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LOS MECANISMOS DE DEFENSA DE LAS PLANTAS SUPERIORES Las plantas, tal como hoy las conocemos, son el resultado de milenios de adaptación tanto a factores abióticos como a factores bióticos. Los factores bióticos a su vez no son siempre los mismos, se encuentran en un continuo devenir, en un flujo de cambios más o menos gradual, pero a veces también bruscos, como cuando se introduce una nueva especie en un contexto de seres vivos en equilibrio. Todos los seres vivos están insertos en un ambiente con el cual establecen acciones y reacciones. Si se estudia cualquier ser vivo sin considerar las presiones externas a que está sometido, solo tendremos parte de la verdad e incluso podremos caer en el error, todo ser vivo es él y sus circunstancias. Considerar, por ejemplo, un principio activo de un vegetal sin considerar si varía o no con los cambio ambientales – incluyendo los cambios ecológicos – es solo conocer parte del problema y lo mismo ocurre cuando solo estudio la variación del contenido de un principio activo durante la ontogenia del vegetal. En la interacción con su medio ambiente los vegetales no solo han sufrido cambios temporales en su morfología, sino que también han tenido cambios en su composición química. Cuando estos cambios se producen sin afectar el genoma tenemos un fenotipo, el que revertirá a las características de la especie por la supresión de los factores que lo producen. Si el cambio llega a afectar el genotipo nos encontramos frente a un fenómeno evolutivo. La presión evolutiva de la convivencia de los vegetales con los herbívoros (mamíferos e insectos) ha creado en las plantas diversos tipos de mecanismos de defensa, tanto morfológicos (p.ej. formación de espinas), como químicos (impalatabilidad del vegetal, toxicidad, etc). Por otra parte, las plantas deben sobrevivir al ataque de un gran número de microorganismos, particularmente hongos y bacterias, y finalmente estando las plantas fijas al sustrato terrestre del que deben extraer diversos nutrientes (agua, sales, compuestos de nitrógeno, etc) forzosamente están en un cierto espacio vital de terreno para sí, cosa bien conocida en la práctica agrícola y jardinera. Del mismo modo, muchas plantas elaboraron productos químicos con los que inhiben el crecimiento en sus cercanías de otras especies vegetales con lo que se resguarda el espacio vital ya aludido. En síntesis, este capítulo describe algunos de los pocos mecanismos conocidos por los cuales una planta se defiende de predadores de diversos tipos incluida la defensa de su espacio vital frente a otros individuos vegetales incluyendo a los de su propia especie. Este capítulo no solo tiene que ver con el enfoque vegetal que tomamos, sino que es una importante parte de una rama de la ciencia: La ecología bioquímica. Finalmente, los compuestos elaborados por las plantas en su estrategia defensiva pueden, y en muchos casos lo hacen, proveer de muchos productos con aplicaciones farmacéuticas.

EL CONCEPTO DE ALELOPATIA. El termino ALELOPATIA (de alelon, de otro, y pathos, sufrir, que sufre el efecto injurioso de uno sobre el otro) fue acuñado por Molisch en 1937 para referirse tanto a las interacciones bioquímicas benéficas como a las perjudiciales entre toda clase de plantas (incluyendo a los microorganismos) mediadas por compuestos químicos liberados al medio ambiente. Por otra parte Muller, que fue un pionero en el desarrollo del tema, restringió en 1970 el uso del término alelopatía a las interacciones entre las plantas superiores. Esta es la definición también adoptada por Harborne y en la práctica numerosos autores, cuando hablan de los

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compuestos con que una planta superior afecta a otra, emplean simplemente el termino alelopatía para la designación del fenómeno y clasifican los compuestos que desencadenan el proceso como compuestos, agentes o sustancias alelopáticas. Por tanto, pareciendo más clara la definición de Muller, en esta asignatura se utilizará el termino alelopatía para designar los efectos nocivos de un producto producido por una planta superior sobre otra planta superior. La alelopatía, también ha sido descripta como la guerra química entre las plantas pero esta descripción, al menos por el momento, no es apropiada ya que una guerra implica ataques y contraataques o al menos defensa por la parte afectada y no conocemos nada equivalente en las relaciones entre las plantas superiores. El término más general utilizado para abarcar todo tipo de sustancia utilizada en interacciones defensivas entre especies es el de aleloquímico. Este término es profusamente utilizado en la literatura.

