a  partir  de  la  obtención  del  peso  molecular  por  comparación  con  los  patrones.  

 

65

4.3 BASES  MOLECULARES  DE  LA  RESPUESTA  A  BIOTINA  EN  ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA.      Los  estudios  desde  hace  36  años  han  presentado  evidencias  que  indican  la  implicación  de  la  biotina  en  el  control  de  la  expresión  génica  en  animales  de  laboratorio y células en cultivo. La lista  de proteínas cuya expresión es afectada por  la  biotina  incluye  enzimas  implicadas  en  el  metabolismo  de  la  glucosa,    enzimas  asociadas a  la homeostasis  de la biotina, transportadores de vitaminas, factores de  transcripción,  citokinas  y  sus  receptores  y  oncogenes  (Baur  et  al.  2002;  De  La  Vega  and Stockert 2000; Pacheco‐Alvarez et al. 2002).     Con  objeto  de  esclarecer  el  posible  efecto  de  la  biotina  sobre  la  expresión  génica de carboxilasas dependientes de biotina, acerca de lo cual no hay consenso en  la  literatura,  y  que  permitiría  sentar  las  bases  para  una  posible  terapia  de  suplementación con esta vitamina, nos centramos en el estudio de dos enzimas, PCC  y  MCC,  cuyo  defecto  causa  acidemia  propiónica  y  metilcrotonilglicinuria,  respectivamente.  Para analizar  el  posible efecto de una suplementación  con biotina  sobre  la  expresión  de  PCC  y  MCC  utilizamos  dos  modelos  celulares,  hepatoma  (Hep3B)  y  linfoblastos  (MCR),  que  cultivamos  durante  periodos  largos  de  tiempo  (14‐16 días) en presencia de diferentes niveles de biotina.     Para alterar los niveles de la biotina se prepararon medios de cultivo con un  10%  de  tres  sueros  comerciales  diferentes  con  concentraciones  de  biotina  ya  definidas  en  la  literatura;  FBS  (biotina  100‐200  nM),  NBCS  (biotina  G 

Skipping exón 13 

2‐3 %(Desviat et al. 2006) 

PCCA/19802 

IVS13nt+3A>G 

Skipping exón 13 

2‐3 %(Desviat et al. 2006) 

La presencia de transcritos normales en estos pacientes abría la posibilidad de  utilizar  compuestos  como  el  valproico,  el  butirato  sódico  y  la  kinetina  cuyo  efecto  sobre  la  restauración  del  splicing  normal  había  sido  descrito  en  otros  trabajos.  Para  analizar  este  posible  efecto  se  cultivaron  fibroblastos  de  los  tres  pacientes  en  presencia  de  valproico  o  butirato  sódico  a  una  concentración  final  de  500  μM  durante  24  horas  o  con  kinetina  100  μM  durante  72  horas,  después  se  recogió  el  precipitado celular mediante centrifugación y posteriormente se cuantificó el mRNA  correctamente  procesado  llevando  a  cabo  una  qRT‐PCR  utilizando  sondas  específicas  para  los  exones  delecionados  que  nos  permitían  rescatar  sólo  los  transcritos normales. No se observó variación significativa en los niveles de mRNA  correctamente  procesado  para  las  tres  líneas  de  fibroblastos  con  ninguno  de  los  compuestos  utilizados.  Para  el  paciente  17475  se  llevaron  a  cabo  además  experimentos  de  medida  de  actividad  PCC  y  tampoco  se  observó  un  aumento  en  presencia de los diversos compuestos (Fig 26)  120 100

Cantidad relativa (%)

RNA  Actividad

80 60 40 20 0

16440 (control)

17475

17475 17475 17475 Valproíco NaBu Kinetina 500μM 500μM 100μM 24 horas 24 horas 72 horas

Figura  26:  Porcentaje  de  mRNA  con  el  exón  23  y  actividad  de  fibroblastos  control  y  del  paciente  17475  tras  cultivo  en  presencia  de  diversos  compuestos.  Los  datos  son  la  media  de  al  menos  dos  experimentos independientes por duplicado. 

72

4.4.2  ANÁLISIS  DEL  EFECTO  DE  OLIGONUCLEÓTIDOS  ANTISENTIDO  SOBRE LA INCLUSIÓN ABERRANTE DE PSEUDOEXONES.    Los pacientes 22742 y 23660 fueron diagnosticados de acidemia propiónica en  base  a  sus  niveles  de  metabolitos  marcadores  en  sangre  y  orina  y  ensayos  enzimáticos  en  fibroblastos  y  fueron  referidos  al  laboratorio  para  su  estudio  genético.    En el cDNA del paciente  22742 se observó una inserción entre los exones 14 y  15 de 84 pares de bases correspondientes a una región del intrón 14 del gen PCCA.  Esta secuencia intrónica ya había sido descrita (Campeau et al. 1999) como transcrito  minoritario en individuos normales, pero en el paciente el transcrito con la inserción  era prácticamente exclusivo. Los análisis en el gDNA del paciente 22742 revelaron el  cambio nucleotídico IVS14‐1416A>G en el interior de las 84 pb. El análisis mediante  programas de predicción de secuencias auxiliares de splicing, en concreto el uso de  ESEfinder ha identificado que este cambio nucleotídico en el paciente PCCA elimina  un sitio de unión para SRp55 y crea una nueva secuencia de unión a SRp40 (Fig. 27),  por lo tanto este cambio generaría una secuencia reconocida con gran afinidad por la  maquinaria de splicing que llevaría a cabo la inclusión en el mRNA maduro de las 84  pb como si fueran un exón (pseudoexón).  

A

G

ag//…………TGAATTTCATA/GGAACATCAGTTT…………..//gt

SF2/ASF

SC35

SRp40

SRp55

Figura 27: Análisis in silico con el programa ESEfinder del pseudoexón para PCCA en cuyo interior se encuentra la base que aparece mutada en el paciente (rosa). Se muestran el cambio en el patrón de unión a los factores de splicing Srp55 y Srp40 dependiendo si la base es la A ( nucleótido wt) o la G (nucleótido mutante)

De  manera  análoga,    para  el  paciente  23660  se  identificó  una  inserción  en  el  cDNA de PCCB de 72 pares de bases entre los exones 6 y 7 correspondientes a una  región  del  intrón  6.  El  cambio  nucleotídico  encontrado  en  gDNA  es  IVS6+462A>G,  este  cambio  se  encuentra  en  la  posición  +5  relativa  al  GT  de  la secuencia  insertada   incrementando el sitio 5´críptico donador de splicing aumentando el score de 0,93 a 1  73

aumentando  la  afinidad  de  la  secuencia  consenso  de  reconocimiento  de  U1snRNA  (Fig. 28). Análisis adicionales in silico utilizando el ESEfinder predicen la creación de  un  sitio  para  SRp55.  Como  ocurre  para  el  paciente  22742  parece  probable  que  ese  cambio  genere  un  reconocimiento  por  parte  de  la  maquinaria  de  splicing  de  una  región  en  el  intrón  6  que  se  introducirá  en  el  mRNA  maduro  como  un  exón  generando un mensajero aberrante cuya traducción queda interrumpida de manera  prematura.   

U1 snRNA

UCCAUUCAUA

Paciente PCCB

AGGTACATAT G

Figura 28: Alineamiento entre  la  secuencia  consenso  para  U1snRNA  y  la  región  donadora  de  splicing del pseudoexón, se observa que el cambio de una A por una G en el nucleótido + 5 (en  rojo) del pseudoexón aumenta la complementariedad entre ambas secuencias.  

A  partir    de  estos  datos  previos,  nos  planteamos  como  hipótesis  que  la  eliminación  de  estas  inserciones  produciría  la  recuperación  del  mRNA  normal,  la  obtención de proteína normal y como consecuencia la recuperación de la actividad.    Para la eliminación del pseudoexón se utilizaron oligonucleótidos antisentido  tipo  morfolinos  (diseñados,  sintetizados  y  purificados  por  la  casa  comercial  Gene  Tools)  que  se  unirían  a  la  región  3´  ó    5´  del  pseudoexón    e  impedirían  su  reconocimiento  por  parte  de  la  maquinaria  de  splicing  y  su  inclusión  en  el  mRNA  final (Fig 29).    b)

a)

Exon 14

84 bp

Exon 15

Exon 15

Exon 6

gt

ag

Exon 6

A >G

ag

gt

72 bp

0.87

ag

0.98

gt

1

ag

1

gt

0.98

0.92

0.92 Exon 14

A >G

0.93

c.654ins72 (IVS6+462A>G)

c.1209ins84 (IVS14-1416A>G)

Exon 7

Exon 7

Figura 29:  Esquema de la incorporación a) del fragmento de 84 pares de bases en el mRNA  de PCCA entre los exones 14 y 15 y b) del fragmento de 72 pares de bases en el mRNA de  PCCB  entre  los  exones  6  y  7.  En  verde  se  muestra  el  cambio  nucleotídico  presente  en  cada  paciente y en azul el oligo antisentido que se une a la región 5´ o 3´del pseudoexón. También se   indica encima de las  diferentes secuencias el valor de splicing según (Shapiro et al 1987).   

