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Detección de Virus Respiratorios Anti-(Adenovirus group + Influenza A & B + Parainfluenza 1, 2 & 3 + VRS) Conjugado de Fluorescéina REF 17-092 80 determinaciones

Contiene: 1 frasco gotero de 4 mL de anticuerpo monoclonal purificado, conjugado de fluorescéina, listo para usar. Tampón fosfato pH:7.2 Estabilizante proteico Azul de Evans 0,5% Proclin 300® como conservador. Especificidad: Determinada individualmente en cepas de referencia, así como en aisladores salvajes tipados por anticuerpos de referencia. Esta mezcla permite la detección rápida en muestra, así como el revelado de cultivo. No existe relación cruzada con: Cytomegalovirus humano, Herpes simplex tipo 1 & 2, Chlamydia trachomatis.

Especificidad Adenovirus Influenza A Influenza B Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 VRS

I VD

Isotipo IgG2a IgG2a IgG1 IgG1-κ y IgG2a IgG2a-κ IgG1-κ y IgG3-κ IgG1-κ

Huesped: Ratón Purificación: Purificado en columna de proteína A recombinante. Almacenamiento antes y después de la primera apertura : En un lugar oscuro. +2/+8º (no diluido) hasta la fecha de caducidad indicada en el envase. No congelar.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Interés del test ........................................................................................................................................................................................................2 Aplicaciones ............................................................................................................................................................................................................2 Principio del test .....................................................................................................................................................................................................2 Normas de seguridad y de aplicación....................................................................................................................................................................2 Recogida y transporte de muestras .......................................................................................................................................................................3 Detección rápida de los virus respiratorios en las secreciones nasofaríngeas por inmunofluorescencia ..........................................................4 Revelado de cultivo de los virus respiratorios por inmnofluorescencia ................................................................................................................5 Lectura e interpretación de los resultados.............................................................................................................................................................6 Dificultades encontradas en inmunofluorescencia / Explicaciones y Soluciones ................................................................................................7 Eficiencia.................................................................................................................................................................................................................9 Materiales y reactivos necesarios que no se incluyen ..........................................................................................................................................9 Otros reactivos......................................................................................................................................................................................................10 Referencias ...........................................................................................................................................................................................................10

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1.

Interés del test

A.

Adenovirus, Virus respiratorio sincitial (VRS), Parainfluenzavirus (PIV) e Influenzavirus A y B • Los virus Respiratorio Sincitial, Influenza A y B, Parainfluenza 1, 2, 3 y Adenovirus son responsables de infecciones respiratorias frecuentes que pueden ser graves en los lactantes y en las personas ancianas y debilitadas. El diagnóstico viral de estas infecciones es esencial para la aplicación de la terapia y de las medidas preventivas. • El diagnóstico serológico no proporciona información en el caso de una infección aguda: el índice de anticuerpos sólo aumenta de forma significativa de 10 a 15 días después del comienzo de los signos críticos. Según los tests utilizados, los anticuerpos pueden no ser detectados en el lactante. • El método de referencia es el aislamiento y la identificación de los virus en cultivo celular (linajes celulares: HeLa, KB, HEp-2 o células fibroplásticas humanas de origen embrionario: MRC-5), a partir de una muestra nasal, escobillón o lavado nasofaríngeo, de una aspiración traqueobrónquica o de un líquido de lavado broncoalveolar; la extracción de muestras debe ser realizada durante la fase máxima de excreción del virus, es decir inmediatamente después del comienzo de los signos clínicos (menos de 3 días). • La detección de los virus directamente en las muestras de los pacientes, permite realizar un diagnóstico rápido de estas infecciones sin pasar por la etapa delicada del cultivo celular. La técnica de inmnofluorescencia efectuada en las muestras respiratorias es un método sencillo y eficaz, gracias a la utilización de anticuerpos moclonales específicos de estos virus. • Los anticuerpos monoclonales anti-proteínas virales han sido seleccionados por su especificidad y la calidad de la imagen observada en inmunofluorescencia; el aspecto habitual es una inclusión fluorescente granular o particular bien visible en el citoplasma o el núcleo de las células infectadas. Estos anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados igualmente para identificar los virus tras su aislamiento en cultivo celular.

2. Aplicaciones • Esta mezcla permite la detección por inmunofluorescencia indirecta, de antígenos específicos de los virus respiratorios: Adenovirus, Parainfluenza 1, 2 y 3, Influenza A y B, VRS. La detección re realiza en muestras de secreciones nasales o traqueobrónquicas de pacientes sintomáticos infectados.

3. Principio del test • Este reactivo está destinado a la detección de Adenovirus, Influenza A & B, Parainfluenza 1, 2 & 3, VRS en las células infectadas. La detección se realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta, en las células de las vías respiratorias, o en la células infectadas en cultivo. • Este reactivo se fija específicamente en el antígeno expresado en el núcleo o citoplasma de las células infectadas. • Las células infectadas por el Adenovirus, Influenza A & B, Parainfluenza 1, 2 & 3, VRS han fijado el anticuerpo monoclonal y aparecen fluorescentes a la observación en luz UV.