Desarrollo del conocimiento de la alelopatía Probablemente la referencia más antigua sobre fenómenos alelopáticos se deba a Plinio (23-27 AD) quien observó que el nogal (Juglans regia) ejercía un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de otras especies plantadas en su vecindad. También existe un documento de alrededor de 300 años de antigüedad en que Banzan Kumazawa indicó que tanto la lluvia como el rocío que lavaban el follaje de Pinus densiflora resultaban nocivos para cultivos que crecían bajo la planta. De Candolle (1832) comunicó que cardos que crecían en sembrados de granos eran nocivos para las plantas de avena, y que Euphorbia dañaba el crecimiento del lino. Este mismo investigador demostró que las raíces del poroto secretaban sustancias capaces de hacer languidecer y aún matar a otras plantas de la misma especie. Posteriormente, estudiando suelos fatigados Schreiner y Col. (1907 – 1911) descubrieron que estos suelos contenían productos químicos también presentes en las plantas en cultivo y que tenían efectos deletéreos sobre muchas plantas cultivadas. Massey (1925) observó plantaciones de tomate y alfalfa en un radio de hasta 25 m del tronco de Juglans nigra. Las plantas situadas en un radio de hasta 16 m morían mientras las que situadas más allá de dicho radio crecían sanas. Se demostró además que el agente alelopático era la hidroxinaftoquinona, juglona, un pigmento amarillo soluble en agua y que es el causante del color pardo que tiñe las manos de quienes manipulan nueces. En todas las partes verdes de la planta (hojas, frutos, ramas) se encuentra el 4 - glucósido del 1,4,5-trihidroxinaftaleno, producto atóxico y que una vez arrastrado por las lluvias al suelo es hidrolizado y oxidado a juglona (Fig. 1). La juglona al 0,002 % produce inhibición total de la germinación de semillas sensibles e inyectando peciolos produce la muerte de las plantas. También se demostró que la juglona es tóxica para los manzanos. La concentración de juglona en el suelo se mantiene por realimentación constante a partir de los nogales. No se conoce el tiempo que los microorganismos del suelo tardan en degradar este producto. Como era de esperar se encontraron plantas que no son sensibles a la juglona p.ej. Rubus sp. (rosáceas) género al que pertenecen plantas como la zarzamora o la frambuesa, y la gramínea Poa pratensis. Otro importante ejemplo de alelopatía es la del chaparral californiano. Recibe el nombre de chaparral una formación arbustiva – herbácea xerófila que crece en el sur

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Juglona FIGURA 1 de California (Estados Unidos de América). Un área de inhibición de plantas herbáceas es visible alrededor de las formaciones arbustivas. Entre los arbustos se encuentran Salvia leucophylla (labiada) y Artemisia californica (compuesta). Los compuestos alelopáticos son terpenos abundantemente presentes en las hojas, y las plantas están envueltas en nubes de esencia volátiles. Estas esencias se encuentran inclusive en el suelo que rodea las plantas y en ambos arbustos los agentes alelopáticos más activos son coincidentemente el 1,8 – cineol y el alcanfor (Fig.2). Entre las hierbas inhibidas tenemos la Avena fatua, Bromus sp. y Festuca sp. la presencia de vapores altamente inflamables acarrean incendios espontáneos, los que se suceden en promedio cada 25 años. Entonces las herbáceas prosperan rápidamente y cubren completamente el área hasta que lentamente el chaparral se reconstituye por germinación de semillas de arbustos que quedaron en el suelo. Poco a poco se restablecen los halos de inhibición herbácea y se reinicia el ciclo que durara aproximadamente otros 25 años. También se han estudiado dos arbustos del chaparral que no contienen esencia volátiles (Adenostoma fasciculatum – rosácea y Arctostaphylos glandulosa –ericácea).

FIGURA 2 En ambos casos, los agentes alelopáticos son un conjunto de fenoles solubles en agua conteniendo en común los ácidos p-hidroxibenzoico, vainíllico y ferúlico. Cuando se aplican conjuntamente el ácido vainíllico y el p-hidroxibenzoico resultan más potentes inhibidores de la germinación de semillas que en las aplicaciones individuales (efecto sinérgico). Bonner (1950) encontró en residuos de plantas de guayul (Parthenium argentatum) el ácido trans – cinámico, el que resulta tóxico para plantas jóvenes de la misma especie. Se demostró que el ácido se descompone lentamente en el suelo de modo que el efecto deletéreo desaparece con el tiempo. Bode (1940) demostró que la exudación de absintina por Artemisia absinthium produce la inhibición del crecimiento de plantas de hinojo (Foeniculum vulgare) y de otras plantas vecinas. También se encontró que substancias producidas por maíz (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), avena (Avena sativa), sorgo (Sorghum bicolor) eran capaces