74

El  cultivo  de  los  fibroblastos  de  los  dos  pacientes  en  presencia  de  los  oligonucleótidos  antisentido  (AON)  en  las  condiciones  que  se  describen  en  materiales  y  métodos  permitió  la  recuperación  total  del  transcrito  normal  (sin  la  inserción) tanto a las 48 horas como a las 72 horas de tratamiento con el AON tanto a  10μM  como  a  20  μM  (Fig.  30).  La  identidad  de  las  bandas  se  comprobó  mediante  secuenciación.    a)   1

b)  2

3

4 Exon 15

Exon 14 Exon 14

1

2

3

4 Exon 7

Exon 6

Exon 15

Exon 6

Exon 7

Figura  30:  RT‐PCR  a  partir  de  mRNA  obtenido  de  fibroblastos  control  y  de  los  pacientes  22742  y 23660 sin transfectar o 72 horas tras la transfección con 10 μM ó 20 μM de AON. a)  carril 1: fibroblastos control, carril 2: 22742, carril 3: 22742 + 10 μM AON, carril 4: 22742 + 20 μM  AON.  b)  carril  1:  fibroblastos    control,  carril  2:  23660,  carril  3:  23660  +  10  μM  AON,  carril  4:  23660 + 20 μM AON 

  Por  otra  parte  se  llevo  a  cabo  la  medida  de  la  actividad  PCC  en  los  fibroblastos de los pacientes transfectados con los AONs, para comprobar si 72 horas  tras  la  transfección  la  recuperación  del  transcrito  normal  era  paralela  a  una  recuperación  de  la  actividad.  Los  resultados  indican  que  la  actividad  se  recupera  totalmente alcanzando niveles control en ambas líneas celulares (Fig. 31). 

Actividad PCC (pmol/min/mg)

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0

Control

0

10

22742

20

0

10

23660

20

[ AONs ] µM Línea celular

Figura 31: Medida de la actividad carboxilasa en fibroblastos control y de los pacientes 22742  y 23660 72 horas tras la transfección con distintas concentraciones de AONs. Todos los datos  son la media de tres experimentos independientes por duplicado. 

75

Asimismo, en el caso del defecto en el gen PCCA, analizamos la cantidad  de proteína PCCA biotinilada en los fibroblastos del paciente 22742 transfectados  o  no  con  20  μM  de  AONs  durante  72  horas,  observándose  que  en  presencia  de  AONs se recupera la proteína PCCA (Fig 32). 

MCCA

PCCA

- AON

20 µM AON

Hep 3B

Figura 32: Detección de las proteínas biotiniladas PCCA y MCCA en extractos celulares de fibroblastos del paciente 22742 sin transfectar con AON o 72 horas tras la transfección con 20µM del AONs. Se utilizaron mitrocondrias de hepatoma como control.

Para comprobar que el efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre los  fibroblastos de los pacientes era específico de secuencia se hicieron una serie de  experimentos utilizando diferentes AONs y diferentes líneas celulares. En primer  lugar    se  cultivaron  los  fibroblastos  del  paciente  22742  con  un  oligo  antisentido  específico  de  otro  gen  diferente  a  PCCA  y  se  midió  la  actividad  en  el  extracto  celular tras transfección durante  72 horas con 20 μM  de este AON, el resultado  obtenido fue que la línea celular 22742 no presentaba aumento de actividad con  respecto  al  cultivo  sin  transfectar,  lo  mismo  ocurría  para  la  línea  celular  23660,  cuando  se  transfectaba  durante  72  horas  con  20  μM  de  un  AON  no  específico  para el gen PCCB.   La  secuencia  intrónica  que  se  incorpora  en  el  mRNA  de  PCCA  del  paciente  22742  ya  había  sido  descrita  (Campeau  et  al.  1999)  como  transcrito  minoritario  en  individuos  normales  y  también  es  detectada  en  pacientes  con  mutaciones  de  frameshift  o  mutaciones  nonsense  que  producen  mRNA  con  un  codón  de  parada  prematuro  (PTC).  Se  eligió  un  paciente  (21398)  con  una  mutación  nonsense  en  homocigosis  y  que  presentaba  la  inserción  para  comprobar  si  la  eliminación  de  la  inserción  utilizando  el  AONs  revertía  el  fenotipo  deficiente.  El  resultado  fue  que  no  se  recuperó  la  actividad  en  este  paciente, siendo por lo tanto el efecto observado para el AONs, específico de la  mutación del paciente 22742.  

  76

                                   

5. DISCUSIÓN 

77

5.1 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH    5.1.1 Respuesta a tetrahidrobiopterina en fenilcetonuria.      El  genotipado  de  pacientes  PKU  sometidos  a  sobrecarga  con  BH4  intenta  establecer  las  relaciones  entre  el  fenotipo  y  el  genotipo  de  los  fenilcetonúricos  que  responden a BH4 para intentar predecir en base al genotipo que pacientes, a priori,  son  susceptibles  de  ser  respondedores.  La  expresión  y  caracterización  de  las  mutaciones  asociadas  a  respuesta  a  BH4  intenta  esclarecer  cuales  con  los  mecanismos moleculares subyacentes a la respuesta.    Un  alto  porcentaje  de  los  pacientes  del  presente  trabajo  con  una  respuesta  favorable  al  test  de  sobrecarga  presentaban  fenotipos  suaves  (HFAs  y  PKU  leves).  Actualmente  se  cree  que  el  número  de  pacientes  que  se  pueden  beneficiar  de  este  tratamiento  podría  representar  el  60‐80  %  PKU  leves  o  moderados  y  un  40%  de  la  población total PKU (Blau and Erlandsen 2004; Zurfluh et al. 2008).    En  general  la  diversidad  alélica  en  los  pacientes  que  responden  es  grande  y  casi  el  90%  de  ellos  son  compuestos  heterocigotos,  por  lo  tanto  es  importante  el  estudio de los genotipos asociados a respuesta en cada población para determinar su  prevalencia.    La mayoría de las variantes alélicas missense que portaban los pacientes que  respondían (Tabla10) habían sido previamente descritas en pacientes respondedores,  excepto la R176L, S87R, P275R y L348V. De estas cuatro mutaciones las dos primeras   se  encontraban  presentes  en  pacientes  hemicigotos  (en  combinación  con  una  mutación  funcionalmente  nula)  permitiendo  determinar  su  relación  directa  con  la  respuesta a BH4, las otras dos mutaciones aparecen combinadas en un paciente  y se  desconoce  cual  de  las  dos  o  si  la  combinación  de  ambas  es  responsable  del  efecto  positivo  frente  a  BH4,  ya  que  L348V  aparece  junto  a  Y414C  en  un  PKU  leve  que  responde pero también en un paciente que presenta una mutación de splicing y  que  es no respondedor.     Otras  dos  mutaciones  interesantes  son  D415N  y  E390G,  que  han  sido  previamente  descritas  como  posiblemente  asociadas  a  respuesta  pero  que  en  este  estudio se encontraban combinadas en algún paciente con mutaciones nulas por lo  que se demuestra su implicación directa en la respuesta.       Todas  las mutaciones  missense asociadas  a respuesta en este trabajo (excepto  P275R) han sido analizadas cinéticamente en diversos trabajos y presentan actividad  residual (Pey et al. 2003), de ellas el 70% se localizan en el dominio catalítico, el 15%  78

