BOLETÍN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

VOL. 33 Nº1 2008

LA FISIOPATOLOGÍA DE LA HEMOSTASIA: ALGUNOS ASPECTOS SOBRE LA VIDA Y MUERTE DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACION Dr. Jaime Pereira G. (1)

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

En las últimas dos décadas se ha progresado notablemente en el conocimiento de la fisiología de las plaquetas. Esta nueva información no solamente ha significado cambiar una serie de paradigmas, sino que también ha contribuido a un mejor entendimiento del papel de estas células en enfermedades hemorrágicas y trombóticas. Entre otros aspectos, han surgido nuevos hallazgos con respecto a los procesos de envejecimiento de las plaquetas en la circulación y la descripción de marcadores de edad plaquetaria; mecanismos de remoción desde la circulación y la demostración de que las plaquetas experimentan apoptosis durante su envejecimiento en la sangre. En cuanto a su participación en procesos patológicos, se describió el papel que juegan en la patogenia de los estados de hipercoagulabilidad adquiridos, como los que se observan en pacientes portadores de lupus eritematoso sistémico y en el uso crónico de cocaína.

Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de hemostasia primaria. Además, aunque las plaquetas carecen de núcleo y podrían ser definidas como “trozos de citoplasma de los megacariocitos”, estas células contienen muchos componentes estructurales, metabólicos y de señalización propios de las células nucleadas. Incluso debido a su participación en diversos procesos fisiológicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biología celular. Las plaquetas, que circulan normalmente en forma inactiva, se adhieren a la pared del vaso dañado, secretan el contenido de sus gránulos e interactúan con otras plaquetas, formando la base del tapón hemostático. Además, las plaquetas participan en la activación del sistema de la coagulación, proveyendo la superficie sobre la cual se ensamblan los complejos de este sistema (1). A la luz de nuestro trabajo experimental y clínico en torno a la fisiopatología plaquetaria, en el presente artículo haremos un recorrido por aquellos aportes más relevantes de nuestro grupo.

Finalmente, la demostración de que las plaquetas son capaces de sintetizar y expresar factor tisular funcional, nos lleva a proponer un nuevo modelo de hemostasia basado en células. En éste, las plaquetas constituirían el punto de unión entre hemostasia primaria y secundaria y permitirían formular un modelo más racional para explicar los mecanismos hemostáticos en salud y enfermedad.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACION Las plaquetas humanas después de ser liberadas por los megacariocitos de la médula ósea, permanecen en la circulación

(1) Profesor Titular, Departamento de Hematología y Oncología. Financiamiento: Fondecyt 1971024, 1990131, 1011010, 8010002, DIPUC 2006/10 Correspondencia: [email protected] Fax: 354 3772

durante 8 a 10 días, antes de su remoción por parte de los macrófagos del sistema reticuloendotelial (SRE) (2). Estudios de cinética de plaquetas demostraron que éstas son removidas de la sangre en función de su edad. Durante su envejecimiento en la circulación, las plaquetas sufren una serie de cambios físicos, bioquímicos y funcionales, que determinan en gran parte su heterogeneidad. Este fenómeno fue el primero en ser abordado por nuestro laboratorio, enfocándonos principalmente en aquellos cambios que pudieran constituir marcadores de edad de las plaquetas (35) (figura 1). Una vez demostrado que las plaquetas circulantes envejecen, la siguiente interrogante que surgió fue: ¿Qué determina, en condiciones fisiológicas, su remoción desde la circulación al cabo de 8 a 10 días?. Debido a que las plaquetas normales son retiradas de la circulación en función de su edad, era lógico suponer que durante el proceso de envejecimiento se verificaban alteraciones estructurales y/o bioquímicas que finalmente determinarían la remoción al final de su vida útil. Con el fin de contestar esta pregunta, iniciamos estudios tendientes a investigar los cambios plaquetarios durante su envejecimiento in vivo que pudieran promover su retiro de la circulación. En este sentido, la investigación se enfocó en la pérdida de la asimetría de los fosfolípidos de membrana, como un mecanismo fundamental. 5

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Figura 1. En A se observa un aumento progresivo en el contenido de serotonina intraplaquetaria (5-HT) luego de esplenectomía efectuada a pacientes portadores de PTI. El panel B muestra el recuento de plaquetas y el contenido de 5-HT determinados secuencialmente después de la inyección de estradiol en perros. En el C, se demuestra que las plaquetas de alta densidad (enriquecidas con plaquetas de mayor edad) expresan significativamente menor número de moléculas de HLA, mientras que un antígeno plaquetario específico (PLA1) no cambia.

LA ASIMETRÍA DE LOS FOSFOLÍPIDOS DE MEMBRANA DE LAS PLAQUETAS En las células eucarióticas, las dos caras de la membrana plasmática tienen una distinta composición fosfolípidica; esta distribución asimétrica se encuentra también presente en la membrana plaquetaria. En las plaquetas, los lípidos son primariamente componentes de las membranas y están integralmente involucrados en actividades biológicas plaquetarias tales como mantención de la fluidez de la membrana, producción de eicosanoides y actividad procoagulante. Los fosfolípidos constituyen cerca del 80% de los lípidos plaquetarios. En las plaquetas humanas se han identificado cinco fosfolípidos mayores: fosfatidilcolina (FC), que constituye alrededor del 38% del total de fosfolípidos, fosfatidiletanolamina (FE) 27%, esfingomielina (EM) 17%, fosfatidilserina (FS) 10% y fosfatidilinositol (FI) 5% (6). Es de interés señalar que en las plaquetas humanas, los lípidos de la membrana plasmática tienen una distribución asimétrica: el 93% de la EM y 45% de la FC se encuentran en la mitad externa de la bicapa, mientras que un 80% de la FE y 92% de la FS se encuentran en la mitad interna; siendo imposible descartar que cantidades menores de FS se expresen en la mitad externa de la membrana. Esta distribución preferencial de los aminofosfolípidos en la capa interna 6

de la membrana se encuentra también en los glóbulos rojos (7). La asimetría de los fosfolípidos de membrana se mantiene por tres actividades diferentes: Translocasa de aminofosfolípidos. La actividad de translocasa de aminofosfolípidos dependiente de ATP, fue originalmente descrita en glóbulos y requiere la acción concertada con otra proteína de 32 Kd, como ha sido descrito para transportadores ABC (“ATP-Binding Cassette”). Esta actividad además de plaquetas y eritrocitos se ha descrito en varias células incluyendo las células endoteliales (7). “Flopasa” dependiente de ATP. Esta actividad también fue descubierta en eritrocitos y transporta principalmente colinofosfolípidos (neutros) a la cara externa y en menor medida aminofosfolípidos. Su actividad concertada con aquélla descrita para la translocasa provee a la célula de un efectivo mecanismo que corrige las alteraciones en la distribución de fosfolípidos, evitando posibles consecuencias patológicas. “Escramblasa” de lípidos. La membrana plasmática dispone de un mecanismo dependiente de Ca++ que rápidamente mueve fosfolípidos hacia adentro y afuera, llevando en minutos a pérdida de la asimetría de los fosfolípidos de membrana

(8), la clonación del gen de la escramblasa, permitió obtener una estructura deducida de la una proteína de 37 Kd con un único segmento de transmembrana (9).

En resumen, la generación y mantención de la asimetría de los fosfolípidos de la membrana celular es producto de la acción sincrónica y cooperativa de la aminofosfolípido translocasa y “flopasa” inspecífica, mientras que la actividad de la “escramblasa” resulta en su colapso. La pérdida de esta distribución asimétrica de los fosfolípidos se produce por daño celular, activación o muerte celular programada (apoptosis). Estos mecanismos generales pueden explicar una gran variedad de situaciones en las que se produce pérdida en la asimetría de fosfolípidos: eritrocitos y plaquetas almacenadas (10, 11), células falciformes (12), células sanguíneas en diabéticos (13), glóbulos rojos envejecidos (14) y células tumorales indiferenciadas (15). La biogénesis y mantención de la asimetría de fosfolípídos es de gran importancia en la homeostasis del organismo, debido a que la exposición de fosfolípidos aniónicos en la cara externa de las membranas celulares se asocia a daño celular, lo que se traduciría en: 1) Aumento de la actividad procoagulante, ya que los fosfolípidos aniónicos, en particular FS, proveen sitios

LA FISIOPATOLOGÍA DE LA HEMOSTASIA: ALGUNOS ASPECTOS SOBRE LA VIDA Y LA MUERTE DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACIÓN - DR. JAIME PEREIRA G.

de unión y ensamblaje de los complejos tenasa y protrombinasa, requeridos para la activación del factor X y protrombina respectivamente (7); 2) activación de complemento a través de la vía alterna (16) 3) reconocimiento y remoción de las plaquetas por parte de los macrófagos del SER, que poseen receptores para FS (17, 18). En ese momento propusimos como hipótesis de trabajo que durante el envejecimiento de las plaquetas en la circulación se produciría pérdida de la asimetría de los fosofolípidos de membrana, lo que determinaría la remoción de las plaquetas de la circulación.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACIÓN SE ASOCIA A PÉRDIDA DE LA ASIMETRÍA DE LOS FOSFOLÍPIDOS DE MEMBRANA Este fenómeno lo estudiamos en dos tipos de condiciones experimentales 1) en subpoblaciones de plaquetas de diferente densidad, aprovechando el hecho que las plaquetas humanas aumentan de densidad con la edad (3, 4 y 2) en un modelo canino de supresión de la trombopoyesis in vivo (19). Estudios previos habían demostrado que perros expuestos a altas dosis de estradiol desarrollaban trombocitopenia por supresión de la megacariopoyesis; este modelo había sido caracterizado y validado en el laboratorio, para obtener plaquetas de diferente edad (5). La exposición de fosfatidilserina (FS) sobre la membrana plaquetaria se demostró mediante citometría de flujo usando anexina V marcada con fluoresceína. Utilizando este modelo experimental, demostramos que la expresión de fosfatidilserina aumentaba con la edad de las plaquetas En efecto, la proporción de plaquetas que expresaban FS sobre la cara externa de la membrana aumentaba significativamente con la edad, desde 3.1±0.4% antes a 17.7±12.3%, diez días después de la exposición a estradiol (19)

Figura 2. Recuento de plaquetas y proporción de plaquetas que expresan fosfatidilserina (FS) determinados secuencialmente después de la inyección de estradiol en perros. El porcentaje de plaquetas que expresan FS a los diferentes tiempos fue determinada mediante citometría de flujo. Los datos representan el promedio ± error estándar. La exposición de FS alcanzó una diferencia significativa al día 9 cuando se comparó con los días 0 y 3 post-inyección de estradiol.

(figura 2). Estos resultados demostraron que el envejecimiento de las plaquetas en la circulación se asocia a pérdida de la asimetría de fosfolípidos, lo cual podría jugar un papel en el reconocimiento y posterior remoción de las plaquetas de la circulación.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PLAQUETAS SE ASOCIA A CAMBIOS PROPIOS DE LA APOPTOSIS Como continuación de esta línea de investigación, nos interesó conocer los posibles mecanismos de esta pérdida de la distribución asimétrica de fosfolipidos durante el envejecimiento plaquetario in vivo e in vitro. La pérdida de la asimetría de fosfolípidos es común a todas las células eucarióticas y en muchos sistemas celulares estudiados hasta ahora parece ser el fenómeno universal que acompaña a la muerte celular programada o apoptosis (20). Debido a que inicialmente se dio mucha importancia al núcleo en la ejecución de la apoptosis, la idea que las plaquetas como células anucleadas pudieran

presentar este fenómeno parecía altamente improbable. Sin embargo, experimentos in vitro demostraron que las plaquetas podían experimentar cambios propios de la muerte celular programada (21), en que la mitocondria actuaría como ejecutora del proceso. Con el fin de investigar si durante su envejecimiento en la circulación, las plaquetas sufrían apoptosis, utilizamos nuevamente el modelo canino de supresión de la trombopoyesis. Como marcador de apoptosis se determinó el colapso del potencial de membrana de la mitocondria (∆Ψm) (22). El envejecimiento de las plaquetas en la circulación se acompañó de pérdida del potencial de membrana mitocondrial y exposición de FS (figura 3). Así, por primera vez se demostraba que la senescencia de las plaquetas se asociaba a cambios propios de la apoptosis, que podrían ser determinantes de su remoción desde la circulación. Esta sugerencia fue confirmada recientemente por Mason y colaboradores(23), quienes demostraron que las plaquetas poseen un programa intrínseco para la apoptosis, centrado en la mitocondria, que controla su supervivencia y determina su permanencia en la circulación. 7

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específicos puedan ser los responsables de la destrucción de las plaquetas. En un estudio realizado en nuestro laboratorio en pacientes portadores de LES, encontramos una prevalencia de anticuerpos antiplaquetarios específicos de solamente 17%, en contraste con un 44% que presentaba aAFL, cuya presencia se asoció a recuentos de plaquetas significativamente más bajos (25, 26). En ese mismo estudio, encontramos que era posible absorber/eluir aAFL purificados a/desde plaquetas intactas, sugiriendo exposición de FL aniónicos sobre la membrana de las plaquetas. De acuerdo con estos resultados, planteamos en esa oportunidad que en el LES la pérdida de asimetría de los fosfolípidos de membrana podría jugar un papel central en la remoción acelerada de las plaquetas de la circulación.

Figura 3. En A se observa el colapso del potencial de transmembrana mitocondrial (ΔΨm) durante la caída del recuento de plaquetas después de la supresión de la trombopoyesis en perros. ΔΨm fue determinado por incubación de las plaquetas con DIOC6 y analizadas mediante citometría de flujo. La intensidad media de fluorescencia (MFI) se presenta como el promedio ± error estándar de 11 determinaciones. Se observó una caída significativa de la MFI al día 8 después de la inyección de estradiol *p