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Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos (Validation of microbiological culture method for use in diagnosis of mycoplasma in sera, cell cultures and biopharmaceuticals products) Lozada Yoesley 1: 1MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 1: Lobo Evelyn 1:1MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 2: Burgher Yaima 1:1MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 3: Duque Arianna 1:1MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 4: Martínez Siomara 2 : 2Grupo de Biología Molecular, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria CENSA. Contactos: [email protected] y [email protected]

Resumen Los micoplasmas infectan frecuentemente los cultivos celulares, sueros y productos biofarmecéuticos. A partir del desarrollo de la biotecnología en Cuba, se hace necesario controlar estrictamente estas contaminaciones, específicamente las producidas por micoplasmas, como parte de los sistemas de calidad para la fabricación y liberación de estos productos. En tal sentido es imprescindible disponer de técnicas de diagnóstico sensibles y confiables para la detección de estas especies, tal es el caso del cultivo microbiológico (CM), aprobada por la Farmacopea Europea, 2007 como técnica a emplear para el diagnóstico de rutina de estos microorganismos. MYCOLAB (Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas) tiene implementado un sistema de diagnóstico para la detección de estos agentes que incluye este ensayo, pero para demostrar la confiabilidad de los resultados resulta imprescindible lograr la validación y acreditación de esta técnica bajo un Sistema de Gestión de la Calidad (SGC) según la NC ISO/IEC 17025:2006. Por lo tanto, nos propusimos como objetivo establecer un diagnóstico confiable para la detección de micoplasmas en productos biofarmacéuticos de aplicación biomédica en MYCOLAB mediante el ensayo de cultivo microbiológico validado y acreditado por la NC ISO/IEC 17025:2006. Para esto se validó el (CM) teniendo en cuenta diferentes parámetros de desempeño como fueron robustez, límite de detección, especificidad y precisión. Como resultados de la 1 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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validación del CM se comprobó que el ensayo es robusto, específico para micoplasmas, capaz de detectar hasta 1 UFC/mL y con una alta precisión, lo que permite brindar un diagnóstico más rápido, confiable y menos costoso. Palabras clave: validación| prueba cualitativa| micoplasmas | cultivo. Abstract Mycoplasmas frequently infected cell cultures, serums and biofarmeceutical products. With the development of biotechnology in Cuba, it is necessary to strictly control such pollution, specifically those caused by mycoplasma, as part of quality systems for the production and release of these products. Thus it is essential to have sensitive diagnostic techniques and reliable detection of these species, as in the case of microbiological culture (CM), adopted by the European Pharmacopoeia, 2007 as a technique to use for routine diagnosis of these organisms. MYCOLAB (Laboratory for diagnosis of mycoplasma) has implemented a system for the detection of these agents included in this trial, but to demonstrate the reliability of the results is essential to achieve the validation and accreditation of the technique under a Management System (QMS) according to the NC ISO/IEC 17025:2006. Therefore, we intended to establish a reliable diagnosis for the detection of mycoplasma in biopharmaceutical products MYCOLAB biomedical application by microbiological culture assay validated and accredited by the NC ISO/ IEC 17025:2006. To this was validated (CM) taking into account various performance parameters as they were robust, detection limit, specificity and accuracy. As a result of the validation of the CM was found that the assay is robust, specific for mycoplasma, can detect up to 1 CFU/mL and with high accuracy, allowing a diagnosis to provide faster, more reliable and less expensive. Keywords: validation| qualitative test | mycoplasmas |culture.