en el dominio regulador y el otro 15% en la región de tetramerización, coincidiendo  esta distribución con la descrita en otros estudios (Zurfluh et al. 2008)    La única mutación no missense que está asociada a respuesta es IVS10‐3ntC>T,  esta aparece en homocigosis en un paciente HFA (19548) que presenta una respuesta  lenta. Esta mutación produce un skipping del exón 11 en el mRNA. Los estudios de  splicing  en  este  trabajo  (Fig.  12)  y  en  otros  anteriores  (Jaruzelska  et  al.  1995)  han  demostrado que existen transcritos normales, y por lo tanto proteína normal, lo cual  explicaría el fenotipo suave del paciente. Este caso es el primero en el que se asocia  una  mutación  de  splicing  a  una  respuesta  a  BH4  (recientemente  se  ha  descrito  otra  mutaciones de splicing (IVS4 ‐5C>G) que ha sido asociada claramente a respuesta a  BH4    (Zurfluh  et  al.  2008)).  La  estabilización,  al  actuar  la  BH4  como  chaperona  química,  de  los  niveles  reducidos  de  proteína  PAH  normal  en  este  paciente,  produciría  un  aumento  en  la  cantidad  y  actividad  PAH  y  justificaría  la  respuesta.  Esta  hipótesis  se  correlaciona  con    resultados  en  hepatoma  que  se  discuten  en  el  siguiente apartado. Otra hipótesis que explicaría la respuesta en este paciente sería  que  los  niveles  elevados  de  BH4  produjeran  la  activación  de  la  transcripción  del  mRNA  de  la  PAH  o  la  activación  de  factores  de  splicing  que  aumentarían  el  porcentaje de transcrito correctamente procesado con el exón 11.     En  este  trabajo  ciertas  mutaciones  (I65T,  R261Q,  L348V,)  aparecen  tanto  en  individuos  que  responden  como  en  aquellos  que  no  y  se  han  descrito  en  otros  trabajos    inconsistencias  en  la  respuesta  en  pacientes  con  el  mismo  genotipo,  particularmente en pacientes que portan las mutaciones L48S, I65T, R158Q, R261Q e  Y414C  (Desviat  et  al.  2004;  Fiori  et  al.  2005;  Leuzzi  et  al.  2006;  Yildirim  et  al.  2007)  esto  hace  que  todavía  sea  desconocida,  para  algunas  mutaciones,  cual  es  su  implicación  en  la  respuesta,  desconociéndose  por  el  momento  hasta  que  punto  la  combinación  de  distintas  mutaciones  y  las  características  fisiológicas  de  cada  individuo determinan la respuesta. A pesar del número de trabajos realizados y del  elevado número de  pacientes descritos con una repuesta positiva, la diversidad en  los protocolos utilizados no permite comparar todos los casos de forma cuantitativa.    La  presencia  de algunas mutaciones de  forma persistente  (I65T aparece  en  4  de los 11 respondedores de este trabajo y D129G aparece en 3 pacientes descritos en  varios  trabajos  (Baldellou  et  al.  2006;  Hennermann  et  al.  2005)  y  la  existencia  de  individuos  homocigotos  (IVS10‐3  C>T)  o  hemicigotos  (D415N,  E390G...)  que  responden, permite pensar que determinadas mutaciones o combinados genotípicos  están asociados directamente a la respuesta.     Los  casos  reportados  de  monoterapia  con  BH4  a  largo  plazo  parecen  prometedores  ya  que  algunos  pacientes  mantienen  en  su  sangre  niveles  de  fenilalanina dentro de los rangos terapéuticos (Belanger‐Quintana et al. 2005; Cerone  et al. 2004; Hennermann et al. 2005; Lambruschini et al. 2005; Trefz et al. 2005) por lo  79

que  esta  terapia  se  muestra  como  una  alternativa  real  a  la  dieta  y  hace  muy  interesante  la  posibilidad  de  poder  predecir  en  muchos  casos  ,en  base  al  genotipo,  qué  individuos  fenilcetonúricos  tienen  altas  probabilidades  de  beneficiarse  del  tratamiento  oral  con  BH4.  Recientemente  se  ha  descrito  la  eficacia  del  tratamiento  con  una  forma  sintética  biológicamente  activa  de  la  BH4,  la  dihidroclorido  sapropterina  (comercialmente  llamado  KuvanTM)  y  que  se  encuentra  en  fase  clínica  III(Burton et al. 2007; Levy et al. 2007)    Con  el  objetivo  de  entender  los  mecanismos  que  subyacen  a  la  respuesta  positiva  a  BH4  se  han  llevado  a  cabo  diversos  estudios  de  expresión  para   caracterizar cinética y estructuralmente la PAH normal y varias proteínas mutantes  presentes en pacientes que responden.     Por  estudios  estructurales  previos  se  conoce  que  las  mutaciones  asociadas  a  respuesta no sólo afectan a las regiones de unión al BH4 o a regiones próximas a esta  zona sino que se encuentran distribuidas por los tres dominios de la PAH por lo se  han  propuesto  varias  hipótesis  para  explicar  el  efecto  de  la  BH4  sobre  la  PAH:1)  efecto  catalítico  (compensación  de  Km  elevadas),  2)  efecto  estabilizador  sobre  la  proteína  (chaperona  química),  3)  efecto  sobre  la  expresión  génica  de  la  PAH,  aumentando la transcripción o estabilizando el mRNA , 4) efecto por compensación  de  concentraciones  subsaturantes  de  cofactor  en  hígado  y  5)  efecto  protector  de  la  BH4 frente a la inactivación    Mediante el análisis cinético llevado a cabo en cinco proteínas mutantes (D129G,  H170D,  V190D,  E390G,  P407S)  como  proteínas  de  fusión  a  MBP,  se  ha  observado  que cuatro de las cinco presentan defectos en alguna de las propiedades catalíticas  y/o reguladoras, con pérdida de función,  pero manteniendo actividad residual.     La Km por BH4 sólo está elevada en la proteína mutante D129G, por lo que  para las otras cuatro variantes analizadas cinéticamente en este trabajo, la hipótesis  catalítica no es la que subyace a la respuesta positiva. Respecto a la mutante D129G  analizando la estructura de la proteína PAH se observa que el Asp 129 se encuentra  localizado en el dominio catalítico y forma un puente de hidrógeno con la Ala132 y  con  la  Arg  234.  El  cambio  del  aspártico  129  por  una  glicina  altera  las  interacciones  con estos dos aminoácidos produciendo una desestabilización de la parte inicial de  la  región  catalítica,  este  cambio  estructural  podría  propagarse  al  centro  activo  pudiendo  afectar  a  la  afinidad  por  BH4  y  resultando  en  un  incremento  de  la  Km  (Fig. 33).  Se  han  identificado  más  mutantes  de  Km  en  estudios  previos  en  el  laboratorio  (F39L,  I65T,  P244L,  L308F  y  A309V),  pero  además  de  representar  un  número  reducido  dentro  de  las  mutaciones  asociadas  a  respuesta,  los  incrementos  de  Km  detectados en ellas son leves, por lo que se  piensa que este no es el mecanismo más  80

importante implicado en la respuesta. Se ha descrito que en PKU solo un tercio de  las proteínas mutantes asociadas a respuesta a BH4 presentan una afinidad reducida  por este cofactor (Pérez et al. 2005). 

Figura 33: Visualización parcial de la estructura cristalizada de la PAH humana. La figura muestra  la Asp129 (verde), los aminoácidos con los que interaccionan, la Arg 243 y la Ala132. Se muestra la  BH4 (rojo) localizada en el sitio activo. 

  Para  analizar  el  efecto  de  la  BH4  sobre  la  estabilidad  de  las  proteínas  mutantes  se  han  analizado  once  proteínas  mutantes  (F39L,  R68S,  E178G,  V190A,  A300S,  A309V,  A313T,  A373T,  V388M,  E390G,    Y414C)  en  el  sistema  de  expresión  TNT  libre  de  células,  la  mayoría  de  ellas  tienen  vidas  medias  disminuidas  en  ausencia  de  BH4  y  con  respecto  a  la  salvaje,  confirmándose  un  defecto  estructural  que originaría una degradación acelerada. En tres de ellas (A309V, V388M y Y414C)  este  defecto  es  corregido  al  aumentar  los  niveles  de  BH4.  Este  resultado  avala  la  hipótesis de que la BH4 ejerce un efecto protector sobre algunas mutaciones frente a  la degradación proteolítica.  En la PAH recombinante se ha demostrado que la unión  a BH4 resulta en una reducción en la proteólisis por tripsina (Solstad and Flatmark  2000).     La  utilización  de  un  modelo  celular  de  hepatoma  para  estudiar  el  efecto  de  distintos niveles de BH4 sobre la PAH endógena y sobre proteínas de fusión PAHwt  y  mutantes  transfectadas  permite  estudiar  la  relación  entre  BH4  y  la  PAH  en  un  entorno  más  fisiológico.  Cuando  el  hepatoma  se  cultiva  en  presencia  de  niveles  elevados  de  BH4  se  observa    una  mayor  cantidad  de  proteína  y  una  mayor  estabilidad  de  la  PAH  endógena,  este  efecto  ha  sido  observado  también  utilizando  como  modelo  el  ratón  wt  y  el  ratón  deficiente  en  el  gen  PTS  (Scavelli  et  al.  2005;  Thony  et  al.  2004).  Este  efecto  estabilizador  sobre  la  PAH  endógena  justifica  la  respuesta  a  BH4  que  existe  en  el  paciente  19548  (Tabla  10).  Este  paciente  es  homocigoto  para  la  mutación  de  splicing  IVS10nt‐3  C>T,  este  cambio  nucleotídico  altera  el  sitio  aceptor  de  splicing  del  intrón  10  y  como  consecuencia  se  produce  la  eliminación  del  exón  11 en  la  maduración del mensajero aunque esto no ocurre en  todos los transcritos, sino que se ha comprobado (Fig. 12) (Jaruzelska et al. 1995) que  existen  niveles  reducidos  de  mRNA  PAH  normal.  Esto  haría  que  en  el  paciente  se  81