4.

Normas de seguridad y de aplicación Este reactivo está destinado exclusivamente a una utilización in vitro. A. Normas de manipulación para inmunología: • Controlar periódicamente el microscopio de luz visible o UV (objetivos limpios, alineación y control de la lámpara) • Utilizar portas de cristales limpios y desengrasados con alcohol. B. Precauciones generales de manipulación : • Leer detenidamente todas las instrucciones antes de comenzar la manipulación. • Manipular y eliminar todas las muestras, el material, los reactivos y los efluentes como si fueran susceptibles de transmitir agentes infecciosos, de acuerdo a la legislación vigente. • El empleo de este reactivo queda reservado al personal cualificado y correctamente formado. • Leer atentamente todas las instrucciones antes de comenzar la manipulación. • Respetar los tiempos, temperaturas y velocidad de centrifugado prescritos. • No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad impresa en sus etiquetas. Respetar les condiciones de almacenamiento. • El control y el mantenimiento de los equipos utilizados deben se realizados de acuerdo a las normas tipo GBEA, BPL o equivalentes. • Utilizar guantes de uso único durante la manipulación de los reactivos y las muestras, lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. • Equilibrar los reactivos a temperatura ambiente antes de su utilización. • Homogenizar correctamente los reactivos antes de usarlos. • No intervenir en los tapones de los frascos • Evítese todo contacto de la pipeta con la boca. • No beber, fumar ni comer en la sala de trabajo.

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5. A.

Recogida y transporte de muestras Recogida de muestras: • La calidad de la muestra es el factor esencial que determina la eficacia y la fiabilidad del método. • Se investiga la presencia de los virus respiratorios en las muestras de las secreciones nasales o traqueobronquiales de los pacientes, realizadas ya sea por aspiración (nariz o traquea/bronquios), o en el caso en que la nariz del paciente esté seca, mediante lavado nasofaríngeo (1), (2), (3) A.1. Aspiración nasofaríngea • Inclinar la cabeza del paciente 70° hacia atrás (hiperextensión). • Colocar la sonda de aspiración en la parte anterior de la rinofaringe y adaptar el aspirador de mucosidades (bomba de aspiración) o la jeringuilla. • Aspirando el mucus, retirar con cuidado la sonda • Aclarar, en caso necesario, el catéter con una solución salina o el medio de transporte. • Descargar el líquido recogido en un tubo que contenga, en caso necesario, un medio de transporte (véase « Transporte de muestras »). Edad del paciente

Tamaño del catéter

Niños prematuros Lactantes Niños pequeños Niños Adolescentes / adultos

6 8 10 12 14

Presión de aspiración 80-100 mmHg 80-100 mmHg 100-120 mmHg 100-120 mmHg 120-150 mmHg

A.2. Lavado nasofaríngeo • Inclinar la cabeza del paciente 70° hacia atrás (hiperextensión). • Instilar de 3 a 5 mL de líquido fisiológico estéril en un orificio nasal con una jeringuilla o una perilla estéril. • Reaspirar inmediatamente el líquido en la jeringa o la perilla. • Descargar el líquido recogido en un tubo que contenga si es necesario, un medio de transporte (véase « Transporte de muestras »). A.3. Raspado nasofaríngeo mediante escobilla • Insertar el escobillón en un orificio nasal. • Haciéndole progresar por rotación suave, avanzar el escobillón hasta encontrar una resistencia al nivel de los cornetes (menos de 2,5 cm en el orificio nasal). • Girar el escobillon varías veces contra la pared nasal. • Retirar el escobillón, colocarlo en un tubo estéril que contenga de 1 mL a 2 mL de medio de transporte (véase « Transporte de muestras »). • Descargar enérgicamente el escobillón en las paredes del tubo. • Extraer el máximo de líquido del escobillón presionando contra la pared del tubo y desechar el escobillón.

B.

Transporte de muestras: • El medio de transporte utilizado por el laboratorio debe ser validado con este test. Se utilizará por ejemplo el Medio de Eagle enriquecido con suero bovino fetal conteniendo eventualmente antibióticos con el fin de reducir la proliferación de la flora asociada. • Las muestras deben transportarse y ensayarse en el laboratorio lo antes posible. • Para un examen de la muestra por inmunofluorescencia, un plazo de conservación inferior a 3 horas a temperatura ambiente o a 48 horas entre +2 y +8° C no altera la calidad de los antígenos virales y de las células. • Si se considera el aislamiento del virus por cultivo celular, la inoculación no debe retrasarse con respecto a la obtención de la muestra. El poder infeccioso del virus disminuye rápidamente tras la obtención de las muestras, y es imprescindible que la muestra se conserve entre +2 et +8° C durante este intervalo de tiempo.