Introducción. La validación no es más que la confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de datos que respaldan la existencia o veracidad de algo, estos pueden obtenerse por medio de la observación, medición, ensayo/prueba u otros medios que han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (NC ISO 9000:2005), similar concepto refiere la NC ISO/IEC 17025:2006 incluyendo la comparación con otro método de ensayo siendo esta una parte de la validación que se emplea para fines de comprobar la exactitud. Para validar los métodos se hace referencia a los parámetros a comprobar de acuerdo con las características de los ensayos cuantitativos o cualitativos de analitos 2 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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mayoritarios o minoritarios en la muestra evaluada según lo refiere la REGULACIÓN No. 41-2007 del CECMED (Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos), durante este proceso es posible identificar si la metodología nueva o modificada se acepta para su uso, en tanto demuestre equivalencia con el método de referencia, entendiéndose ésta como una diferencia no significativa en los resultados emitidos por ambos métodos, o se determine que el nuevo ensayo demuestra un comportamiento superior. Si en el proceso de validación el nuevo ensayo demuestra un recuento significativamente más bajo que el de referencia, se debe rechazar (Barrell et al., 2002). Teniendo en cuenta lo anterior y conociendo el papel patogénico de los micoplasmas que de manera indiscutible están presentes en un gran número de enfermedades infecciosas, pudiéndose encontrar colonizando los tractos respiratorios, urogenital y las articulaciones tanto del hombre como de los animales, además de infectar las plantas, los cultivos celulares y los productos biotecnológicos de aplicación biomédica (Chaudhry et al., 2004; Ferrer, 2005; Rivera-Tapia et al., 2010; Arismendi et al., 2010) y por otra parte él gran desarrollo de la biotecnología, surge la necesidad de establecer sistemas de calidad para aquellos métodos validados que garanticen la seguridad de productos, los cuales dentro de su obtención utilizan como materias primas derivados biológicos como cultivos de células, sueros fetales, enzimas, entre otros (Hernández, 2007). Dentro de los sistemas de calidad la detección de contaminaciones biológicas juega un importante rol, de modo que las agencias reguladoras han establecido normas relacionadas con la detección de estas contaminaciones y entre ellas, específicamente, la detección de micoplasmas como prueba determinante para la liberación o no de productos biotecnológicos (Farmacopea Británica, 2004; Regulación 16:2006 CECMED; Farmacopea Europea, 2007), debido a los efectos indeseables que producen estos microorganismos en el individuo que recibe los productos contaminados, el error en la interpretación de un diagnóstico y en las alteraciones que inducen los micoplasmas en la actividad y funciones de la célula, relacionadas con la producción de severos eventos citopáticos, la inhibición de síntesis de carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos (Lobo y Vega, 2004; Rivera-Tapia et al., 2010). El Laboratorio de Diagnóstico de Micoplasmas, del CENSA (Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria), cuenta entre los procedimientos utilizados para el diagnóstico de micoplasmas con el método de cultivo microbiológico el cual es utilizado por centros de referencias internacionales además de ser reconocida como la técnica de referencia en los documentos normativos relacionados con diagnóstico de micoplasmas en animales, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos. En tal sentido la validación de este procedimiento en nuestro laboratorio nos pone al mismo nivel de los estos centros de referencias internacionales, además, de ser el único laboratorio del país que brinda el servicio de detección de micoplasmas a los diferentes productos o materias primas utilizadas tanto para investigaciones, producciones como componentes de diagnosticadores desarrollados por los diferentes centros del polo científico. Para el desarrollo del protocolo de validación se tuvo en cuenta lo referido en la REGULACIÓN 3 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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No. 41-2007 del CECMED bajo un sistema de calidad regido por la norma NC ISO/IEC 17025:2006. MATERIALES Y MÉTODOS. Material de Referencia Certificado (MRC), utilizado como controles positivos en el ensayo Cultivo Microbiológico. Cepa de Mycoplasma arginini (M. arginini) NCTC 101291: esta cepa se presenta como el contaminante más frecuente de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos. Es la cepa tipo a emplear en los ensayos de cultivo microbiológico y PCR según lo recomendado por la Farmacopea Británica, 2004; Farmacopea Europea, 2007. Cepa de Mycoplasma orale (M. orale) NCTC 101121 Cepa de Acholeplasma laidlawii (A. laidlawii) NCTC 101161 Cepa de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) NCTC 101301 Cepa de Mycoplasma fermentans, (M. fermentans) NCTC 101171 Cepa de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony biotype (MmmSC). ATCC 279481 Cepa de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides large colony biotype (MmmLC). NCTC 101371 Cepa de Mycoplasma spp. Material de colección del laboratorio de Microbiología del Instituto Zooprofiláctico de Teramo, Italia. (Laboratorio de referencia de la OIE para el diagnóstico de la Pleuroneumonía contagiosa bovina). 1