sintetizara  una  cantidad  reducida  de  PAH  normal  que  sería  estabilizada  por  la  sobrecarga  a BH4,  aumentando  la cantidad  relativa  de  la enzima  y produciendo  la  respuesta.    Las tres proteínas  expresadas como proteínas de fusión  al  péptido FLAG  en  células  Hep3B  (A309V,  V388M  y  Y414C)  fueron  seleccionadas  por  presentar  una  corrección en su defecto estructural en el sistema TNT en presencia de BH4. Cuando  transfectamos estas proteínas mutantes en el sistema de hepatoma observamos que  dos de las tres se acumulan en menor cantidad que la proteína wt, esto coincide con  la menor cantidad de estas proteínas detectadas en el modelo TnT  y como proteínas  MBP‐PAH expresadas en E coli. También se observa que al cultivar el hepatoma con  niveles  elevados  de  BH4  las  tres  proteínas  mutantes  transfectadas  aumentan  su  cantidad relativa entre 1,5 ‐ 2,5 veces alcanzando y superando en algunos casos los  niveles  de  la  proteína  FLAG‐PAHwt,  coincidiendo  también  con  los  resultados  obtenidos en el modelo TNT.    Todos  estos  resultados  obtenidos  en  diversos  trabajos  y  con  diversas  metodologías  permiten  afirmar  que  el  efecto  estabilizador  de  la  BH4  como  chaperona  química  sobre  la  PAH  previniendo  su  degradación  es  un  mecanismo  relevante en la respuesta.    Existen varios trabajos en la literatura sobre el efecto a nivel de regulación de  la expresión génica de la BH4. Para la proteína oxido nítrico sintasa, de la que la BH4  es también cofactor, se ha descrito que un aumento en los niveles de BH4 producen  un aumento en los niveles de mRNA de esta enzima (Linscheid et al. 1998; Saura et  al.  1996)  y  para  un  ratón  transgénico  con  defecto  en  la  GTP  ciclohidrolasa,  se  ha  descrito  un  aumento  de  actividad,  niveles  de  proteína  y  mRNA  para  la  PAH  en  hígado tras administración oral de cofactor (Hyland and Munk‐Martin 2001).   En  el  presente  estudio  se  analizó  el  posible  efecto  de  la  BH4  sobre  transcripción y estabilidad del mRNA de la PAH en hepatoma. Para ello se midió el  efecto  de  niveles  elevados  de  BH4  sobre  el  mRNA  PAH  endógeno  y  sobre  la  expresión  de  genes  reporter  clonados  bajo  el  promotor  de  la  PAH.  Los  niveles  elevados de BH4 no ejercen ningún efecto ni en la mayor expresión del gen PAH, ni  en  la  mayor  estabilidad  del  mRNA. Esto concuerda con otro  estudio  utilizando  un  modelo experimental de ratón con defecto en la ruta de biosíntesis del cofactor (en  concreto el gen PTS) en el cual se observó que mientras la actividad y la cantidad de  enzima disminuyen (al estar disminuidas las concentraciones de BH4) las cantidades  de mRNA son similares para los ratones control que para los defectivos (ratón k.o.  para PTPS)(Thony et al. 2004).    En  los  estudios  con  hepatoma  se  observa  un  efecto  del  dicumarol,  este  disminuye la cantidad de mRNA de la PAH. El hecho de que el dicumarol no sólo  sea un inhibidor de la sepiapterina reductasa y por lo tanto de la biosíntesis de BH4,  82

sino  que  también  inhibe  otros  procesos  celulares  sugiere  que  la  inestabilidad  y  disminución del mensajero de la PAH quizá no sea específico de la bajada del BH4  sino secundario a otros efectos del dicumarol, esto coincide con que al utilizar otro  inhibidor de la vía de síntesis del cofactor (DAHP) no se observa disminución en los  niveles  de  mRNA.  De  manera  inesperada  la  inhibición  de  la  enzima  GTP  ciclohidrolasa  con  DAHP  produce  un  aumento  en  la  cantidad  y  por  lo  tanto  en  la  actividad  de  la  PAH  que  podría  explicarse  por  un  posible  efecto  inespecífico  del  DAHP sobre la traducción que justificaría este resultado.    Existen otras hipótesis asociadas al efecto de la BH4 que han sido analizadas  en  otros  estudios  y  que  podrían  contribuir  a  la  respuesta,    una  de  ellas  se  basa  en  que  las  concentraciones  fisiológicas  de  BH4  en  el  hígado  son  subsaturantes,   concentraciones inferiores a la Km por BH4 de la PAH, produciendo una actividad  submáxima  de  la  PAH.  La  sobrecarga  con  BH4  produciría  un  aumento  en  las  concentraciones  del  cofactor  en  el  hígado  aumentando  la  actividad  fenilalanina  hidroxilasa (Kure et al. 2004).     También  en  trabajos  previos  en  el  laboratorio  se  ha  postulado  que  la  BH4  ejerce un efecto protector frente a la inactivación por un fenómeno de tipo oxidativo.  Este  efecto  protector  de  la  BH4  frente  a  la  inactivación  oxidativa  puede  deberse  al  cambio conformacional que el cofactor parece inducir sobre la proteína, que causa la  oclusión  del  centro  activo  por  una  secuencia  autorreguladora  presente  en  el  dominio  N‐terminal,  pudiendo  proteger  de  este  modo  a  los  residuos  esenciales  para  la  catálisis. La BH4 también podría actuar directamente como antioxidante (Kohnen et  al. 2001; Kuzkaya et al. 2003)  ya sea libre en disolución o unido al centro activo de la  PAH.     Los  distintos  datos  existentes  en la  literatura  y  los  obtenidos  en  este  estudio  permiten  afirmar  que  aunque  los  mecanismos  moleculares  que  subyacen  a  la  respuesta  positiva  a  BH4  todavía  no  han  sido  totalmente  dilucidados,  se  confirma  que  posiblemente  sea  un  efecto  multifactorial  y  dependiente  del  tipo  de  mutación,  apuntando a un efecto estabilizante de la BH4 que actuaría como chaperona química  como mecanismo mayoritario. 

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5.1.2 Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada    Para  conocer  los  mecanismos  moleculares  responsables  de  la  respuesta  a  cobalamina  in  vivo  e  in  vitro  que  se  ha  descrito  en  diversos  pacientes  con  acidemia  metilmalónica  aislada  perteneciente  al  grupo  de  complementación  cblB    (mutante  MMAB) se ha utilizado un sistema de expresión procariota  para expresar y analizar  cinética  y  estructuralmente  la  enzima  codificada  por  el  gen  MMAB,  la  ATP:cob(I)alamina    adenosiltransferasa  humana  (hATR)    con  varias  mutaciones  (I96T y  R195H) asociadas a esta respuesta.    La primera mutación I96T es una mutación missense localizada en el exón 3  y  la segunda mutación aparece en el último nucleótido del exón 7 y afecta al correcto  procesamiento del mRNA produciendo la deleción del exón 7 y como consecuencia  una  mutación  de  parada  prematura  p.S174fs.  Existe  la  posibilidad  de  que  haya  transcritos con el exón 7 pero con la mutación R195H, aunque datos del laboratorio  indican  que  dichos  transcritos  serán  muy  minoritarios  por  lo  que  la  respuesta  a  cobalamina será responsabilidad fundamentalmente de las características cinéticas y  conformacionales de la proteína mutante I96T.    La  mutación  I96T  aparece  en  otro  paciente  con  respuesta  positiva  in  vitro  a  cobalamina  en  combinación  con  la  mutación  R191W,  localizada  en  la  región  de  trimerización  (Fig.  34)  La  mutación  R191W  ha  sido  expresada  como  proteína  de  fusión  a  GST    y  presenta  una  disminución  de  su  afinidad  por  los  sustratos  ATP  y  cob(I)alamina (Zhang et al. 2006). Para este paciente la respuesta a cobalamina por lo  tanto será debida a un efecto a varios niveles debido a las características cinéticas y  estructurales  tanto de la mutante R191W  como de la mutante I96T.  I96

E91

R191

E84 R195 Figura 34: Visualización parcial de la estructura trimérica cristalizada de la ATR humana. La figura  muestra la región de interacción entre los tres monómeros con los pares implicados en trimerización  Glu84(gris) /Arg195(azul oscuro) y Glu91(verde oscuro) / Arg191 (rosa) y los puentes de hidrógeno  que establecen entre ellos en verde punteado. En azul claro se muestra la I96.  