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de inhibir el crecimiento de la soja (Glycine max), el girasol (Helianthus annus) y el tabaco (Nicotiana tabacum). Además se están acumulando datos de que los productos químicos producidos por las malezas afectan severamente el crecimiento de las plantas cultivadas. Un pasto presente en los Estados Unidos (Setaria faberii) inhibe fuertemente el crecimiento del maíz y de la soja mientras que otra gramínea (Festuca arundinacea) conocida en nuestro país como festuca alta e introducida como forrajera produce agentes alelopáticos que inhiben el crecimiento de la mostaza (Brassica nigra), del liquidámbar (Liquidambar styraciflua, un árbol introducido como ornamental a nuestros parques, plazas, calles y avenidas), de dos tréboles forrajeros (Lotus corniculatus y Trifolium pratense). En Estados Unidos de América Abutilon theophrasti (malvácea anual) reduce el rendimiento del algodón (Gossypium hirsutum) y de la soja. En Argentina, tenemos la falsa altamisa (Parthenium hysterophorus) que afecta el crecimiento de cualquier tipo de vegetación, incluyendo a las plantas cultivadas, lo que le permite formar densas colonias. Su principal agente alelopático es la partenina cuya estructura corresponde a una lactona sesquiterpénica. A pesar de que en los casos señalados como ejemplos nos referimos en general a una sustancia alelopática por planta, ya vimos que ésta no es la única situación posible. Estudios con extractos crudos de F. arundinacea mostraron la inhibición de la germinación de porotos, sin embargo la purificación de los extractos conlleva la disminución de la inhibición. Consecuentemente es posible que la actividad alelopática se deba a veces a un complejo agente alelopático que actúen sinérgicamente.

Naturaleza química de los agentes alelopáticos Los agentes alelopáticos conocidos pueden pertenecer a muy diversos tipos de compuestos químicos, pero hasta ahora todos ellos pueden clasificarse dentro del grupo de los llamados compuestos secundarios. De modo resumido podemos clasificar estos agentes dentro de los siguientes grupos: Glicósidos cianogénicos : p.ej. Amigdalina, prunasina y durrina Aminoácidos no proteicos: Experimentos de germinación realizados con lechuga (Lactuca sativa) demostraron que la mimosina, homoarginina, 3,4 – dihidroxifenilalanina, ácido α amino – β – oxalilamino – propiónico, ácido α- amino β – metilaminopropiónico, ácido α, β diaminopropiónico, ácido α, γ –diaminobutírico, canavanina, ácido acetidina-2-carboxílico, hidroxiprolina, balclaina, enduracididina, 4-hidroxiarginina, 5-hidroxinorleucina, tetrahidrolatirina, suprimen sea el crecimiento del hipocótilo o de la raíz o ambos significativamente. Estos aminoácidos pueden encontrarse en altas concentraciones en semillas y se demostró que en el caso de Glycine wightii las raíces de las plántulas en germinaciones exudaban aminoácidos no proteicos (particularmente canavanina, la que mantenía altos niveles de exudación durante las 310 horas del experimento). Se demostró que otras semillas también exudan aminoácidos no proteicos durante la germinación. Así la raíz de plántulas de arvejilla (Lathyrus odoratus) exudaba β–aminopropionitrilo (presente en la semilla como acido -γ glutamil – β- aminopropiónico).

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El aminopropionitrilo es inocuo para la lechuga, pero es en cambio un fuerte tóxico para plántulas de Vicia benghalensis y letal para las de Lathyrus aphaca y Leucaena leucophylla un pequeño árbol introducido a la Argentina como ornamental y que ocasionalmente puede encontrarse en las calles de S.M. de Tucumán, exuda a su vez mimosina durante la germinación. Compuestos fenólicos simples: P.ej. Arbutina, hidroquinona, ácido benzoico. gálico, elágico, salicílico, sulfosalicílico y vainíllico, que se encuentran en el agua de lavado de hojas y en el suelo. Los ácidos cinámico, sináptico, cafeico, clorogénico y cumárico, cuya presencia es general en los vegetales. Quinonas: Son compuestos ampliamente distribuidos en los vegetales. El ejemplo clásico es la juglona exclusiva del género Juglans. Lactonas no saturadas: Psilotina, psilotinina, éstas dos últimas producidas por Psilotum nodum y Tmesipteris tannensis pertenecientes a las Psilotinae y que inhiben la germinación de las semillas y el crecimiento de plántulas, protoanemonina producida por varias ranunculáceas y que inhiben la germinación de semillas. Cumarinas: Son lactonas del ácido o –hidroxicinámico generalmente provistas con cadenas laterales isoprenoides, que normalmente se presentan como glicósidos en las plantas. Entre ellos podemos citar la escopoletina, escopolina (7-glúcosido de la escopoletina producida por raíces de avena), esculina, esculetina y metilesculina, cumarina (producida p.ej. por Melilotus albus y que es capaz de bloquear completamente la mitosis de las raíces de cebollas), y psoraleno (furanocumarina que inhibe fuertemente la germinación de las semillas y que es producida por tallos y hojas de umbelíferas). Flavonoides: Numerosos miembros de este grupo son agentes alelopáticos p.ej. la floridzina (producida por Malus sp. y algunas ericáceas), los glicósidos del quempferol, de la quercetina y de la miricetina, y la rotenona. Taninos: Tanto los condensados como los hidrolizables poseen actividad alelopática. Los hidrolizables inhiben la germinación de las semillas y a las bacterias fijadoras de nitrógeno, a las bacterias nitrificantes y al crecimiento vegetal. Terpenoides: Incluyen monoterpenos que constituyen el principal grupo de esta clase de compuestos (α– pineno, β- pineno, alcanfor), cineol, sesquiterpenos (cariofileno, bisaboleno, chamazuleno C). Las salvias deben sus propiedades alelopáticas a su contenido en terpenos, los que inhiben la mitosis en plántulas de pepino e inhiben la división celular en gran número de especies bacterianas del suelo. Los eucaliptus y la artemisia también deben sus propiedades alelopáticas a los terpenoides. Alcaloides: Inhiben fuertemente la germinación de café (Coffea arabica), tabaco (Nicotiana tabacum) y cacao (Theobroma cacao). Los inhibidores más energéticos son la cocaína, fisostigmina, cafeína, quinina, cinconina, cinconidina, estricnina, berberina y codeína.

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La cafeína mata selectivamente a muchas hierbas sin atacar, p.ej.: plantas de poroto. Además de estas sustancias hay una gran cantidad de compuestos secundarios de origen vegetal particularmente alifáticos capaces de inhibir a las plantas superiores pero no se incluyen en esta clasificación debido a que son rápidamente metabolizados en el suelo y por tanto difícilmente puedan actuar en la naturaleza como verdaderos agentes alelopáticos.

Biosíntesis de los compuestos alelopáticos La biosíntesis de los compuestos alelopáticos es la previamente descripta para cada grupo de productos químicos. En este caso concreto no se conoce que haya algún mecanismo de regulación de la producción de agentes alelopáticos ocasionado por la competencia de plantas creciendo juntas. Aparentemente estos compuestos están siempre presentes en las plantas y si existe una regulación de su síntesis ésta es ocasionada por factores ajenos a la alelopatía. Los agentes alelopáticos simplemente confieren a las plantas que los producen una ventaja competitiva respecto a aquellos que no los producen, y ésta es probablemente la razón por la cual se originaron y se mantienen en el transcurso de la evolución. No se conoce ningún caso en que se manifieste una razón causa- efecto en la producción de compuestos alelopáticos y es por ese hecho que no pueden considerarse como parte de una guerra química.

Modos de liberación al medio de los compuestos alelopáticos Los compuestos alelopáticos normalmente se almacenan en las células del vegetal productor al estado de glicósidos. Estos compuestos pueden ser liberados al medio como exudados de raíz, p.ej. en el caso de los ácidos clorogénico, melilótico, pipérico, 2-furanacrílico, gálico, ocumárico, fenilpropiónico, juglona, alicina y p-hidroxibenzaldehido. Otro modo de liberación es por arrastre con agua de lluvia, nieblas o rocío de los exudados de hojas y frutos o bien por descomposición del follaje u otras partes de la planta y caídos al suelo (es el caso de los ácidos siríngico, protocatéquico, genístico, dihidroxiesteárico, cafeico y p-hidroxibenzoico, 3 –acetil-6metoxibenzaldehido). Los compuestos volátiles a su vez son directamente liberados al medio por las partes aéreas de las plantas (p.ej. etileno, β pineno, canfeno y cineol).

Métodos de estudio de las alelopátias A veces puede observarse en la naturaleza que alrededor de ciertas plantas creciendo en zonas áridas se produce un halo por carencia de vegetación, como es dable de observar en Baccharis trímera cuando crece en zonas con pocas lluvias. Este tipo de halos en general pueden indicar la presencia de sustancia alelopáticas. Para estudiar esta cuestión es necesario contar con métodos biológicos de ensayo. Los bioensayos pueden hacerse estudiando la germinación de semillas, el crecimiento de raíces, tallos u otro síntoma en las jóvenes plántulas que se hacen crecer en presencia de extractos de la planta en estudio, incluyendo controles adecuados. Estas pruebas pueden hacerse utilizando cajas de Petri. Si se observan síntomas inhibitorios se efectúan fraccionamientos químicos con miras a aislar las sustancias activas, haciendo un

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seguimiento de las fracciones con el bioensayo adoptado. Una vez purificado el agente se procede a su identificación y si fuera un nuevo producto deberá establecerse su estructura. Generalmente, el agente aislado corresponde a un compuesto químico ya conocido e inclusive con existencia comercial, por lo que los métodos cromatográficos pueden ser suficientes para la identificación del producto. El método de elección para preparar extractos es la extracción en agua fría, pero también se ha utilizado agua caliente y solventes orgánicos. El material vegetal puede utilizarse seco o bien macerado en agua. Cuando se sospecha la presencia de sustancias volátiles el material se extrae con solventes orgánicos en un aparato de Soxhlet. En los bioensayos no debe olvidarse la posibilidad de la existencia de un sinergismo entre varios compuestos. El estudio de las alelopatias tropieza con ciertos inconvenientes tales como los cambios degradativos que pueden sufrir las sustancias alelopáticas durante su manejo y almacenamiento, la interacción fisicoquímica con las partículas de suelo, particularmente la disminución de su concentración libre por fenómenos de adsorción; debilitamiento o incremento de su actividad alelopática debida a la presencia de otras sustancias y a cambios en la respuestas debidos a factores intrínsecos o extrínsecos.