Material de referencia certificado proveniente de la Colección de Cultivos Tipos de Inglaterra

Desarrollo de la validación del método de cultivo microbiológico para el género Mycoplasma. Siembra de las cepas. La siembra de las cepas se realizó según lo descrito por Hayflick, 1965. Las cepas liofilizadas se resuspendieron en 1 mL de medio Micoplasma Hayflick líquido. Posteriormente se tomó 0.2 mL de cada una de las cepas y se sembró en medio Micoplasma Hayflick Agar. Se incubó a 370C en incubadora (Thermolyne) durante 48 horas en jarra con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998. 4 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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Estudio morfológico Las colonias fueron observadas a las 48 horas de incubación usando un microscopio óptico (Opton) de luz ordinaria bajo una magnificación de - 35 x. Se siguió como criterio de caracterización la formación de colonias pequeñas, entre 50 a 500 μm de diámetro y en forma de “huevo frito”, según lo descrito por Poveda, 1998. Cultivos de las cepas. El cultivo se realizó según lo descrito en el Manual de Obtención de Antígeno del Instituto de Investigaciones de la Universidad de Georgia, 2002. Se cortó un bloque de 1 cm2 de las placas crecidas y se sembraron en 5 mL de medio Hayflick líquido. Posteriormente se incubaron a 370C por 48 horas hasta que alcanzaron la fase exponencial de crecimiento con un pH entre 7.4-7.5 y una densidad óptica (DO540nm) entre 0.2-0.4, medida en espectrofotómetro (Pharmacia). Se sembraron estos 5 mL de cultivo en 20 mL de medio Hayflick líquido, para un volumen final de 25 mL y se incubaron a 370C por 48 horas, hasta que alcanzó la DO y pH requeridos. Se realizó otro pase sembrando 10 mL de estos precultivos en 40 mL de medio, para un volumen final de 50 mL manteniendo las mismas condiciones de crecimiento. Por último, se tomaron 20 mL de los cultivos crecidos y se sembraron en 80 mL del medio en las mismas condiciones de crecimiento, para un volumen final de 100 mL. En cada pase, el cultivo de las cepas fue sembrado en Agar sangre para el control bacteriológico. Metodología de Validación. Teniendo en cuenta que este ensayo pertenece a la categoría de ensayo cualitativo, según la clasificación realizada por la Organización Internacional de Sanidad Animal (OIE) 2008 y la REGULACIÓN No. 41-2007 del CECMED, se tuvo presente la demostración de los siguientes parámetros: estudio de robustez, límite de detección, especificidad y precisión.

ESTUDIOS DE ROBUSTEZ, LÍMITE DE DETECCIÓN, PRECISIÓN DEL CULTIVO MICROBIOLÓGICO.