  Mediante el análisis cinético se ha observado que la proteína con la mutación  I96T tiene un 60% de actividad con respecto a proteína la wt, pero esta disminución  84

de la actividad no es debida a una disminución de la afinidad por los sustratos ATP  o Cob(II)alamina cuyas Km y Kd se ha comprobado que son normales. Esta menor  actividad  tampoco  parece  ser  debida  a  una  distribución  oligomérica  incorrecta  ya  que  por  cromatografía  en  gel  se  ha  observado  una  composición  mayoritariamente  trimérica muy similar a la obtenida para la proteína salvaje por lo que es posible que  la menor actividad de la proteína sea debida a una menor estabilidad de la misma.    El análisis cinético para la mutación R195H revela unos niveles de actividad  iguales  a  los  de  la  proteína  wt.  Sin  embargo  la  distribución  de  los  oligómeros  esta  alterada  apareciendo  una  proporción  de  monómeros  mayor.  Parece,  por  tanto  una  mutación  estructural,  este  resultado  sería  coherente  con  la  posición  que  ocupa  el  aminoácido alterado, la arginina 195. El aminoácido R195 es esencial en la región de  trimerización junto con Glu 84, Glu 91 y Arg 191 (Fig 34), la alteración en cualquiera  de estos aminoácidos podría alterar de forma significativa la formación y estabilidad  del oligómero. La proteína ATR con la mutación R195H presenta una proporción de  trímeros  disminuida  pero  una  actividad  similar  a  la  wt,  este  resultado  podría  deberse a que el ensayo de actividad se llevó a cabo inmediatamente después de la  purificación de la proteína mientras que la cromatografía se realizó tras almacenar la  proteína durante 48 horas a 4ºC.   Sería necesario llevar a cabo experimentos para calcular la vida media de las  dos  proteínas  mutantes  para  poder  determinar  la  existencia  de  un  defecto  estructural.    En el caso más probable de que la mayoría de los trímeros que forma la hATR  en  el  paciente  portaran  la  mutación  I96T  y  teniendo  en  cuenta  los  resultados  obtenidos  en  los  estudio  cinéticos  y  de  estructura,  la  respuesta  a  cobalamina  no  es  debida  a  una  compensación  por  alteraciones  en  las  constantes  de  afinidad  por  los  sustratos sino que parece más probable que la hidroxicobalamina ejerza otros efectos  entre  los  que  estaría  un  efecto  estabilizante.  Sería  necesario  analizar  el  efecto  de  la  cobalamina sobre la estabilidad de las proteínas mutantes de manera similar a como  se ha hecho para PAH y BH4.    La ATR no sólo cataliza la transferencia de un grupo adenosilo desde el ATP  a  la  cobalamina  para  generar  la  adenosilcobalamina,  sino  que  es  la  responsable  de  transferir esta AdoCbl a la enzima de la que es cofactor, la metilmalonil‐CoA mutasa  (MCM),  en  este  proceso  está  implicada  además  la  proteína  MMAA  (que  tiene  actividad  GTPasa)  aunque  todavía  se  desconoce  que  papel  exacto  ejerce  en  la  transferencia (Banerjee  2006).  Se postula  que  las tres proteínas interaccionarían por  lo  que  mutaciones  en  cualquiera  de  las  tres  proteínas  pueden  alterar  estas  interacciones  y  producir  como  resultado  un  defecto  en  la  actividad  MCM.  Sería  interesante  conocer  como  afectan  las  mutaciones  de  la  proteína  ATR  en  la  interacción  con  las  otras  dos  proteínas  y  si  niveles  elevados  de  cobalamina  estabilizan esta unión.  85

  5.1.3 Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en metilcrotonilglicinuria      En  este  estudio  hemos  utilizado  dos  líneas  celulares,  linfoblastos  (MCR)  y  hepatoma 3B (Hep3B), para determinar el efecto de diferentes niveles de biotina en  el medio de cultivo de las células sobre la expresión de varios genes, entre ellos, los  genes que codifican para la subunidad que une biotina en dos carboxilasas celulares  (PCC  y  MCC),  defectivas  en  acidemia  propiónica  y  metilcrotonilglicinuria,  respectivamente    No  se  han  obtenido  evidencias  de  que  exista  modulación  a  nivel  transcripcional  por  parte  de  la  biotina  de  los  genes  MCCA  y  PCCA  en  estos  dos  tipos  celulares.  Estos  datos  coinciden  con  los  resultados  obtenidos  en  estudios  con  células Jurkat (Manthey et al. 2002; Rodriguez‐Melendez et al. 2001) y en células de  rata de diversos tejidos (Rodriguez‐Melendez et al. 2001; Rodriguez‐Melendez et al.  1999)  pero  son  contrarios  a  los  obtenidos  en  HepG2    (Pacheco‐Alvarez  et  al.  2004;  Solorzano‐Vargas  et  al.  2002)  donde  se  muestra  una  regulación  dependiente  de  biotina  de  los  niveles  de  mRNA  de  las  carboxilasas.  También  se  observó  que  no  existía efecto de la biotina sobre la transcripción del gen HLCS que codifica para la  enzima  holocarboxilasa  sintetasa  responsable  de  la  biotinilización  de  la  apocarboxilasas.  Para  este  gen  también  ha  sido  documentado  una  regulación  de  la  expresión génica por parte de la biotina (Solorzano‐Vargas et al. 2002). La diferencia  de  resultados  en  los  distintos  estudios  puede  ser  atribuida  a  las  diferencias  en  las  técnicas  experimentales  utilizadas  y/o  a  efectos  de  factores  biológicos  aun  no  identificados.     Aunque no existía un efecto de la biotina sobre la transcripción de ninguno de  los  genes  más  relevantes  para  las  carboxilasas  en  nuestro  modelo  celular,  esto  no  descartaba  la  posibilidad  de  un  efecto  a  otros  niveles.  El  estudio  de  los  niveles  de  actividades  carboxilasas  y  proteínas  biotiniladas  llevado  a  cabo  en  células  Hep3B  permitió observar que existía una correlación directa entre los niveles de biotina, las  actividades  PCC  y  MCC  y  la  cantidad  de  proteína  biotinilada,  también  se  observó  que la proteína MCC es más sensible a la disminución de los niveles de biotina que  la PCC, este efecto coincide con otros trabajos (Suormala et al. 2002).    Los  estudios  de  reactivación  de  las  carboxilasas  con  biotina  a  distintos  tiempos  y  en  presencia  o  ausencia  de  puromicina  permitieron  determinar  que  la  síntesis de  proteína  no es  requerida  para  la  recuperación de  la actividad. Sí  parece  que podría existir un cierto efecto estabilizador de la biotina ya que la recuperación  de la actividad en ausencia de puromicina y añadiendo biotina 10 μM no es total a  los 30 minutos (la PCC alcanza un 55% de actividad con respecto a la wt y la MCC  tan solo recupera un 20% de actividad), aunque tras ocho horas ambas actividades  alcanzan  los  niveles  control.  En  cualquier  caso  no  es  descartable  un  cierto  efecto  86