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6. Detección

rápida de los virus respiratorios en las secreciones nasofaríngeas por inmunofluorescencia A.

Tratamiento de las muestras y preparación de los portas : • Es esencial obtener una suspensión de células nasales sin mucus. Para ello, marcar los tubos de muestras mucosas. Serán objeto de un lavado suplementario con el fin de eliminar el mucus. • Añadir 5 mL de PBS* a 0.5-1 mL de secreciones. m Utilizar el resto de la muestra para el aislamiento del virus en cultivo celular (en caso necesario). • Agitar o pipetear delicadamente hasta obtener una suspensión lechosa homogénea. • Centrifugar a 180 g (1 200 rpm) durante 10 minutos (a +2/+8° C si es posible). • Resuspender el precipitado enérgicamente en 10 mL de PBS* y centrifugar a 180g (1 200 rpm) durante 10 minutos a +2/+8° C. • Eliminar el sobrenadante. Nota: Las muestras anteriormente identificadas como mucosas se resuspenden en 10 mL de PBS y se centrifugan de nuevo en 180 g (1 200 rpm) durante 10 minutos a +2/+8°C. El sobrenadante será eliminado a continuación. • Resuspender en precipitado enérgicamente en PBS* (normalmente 0,3 a 0,5 mL , pero el volumen debe ser adaptado al tamaño del precipitado) hasta la obtención de una solución homogénea. • En un porta para inmunofluorescencia previamente identificado con un rotulador (pocillos de 5mm de diámetro y recubiertos de teflón hidrófobo), depositar 30 µL de la suspensión obtenida en el número requerido de pocillos (número de muestras a someter a test + pocillos de control). Nota: Se puede utilizar un citocentrifugado para obtener una imagen más fácil de interpretar. En ese caso, en Cytospin, Shandon, depositar 200 µL de suspensión celular por pocillo y centrifugar a 800 rpm durante 4 minutos. • Secar los portas a +35/+37°C en un recinto protegido o bajo una campana de flujo laminar hasta que las preparaciones estén perfectamente secas. • Fijar las células en el porta utilizando un baño de acetona refrigerado en una bandeja de hielo fundente durante al menos 10 minutos, es decir recubriendo los pocillos con una gota de acetona con ayuda de una pipeta de cristal. . • No debe quedar acetona en los portas durante la realización del test (riesgo de coagulación del anticuerpo). • Las preparaciones fijadas pueden ser almacenadas durante varios meses a -18/-22°C.

B.

Immunofluorescencia directa: • Si los portas han sido congelados, llevarlos a temperatura ambiente15 minutos antes de la utilización. • En el porta de inmunofluorescencia, depositar una gota de reactivo 17-092 y una gota de PBS* en el pocillo de control negativo. • Controlar que la totalidad de la superficie de cada pocillo esté bien recubierta por el anticuerpo monoclonal. Llevar el reactivo 17-092 a +2/+8°C inmediatamente después de su utilización. • Los portas de control positivo y negativo están disponibles de forma independiente*. • Incubar a +35/+37°C durante 15 minutos en cámara húmeda. • Lavar 5 minutos en PBS* • Sumergir rápidamente (ida y vuelta simple) los portas en agua destilada (mejora la imagen obtenida por eliminación de los cristales del PBS). • Secar perfectamente los portas antes del montaje. • Depositar 1 o 2 gotas de medio de montaje para inmunofluorescencia* en el porta, a continuación depositar el porta. Eliminar las burbujas de aire por presión en el porta y examinar bajo el microscopio a la fluorescencia (luz ultravioleta) utilizando un objetivo x 25 o x 40. • Véase apartado « Lectura e interpretación de los resultados ».

* Véase « Otros reactivos » al final de la ficha técnica.

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7. Revelado de cultivo de los virus respiratorios por inmnofluorescencia • Dado que los virus son termolábiles en su mayoría, la inoculación no debe retrasarse demasiado con respecto a la toma de muestras. La muestra debe ser conservada a +2/+8°C durante este intervalo de tiempo. • En el laboratorio, utilizar como inóculo el resto de la muestra después de haber recogido 0,5 o 1 mL para la detección directa por inmunofluorescencia (véase párrafo « Detección rápida de los virus respiratorios en las secreciones nasofaríngeas por inmunofluorescencia»). • Las células más frecuentemente utilizadas para el cultivo de los virus se muestran en el siguiente cuadro (4): MDCK Adenovirus Influenzavirus