ESPECIFICIDAD

Y

Robustez En el estudio de robustez se evaluaron las siguientes variantes: - Diferentes rangos de temperaturas (330C, 350C; 370C y 390C) manteniendo una atmosfera de 5% CO2, - Diferentes tiempos de conservación del suero equino para ser empleado como suplemento del medio de cultivo (tres meses, seis y 12 meses). 5 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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- Diferentes medios de micoplasma base PPLO-OXOID y Micoplasma Base CaldoBIOCEN (Centro Nacional de Biopreparados, Cuba). Límite de detección. Se partió de un cultivo inicial de Mycoplasma arginini (NCTC 10129), con una concentración de 2x10 8 UFC/mL. Se realizaron diluciones seriadas en base a diez, desde 10-1 hasta 10-10 UFC/mL, las mismas fueron sembradas en placas con medio Hayflick e incubadas a 370C por 48 horas en jarra con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998. Todas las diluciones se trabajaron por triplicado. Especificidad. Para la determinación de este parámetro se utilizaron los siguientes cultivos de los MRC mencionadas anteriormente: - M. arginini, con una concentración de 2x108 UFC/mL - M. hyorhinis; con una concentración de 1.4 x108 UFC/mL - M. fermentans; con una concentración de 3,2x108 UFC/mL - M. orale con una concentración de 2.2x108UFC/mL - A. laidlawii, con una concentración de 1.7x108 UFC/mL -Staphylococcus aureus con una concentración de 2x108 UFC/mL,(ATCC 6538), donada gentilmente por Laboratorio de Microbiología, Dirección de Aseguramiento de la Calidad, CENSA. Los cultivos fueron sembrados en placas con medio Hayflick e incubadas a 370C por 48 horas en jarra con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998. Todos los cultivos de las cepas se trabajaron por triplicado. Precisión La determinación de la precisión se realizó en dos niveles: intraensayo e interensayo relacionado con la elaboración del medio de cultivo, comprobando para cada caso la esterilidad y promoción del crecimiento. - intraensayo (repetibilidad): elaboración del Medio de cultivo Hayflick por un mismo analista y bajo las mismas condiciones de trabajo en diferentes días, hasta llegar a un total de 20 lotes con 15 placas cada uno. De ellas el 100% fueron sometidas a prueba de esterilidad y el 20% a promoción del crecimiento. 6 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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- interensayo (precisión intermedia): realizado por dos (2) analistas, con las mismas condiciones, en días diferentes. En este estudio se mantuvo las mismas condiciones del análisis anterior para cada analista. Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó la prueba t de student para comprobar la homogeneidad de varianza. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ENSAYOS RELACIONADOS CON EL CULTIVO PARA MICOPLASMAS. A pesar de los avances tecnológicos en el diagnóstico de los micoplasmas, el método de cultivo continúa siendo la técnica de referencia aprobada por las diferentes famacopeas (Farmacopeia Europea, acápite 2.6.7 y 2.6.16, 2007 y 2010 y organismos reguladores como la OIE (Manual de la OIE, 2008), Organización Mundial de la Salud (OMS, 2000 y 2010) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS, 2000). En la Figura 1 se observan los resultados obtenidos como parte del estudio morfológico utilizados en este ensayo. En todos los casos se puedo apreciar la conocida forma de “huevo frito” reportada como característica distintiva de los micoplasmas consistente en una región central granular oscura embebida en el agar y una zona traslúcida periférica alrededor de esta, lo cual coincide con lo reportado por Poveda, 1998 y aparece descrito en el Manual Bergey, del 2010.

Figura 1.- Colonias en forma de huevo frito, reportadas como característica distintiva para el micoplasmas. A: M. fermentans; B: M. hyorhinis; C: M. arginini; D: A. laidlawii; E: M. orale. Los cultivos de estas cepas presentaron el pH y DO requeridos según se refiere en el Manual de Obtención de Antígeno del Instituto de Investigaciones de la Universidad de Georgia, 2002, donde se señala que valores de pH entre 7.2 y 7.5 y una absorbancia entre 0.2 y 0.4 nm es lo recomendado en un cultivo para ser utilizado en los ensayos de validación. Valores similares fueron obtenidos por Hernández, 2005 y Zamora, 2006 quienes señalan, además, que cuando un cultivo mantiene sus propiedades 7 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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morfológicas y bioquímicas estables y homogéneos, pueden ser utilizados en estudios de caracterización y posibilita la extracción de ADN de buena calidad. El análisis bacteriológico de estos cultivos resultó negativo, lo que demuestra que no presentaba contaminación bacteriana y que el crecimiento evidenciado se corresponde con las especies de micoplasmas y no con las conocidas formas L bacterianas ya que en subcultivos realizados todas las cepas de micoplasmas crecieron. Lo anterior tiene su explicación ya que en condiciones de incubación favorables o en las fases tempranas del cultivo (24 y 72 horas (hrs), las formas celulares esféricas de 0,3 µm de diámetro son las predominantes. Cuando las condiciones de incubación no son las óptimas o el cultivo ha envejecido, comienzan a aparecer formas cilíndricas (100 µm de largo y entre 0,3-0,4 µm de ancho), que contienen varios nucleoides similares a las formas L bacterianas. Estas estructuras fibrilares se fragmentan y dan origen a estructuras esféricas de 0,1 a 0,25 µm, denominadas “cuerpos elementales”, que carecen de viabilidad, según lo descrito por Razin y Concenza, 1966. Cuando estas estructuras son re-inoculadas en un medio fresco, no son capaces de crecer ni de multiplicarse criterios que sustentan los resultados obtenidos por nosotros. ESTUDIOS DE ROBUSTEZ, LIMITE DE DETECCIÓN, PRECISIÓN DEL CULTIVO MICROBIOLÓGICO.