estabilizante  de  la  biotina  sobre  las  carboxilasas  aunque  parece  que  el  mecanismo  mayoritariamente  responsable  de  la  reactivación  es  el  paso  de  apocarboxilasa  a  holocarboxilasa.    In  vivo  la  terapia  con  biotina  produce  respuesta  positiva  en  pacientes  con  deficiencia  en  los  defectos  de  biotinidasa  y  en  los  defectos  en  HCS,  en  este  último  caso  la  base  molecular  mayoritariamente  responsable  de  esta  respuesta  es  la  compensación  en  el  defecto  de  afinidad  (Km  elevada)  por  biotina  que  existe  en  muchas  de  las  proteínas  HCS  mutantes  (Sakamoto  et  al.  1999;  Suzuki  et  al.  1996)}  aunque  también  han  sido  reportados  casos  en  los  que  la  respuesta  esta  asociada  a  mutaciones de splicing (Sakamoto et al. 2000; Santer et al. 2003), lo que indicaría que  puede haber otros mecanismos implicados en al respuesta. Sin embargo en acidemia  propiónica  (AP)  no  ha  sido  reportado  ningún  caso  de  respuesta  a  biotina    y  en  metilcrotonilglicinuria  (MCG)  sólo  se  ha  descrito  un  paciente  (Baumgartner  et  al.  2004).     Aunque por los estudios existentes hasta ahora no parece haber una respuesta  significativa, desde el  punto de vista bioquímico, a la administración de biotina en  pacientes  con  acidemia  propiónica,  se  recomienda  la  administración  de  biotina  continuada a dosis de 5‐10 mg/día, que podría ser útil para mantener la enzima con  actividad residual plenamente activa en los momentos de stress metabólico, además  son necesarios más estudios que permitan entender las diferencias en los resultados  obtenidos en distintos tipos celulares y la no respuesta in vivo.    Los  resultados  hasta  ahora  indican  que  la  respuesta  a  biotina  en  acidemia  propiónica y metilcrotonilglicinuria es un evento poco común, por lo que no parece  que pueda llegar a ser una terapia relevante en estas enfermedades. 

 

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5.2 TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING  EN ACIDEMIA PROPIÓNICA      5.2.1  Efecto  de  drogas  sobre  mutaciones  de  splicing  que  producen  niveles  detectables de transcritos normales.    Se  ha  descrito  que  el  uso  de  compuestos  como  valproico,  butirato  sódico  y  kinetina aumenta los niveles de transcritos  correctamente  procesados  en genes con  mutaciones  de  splicing  responsables  de  algunas  enfermedades  como  atrofia  muscular espinal, fibrosis cística, disautonomía familiar (Andreassi et al. 2001; Hims  et al. 2007; Nissim‐Rafinia et al. 2004).     El  valproico  y  el  butirato  sódico  son  inhibidores  de  las  histonas  deacetilasas  (HDAC) y actúan como activadores transcripcionales de genes entre ellos genes que  codifican para algunos factores de splicing como Htra2‐β1 y SC35 (Brichta et al. 2003;  Chang et al. 2001), estos factores a su vez facilitan el correcto splicing del mRNA, esto  ocurre  para  el  caso  del  splicing  del  gen  SMN2  asociado  a  atrofia  muscular  espinal  (Britchta  L  et  al  2003).  La  kinetina  por  su  parte  favorece  el  splicing  correcto  en  la  disautonomía  familiar  y  se  postula  que  influye  en  la  activación  o  la  localización  celular  de  proteínas  específicas  de  splicing  (Hims  et  al;  2007).  Debido  a  .que  los  factores  de  splicing  aumentados  mediante  la  utilización  de  los  diversos  compuestos  son  generales,  su  efecto  podría  ser  efectivo  para  muchos  genes  con  mutaciones  que  alteran  el  splicing  pero  que  presentan  ciertos  niveles  de  transcrito  normal,  siendo  interesante  llevar  a  cabo  experimentos  en  los  diversos  pacientes  con  enfermedades  metabólicas hereditarias que cumplen estas características.    En  los  estudios  realizados  en  este  trabajo  con  pacientes  que  portaban  mutaciones de splicing responsables de skiping exónico en PCCA  no se ha observado  este  efecto  positivo,  no  se  ha  incrementado  el  nivel  de  transcritos  correctamente  procesados.  El  splicing  es  regulado  por  la  interacción  de  un  complejo  repertorio  de  factores  de  splicing  con  diferentes  secuencias  reguladoras  por  lo  que  serían  necesarios  estudios  sobre  que  factores  y  en  que  nivel  están  implicados  en  el  procesamiento  del  mRNA  para  el  gen  PCCA,  de  esta  manera  podríamos  comprender porque no ocurre un efecto favorable de los compuestos utilizados.     Para algunos compuestos como la kinetina se ha demostrado que se requieren  determinados  elementos  en  las  proximidades  de  las  secuencias  canónicas  de  los  exones diana (un elemento CAA cerca del extremo 5´ del exón) (Hims et al. 2007) que  no están presentes en los exones del gen PCCA.   

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Los  niveles  de  transcrito  normal  PCCA  en  los  pacientes  estudiados  eran  aproximadamente  entre  un  5‐15  %  mientras  que  en  los  estudios  en  la  literatura  el  porcentaje  de  mRNA  normal  del  gen  correspondiente  nunca  es  menor  del  20%,  quizá sea necesario un nivel mínimo de reconocimiento de la maquinaria de splicing  sobre las secuencias mutantes para que pueda existir un efecto positivo significativo  de las drogas en el proceso de splicing.    5.2.2  Efecto  de  la  terapia  con  oligonucleótidos  antisentido  sobre  mutaciones  de  splicing que producen inclusión de pseudoexones.    La  modulación  del  splicing  mediante  el  uso  de  oligonucleótidos  antisentidos  (AONs)  ha  sido  usada  en  fibrosis  cística  y  en  la  distrofia  muscular  de  Duchene  (Takeshima  et  al.  2006)  para  interferir  el  proceso  de  splicing  y  originar  proteína  funcional.  La  existencia  de  pacientes  con  acidemia  propiónica  cuyas  características  genéticas  permitían  postular  una  posibilidad  de  beneficio  tras  aplicación  de  esta  terapia fue el motor que impulsó los ensayos realizados en el presente trabajo.     En  los  intrones  existen  secuencias  correspondientes  a  sitios  potenciales  de  splicing 3´y 5´de manera muy abundante, sin embargo, no se incluyen estas regiones  como  exones  de  manera  frecuente  en  el  mRNA  maduro  y  esto  es  debido  a  que,  a  pesar  de  tener  unos  buenos  valores  de  splicing,  estas  regiones  presentan  otros  defectos  importantes,  además  de  un  enriquecimiento  de  regiones  silenciadoras  (Buratti et al. 2006) que impiden su reconocimiento como exones verdaderos.   Estudios  genéticos  previos  en  el  laboratorio  en  dos  pacientes  con  acidemia  propiónica  permitieron  observar  que  estos  pacientes  presentaban  una  inserción  de  una  región  intrónica  (pseudoexones)  en  el  mensajero  maduro  y  un  cambio  nucleotídico en el gDNA en homocigosis. (Tabla 22).    Tabla 22: Secuencia intrónica insertada y variaciones intrónicas genómicas.  Origen de la    secuencia  Cambio en el  Cambio en el gDNA  Gen /Paciente insertada  mRNA  A→G en el medio del pseudoexón  PCCA/22742  Intrón 14   r.1284ins84  (IVS14‐1416A→G)  A→G en posición +5 del sitio 5´  PCCB/23660   Intrón 6  r.654ins72  donador del pseudoexón  (IVS6+462  A→G)      Los estudios in silico de las regiones 3´y 5´de los pseudoexones incorporados  en  estos  pacientes  predicen  scores  de  splicing  elevados.  Esto  sugiere  que  tales  secuencias  deben  ser  incluidas  en  el  mRNA  maduro  generando  un  mRNA  con  un  89