+++

Parainfluenzavi rus VRS

+

MRC5

HeLa

KB

HEp-2

A549

+

+++

+++

+++

++

++ +

+++ ++

LLCMK2

Vero

+

+

+++

+

+++

+

Sarampión Paperas

B95a

++

+

+++

++

+

Nota: el medio de cultivo de las células deberá estar adaptado según el virus a aislar. Este medio podrá ser Minimum Essential medium (MEM) con adición de 2% de suero bovino fetal. Para los virus de Influenza o Parainfluenza, el medio estará compuesto por MEM con adición de tripsina y EDTA. • La elección de la técnica debe estar adaptada a la cantidad de muestras a tratar en el laboratorio. o La técnica de cultivo en tubo rotatorio tiene la ventaja de oxigenar bien las células. La replicación viral se ve favorecida por el barrido constante de células por el medio de cultivo. No obstante, esta técnica no permite el centrifugado de los cultivos. o La técnica de cultivo en placa permite el centrifugado de las muestras en la capa de células, lo que aumenta considerablemente las oportunidades de aislar el virus. Este método, combinado con la detección antigénica por inmunofluorescencia, es utilizado a nivel mundial para el aislamiento de los virus gripales (estandardización de los métodos para el control epidemiológico). El principal inconveniente de esta técnica es la contaminación posible entre los pocillos en cada etapa del cultivo. • Las células deben ser inoculadas de 3 a 4 días después de su puesta en cultivo, es decir a partir de una confluencia de aproximadamente 50 a 60%. A.

Cultivo celular en tubos rotarios: • Preparar 2 tubos por muestra. • Eliminar el medio de cultivo y añadir aproximadamente un 1 mL de muestra. Nota: es necesario asegurarse que los tubos estén perfectamente cerrados antes de ponerlos en el rotor. Un escape de CO 2 implicaría una alcalinización del medio (coloración violeta del medio). • Colocar los tubos en el rotor. • Incubar 1 hora a +34/+36° C. • Añadir 1,5 mL de medio de cultivo. • Incubar a +34/+36° C en el rotor a una velocidad de 1 vuelta/min. • Mantener el cultivo celular renovando el medio de cultivo 2 veces por semana hasta la aparición de un efecto citopático (ECP). Véase párrafo « Lectura y observación de los resultados ». Los cultivos deben ser examinados regularmente al microscopio óptico (aumento x40 a x100) comparándolos con los cultivos testigos no infectados, aproximadamente durante 10 días. • En el contexto de un cultivo rápido, se puede considerar un revelado por inmunofluorescencia desde el 3er día de cultivo.

B.

Cultivo celular en placa (24 pocillos) : • Las células son cultivadas en placas de 24 pocillos • Preparar 2 pocillos por muestra. • Cuando la capa de células llega a una confluencia de 50 a 60% en su soporte, el medio de cultivo es aspirado y sustituido por 1,5 mL de medio de cultivo. • Añadir la muestra en cada pocillo después de haber identificado el cuerpo de las placas y su tapa mediante un rotulador que no se borre. • Centrifugar en 700 g durante 30 minutos a +34/+36° C. • Incubar en una estufa de CO2 (5%) a +34/+36 °C en atmósfera húmeda. • Mantener el cultivo celular renovando el medio de cultivo 2 veces por semana hasta la aparición de un efecto citopático (ECP). Véase párrafo « Lectura e interpretación de los resultados ». Los cultivos deben ser examinados regularmente al microscopio óptico (aumento x40 à x100) comparándolo con cultivos testigos no infectados durante aproximadamente 10 días. • En el contexto de un cultivo rápido, se puede considerar un revelado por inmunofluorescencia desde el 3er día de cultivo.

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C.

Preparación de los portas : Bajo campana de flujo laminar • Cuando el ECP alcance el 50 % de las células, raspar las células y aspirar la suspensión celular, a continuación transferirla a un tubo de centrifugado, previamente identificado. • Centrifugar la suspensión celular en 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. • Eliminar el sobrenadante. • Resuspender el precipitado en 100 µL de PBS*. La cantidad de células en esta suspensión debe ser suficiente, pero no demasiado rica para que no se produzca superposición de células en el porta. • Depositar 10 µL de esta suspensión celular en un pocillo de porta de microscopio, extendiéndolo con la punta de la pipeta. Se puede realizar un control visual de la cantidad de células en el microscopio óptico. • Realizar 3 pocillos por muestra. Nota: identificar los portas mediante un lapicero. No utilizar nunca rotulador. • Dejar secar perfectamente los portas bajo la campana de flujo laminar. • Fijar las células en el porta utilizando un baño de acetona enfriado en una bandeja de hielo durante al menos10 minutos, o recubriendo los pocillos con una gota de acetona mediante una pipeta de cristal. • Dejar evaporar la acetona residual que recubre los portas. • Las preparaciones fijadas pueden ser almacenadas durante 2 o 3 días a +2/+8° C antes de su examen por inmunofluorescencia. • Proceder al examen de los portas por inmunofluorescencia, como queda descrito en el párrafo « Detección de los virus respiratorios en las secreciones nasofaríngeas por inmunofluorescencia ».

* Véase "Otros reactivos" al final de la ficha técnica

8. Lectura e interpretación de los resultados A.

B.

Examen directo por inmunofluorescencia : Nota: es necesario interpretar los resultados en comparación con un control negativo con control positivo realizados paralelamente al test. los portas de control positivo están disponibles como reactivos independientes*. • Las células infectadas por los virus respiratorios que hayan fijado el anticuerpo monoclonal 17-092 aparecen como células fluorescentes sobre un fondo rojo al observarse al microscopio de fluorescencia (aumento x40 a x100). • Si ninguna célula (o un número muy bajo) es observada en la lectura, el resultado deberá ser considerado como no válido para su interpretación, y el diagnóstico se realizará mediante cultivo. Cultivo celular: B.1. Observación del efecto citopático • El efecto citopático es observado en cultivos de células recién extraídas. Los cultivos deben ser examinados regularmente al microscopio óptico (invertido para la observación de las placas) a un aumento x40 a x100. Estos cultivos deben ser comparados a los cultivos de control no infectados durante al menos 10 ó12 días. • El aspecto del efecto citopático depende de varios parámetros (carga viral de la muestra, sistema celular, soporte de cultivo). Su plazo de aparición depende igualmente del virus. o Adenovirus: aumento del tamaño de las células que toman forma redondeada; las células se agregan entre sí formando agrupaciones comparables a las uvas en racimo o tomando un aspecto de encaje. o VRS : formación de células gigantes (sincitia) seguido de una destrucción celular. o Influenza A & B : aparición de pequeñas células refringentes irregularmente redondeadas y separación de las células. o Parainfluenza 1, 2 y 3 : aparición de pequeñas células refringentes redondeadas o sincitia (no se ven las inclusiones en cultivos de células recién extraídas) o Sarampión y Paperas: muy frecuentemente formación de sincitia en el caso del sarampión y células redondeadas en el caso del virus de paperas. • 2 ó 3 días después de la inoculación de las células, es posible detectar la presencia de los antígenos virales en las células infectadas. Proceder a la coloración como se describe en el párrafo « Detección rápida de los virus respiratorios en las secreciones nasofaríngeas por inmunofluorescencia » • Un (o varios) paso en células frescas puede ser considerado en los casos siguientes: o Si aproximadamente de 7 a 10 días después de la inoculación de la muestra, el efecto citopático es discreto o poco característico; o Si deben realizarse tests complementarios a partir de ese material infeccioso (identificación del virus, sensibilidad a los antivirales o almacenamiento del aislador).

B.2. Almacenamiento de los aisladores (4) : • Es indispensable utilizar contenedores herméticos de tipo frasco o tubos resistentes a las bajas temperaturas. • Los virus no encapsulados (Adenovirus) se conservan muy bien a–18/-22°C, mientras que los virus encapsulados (VRS, Influenza, Parainfluenza) necesitan una temperatura de almacenamiento a –78/-80° C. • La conservación en nitrógeno líquido es excelente. • La liofilización seguida de un almacenamiento a +2/+8°C permite la preservación de la capacidad de infección y la conservación a largo plazo. * Véase «Otros reactivos » al final de la ficha técnica.

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9. Dificultades encontradas en inmunofluorescencia / Explicaciones y Soluciones •

Causas

•

Causas

Soluciones.

Los controles (positivos y negativos) no son visibles al microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia funciona correctamente

no

•

Comprobar el funcionamiento del microscopio con un porta utilizado. anteriormente. Si el problema persiste, comprobar los filtros, la bombilla y el alineamiento del microscopio.

El conjugado FITC es demasiado concentrado o la fluoresceína libre está presente

•

El medio de montaje puede dar una fluorescencia parásita.

• •

Utilizar el medio de montaje recomendado Evitar el contacto del frasco cuentagotas del medio de montaje en los spots.

El filtro del microscopio no está en la longitud de onda adecuada

•

Regular el filtro del microscopio a la longitud de onda adecuada para la lectura del FITC.

•

Nada es visible en el porta El antígeno no está en el porta

• • •

No tocar nunca la superficie de la mancha con las manos o las pipetas. Dejar secar bien el depósito en el porta antes de la fijación en la acetona Respetar los tiempos de fijación en la acetona

La muestra se ha lavado en exceso.

•

Respétese el protocolo de lavado.

Un pH demasiado ácido o demasiado básico del PBS puede implicar la pérdida del antígeno

•

Disolver adecuadamente el PBS durante su reconstitución. Comprobar el pH del PBS y ajustarlo en caso necesario

Utilización de otro fijador que no sea la acetona.

•

Respétese el protocolo .

Las células son visibles, pero todo es negativo, incluso el control positivo Los reactivos no han sido utilizados en el orden adecuado O Uno o varios reactivos han sido olvidados

•

Revisar el procedimiento y repetir el test en siguiendo el protocolo con precisión.

El control positivo aparece negativo y el control negativo aparece positivo Utilización errónea de los controles o reactivos.