ESPECIFICIDAD

Y

Según lo establecido en la Farmacopeia Británica Veterinaria, 2004; Manual OIE, 2008 y Farmacopeia Europea, 2007 es necesario emplear material de referencia certificado en los estudios de validación de cualquier ensayo, ya que los mismos poseen todas sus propiedades bioquímicas y enzimáticas estables. El empleo de este material garantiza obtener resultados confiables y permite demostrar que realmente el ensayo empleado es útil para detectar el microorganismo deseado. De acuerdo a lo establecido en la Regulación 41/2007 del CECMED y la NC ISO/IEC 17025:2006, los métodos normalizados y estandarizados no requieren validación sino una evaluación de su desempeño. No obstante, para la introducción de los mismos cada laboratorio definirá sus criterios de evaluación caso a caso, tomando en consideración las características del método y la experiencia que se tenga en la caracterización del producto en cuestión. ROBUSTEZ Los resultados obtenidos en relación a las condiciones de incubación empleando diferentes rangos de temperaturas evidenciaron que en el caso de las variables de 330C, 350C y 390C no hubo crecimiento en ninguno de los medios utilizados, por el contrario si se observó crecimiento a 37ºC ±0,5 de temperatura. Esto se debe a que los micoplasmas son microorganismos mesófilos y necesitan este rango de temperatura para propiciar su crecimiento Poveda, 1998. Este resultado también coincide con lo reportado por Baseman et al., 2004, quienes obtuvieron de la región del cuello uterino 8 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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y de la vagina 21 aislados de M. genitalium durante una investigación a 31 mujeres que presentaban uretritis no gonocócica al sembrar estos exudados en el medio SP-4 a 37ºC durante 21 días evidenciándose el cambio de pH. Se conoce que los micoplasmas carecen de las vías biosintéticas necesarias para la síntesis de ácidos grasos y precursores de los ácidos nucleicos (Manual Bergey, 2002), además de ser incapaces de sintetizar esteroles, es por ello que en su mayoría se presentan como parásitos de organismos eucarióticos, asociados a la membrana tanto de la célula como a la de los orgánulos citoplasmáticos (Willby et al., 2000). Teniendo en cuenta estas características y para favorecer el crecimiento de estos microorganismos en medios artificiales se utiliza el suero equino como uno de los requerimientos nutricionales más relevante. En el estudio de los tiempos de conservación de tres, seis y doce meses del suero equino utilizado como suplemento, no se observó diferencia significativa entre los tres tiempos evaluados (Tabla 1), esto puede deberse a que la conservación a -20ºC del suero equino en estos intervalos de tiempo no afecta la calidad del colesterol favoreciendo el crecimiento de los micoplasmas. Estudios similares fueron llevados a cabo por Hernández et al., 2005 quienes confirman estadísticamente, la factibilidad que tiene el empleo del suero equino con respecto al empleo del suero humano para realizar la prueba de la coagulasa en tubo para la detección de Staphylococcus aureus por parte de los laboratorios microbiológicos y de poder obtener grandes volúmenes para su distribución a diferentes laboratorios, al mostrar ser muy estable a - 20 ºC por un período de 12 meses. Tabla 1.- Crecimiento de micoplasmas en medio Mycoplasma Hayflick empleando diferentes tiempos de conservación de suero equino. Diluciones N° colonias/tiempo SE Media meses III VI XII