codón de parada prematuro (PTC), que probablemente será diana del sistema NMD  que lo degradará, el mensajero que no es degradado predeciblemente generará una  proteína no funcional.       Para el caso del pseudoexón del gen PCCA (inserción de 84 pares de bases) la  inserción  es  detectada  en  células  control  en  niveles  muy  bajos  y  en  pacientes  con  mutaciones de frameshift o mutaciones nonsense que producen mRNA con PTC. Es  posible  que  estos  transcritos  con  la  inserción  de  pseudoexones  formen  parte  del  mecanismo de control del splicing en el cual eventos alternativos de splicing pueden  regular  la  expresión  génica  por  inclusión  de  pseudoexones  y  activación  de  NMD,  como  se  ha  descrito  para  el  gen  de  la  tropomiosina  (Grellscheid  and  Smith  2006).  Para  el  caso  del  pseudoexón  del  gen  PCCB  la  inserción  no  ha  sido  descrita  ni  en  otros  pacientes  ni  en  individuos  control  por  lo  que  es  un  evento  específico  del  genotipo de este paciente.    La  hipótesis  en  los  dos  pacientes  es  que  el  cambio  nucleotídico  en  el  gDNA  activa la inserción del pseudoexón. Para el caso de PCCA el cambio identificado se  encuentra  en  medio  del  pseudoexón  y  es  una  A  por  una  G.  El  análisis  mediante  programas de predicción de enhancers de splicing, en concreto el uso de ESEfinder ha  mostrado que este cambio nucleótidico elimina un sitio de unión para SRp55 y crea  una nueva secuencia de unión a SRp40. Serían necesarios estudios con RNAi contra  el gen SRp40 para demostrar la implicación de este factor en el reconocimiento del  pseudoexón promovido por la mutación.    Para  el  paciente  23660  la  inserción  en  el  cDNA  de  PCCB  es  de  72  pares  de  bases entre los exones 6 y 7. El cambio nucleotídico en gDNA es IVS6+462A>G y se  encuentra en la posición +5 relativa al gt de la secuencia insertada, incrementando el  sitio 5´críptico donador de splicing aumentando el score de 0,93 a 1 y  aumentando la  afinidad de la secuencia consenso de reconocimiento de U1snRNA (Fig. 31). Análisis  adicionales  in  silico  utilizando  el  ESEfinder  predicen  la  creación  de  un  sitio  para  SRp55.    El uso de oligos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos de estos pacientes  PCCA  y  PCCB  ha  permitido  recuperar  la  actividad  normal,  revirtiendo  así  el  fenotipo mutante en ambos pacientes. La recuperación de la actividad al impedir la  incorporación del pseudoexón en los mRNA, demuestra  que estas inserciones son la  causa de la enfermedad en estos pacientes    Cuando se llevó a cabo la RT‐PCR, tras el tratamiento con AONs, se observó  un  100%  de  transcritos  normales,  probablemente  los  transcritos  aberrantes  sean  inestables  debido  a  la  presencia  de  PTC,  por  lo  que  el  mRNA  normal  será  amplificado de manera preferente. Aunque no se puede afirmar que en la población  de células tratadas, solo exista mRNA correctamente procesado, la cantidad de este  90

mRNA correctamente procesado es suficiente para corregir el defecto enzimático. La  recuperación  de  la  actividad  permite  deducir  que  el  mRNA  es  procesado  correctamente y traducido en proteínas activas, la detección de proteína  biotinilada  en el paciente PCCA tras el cultivo en presencia de AONs confirma esta teoría.     Los  experimentos  con  oligonucleótidos  diseñados  contra  otros  genes  no  producen ningún efecto,  por lo que el efecto de los AONs es específico de secuencia,  además  no  se  ha  observado  un  efecto  citotóxico  de  estos  oligonucleótidos  sobre   ninguna de las líneas celulares utilizadas.    Tampoco  existe  un  efecto  de  los  oligonucleótidos  antisentido  diseñados  específicamente contra las inserciones en pacientes con las inserciones no activadas,  este hecho junto a los experimentos llevados a cabo en el laboratorio con minigenes  demuestran  que  los  cambios  nucleotídicos  detectados  en  gDNA  activan  la  exonización de las secuencias.     Una gran ventaja de estos oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos es que  tienen una gran estabilidad, son muy resistentes a nucleasas y a la degradación por  RNAsaH cuando forman híbridos con RNA.     Las  mayores  dificultades  para  la  utilización  in  vivo  de  estos  AONs  es  su  vehiculización para que puedan llegar a los tejidos de interés y la determinación de  la  dosis  óptima  que  permita  obtener  de  forma  simultánea  la  recuperación  de  los  transcritos de interés sin una toxicidad elevada. Otra desventaja de esta terapia es su  elevada  especificidad  de  mutación,  son  efectivas  únicamente  para  un  genotipo  concreto, por lo que su aplicación es limitada.     Un  ejemplo  de  utilización  in  vivo  de  este  tipo  de  terapia  es  la  distrofia  muscular de Duchene en la que los oligonucleótidos antisentido han sido utilizados  en  pacientes  de  forma  intramuscular  y  se  ha  restaurado  parcialmente  la  distrofina  (Aartsma‐Rus  et  al.  2007).  Todos  estos  datos  sugieren  que  el  uso  terapéutico  de  oligonucleótidos  antisentidos  puede  ser  clínicamente  prometedor  para  acidemias  orgánicas.    En  las  enfermedades  metabólicas  hereditarias  el  porcentaje  de  variantes  alélicas  identificadas,  analizando  los  fragmentos  exónicos  que  comprenden  toda  la  región codificante más las regiones intrónicas adyacentes a cada exón, está entre el  95‐98  %  de  los  alelos,  para  el  2‐5%  restante  se  postula  que  las  mutaciones  podrían  encontrarse en regiones promotoras, regiones de poliadenilación o podrían producir  inserciones  de  pseudoexones  que  generarían  un  mRNA  aberrante,  que  sería  diana  del sistema NMD siendo degradado de manera acelerada y no siendo detectado por  los  sistemas  tradicionales  de  detección  de  mutación.  En  el  caso  de  los  pacientes  descritos  en  este  trabajo,  al  ser  homocigotos,  la  detección  de  los  transcritos  con  la  91

inserción  fue  inmediata.  Para  otros  casos,  utilizando  compuestos  (emetina  o  puromicina)  que  inhiben  este  sistema  NMD,  se  podrían  rescatar  transcritos  con  pseudoexones,  por  lo  que  potencialmente  podría  haber  un  mayor  número  de  pacientes  que  los  identificados  actualmente  que  serían  susceptibles  de  ser  tratados  con terapia antisentido.    Las terapias basadas en el RNA, dentro de las cuales se encuentra la terapia  con  AONs  presentan  toda  una  serie  de  ventajas  con  respecto  a  las  terapias  convencionales  de  reemplazamiento  génico  ya  que  no  presentan  peligro  de  integración  en  el  genoma  huésped  y  permiten  modificar  la  expresión  génica  sin  alterar la regulación normal del gen a nivel de gDNA (Wood et al. 2007). Es esencial,  para el conocimiento completo de los mecanismos moleculares de las enfermedades,  no  sólo  identificar  las  mutaciones  a  nivel  de  gDNA  sino  también  conocer  que  alteraciones  a  nivel  de  mRNA  están  asociadas  a  esas  mutaciones,  ya  que  se  está  comprobando  que  la  modulación  de  este  mRNA  es  una  estrategia  terapéutica  eficiente y prometedora.   

 

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6. CONCLUSIONES   

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  1. La  respuesta  a  BH4  en  los  pacientes  fenilcetonúricos  españoles  se  asocia  mayoritariamente a fenotipos leves o moderados siendo un fenómeno menos  frecuente en aquellos fenotipos más severos.     2. En  general  se  puede  afirmar  que  aquellos  pacientes  con  fenotipos  suaves  y  con  mutaciones  missense  que  mantienen  una  actividad  residual  presentan  altas probabilidades de responder de forma favorable al tratamiento oral con  BH4.    3. La base molecular de la respuesta a tetrahidrobiopterina en fenilcetonuria es  multifactorial  y  dependiente  del  tipo  de  mutación,  apuntando  a  un  efecto  estabilizante,  como  chaperona  química  de  la  BH4,  como  mecanismo  mayoritario  y  descartando  un  efecto  de  la  BH4  sobre  la  expresión  del  gen  PAH.    4. En  algunos  casos,  la  respuesta  a  cobalamina  en  acidemia  metilmalónica  por  defecto  en  la  enzima  ATR,  puede  deberse  a  un  efecto  estabilizante  de  la  coenzima,  ya que mutaciones  asociadas a la  respuesta no alteran la  afinidad  del enzima por sus sustratos, ATP y cobalamina.    5. La biotina no afecta a la expresión génica de dos carboxilasas celulares PCC y  MCC,  en  los  modelos  celulares  de  hepatoma  (Hep3B)  y  linfoblastos  (MCR),  pero sí favorece su activación de apocarboxilasas a holocarboxilasas.    6. El  uso  de  diversas  drogas  moduladoras  de  splicing  no  ha  resultado  una  terapia efectiva en fibroblastos de tres pacientes con acidemia propiónica que  portan  mutaciones  de  splicing  con  niveles  detectables  de  mRNA  correctamente procesado.    7. El  uso  de  oligonucleótidos  antisentido  en  fibroblastos  de  dos  pacientes  con  acidemia  propiónica  ha  demostrado  que  las  inserciones  presentes  en  estos  pacientes  son  la  causa  de  la  enfermedad  y  que  la  terapia  antisentido  es  altamente  efectiva  para  mutaciones  que  generan  la  inserción  de  pseudoexones.   8. Los  estudios  presentados  en  este  trabajo  sobre  las  bases  moleculares  responsables  del  efecto  de  las  diferentes  variantes  alélicas  permiten  aportar  una base científica para la aplicación de terapias específicas de mutación. 