Mecanismos de acción de los compuestos alelopáticos No puede pensarse, dada la amplia gama estructural de los compuestos alelopáticos conocidos, que haya un solo tipo de mecanismo para la manifestación de alelopatía. Los datos obtenidos hasta la fecha indican que la acción alelopática puede deberse a perturbaciones en los procesos de absorción de minerales, fotosíntesis y respiración, interferencia en procesos hormonales, bloqueos enzimáticos (p.ej. a nivel de la fenilalaninaliasa – PAL- enzimas hidrolíticas – pécticas, celulasas – peroxidadas, catalasas, fosforilasas, síntesis proteica, síntesis de porfirinas), permeabilidad de membranas, modificación de la apertura estomática, etc.

LOS MECANISMOS DE DEFENSA CONTRA MICROORGANISMOS La relación huésped – parásito más estudiada es la de la planta superior- hongo, solo se sabe algo de algunas bacterias y de unos pocos virus. Los hongos pueden presentar especificidad de huésped mientras que otros pueden atacar varias especies vegetales, es decir no son huésped específico. Además hay hongos facultativamente fitopatógenos, a los que se debe la fama de que los hongos son “oportunistas”, hecho similar al de la patología fúngica humana. Se dice que los hongos huésped específico son compatibles cuando infectan al vegetal, y que el vegetal infectable es susceptible. Esta terminología está ampliamente aceptada en la literatura científica. Para que se establezca la infección es necesario que el hongo penetre las barreras o defensas mecánicas de la planta huésped, lo que en última instancia significa el ataque a la pared celular por la batería enzimática del microorganismo patógeno. A su vez este ataque implica que el hongo se pondrá en contacto con los metabolitos y enzimas presentes en la pared celular del vegetal atacado.

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Esquematización de las secuencias de interacciones huésped- parásito. Normalmente el proceso de defensa de la planta atacada se inicia con una toma de Ca extracelular, hay una despolarización del potencial de membrana, una activación de la β -1,3glucan sintasa unida a la membrana (productora de callosa), que se deposita en las paredes inmediatas a la penetración de hifas y que además de constituir un refuerzo de la pared sirve de material de fijación para la lignina. La toma de Ca+2 se realiza por los canales para el calcio existentes en la membrana celular, lo que se demostró mediante el uso de bloqueadores de los canales cálcicos (verapamil, diltiazem, CoCl2 o LaCl3) en tejidos de tubérculos de papa. Si se trabaja en presencia de EGTA, un quelante del Ca+2, se paraliza el proceso de defensa del vegetal. Finalmente, si se trata de cultivos celulares de soja con un ionóforo del Ca+2 se desata el proceso de defensa con producción de fitoalexinas. El siguiente paso detectado es lo que se ha denominado el estallido oxidativo. Este se manifiesta en cortes de tubérculos de papa a los 10 min de ser infectados por Phytophthora infestan. El proceso consiste en la formación de HO•, anión superóxido y otras especies activas de oxígeno. Estos productos pueden tener por si mismos una acción antimicrobiana. Posteriormente los vegetales en general sufren la necrosis celular (respuesta hipersensitiva) en la zona infectada, con el consiguiente vuelco al medio intercelular inmediato a la lesión de numerosas sustancias antimicrobianas y enzimas contenidas en las células, y particularmente en la vacuola, sintetizadas con anterioridad a la infección o lesión (ver capítulo sobre vacuola). Sin embargo, se plantea si la necrosis celular del huésped es ocasionada por el parásito o si tiene origen en los mecanismos de defensa del propio vegetal atacado. Quizás la respuesta más clara provenga de experimentos realizados con un microorganismos no patógenos, Aspergillus niger. Cuando se aplica el micelio de A. niger a la superficie de legumbres de caupí (Vigna sinensis) se produce una reacción necrótica, la que también pudo ser ocasionada dentro de las 24 hs por aplicación de la poligalacturonasa del hongo. Por otra parte inactivando la enzima antes de la aplicación la necrosis no se produce. Esto indica a la poligatacturonasa como causante de la necrosis. Sin embargo la poligalacturonasa es una enzima de alta especificidad de sustrato, y por tanto no puede per se causar otro daño que el de efectuar la depolimerización, más o menos acusada, de las sustancias pécticas de la pared celular. Por tanto esto sugiere que la respuesta hipersensitiva es producida por acción de los productos de depolimerización de las pectinas de la propia planta, como parte de sus mecanismos de defensa. En una nueva fase se inicia la acumulación de una serie de metabolitos conocidos por varios investigadores como metabolitos de estrés, entre los cuales se encuentran productos con acción antibiótica. La acumulación de metabolitos de estrés se produce en unas pocas capas celulares alrededor de la lesión. Estos compuestos secundarios de bajo peso molecular y con actividad antibiótica, que se producen y acumulan en la planta como respuesta al ataque por microorganismos, son conocidos como fitoalexinas. En cortes de papa la producción de fitoalexinas ocurre aproximadamente 6 hs después de la infección por P. infestan. Las fitoalexinas aún cuando son un importante componente de los mecanismos de defensa de las plantas, no constituyen el único tipo de respuesta del vegetal frente a una infección. Por una parte vimos que las vacuolas contiene normalmente compuestos con acción antimicrobiana ya antes de que se produzca infección alguna, los que son liberados al medio intercelular al producirse el ataque, y por otra parte hay reacciones tales como la de lignificación (con su consiguiente capacidad de barrera, reducción y aún desaparición de la permeabilidad de la pared) acompañada de estimulación de las

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actividades enzimáticas (PAL, etc) correspondiente, que también se producen, como en el caso de las fitoalexinas, en el área celular inmediata a la infección, y que tiende a aislar la zona lesionada. Las diversas proteínas producidas como consecuencia de la infección son conocidas como proteínas relacionadas con la patogénesis (PRP =Pathogenesis – related – proteins). Sin embargo estos mecanismos, que son los más estudiados hasta el momento, están siempre localizados en la zona de la lesión, por lo que también son conocidos como mecanismos zonales de defensa, en contraposición a lo que empieza a conocerse como mecanismos sistémicos, o sea generalizados en el vegetal, los que aún no están suficientemente estudiados. La existencia de una respuesta por el huésped frente a la invasión por un microorganismo implica el reconocimiento de la presencia del parásito por la planta huésped, es decir que la planta debe poseer un sistema de alarma que ponga en marcha sus mecanismos defensivos. Esta alarma química y/o eléctrica. Pero aquí, otra vez, las alarmas eléctricas están mucho menos conocidas que las químicas, por lo cual solo nos ocuparemos de éstas últimas. Las alarmas químicas han recibido el nombre genérico de elicitores, los que se definen como sustancias que provocan la síntesis y acumulación de fitoalexinas en el organismo del huésped. Sin embargo, la biosíntesis de fitoalexinas no es solo provocada por factores biológicos, sino que también puede ser estimulada por factores como heridas, intoxicaciones, irradiaciones, etc. Por esta razón los elicitores se clasifican como bióticos y abióticos. Sustancias elicitoras en hongos: Se ha comunicado el desencadenamiento de la biosíntesis de fitoalexinas por un buen número de hongos fitopatógenos. Todas las grandes categorías taxonómicas de hongos poseen especies reconocidas como capaces de provocar la biosíntesis de fitoalexinas. Sin embargo, hay hongos parásitos con especificidad de huésped que inducen en forma insuficiente la producción de fitoalexinas. Esto puede deberse a la presencia de elicitores poco activos, a que el parásito causa modificaciones del control biosíntetico de la producción de fitoalexinas por el vegetal, o bien, por producir alguna sustancia supresora que bloquea el efecto elicitor (hay referencias sobre un glicomanano – proteíco con este efecto y también un glucano soluble producido por razas compatibles de Phytophthora infestans que suprimen la repuesta hipersensitiva de tejidos susceptibles de papa cuando se los infecta con razas incompatibles), o finalmente porque el parásito posee capacidad de metabolizar las fitoalexinas. En algunas especies de hongos, como en el caso de Phytophthora infestans, hay razas compatibles y no compatibles en especies de plantas (S. tuberosum) que presentan razas susceptibles y no susceptibles.

Naturaleza de los elicitores fúngicos. Se ha comunicado el aislamiento de varios elicitores de proveniencia fúngica. Estos elicitores son químicamente poli y oligosacáridos, péptidos y glicoproteínas. Los pesos moleculares de los péptidos y glicopéptidos elicitores se encuentran entre los 3.000 y los 8.000; los glucanos y glicoproteínas oscilan entre 100.000 y 5.000.000. También se han aislado compuestos de menor peso molecular como en el caso de Sclerotinia fructicola (= Monilia frutícola), que produce un pequeño péptido, la monilicolina A, que causa la síntesis de fitoalexinas en el poroto (Phaseolus vulgaris), o el ácido elaidico de Verticilium dahlia y los ácidos araquidónico y eicosapentanoico procedentes de Phytophthora infestans, que poseen actividad elicitora de sesquiterpenoides en el algodón (Gossypium hirsutum) y la papa (S. tuberosum). Entre los polisacáridos con actividad elicitora se encuentra la quitina (β-

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1,4-poli -N-acetilglucosamina), normalmente presente en la pared celular fúngica; el quitosano (β-1,4-poliglucosamina); el Pmg-glucano (glucano β-1,3-β-1,6) del hongo Phytophthora megasperma f. sp. Glycinea, componente de la pared celular del hongo. Como se indicó previamente, tanto en las vacuolas como en las paredes celulares se encuentran quitinasas y glucanasas, por lo que el verdadero elicitor podría ser un derivado de degradación de estos polímeros. Además el quitosano también podría derivar de la desacetilación de la quitina por las enzimas en la planta huésped, como se ha constatado con endocarpos de arvejas. Algo similar se demostró en el caso del Pms glucano en que se aislaron varios heptasacáridos obtenidos por digestión enzimática con una glucanasa proveniente de la soja. Solo uno de los oligosacáridos obtenidos del glucano mostró actividad elicitora. Este heptasacárido es uno de los más activos elicitores conocidos. Elicitores provenientes del vegetal. Durante las primeras etapas de la infección los hongos secretan pectinasas para degradar la pared celular. Como resultado de la actividad de estas enzimas se producen oligosacáridos del ác. D- galacturónico. Entre las diversas estructuras correspondientes a los oligosacáridos se encuentran los que dan la primera señal de alarma capaz de activar la respuesta defensiva de la planta. Se demostró que estos fragmentos, entre otras respuestas, inducen la síntesis de β-glucanasas y quitinasas con capacidad de fragmentar la pared celular del hongo. Modo de acción de los elicitores. Los elicitores conocidos operan en concentraciones desde alrededor de 2.5 x 10-9 M (monilicollina A) hasta 10-11 a 10-19 M (glucano). En los cotiledones de la soja se logra la acumulación máxima de fitoalexinas (gliceolina- una isoflavona) con 1 mg/ml de Pmg-glucano. Los PM de péptidos y glucopéptidos van desde 3.000 hasta 8.000, y el de las glicoproteínas entre 100.000 y 5.000.000. Los Pmg-glucanos operan a partir del octasacárido. Los elicitores no tienen especificidad de huésped, así la monilicolina A estimula la actividad PAL y la acumulación de fitoalexinas en arvejas (isoflavona), poroto (isoflavona), Ruta (acridonaepóxido) y papa (rishitina). Botritis cinerea (con elicitores glucano y glicoproteico) incrementa la actividad PAL e incrementa las enzimas biosintéticas de isoflavonas en porotos, en la vid enriquece los derivados del estilbeno, en Vicia faba (haba) acumula poliacetilenos. El alginato es un elicitor en Ruta (rutacridona-epóxido) y en Vitis vinífera (vid) incrementa la estilbenosintetasa. La alta especificidad con que la célula reconoce la estructura del elicitor sugiere que hay receptores específicos en los que se unen los elicitores a la membrana plasmática. Se han aislado algunos de estos receptores por ligamiento con los elicitores de soja, y por estudios microscópicos utilizando aminofenetilamina radio-iodada se sabe que los receptores se inactivan por calentamiento y por ataque con proteasas.

Elicitores abióticos. Se han descripto numerosos productos y estímulos físicos con propiedades elicitoras. En general estos elicitores producen estrés en el vegetal, y consiguientemente entre los metabolitos de estrés aparecen y se acumulan las fitoalexinas.

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Tabla 1. Distribución taxonómica de los principales hongos fitopatógenos que elicitan la producción de fitoalexinas

Grupo Phycomycetes Ascomycetes

Especie Phutoptora infestans Aspergillus (especies fitopat. facultativas) Penicillium (especies fitopat. facultativas) Sclerotinia fructicola Pulvia fulva Glomerella lindemuthiana Saccharomyces Basidiomycetes Fomes annasus Uromyces phaseoli Puccinia sp. Hongos imperfectos Fusarium sp. Verticillum sp. Botrytis allí Piricularia orizes

Huesped Papa

Enfermedad ocasionada Podredumbre del tubérculo

Fruta Tomate Chaucha

Podredumbre marrón Mancha aterciopelada Antracnosis

Árboles Chaucha

Podredumbre del leño Ataque a hojas y frutos

Enfermedades del marchitamiento Cebolla Arróz

Tabla 2. Composición química de las principales fitoalexinas conocidas de la familia de las leguminosas.

Especie

Nombre vulgar Fitoalexina

Canavalia ensiformis Phaseolus vulgaris

Poroto Sable Poroto caballero

Phaseolus Lunatus Phaseolus radiatus Phaseolus leucanthus Vigna sinensis

Glycine max pterocarpano Cicer arietinum

Soja Garbanzo

Vicia faba

Haba

Pisum sativum

Arveja

Medicarpina Faseolina Faseolin isoflavano Quievitona Faseolina Faseolina Faseolina Faseolina Quievitona Faseolina Un Medicarpina Maaquiaina Ac. Wierónico Wierona Pisatina

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Pisum arvense Pisum elatius Pisum abyssinicum Pisum fulvum Medicago sativa

Alfalfa

Trifolium pratense Trifolium repens Trifolium corniculatus

Maaquiaina Pisatina Pisatina Pisatina Pisatina Medicarpina Sativano Maquiaina Medicarpina Medicarpina Sativano Vestitol

Tiene acción elicitora el cloroformo, cloruro mercúrico, iones cúpricos, vanadato sódico (Na3 VO4), lesiones mecánicas, la irradiación por UV, etc.

Fitoalexinas. Actualmente es extrapolable que todo vegetal superior es capaz de producir fitoalexinas. En efecto, se han descripto fitoalexinas en no menos de 160 especies vegetales pertenecientes a alrededor de 17 familias. Las leguminosas es la familia más estudiada (Tabla 2). En ella los flavonoides representan la mayor parte de las fitoalexinas conocidas. En haba (Vicia faba) se producen sesquiterpenoides (p.ej. rishitina en la papa, tomate y tabaco; capsidiol en Capsicum frutescens –ají- y en tabaco. La papa, además, produce glicósidos esteroidales. Cuando Lycopersicon esculentum es atacado por Cladosporium fulvum la planta produce los poliacetilenos falcarinona, falcarindiol y tetradeca-6-(Z)-en-1,3-diin-5,8 diol, que no están previamente presentes.

Tabla 3. Algunas Fitoalexinas procedentes de familias distintas a la de las leguminosas.

Familia Amarilidáceas Quenopodiáceas

Especie Narcissus pseudonarcissus Beta vulgaris

Malváceas

Gossypium barbadense

Umbelíferas Convolvuláceas Compuestas Euforbiáceas

Daucus carota Pastinaca sativa ipomoea batatas Carthamus tinctorius Ricimun communis

Fitoalexina 7-Hidroxiflavano (Flavanona) Betavulgarina (isoflavona) Vergosina Hemigosipol 6-metoximeleina (isocumarina) Xantotoxina ipomeamarona Safinol, Deshidrosafinol Casbene

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Gramímeas Lináceas Moráceas Orquidáceas Rosáceas Solanáceas Vitáceas

Oryza sativa Linum usitatissimum Morus alba Orchis militaris Loroglossum hircinum Malus pumila Solanum tuberosum Vitis vinifera

Momilactona A (diterpeno) Alcohol coniferílico Moracina C (benzofurano) orquidol (hidroxifenantreno) Hircinol Ac. Benzoico Rishitina Resveratrol

Hay una respuesta idéntica a Verticillium albo-atrum. El falcarindiol es un compuesto activo contra Cladosporium fulvum y contra otros fitopatógenos como Alternaria brassicola y Septoria nodorum a los que inhibe totalmente a concentraciones de 20 µg/ml. El compuesto también se muestra activo contra Mycocentrospora acerina, que ataca zanahorias almacenadas. Se ha constatado que esta fitoalexina destruye la membrana y el citoplasma fúngico, y que en las hifas jóvenes causa el estallido de las puntas, con la consecuente pérdida de citoplasma. Es probable que la capacidad destructiva del falcarindiol se deba a su naturaleza hidrofóbica. En las orquídeas terrestres las fitoalexinas están representadas por dihidrofenantrenos (orquinol) en los órganos subterráneos. En compuestas se aisló un poliacetileno del cártamo o alazor (Carthamus tinctorius), el safinol. En las rutáceas las fitoalexinas se presentan como rutaacridona-epóxido, mientras que en malváceas (Gossypium hirsutum) se aisló un sesquiterpeno dimérico, el gosipol. Actualmente se conoce un enorme número de fitoalexinas prácticamente distribuidas en todas las familias estudiadas y su número se acrecienta casi diariamente. Bacterias que provocan la acumulación de fitoalexinas. Erwinia carotovorans es una bacteria que provoca la acumulación de fitoalexinas en la papa. Se detectó, p.ej., la acumulación de rishitina y fituberina. Virus que inducen la producción de fitoalexinas. En la arveja se detectó la producción de pisatina por virus del mosaico del tabaco, y a pesar de la diferencia biológica entre los organismos, el mismo producto es producido bajo acción de diversos ascomicetes, basidiomicetes y bacterias. Vínculo entre heridas y producción de fitoalexinas. En el metabolismo del fenilpropano existe una estrecha relación entre las reacciones bioquímicas en lesiones y la infección de tejidos. Las reacciones a heridas en la planta se limitan, al igual que la acumulación de fitoalexinas, al ambiente inmediato a la lesión. En la formación del callo (tejido cicatricial) y de la peridermis en las heridas, se sintetizan en forma intensiva aminoácidos aromáticos por la vía del ácido shiquímico, destinados a la síntesis de las proteínas necesarias para la formación de tejidos de oclusión. No es extraña la similitud existente entre la reacción a la infección y la producida frente a heridas, ya que de hecho una herida es una puerta abierta a la infección microbiana.