UFC/mL

10-6

2

1

1

1.33

1.33x107 UFC/mL

10-5

10

10

9

9.66

9.6x106 UFC/mL

10-4

72

78

70

73.3

0.73x105 UFC/mL

El tercer parámetro evaluado en la robustez fue el empleo de dos tipos de medios de Micoplasma base procedente de dos casas comerciales, OXOID y BIOCEN. Además del suero equino utilizado como suplemento en el medio de cultivo y las condiciones de incubación, es importante conocer que a veces los componentes pueden ser tóxicos para los micoplasmas, según lo refiere Manual Bergey, 2002 recomienda el uso del 9 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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Agar purificado o Agar Noble, que garantiza las condiciones óptimas de crecimiento en el medio de cultivo. Como resultado de este estudio se pudo evidenciar que no hubo diferencias en cuanto a los parámetros de control de esterilidad y promoción del crecimiento entre los medios analizados, comportándose de manera satisfactoria ambos medios de cultivo, estos resultados coinciden con los obtenidos por Pérez et al., 2001 quienes aplicaron un diseño compuesto central para estudiar el medio de cultivo Mycoplasma base (Oxoid), enriquecido con extracto de levadura, suero equino y glucosa, para el crecimiento de M. gallisepticum en el cual demostró que una disminución de un 40% del medio Micoplasma base no influye negativamente en el rendimiento celular. Resultados similares a los nuestros fueron obtenidos por Lobo, 2000 quien utilizando un medio de cultivo que contenía PPLO y suero equino en condiciones de agitación favoreció el crecimiento de M. pullorum obteniéndose un mejor comportamiento en cuanto a la velocidad de crecimiento y rendimientos de la biomasa, aspectos que se deben tener en cuenta a la hora de trabajar en el laboratorio con estos microorganismos. LIMITE DE DETECCIÓN Como resultado del límite de detección del ensayo, el mismo, fue capaz de detectar hasta 1 UFC/mL, resultados similares se describen por Poveda, 1998; Pérez, et al., 2009 y Asarnow et al., 2010 quienes señalan que los micoplasmas son microorganismos muy exigentes desde el punto de vista nutricional y sus requerimientos culturales son muy altos por tanto, en la medida que le sean suplementados o garantizadas estas condiciones en los medios de cultivos artificiales se podrán obtener resultados favorables en cuanto a la promoción de crecimiento de estos microorganismos ya que la célula tendrá todos los cofactores enzimáticos necesarios para el desarrollo de las funciones metabólicas básicas. En nuestro caso el medio de cultivo utilizado contiene como suplemento dextrosa la cual es utilizada, según refiere Poveda, 1998, como fuente de energía mediante la vía glicolítica Embden-Meyerhof-Parnas para la de obtención de trifosfato de adenosina (ATP), que garantiza el crecimiento de micoplasmas, por otra parte se mantuvieron las condiciones de atmósfera propia para su desarrollo en condiciones de cultivo in vitro relacionada con 5 - 10 % de CO2 y 90 - 95% de N2 en microaerofilia y pH entre 7,0 – 7,4 que favorecieron el crecimiento, permitiendo obtener los resultados antes mencionados y de esta forma ofrecer una seguridad en el diagnóstico de estos microorganismos. ESPECIFICIDAD Todas las cepas de micoplamas empleadas en este ensayo crecieron entre las 24 y 48 horas a 37 0C con atmósfera de microaerofilia (Gráfico 1), lo que se describe como característico para estas especies según Razin, 1999. Los resultados obtenidos 10 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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ratificaron la especificidad del medio Hayflick para micoplasmas coincidiendo con lo reportado en la Farmacopea Europea, 2007 y el Manual Bergey 2002, quienes recomiendan este medio para el cultivo de los micoplasmas que afectan los cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos puesto que propicia condiciones fisiológicas y pH adecuado para el crecimiento de estas especie.