•

Comprobar las etiquetas y repetir el test.

El control negativo aparece positivo y/o una misma muestra no da resultados reproducibles Contaminación de los controles y/o muestras.

•

Cambiar las puntas de las pipetas entre la manipulación de los controles y de las muestras

Contaminación de pocillo a pocillo entre las muestras negativa y/o control negativo. Contaminación posible de los pocillos durante el depósito del medio de montaje.

• • •

Utilizar gotas más pequeñas para dejar en el perímetro del pocillo Comprobar la buena calidad del teflón que separa los pocillos. No tocar nunca los pocillos.

Soluciones

Ruido de fondo verdoso en todo el porta Centrifugar el tubo conjugado FITC concentrado antes de la reconstitución Comprobar la dilución del conjugado FITC utilizado (cf. « reconstitución de los reactivos ») Utilizar el conjugado FITC recomendado.

Presencia de un velo de fluorescencia no específica en la totalidad de los spots (controles + muestras) Las etapas de lavado y aclarado no han sido correctamente realizadas

• •

Cambiar el baño de PBS entre un lavado y otro. Respétese el tiempo de lavado.

La muestra mucosidad.

demasiada

•

Efectúese una etapa de lavado complementario.

Los spots se han secado después de las etapas de lavado y aclarado antes de la aplicación del conjugado FITC

• •

No dejar secar los spots antes de la aplicación del conjugado FITC. Manipular sólo 1 ó 2 portas cada vez para las etapas de lavado, antes de aplicar el conjugado y llevar a cámara húmeda.

Las lentes del microscopio están sucias

•

Limpiar el objetivo y el ocular

El cubreobjetos es demasiado grueso

•

Comprobar que sólo se ha colocado un cubreobjetos sobre el porta.

Los reactivos se han contaminado.

• •

Comprobar el PBS y los reactivos. Cambiar el PBS entre cada baño de lavado / aclarado.

presenta

La superficie del spot parece haber sido arañada Movimiento excesivos del cubreobjetos o raspado con el cono de la pipeta.

•

Manipular con precaución el cubreobjetos. No tocar la superficie del spot con el cono de la pipeta.

El marcado fluorescente de la muestra no se parece al del control positivo Presencia de un cuerpo extraño o de una contaminación del tampón o de los reactivos

• •

Comprobar el PBS y los reactivos. Cambiar el PBS entre cada baño de lavado / aclarado.

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•

Causas

Soluciones.

La fluorescencia del control positivo es inferior a la esperada (en todas las muestras aparece una fluorescencia más débil)

Causas

•

Soluciones.

El porta ha quedado toda la noche a la temperatura del laboratorio antes de ser leído, y la intensidad de la fluorescencia ha disminuido, especialmente si ha sido expuesto a una luz excesiva y/o calor.

•

Almacenar los portas a +2/+8°C, en la oscuridad y realizar la lectura lo antes posible.

Las células se han recogido demasiado pronto (caso de una detección tras un cultivo celular)

•

Recoger cuando el ECP haya alcanzado al 50% de las células.

Avería del microscopio

•

Comprobar el microscopio (longitud de onda de los filtros, alineamiento, lámpara).

Deterioro de uno o varios reactivos debido a malas condiciones de almacenamiento (temperatura demasiado elevada)

•

Respetar las condiciones de almacenamiento indicadas en el envase.

Deterioro de los anticuerpos debido a malas condiciones de almacenamiento.

•

Manipular el anticuerpo en condiciones estériles y llevar a +2/+8°C inmediatamente después del uso.

La dilución del conjugado es demasiado baja

•

Comprobar los cálculos de dilución, volver a preparar el conjugado diluido y repetir el test.

Pérdida de la actividad del conjugado debido a una exposición excesiva a la luz o al calor durante el almacenamiento o el test.

• • •

Preparar los reactivos extemporáneamente No almacenar los reactivos a la luz No dejar las láminas a la luz del microscopio

Los portas han sido retirados de su envase demasiado con demasiada anterioridad al test

•

Retirar los portas de su envase de 5 a 30 minutos antes de la utilización

La fluorescencia aparece más débil a nivel de las burbujas de aire en el medio de montaje

• •

No agitar el frasco de medio de montaje. Colocar cuidadosamente el cubreobjetos sobre la gota de medio de montaje.

El pH de un reactivo (conjugado, PBS, medio de montaje) es demasiado ácido (pH < 7)

•

Utilizar el reactivo como recomienda la ficha técnica.

El preparado no ha sido correctamente secado antes del montaje

•

Secar perfectamente el porta antes de distribuir el medio de montaje

El PBS no correctamente

•

Seguir bien las recomendaciones para la reconstitución del PBS. Disolver siempre bien el polvo y someter a test el pH en caso necesario. La utilización de agua destilada proporciona mejores resultados que el agua desionizada.

Demasiado medio de montaje en los pocillos.

•

Las lentes están sucias.

No poner más de 1 ó 2 gotas de medio de montaje.

•

Limpiar el objetivo y el ocular.

ha

sido

preparado

Presencia de un marcado denso y no específico especialmente en la periferia de los pocillos Secado de la muestra o del conjugado durante la etapa de incubación antes de que el exceso de líquido haya sido eliminado

•

Aumentar el tamaño de la gota de reactivo en la superficie del pocillo y / o aumentar la humedad de la cámara.

El conjugado se ha deslizado fuera de los pocillos por capilaridad

•

Agitar el porta para eliminar el exceso de PBS y secar cuidadosamente el borde de los pocillos antes de añadir el conjugado.

Marcado desigual en los pocillos o aspecto borroso del preparado

El PBS está contaminado. Esa puede se a menudo una causa de falso negativo.

•

Utilizar un nuevo frasco de PBS cada día.

La lámina se ha lavado con otro fluido que no es el PBS

•

Utilizar únicamente el PBS para lavar las láminas.

Los reactivos no han sido llevados a temperatura ambiente antes de su utilización

•

Contar con un tiempo para que los reactivos se equilibren a la temperatura de la sala. Los reactivos fríos reaccionan con más lentitud

El substrato no se ha incubado lo suficiente con la muestra o el conjugado.

•

Comprobar que el tiempo transcurrido para cada etapa de incubación es correcto. No abreviar estas etapas.

Un tiempo demasiado largo de lavado ha eliminado material antigénico

•

Comprobar los tiempos de lavado. No dejar el porta en el tampón de lavado más de lo recomendado.

El medio de montaje se ha secado entre el porta y el cubreobjetos

•

Añadir medio de montaje y volver a colocar el cubreobjetos.

Un exceso de medio de montaje entre el porta y el cubreobjetos no permite el paso óptimo de la luz a través del spot.

•

Retirar el exceso de medio de montaje pasando un absorbente por el borde del porta. No apoyar sobre el cubreobjetos.

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10. Eficiencia Los resultados han sido evaluados en la forma preparada para el empleo FITC. • Se ha realizado un estudio retrospectivo en el laboratorio de virología humana y molecular de Caen. • Este estudio se ha llevado a cabo en muestras nasofaríngeas de pacientes admitidos en el CHU de Caen. • Las muestras han sido sometidas a tests en inmunofluorescencia simultáneamente con anticuerpos Argene y anticuerpos comercializados por la competencia, habitualmente utilizados por el laboratorio (referencia). • En 247 muestras analizadas, 134, es decir el 54% se han revelado positivas y 112, es decir el 45,3%, negativas con los 2 métodos. Referencia Anticuerpos Argene

+

+ 134

1

-

0

112

• Se ha encontrado una muestra discordante, positiva con el anticuerpo Argene (virus Influenza A) y negativa con el anticuerpo de la competencia. Este resultado positivo ha sido confirmado por el cultivo y la PCR. Así en este estudio, la sensibilidad y especificidad concluidas son del 100%. • Entre las 135 muestras positivas, los patógenos identificados están presentes en el siguiente cuadro:

VRS Influenza A Influenza B Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Adenovirus

Argene 47 50 10 0 0 23 5

Referencia 47 49 10 0 0 23 5

• Estos resultados indican que excepto la muestra Influenza A confirmada y no reconocida en los tests de referencia, los resultados son concordantes. • Puesto que ninguna muestra Parainfluenza-1 y -2 estaba presente en este estudio, siete portas que contenían células de fibroblastos humanas infectadas respectivamente por los virus Parainfluenza-1 y -2 han sido reveladas con los anticuerpos de Argene o los anticuerpos de referencia. Todas las portas se han revelado positivos con los anticuerpos Argene o de referencia.

11. Materiales y reactivos necesarios que no se incluyen A. • • • • •

Reactivos Hipoclorito de sodio Porta de control positivo/negativo. PBS pH 7.2 sin Ca2+ ni Mg2+ Medio de montaje Acetona

B. • • • • • • • • • • • • • • •

Material Guantes desechables Refrigerador +2/+8°C Congelador –18/-22°C Centrifugadora termostática. Citocentrifugadora tipo Shandon Cytospin o equivalente (opcional) Tubos de 1,5 mL en polipropileno. Micropipetas y conos Vortex. Incubador +37°C (+ CO2 para el cultivo) Cámara húmeda Portas para inmunofluorescencia limpios y desengrasados con alcohol. Láminas cubreobjetos Microscopio de immunofluorescencia equipado con un filtro para FITC con mantenimiento regular Microscopio o microscopio invertido en luz visible (para el cultivo). Laboratorio P2 y equipos específicos para el cultivo (Pipetas estériles…)

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12. Otros reactivos PBS TAMPON FOSFATO-pH 7.2 Sin Ca2+ ni Mg2+. En polvo para las siguientes cantidades: 1 litro 2x ARGENE, Ref: 33-010 1 litro 4x ARGENE, Ref: 33-011 Aplicaciones: Este tampón puede utilizarse para la dilución y/o pasos de lavado de todos los anticuerpos recogidos en el catálogo de ARGENE. La fluorescencia de las inmunoglobulinas marcadas con isotiocianato de fluoresceína es máxima cuando el pH es ligeramente alcalino (pH 7.2).

PORTAS CONTROL 5 portas Respiratory panel Ref. : 40-161 7 pocillos + / 7 pocillos – VRS Ref. : 40-121 2 pocillos + / 2 pocillos –

Medio de Montaje para Inmunofluorescencia ARGENE - Ref. : 33-041 Listo para usar, frasco cuentagotas de 15 mL. Utilización: Solución de glicerol sellado, diseñado para la fijación de los cubres sobre las preparaciones de microscopio. Protocolo: Depositar de 1 a 2 gotas por porta, a continuación cubrir con un cubreobjetos. Eliminar las burbujas de aire y el exceso de medio de montaje presionando sobre el cubreobjetos. El porta está preparado para la observación al microscopio en luz ultravioleta. Conservación: +2/+8°C hasta la fecha de caducidad indicada en el embalaje.

13. Referencias 1)

BARENFANGER J.,DRAKE C., LEON N., MUELLER T., TROUTT T. Clinical and financial benefits of rapid detection of respiratory viruses : an outcomes study. Journal of Clinical Microbiology, 2000, Vol.38 n°8, pp 2824-2828

2)

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FREYMUTH F., VABRET A., PETITJEAN J. GOUARIN S. GUEUDIN M. CAMPET M. Diagnostic des deux principales viroses respiratoires épidémiques : la grippe et les infections à virus respiratoire syncytial. Place de la virologie moléculaie. Medecine et maladies infectieuses, 200 ; 30 :191-201.

4)

THOUVENOT D., BILLAUD G ., MORFIN F. Actualité de la culture cellulaire et de son application au diagnostic des infections virales. Virologie 2004, 8 : 297-309

5)

POTHIER P., BOUR J.B. Applications des anticorps monoclonaux en virologie. Medecine et maladies infectieuses 1987, 11, 592-597.

6)

AYMARD M. Les orthomyxoviridés: les virus grippaux. Virologie médicale par J. MAURIN, 1985, 448-473 (Edit. Flamarion, Médecine - sciences).

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BREESE-HALL C., GLIMAN JM., BREESE BB., DOUGLAS RG. Jr. Para Influenza viral infections in children. Correlation of shedding with clinical manifestations. J. Pediatr. 1977, 91, 191-198.

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8)

FREYMUTH F., QUIBRIAC M., PETITJEAN J., DAON F., BESNARD A., PIERRE C. Mise en évidence des antigènes viraux par immunofluorescence: methode rapide de detection et d'identification des virus respiratoires. Revue Française des laboratoires, 1985, 137, 21-24.

9)

GARDNER PS., MC QUILLIN J., MC GUCKIN R., DITCHBURN RK. Observations on clinical and immunofluorescence diagnosis of para Influenza virus infections. Br. Med. J., 1971, 2, 7-12.

10) MARSTON RQ., VAUGHAN ER. Para influenza 3 assay and growth in tissue culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1960, 104, 56-60. 11) Wong DT., WELLIVER RC., RIDDLESBERGER KR., SUN MS., OGRA PL. Rapid diagnosis of Para Influenza virus infection in children. J. Clin. Microbiol., 1982, 16, 161-167. 12) DENOYEL G.A., REGNIER L., ALOTH B. Anticorps monoclonaux et diagnostic des infections occulaires à Adénovirus. Biologie prospective - Colloque , 1988, Pont-à-Mousson France. 13) POTHIER P., DENOYEL G.A., GHIM S., PRUDHOMME DE SAINT MAUR G., FREYMUTH F. Use of monoclonal for rapid detection of Influenza A virus in nasopharyngeal secretions. Eur. J. Clin. Microbiol. June 86, p336-339. 14) POTHIER P., NICOLAS J.C., PRUDHOMME DE SAINT MAUR G., GHIM S., KAZMIERCZAK A., BRICOUT F. Monoclonal antibodies against Respiratory Syncytial virus and their use for rapid detection in nasopharyngeal secretions. J. of Clin. Microbiology, Feb 85, p. 286-287. Vol. 21,N°2. 15) GOUYON J.B., POTHIER P., GUIGNIER., PORTIER H., PUJOL H.P., KAZMIERCZAK A., CHATELAIN P., ALISON M. Outbreak of RSV in France. Eur. j. of Clin. Microbiol. August 1985, p. 415-416. Vol. 4, N°4. 16) C. BOURGEOIS. Memoire de D.E.A. Faculté de médecine Dijon.

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