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7. BIBILIOGRAFÍA     

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8. PUBLICACIONES     

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Parte de este trabajo se encuentra descrito en las siguientes publicaciones:    Aguado C, Perez B, Garcia MJ, Belanger‐Quintana A, Martinez‐Pardo M, Ugarte M,  Desviat  LR  (2007)  BH4  responsiveness  associated  to  a  PKU  mutation  with  decreased binding affinity for the cofactor. Clin Chim Acta 380: 8‐12    Aguado  C,  Perez  B,  Ugarte  M,  Desviat  LR  (2006)  Analysis  of  the  effect  of  tetrahydrobiopterin  on  PAH  gene  expression  in  hepatoma  cells.  FEBS  Lett  580: 1697‐701    Desviat LR, Perez B, Belanger‐Quintana A, Castro M, Aguado C, Sanchez A, Garcia  MJ, Martinez‐Pardo M, Ugarte M (2004) Tetrahydrobiopterin responsiveness:  results  of  the  BH4  loading  test  in  31  Spanish  PKU  patients  and  correlation  with their genotype. Mol Genet Metab 83: 157‐62    Erlandsen H, Pey AL, Gamez A, Perez B, Desviat LR, Aguado C, Koch R, Surendran  S, Tyring S, Matalon R, Scriver CR, Ugarte M, Martinez A, Stevens RC (2004)  Correction  of  kinetic  and  stability  defects  by  tetrahydrobiopterin  in  phenylketonuria  patients  with  certain  phenylalanine  hydroxylase  mutations.  Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16903‐8    Pey  AL,  Perez  B,  Desviat  LR,  Martinez  MA,  Aguado  C,  Erlandsen  H,  Gamez  A,  Stevens  RC,  Thorolfsson  M,  Ugarte  M,  Martinez  A  (2004)  Mechanisms  underlying  responsiveness  to  tetrahydrobiopterin  in  mild  phenylketonuria  mutations. Hum Mutat 24: 388‐99    Rincon  A*,  Aguado  C*,  Desviat  LR,  Sanchez‐Alcudia  R,  Perez  B,  Ugarte  M  (2007)  Propionic  and  Methylmalonic  Acidemia:  Antisense  Therapeutics  for  Intronic  Variations Causing Aberrantly Spliced Messenger RNA. Am J Hum Genet 81     

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  INTRODUCCIÓN................................................................................................................. 1    ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH)................................... 2    RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ........................................................................ 5    FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4) .......... 7  Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa ..................................................... 10  El cofactor tetrahidrobioterina.......................................................................................... 12    ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A COBALAMINA.. 14  Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR).............. 15    ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A   BIOTINA........................................................................................................................... 18  Estructura y función de la propionil‐coA carboxilasa y metilcrotonil‐coA  carboxilasa ........................................................................................................................ 21  La coenzima biotina ............................................................................................................ 21    SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS ............................................................. 24    OBJETIVOS.......................................................................................................................... 26    MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................ 28    MATERIALES...................................................................................................................... 29  Reactivos y aparatos............................................................................................................ 29  Material biológico ............................................................................................................... 30  Pacientes................................................................................................................................ 30  Líneas celulares establecidas ............................................................................................ 31  Cepas bacterianas ................................................................................................................ 31  Vectores plasmídicos .......................................................................................................... 31    MÉTODOS ........................................................................................................................... 31  Tratamiento de ácidos nucleicos ...................................................................................... 31  Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) ....................... 35  Expresión y purificación de proteínas en E. coli ........................................................... 35  Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH.................................... 35  Expresión y purificación de la proteína hATR .............................................................. 36  Cromatografía en gel .......................................................................................................... 38  Electroforesis, transferencia  y detección de proteínas ................................................ 38  Electroforesis, transferencia e  inmunodetección de la proteína   111

PAH ........................................................................................................................................ 38  Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje  con avidina conjugada a fosfatasa alcalina ................................................................ 39  Ensayos enzimáticos ........................................................................................................... 39  Actividad fenilalanina hidroxilasa .................................................................................. 39  Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa....................................................... 40  Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA  carboxilasa ............................................................................................................................ 41  Síntesis in vitro  y pulso caza de las proteínas PAH .................................................... 42  Cultivo celular...................................................................................................................... 43  Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B....................................................... 43  Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos..... 44  Medida de pterinas ............................................................................................................. 44  Soporte informático ............................................................................................................ 45    RESULTADOS..................................................................................................................... 46    BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA ... 47  Identificación de mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en  pacientes fenilcetonúricos españoles .............................................................................. 47  Expresión de proteínas PAH mutantes implicadas en la respuesta   a BH4...................................................................................................................................... 50  Análisis cinéticos................................................................................................................. 51  Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la   estabilidad de las proteínas PAH   normal y mutantes........................................................................................................... 53  Efecto de la BH4 sobre la transcripción y traducción del gen PAH........................... 57    BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12) EN  ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA ............................................................. 61  Expresión de proteínas mutantes implicadas en respuesta in vitro   a B12; Análisis cinéticos ..................................................................................................... 61    BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA  PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA ................................................ 66    TERAPIAS MODULADORAS DE  MUTACIONES DE SPLICING EN  ACIDEMIA PROPIÓNICA ........................................................................................... 71  Análisis del efecto de drogas sobre mutaciones de splicing    que producen niveles detectables de transcritos  normales........................................ 71  Análisis del efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la   inclusión aberrante de pseudoexones. ............................................................................ 73    DISCUSIÓN......................................................................................................................... 77  112

  RESPUESTA COFACTORES Y COENZIMAS EN EMH............................................ 78  Respuesta a tetrahidrobioterina en fenilcetonuria ....................................................... 78

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Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada ..................................... 84  Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en   metilcrotonilglicinuria ....................................................................................................... 85    TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA  PROPIÓNICA .................................................................................................................. 88  Efecto de la terapia con oligonucleótidos sobre mutaciones de   splicing que producen inclusión de pseudoexones...................................................... 88  Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen   niveles detectables de transcritos normales................................................................... 89  CONCLUSIONES ............................................................................................................... 93    BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 96    PUBLICACIONES............................................................................................................. 109       

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(Aguado et al. 2007; Aguado et al. 2006; Desviat  et al. 2004; Erlandsen et al.  2004;  Pey et al. 2004; Ugarte et al. 2007)         

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Parte de este trabajo se encuentra descrito en las siguientes publicaciones:    Aguado C, Perez B, Garcia MJ, Belanger‐Quintana A, Martinez‐Pardo M, Ugarte M,  Desviat  LR  (2007)  BH4  responsiveness  associated  to  a  PKU  mutation  with  decreased binding affinity for the cofactor. Clin Chim Acta 380: 8‐12    Aguado  C,  Perez  B,  Ugarte  M,  Desviat  LR  (2006)  Analysis  of  the  effect  of  tetrahydrobiopterin  on  PAH  gene  expression  in  hepatoma  cells.  FEBS  Lett  580: 1697‐701    Desviat LR, Perez B, Belanger‐Quintana A, Castro M, Aguado C, Sanchez A, Garcia  MJ, Martinez‐Pardo M, Ugarte M (2004) Tetrahydrobiopterin responsiveness:  results  of  the  BH4  loading  test  in  31  Spanish  PKU  patients  and  correlation  with their genotype. Mol Genet Metab 83: 157‐62    Erlandsen H, Pey AL, Gamez A, Perez B, Desviat LR, Aguado C, Koch R, Surendran  S, Tyring S, Matalon R, Scriver CR, Ugarte M, Martinez A, Stevens RC (2004)  Correction  of  kinetic  and  stability  defects  by  tetrahydrobiopterin  in  phenylketonuria  patients  with  certain  phenylalanine  hydroxylase  mutations.  Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16903‐8    Pey  AL,  Perez  B,  Desviat  LR,  Martinez  MA,  Aguado  C,  Erlandsen  H,  Gamez  A,  Stevens  RC,  Thorolfsson  M,  Ugarte  M,  Martinez  A  (2004)  Mechanisms  underlying  responsiveness  to  tetrahydrobiopterin  in  mild  phenylketonuria  mutations. Hum Mutat 24: 388‐99    Rincon  A,  Aguado  C,  Desviat  LR,  Sanchez‐Alcudia  R,  Perez  B,  Ugarte  M  (2007)  Propionic  and  Methylmalonic  Acidemia:  Antisense  Therapeutics  for  Intronic  Variations Causing Aberrantly Spliced Messenger RNA. Am J Hum Genet 81     

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