Grafico 1- Crecimiento de las diferentes especies de micoplasmas en medio Micoplasma Hayflick modificado. M. arginini (24 hrs); M. hyorhinis (48 hrs); M. fermentans (48 hrs); M. orale (24 hrs); A. laidlawii (24 hrs). En relación al comportamiento de Staphylococcus aureus no se evidenció crecimiento en el medio. Este resultado se explica si tenemos en cuenta que el medio Hayflick posee dentro de sus componentes la penicilina, antibiótico que actúa sobre la síntesis de la pared celular lo que evita que crezcan bacterias Gram positivas, esto propicia condiciones favorables para el crecimiento de los micoplasmas ya que al carecer de pared celular no tiene efecto sobre el crecimiento de los mismos. Por otra parte el medio de cultivo fue suplementado, además, con acetato de talium que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas (según lo refiere la Farmacopea Española, 2005), de esta manera se garantiza el crecimiento de los micoplasmas y se evitan contaminaciones bacterianas. Independiente de estos resultados debemos señalar que dentro del Sistema de Gestión de la Calidad (SGC), de MYCOLAB esta implementado un procedimiento normativo operacional, relacionado con el protocolo para el diagnóstico de micoplamas. En el mismo se hace referencia a que todas las muestra que entre al laboratorio antes de proceder a las técnicas de cultivo y la PCR para la detección de micoplasmas se le deberá realizar el procedimiento para el control bacteriológico, aquellas muestras que 11 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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resulten positivas saldrán del sistema de diagnóstico de micoplasmas, contribuyendo con esto a un mejor desempeño del ensayo. PRECISIÓN La continua manipulación del medio durante la preparación, incrementa la probabilidad de contaminación y en algunos casos puede interferir en el crecimiento de los microorganismos. Teniendo en cuenta este criterio basamos los estudios repetibilidad y precisión intermedia en la evaluación del control de esterilidad y promoción del crecimiento. En nuestro estudio ninguno de los medios preparados bajo estos criterios presentó contaminación alguna. Estos medios funcionaron de manera óptima, y permitieron el crecimiento de la cepa control en un tiempo aproximado de 48 horas, lo cual está dentro del rango descrito por Pérez et al., 2009. Los estudios para comprobar la homogeneidad de varianza demostraron que no hubo diferencias significativas para una p≥0.05 en el coeficiente de variación. Esto sugiere que cuando se cuenta con un SGC, que de soporte al sistema de diagnóstico y se toman las medidas necesarias, se puede reducir al mínimo la posibilidad de contaminación y lograr resultados reproducibles entre los analistas ya sea en el mismo día o en condiciones diferentes (día y operario). Conclusiones. A partir de los resultados obtenidos se debe utilizar como proveedor, para nuestro laboratorio, el medio Micoplasma base de la firma BIOCEN, el cual cuenta con una patente que avala su composición y calidad, otro parámetro evaluado fue la robustez el cual demostró que el método de cultivo microbiológico para micoplasmas es robusto, pudiéndose aplicar cualquiera de las variantes del tiempo de conservación del suero equino, a temperatura de incubación de 370C ±0,5 con el medio de cultivo recomendado. Teniendo en cuenta estos resultados proponemos el empleo del medio Micoplasma Hayflick modificado (penicilina/acetato de talium) para el diagnóstico de micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biotecnológico como parte del sistema de mejora de MYCOLAB. El método de cultivo microbiológico evaluado en este estudio cumple con los indicadores requeridos de desempeño en cuanto a robustez, límite de detección, especificidad y precisión por lo que posibilita brindar resultados confiables para los fines previstos a partir de la técnica validada. Por otra parte se recomienda ampliar estudios de validación de la PCR incorporando un control interno para detectar inhibidores del ensayo en diferentes matrices e incorporar 12 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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en el sistema diagnóstico del laboratorio MYCOLAB el empleo de PCR múltiples para la identificación de especies de micoplasmas contaminantes. Agradecimientos. A Evelyn Lobo por ser mi compañera y guía durante toda la investigación, gracias una y mil veces por su apoyo infinito y ayuda incondicional, la admiro y le estaré eternamente agradecido, ya que no solo es una gran amiga, también es como una madre llegando en muchas ocasiones a llamarme Roxano, el hijo macho. A Arsenio y a Alejandra por asesorarme todo el tiempo con tanta paciencia. A mis padres por ser mi ejemplo y guía, enseñándome día a día los grandes valores de la vida, sepan que vivo orgulloso de ustedes, por eso los QUIERO y los llevo siempre en mi CORAZÓN. A mi gran amor, Dailis por todo el cariño, comprensión, dedicación y confianza que me brinda cada día, ayudándome en los momentos más difíciles, estando siempre a mi lado, a mis padres que sin ellos este trabajo no fuese posible, a mi tía Migdo y Noe que siempre me brindaron su apoyo y a mi abuela Juana, que siempre me está dando su amor. Bibliografía. • Arismendi, S. N.; Carrillo, L. R. y Andrade, S. N. (2010): Mollicutes fitopatógenos transmitidos por insectos: interacciones y efectos en sus vectores. Agro Sur Vol. 38(2) 55-67. • Asarnow, D.; Warford, A.; Fernandez, L.; Hom, J.; Sandhu, G.; Candichoy, Z.; Luna, G.; Goldman, M.; Rarich, R. (2010): Validation and international regulatory experience for a mycoplasma touchdown PCR assay. Biologicals. 38; 224–231. • Barrell, R. C.; Benton, D. B.; Boyd, P. and Cole, S. (2002): The microbiology of drinking water-Part 3-Practices and procedures for laboratories in methods for the examination of waters and associated materials. Environment Agency, Washington DC, EEUU. • Baseman, J. B.; Cagle, M. K.; Herrera, J. E.; Rasmussen, C.; Baseman, J. G.; Shain, R. and Piper, J. M. (2004): Diagnostic Assessment of Mycoplasma genitalium inCulture-Positive Women. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. Vol. 42, No. 1. p. 203–211. • British Pharmacopoeia Veterinary. (2004): Test for Absence of Mycoplasmas. Appendix XVI. B (Vet) 3. pp A17- A19. • Chaudhry, R.; Tabassum, I.; Nisar, N.; Dhawan, B.; Broor, S. and Khare, S. (2004): Mycoplasma contamination in cell culture. En: Abstract Book of 15th International Congress of the International Organization of Mycoplasmology (IOM). July 11-16, Georgia, Athens. pp: 88. • Europpean Pharmacopeia 5.8 (2007): Mycoplasmas. Appendix 2.6.7. • Europpean Pharmacopeia 5.8 (2010): Mycoplasmas. Appendix 2.6.7. • Farmacopeia Española 5.8 (2005): Mycoplasmas. Appendix 2.6.7. • Ferrer, M. (2005): Análisis de los proteomas de dos micoplasmas: Mycoplasma penetrans y Mycoplasma genitalium. Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad autónoma de Barcelona. 13 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf

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REDVET: 2012, Vol. 13 Nº 11 Recibido 07.06.2012 / Ref. prov. JUN1236B_REDVET / Revisado 29.09.2012 Aceptado 28.10.2012 / Ref. def. 111217_REDVET / Publicado: 01.11.2012 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización®. Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET®http://www.veterinaria.org/revistas/redvet

15 Validación del método de cultivo microbiológico para su utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf