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Noviembre 2007
Manual del kit QIAamp® DSP Virus
Σ
50
Versión 1 IVD El kit QIAamp DSP Virus es un sistema genérico que utiliza la tecnología QIAamp para aislar y purificar ácidos nucleicos víricos en muestras de plasma o suero humano con fines de diagnóstico in vitro.
Para uso diagnóstico in vitro
REF
60704
H B
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11/2007
QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 R1
MAT
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Sample & Assay Technologies
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Marcas comerciales: QIAGEN®, QIAamp®, QIAvac, MinElute™ (Grupo QIAGEN); AMPLICOR HBV MONITOR®, AMPLICOR HCV MONITOR®, AMPLICOR HIV-1 MONITOR®, COBAS®, TaqMan® (Roche Group); artus™, RealArt™ (artus GmbH); Eppendorf® (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Incluso en aquellos casos en los que no se indica de manera explícita, no debe asumirse que las marcas comerciales, nombres registrados, etc., no están protegidos por la ley. El procedimiento de PCR está protegido por las patentes de los EE.UU. n.º 4.683.195 y n.º 4.683.202, y equivalentes en el extranjero, propiedad de HoffmannLa Roche AG. © 2004 QIAGEN, reservados todos los derechos.
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Índice Contenido del kit
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Símbolos
5
Almacenamiento
6
Control de calidad
6
Indicaciones de uso
6
Limitaciones del uso del producto
7
Información de seguridad
7
Introducción
9
Principio y procedimiento
10
Equipo y reactivos de los que debe disponer el usuario
14
Notas importantes
15
Puntos importantes antes de empezar
15
Preparación del ARN
15
Almacenamiento de las muestras
16
Preparación de reactivos y tampones
16
Elución de los ácidos nucleicos víricos
19
Rendimiento y calidad de los ácidos nucleicos víricos
19
Montaje del sistema de vacío QIAvac 24 Plus
19
Protocolo Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos víricos de suero y plasma Distribuidores QIAGEN
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Contenido del kit Kit QIAamp® DSP Virus N.º de catálogo.
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Número de preparaciones
50 50
QIAamp MinElute Columnas QIAamp MinElute™ con tubos de lavado (WT) (2 ml)
COL
EXT
Extensores de columna (3 ml)
COL
EXT
50
ET
Tubos de elución (1,5 ml)
ELU
TUBE
50
VC
VacConnectors
VAC
CON
50
LT
Tubos de lisis (2 ml)
LYS
TUBE
50
WT
Tubos de lavado (2 ml)
WASH
TUBE
50
LYS
BUF
33 ml
AL
Tampón de lisis*
AW1
Tampón de lavado 1* (concentrado)
WASH
BUF
1 CON
19 ml
AW2
Tampón de lavado 2† (concentrado)
WASH
BUF
2 CON
13 ml
AVE
Tampón de elución (tapón púrpura)
ELU
BUF
PS
Disolvente de proteasa
QPROT
SOLV
4,4 ml
CAR
RNA
310 µg
†
†
"carrier"
"Carrier" de ARN (tapón rojo)
QP
Proteasa QIAGEN®‡ CD Manual
QPROT H
4 x 2 ml
1 vial
B
H B
1 1
* Contiene clorhidrato de guanidina. No compatible con desinfectantes que contengan lejía. Para más información, consulte la página 7. †
Contiene azida sódica como conservante.
‡
Volumen de resuspensión 4,4 ml.
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Símbolos Σ
El kit contiene reactivos para preparar 50 muestras
50
Consultar la información que se incluye en el manual
i
Usar antes de IVD
Dispositivo médico de diagnóstico in vitro
REF
Número de catálogo
LOT
Número de lote
MAT
Número de material Componentes
COMP
Volumen
VOL
Limitaciones de temperatura Fabricante legal A su recepción
i
Nota importante Cambiar los guantes después del paso del protocolo marcado con este símbolo 8°C 2°C
?
EtOH
ADD
Abrir a la entrega; guardar las columnas QIAamp MinElute a 2–8°C Anotar la fecha después de añadir etanol al frasco Añadir
CONT
Contenido
LYOPH
Liofilizado
RCNS
Reconstituir en
EtOH
Etanol
GuHCI
Clorhidrato de guanidina
SUBT
➡
Subtilisina Conduce a
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Almacenamiento Las columnas QIAamp MinElute deben almacenarse a una temperatura de 2–8°C en el momento de la recepción. Todos los tampones pueden guardarse a temperatura ambiente (15–25°C). El transportador (carrier) de RNA liofilizado se puede guardar a temperatura ambiente (15–25°C) hasta la fecha de caducidad. El "carrier" de ARN sólo puede disolverse en tampón de elución (AVE); el "carrier" de ARN disuelto debe añadirse inmediatamente al tampón de lisis (AL) como se describe en la página 16. Esta solución debe prepararse fresca, y a 2–8°C es estable hasta 48 horas. Las porciones no utilizadas del "carrier" de ARN disuelto en el tampón de elución (AVE) deben congelarse en alícuotas a –20°C. La Proteasa de QIAGEN (QP) liofilizada se puede guardar a temperatura ambiente (15–25°C) hasta la fecha de caducidad sin deterioro de su actividad. La Proteasa de QIAGEN (QP) una vez reconstituida es estable 1 año a 2–8°C, pero sólo hasta la fecha de caducidad. Los Tampones de Lavado 1 y 2 (AW1 y AW2) una vez reconstituidos son estables 1 año a temperatura ambiente (15–25°C), pero sólo hasta la fecha de caducidad.
Control de calidad Siguiendo el Sistema de gestión total de la calidad certificado de QIAGEN, cada lote del kit QIAamp DSP Virus se comprueba frente a una serie de especificaciones predeterminadas con el fin de garantizar una calidad homogénea del producto.
Indicaciones de uso El kit QIAamp DSP Virus es un sistema genérico que utiliza la tecnología QIAamp para aislar y purificar ácidos nucleicos víricos en muestras de plasma o suero humano con fines de diagnóstico in vitro. Cualquier resultado diagnóstico obtenido con el procedimiento de preparación de muestras en combinación con cualquier ensayo de ácidos nucleicos (NAT, del inglés Nucleic Acid Test) posterior debe interpretarse en el contexto de otros resultados clínicos o analíticos. El producto está destinado a usuarios profesionales tales como técnicos y médicos con formación en técnicas de biología molecular. Está diseñado para utilizarse con cualquier otra aplicación que utilice la amplificación enzimática u otra modificación enzimática del ADN o ARN, seguida por la detección o amplificación de la señal. Los ácidos nucleicos víricos aislados y purificados pueden usarse en ensayos de ácidos nucleicos tanto cualitativos (por ejemplo, diagnóstico precoz en sangre) como cuantitativos (por ejemplo, monitorización de la carga viral).
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Para minimizar las irregularidades de los resultados diagnósticos, el producto debe usarse con un control interno y controles positivos y negativos durante todo el proceso de preparación de muestras, y una amplificación y detección de la muestra de acuerdo al ensayo utilizado a continuación. El producto está diseñado para usarse con el sistema de vacío QIAvac 24 Plus o un sistema de vacío equivalente.
Limitaciones del uso del producto El kit no está pensado para analizar sangre, tejidos, médula ósea o células en cultivo. El kit tampoco sirve para aislar y purificar los ácidos nucleicos de bacterias, hongos o parásitos. Aún no se ha evaluado el rendimiento del kit para el aislamiento y purificación de los ácidos nucleicos víricos procedentes de otros líquidos corporales acelulares como la orina y el LCR.
Información de seguridad Cuando trabaje con productos químicos, use siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas de protección. Para más información, consulte las correspondientes hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS). Estas hojas están disponibles en formato PDF en www.qiagen.com/ts/msds.asp, donde podrá encontrar, consultar e imprimir las MSDS de cada kit y componente de los kits de QIAGEN. PRECAUCIÓN: NO añadir lejía o soluciones ácidas directamente al residuo de la preparación de la muestra. El tampón de lisis (AL) y el tampón de lavado 1 (AW1) contienen clorhidrato de guanidina, susceptible de formar compuestos altamente reactivos cuando se combina con lejía. Si se derrama algún líquido que contenga estos tampones, límpielo con agua y un detergente de laboratorio adecuado. Si el líquido vertido contiene agentes potencialmente infecciosos, limpie primero la zona afectada con agua y detergente de laboratorio, y seguidamente con hipoclorito sódico al 1% (v/v). Si los frascos de tampón sufren algún daño o pierden líquido, use guantes y gafas de protección al desecharlos para evitar lesiones personales o lesiones a terceros. QIAGEN no ha analizado los residuos líquidos generados por el procedimiento QIAamp DSP Virus para determinar si contienen material residual infeccioso. La contaminación del residuo líquido con material residual infeccioso es muy improbable, pero no se puede descartar del todo. Por consiguiente, el residuo líquido debe considerarse como infeccioso, y manipularse y desecharse siguiendo las normas de seguridad aplicables.
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A los diversos componentes del kit QIAamp DSP Virus se les aplican las siguientes declaraciones de riesgo y seguridad: Tampón de lisis (AL) y tampón de lavado 1 (AW1)
Contiene clorhidrato de guanidina: nocivo, irritante. Declaraciones de riesgo y seguridad: * R22-36/38, S13-26-36-46 Proteasa QIAGEN (QP)
Contiene subtilisina (de Bacillus subtilis): sensibilizante, irritante. Declaraciones de riesgo y seguridad:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 Información de urgencias de 24 horas Información médica de urgencia disponible en inglés, francés y alemán las 24 horas del día en: Centro de información de toxicología, Mainz, Alemania Tel.: +49-6131-19240
* R22: Nocivo por ingestión; R36/38: Irrita los ojos y la piel; R37/38: Irrita las vías respiratorias y la piel; R41: Riesgo de lesiones oculares graves; R42: Posibilidad de sensibilización por inhalación; S13: Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos; S22: No respirar el polvo; S24: Evítese el contacto con la piel; S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico; S36: Úsese indumentaria de protección adecuada; S36/37/39: Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara; S46: En caso de ingestión, acuda inmediatamente al médico y muestre la etiqueta o el envase.
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Introducción El kit QIAamp DSP Virus utiliza una tecnología ampliamente consolidada para el aislamiento y purificación de ADN y ARN víricos. El procedimiento QIAamp DSP Virus combina las propiedades de unión selectiva de una membrana de gel de sílice con volúmenes de elución mínimos de 20 ó 60 µl. El rango lineal del procedimiento QIAamp DSP Virus se determinó para HIV RNA y HBV DNA en diversos ensayos diagnósticos posteriores (Tabla 1, Figuras 1 y 2). Tabla 1. Ensayos diagnósticos posteriores en los que se ha estudiado el rango lineal del procedimiento QIAamp DSP Virus Ensayo
Kit
RT-PCR a tiempo real de HIV RNA Ensayo TaqMan y Prueba COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR PCR a tiempo real de HBV DNA
Ensayo TaqMan y Prueba COBAS AMPLICOR HBV MONITOR
Rango lineal del procedimiento QIAamp DSP Virus mediante Ensayos TaqMan
log entrada IU/ml
8 6 4
y = 1.0042x + 0.0832 R2 = 0.9974
2 0 1
2
3 5 4 6 log entrada IU/ml
7
8
log entrada IU/ml
B
A
6 5 4 3 2 1 0
y = 0.9725x + 0.0982 R2 = 0.9984 1
2
3 4 log entrada IU/ml
5
6
Figura 1 El rango lineal del procedimiento QIAamp DSP Virus a 60µl volumen de elución se determinó para A HIV RNA y B HBV DNA mediante Ensayos TaqMan.
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B 6 5 4 3 2 1
y = 1.0098x + 0.1234 R2 = 0.9982
2
3 4 log entrada IU/ml
5
log entrada IU/ml
A
log entrada IU/ml
Rango lineal del procedimiento QIAamp DSP Virus mediante Pruebas COBAS AMPLICOR MONITOR
4 3 2
y = 0.8839x + 0.1718 R2 = 0.984
1 0 1
2
3 4 log entrada IU/ml
Figura 2 El rango lineal del procedimiento QIAamp DSP Virus a 60µl volumen de elución se determinó para A HIV RNA y B HBV DNA mediante Pruebas COBAS AMPLICOR MONITOR
El procedimiento permite la utilización de plasma o suero; cualquiera de ellos puede contener citrato o EDTA. Las muestras pueden ser frescas, liofilizadas o congeladas, siempre y cuando no hayan sido congeladas y descongeladas más de una vez. El procedimiento puede utilizarse para aislar ARN y ADN víricos de una amplia variedad de virus de ARN y ADN. El procedimiento está diseñado para evitar la contaminación cruzada entre muestras, y para poder manipular con seguridad muestras potencialmente infecciosas. El procedimiento es especialmente adecuado para el procesamiento simultáneo de múltiples muestras. Los ácidos nucleicos víricos se eluyen en tampón de elución (AVE), listos para usarse en reacciones de amplificación o almacenarse a –20°C.
Principio y procedimiento El procedimiento QIAamp DSP Virus comprende 4 etapas:
■
Lisis de las partículas de virus presentes en la muestra
■
Unión de los ácidos nucleicos víricos del lisado a la membrana de una columna QIAamp MinElute
■
Lavado de la membrana
■
Elución de los ácidos nucleicos víricos de la membrana
El procedimiento se lleva a cabo utilizando columnas QIAamp MinElute en un sístema de vacío.
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Volumen de la muestra Los límites de detección (LD) y cuantificación (LC) del procedimiento QIAamp DSP Virus, según las normas de la ICH 2QA y 2QB, se han determinado (con un volumen inicial de muestra de 500 µl y volúmenes de elución de 20 µl y 60 µl) utilizando varios métodos diagnósticos posteriores (Tablas 2 y 3). Tabla 2. Límite de detección del procedimiento QIAamp DSP Virus Ensayo
Volumen de elución
Corte a 95%
artus™ RealArt™ HBV DNA
20 µl
2.31 IU/ml (n=240)
artus RealArt HCV RNA
20 µl
24.31 IU/ml (n=192)
AMPLICOR manual HIV RNA
60 µl
90.92 IU/ml (n=209)
TaqMan HBV DNA
60 µl
4.73 IU/ml (n=192)
Tabla 3. Quantificación del Límite del procedimiento QIAamp DSP Virus Ensayo TaqMan HBV DNA TaqMan HIV RNA
QL
CV
5.7 IU/ml
< 70% (n=88)
52 IU/ml
< 60% (n=88)
100 IU/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HBV DNA
30 IU/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HCV RNA
700 IU/ml
< 60% (n=66)
COBAS AMPLICOR HIV RNA
Lisis de las partículas víricas Las muestras se lisan en condiciones desnaturalizantes y a altas temperaturas. La lisis se realiza en presencia de proteasa QIAGEN (QP) y tampón de lisis (AL), garantizando la combinación de ambos la inactivación de las ribonucleasas.
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Unión de los ácidos nucleicos a la membrana de la columna QIAamp MinElute Para optimizar la unión del ADN y ARN víricos a la membrana de la columna QIAamp MinElute, primero se añade etanol a los lisados. Cada uno de los lisados se aplica entonces a una columna QIAamp MinElute y, a medida que la atraviesa por efecto del vacío, los ácidos nucleicos víricos se adsorben sobre la membrana de gel de sílice. Eliminación de los contaminantes residuales Mientras que los ácidos nucleicos víricos se mantienen unidos a la membrana de la columna QIAamp MinElute, los contaminantes se eliminan de manera eficaz primero con tampón de lavado 1 (AW1), después con tampón de lavado 2 (AW2) y seguidamente con etanol. Elución de los ácidos nucleicos puros Los ácidos nucleicos víricos se eluyen de la membrana de la columna QIAamp MinElute usando el tampón de elución (AVE). Las columnas QIAamp MinElute permiten utilizar volúmenes de elución de 20 ó 60 µl. Dependiendo del método de ensayo utilizado a continuación, el ácido nucleico eluido puede contener hasta un 50% del volumen de reacción sin ningún efecto inhibidor.
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Procedimiento QIAamp DSP Virus Muestra
Lea atentamente el protocolo (página 22) antes de empezar Añada a un tubo de lisis 75 µl de QP, 500 µl de muestra y 500 µl de AL. Lisis
Agite en un vortex durante 15 s. Incube 15 min. (±1 min.) a 56°C (± 1°C). Añada 600 µl de etanol. Agite en un vortex durante 15 s. Incube 5 min. (±1 min.) a temperatura ambiente (15–25°C)
Unión
Transfiera el lisado a una columna QIAamp MinElute con un EXT conectado.
Vacío
Lavado (AW1) Retirar EXT antes de aplicar vacío
Añada 600 µl de AW1 reconstituido. Retire el EXT
Vacío Lavado (AW2)
Añada 750 µl de AW2 reconstituido.
Vacío Lavado (etanol)
Añada 750 µl de etanol.
Vacío Centrifugación de secado
Ponga la columna QIAamp MinElute en un WT.
Elución
Ponga la columna QIAamp MinElute en un WT.
Centrifugue durante 1 min. a 14.000 rpm. Incube 3 min. a 56°C. Ponga la columna QIAamp MinElute en un ET. Añada 20 ó 60 µl de AVE. Incube 3 min. a temperatura ambiente (15–25°C).
Ácidos nucleicos víricos puros
Centrifugue durante 1 min. a 14.000 rpm.
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Equipo y reactivos de los que debe disponer el usuario Cuando trabaje con productos químicos, use siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas de protección. Para más información, consulte las correspondientes hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS), que podrá obtener del proveedor.
■
Etanol (96–100%)
■
Pipetas* y puntas de pipeta (para prevenir la contaminación cruzada, es altamente recomendable usar puntas de pipeta con filtro)
■
Guantes desechables
■
Bloque de calentamiento* para lisar las muestras a 56°C (recomendamos el equipo Thermomixer comfort de Eppendorf® con termobloque para microtubos de 2,0 ml†)
■
Microcentrífuga*
■
Probeta graduada (50 ml)
■
Vortex
■
Sistema de vacío QIAvac 24 Plus‡ (QIAvac 24 Plus, n.° de catálogo 19413; sistema de conexión QIAvac, n.° de catálogo 19419; bomba de vacío, n.° de catálogo 84020), o sistema de vacío de laboratorio genérico equivalente
* Para garantizar el correcto procesamiento de las muestras en el procedimiento QIAamp DSP Virus, es muy recomendable calibrar los instrumentos (p. ej., pipetas y bloques de calentamiento) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. †
Ésta no es una relación completa de los proveedores, y no incluye a muchos proveedores importantes de productos biológicos.
‡
Disponible a medidados del 2004; por favor comprobar en www.qiagen.com/products/accessories
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Notas importantes Puntos importantes antes de empezar ■
Al recibir el kit, compruebe que los componentes no han sufrido ningún daño. Si los blísteres o los frascos de tampón están dañados, contacte con el Servicio Técnico de QIAGEN o con el distribuidor local. Si se derrama algún líquido consulte la "Información de seguridad" (página 7). No use los componentes dañados de un kit, el rendimiento del mismo podría verse afectado.
■
Use siempre material libre de ribonucleasas.
■
Conserve el etanol (96–100%) en hielo durante el procedimiento.
■
Cambie siempre las puntas de pipeta entre las transferencias de líquidos. Para evitar la contaminación cruzada se recomienda usar puntas de pipeta con filtro.
■
Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente (15–25°C).
■
Use siempre guantes desechables y compruebe periódicamente que no se contaminan con el material de las muestras.
■
Deseche los guantes si se contaminan, y al menos en todos los pasos marcados con el símbolo del guante.
■
Para evitar la contaminación cruzada, no abra más de un tubo cada vez.
■
No use componentes de kits distintos del que está utilizando, a menos que tengan el mismo número de lote.
■
Procure evitar la contaminación microbiana de los reactivos del kit.
■
Para garantizar la seguridad del material potencialmente infeccioso, se recomienda trabajar bajo un flujo laminar hasta que las muestras estén lisadas.
■
Este kit sólo debe ser utilizado por personal con experiencia en los métodos de laboratorio de diagnóstico in vitro.
■
El procedimiento incluye instrucciones para procesar muestras individuales de plasma o suero. No obstante, con el sistema de vacío QIAvac 24 Plus se pueden procesar hasta 24 muestras simultáneamente.
Preparación del ARN Cuando prepare el ARN vírico, procure realizar rápidamente los pasos manuales del procedimiento. El tampón de elución (AVE) contiene azida sódica*, un agente antimicrobiano que previene el crecimiento de los microorganismos productores de ribonucleasa. Sin embargo, como este tampón no contiene ningún producto químico que degrade la ribonucleasa, no inhibirá activamente la enzima que haya podido introducirse por una manipulación inadecuada. Al manipular el tampón de elución (AVE), es necesario ser especialmente cuidadoso para evitar la contaminación con ribonucleasas. * Cuando trabaje con productos químicos, use siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas de protección.
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Almacenamiento de las muestras Una vez obtenido y centrifugado, el plasma o suero puede conservarse a 2–8°C hasta 6 horas. Para el almacenamiento a largo plazo se recomienda congelarlo en alícuotas a una temperatura de –20 o –80°C. Las muestras de plasma o suero congeladas no deben descongelarse más de una vez. La congelación y descongelación repetida desnaturaliza y precipita las proteínas, produciendo una disminución de los títulos víricos y, por consiguiente, de la cantidad de ácidos nucleicos víricos. Además, los crioprecipitados que se forman durante la congelación y descongelación obstruirán la membrana de la columna QIAamp MinElute. Si los crioprecipitados son visibles, conviene separarlos mediante una centrifugación a aproximadamente 6800 g durante 3 minutos. El sobrenadante transparente debe aspirarse y procesarse inmediatamente sin romper el pellet.
Preparación de reactivos y tampones Preparación de la proteasa QIAGEN Añada todo el contenido del vial de 4,4 ml de disolvente de proteasa (PS) al vial de proteasa QIAGEN (QP) liofilizada y mézclelos bien. Para evitar que se forme espuma, mézclelos invirtiendo el vial repetidas veces. Compruebe que la proteasa QIAGEN (QP) se ha disuelto por completo.
i
No añada la proteasa QIAGEN (QP) directamente al tampón de lisis (AL).
Adición del "carrier" de ARN y del control interno al tampón de lisis El "carrier" de ARN tiene dos funciones. En primer lugar, potencia la unión de los ácidos nucleicos víricos a la membrana de la columna QIAamp MinElute, especialmente si hay pocas moléculas diana en la muestra. En segundo lugar, la adición de grandes cantidades de "carrier" de ARN reduce las posibilidades de degradación del ARN vírico en el caso, poco frecuente, de que las moléculas de ribonucleasa no se desnaturalicen por efecto de las sales caotrópicas y del detergente del tampón de lisis (AL). Si no se añade "carrier" de ARN al tampón de lisis (AL), la recuperación del ARN o ADN vírico puede ser menor. El "carrier" de ARN también puede estar incluido en algunos reactivos de control interno o métodos de ensayo comerciales. En estos casos, consulte las correspondientes instrucciones de uso del fabricante del método de ensayo. Cuando el kit QIAamp DSP Virus se combina con un sistema de amplificación diagnóstica es especialmente recomendable usar un control interno. El ARN o ADN del control interno y el "carrier" de ARN reconstituido se añaden al tampón de lisis (AL), y se mezclan bien invirtiendo el tubo 10 veces. Para evitar la formación de espuma, no utilice un vortex. Consulte las instrucciones del fabricante para determinar la concentración óptima del control interno. Si no se utiliza la concentración recomendada, los resultados obtenidos pueden ser incorrectos. Al calcular la cantidad correcta de control interno que hay que usar, tenga en cuenta el volumen de muestra inicial y el volumen de elución. Recuerde que el kit QIAamp DSP Virus utiliza un volumen de muestra inicial de 500 µl. 16
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Para preparar la solución de "carrier" de ARN, añada 310 µl de tampón de elución (AVE) al tubo con 310 µg de "carrier" de ARN liofilizado para obtener una solución de 1 µg/µl. Disuelva bien el "carrier" de ARN, distribúyalo en alícuotas de un volumen adecuado y guárdelas a –20°C. No congele y descongele el "carrier" de ARN más de 2 veces. Tenga en cuenta que el "carrier" de ARN no se disuelve en el tampón de lisis (AL). Debe disolverse primero en el tampón de elución (AVE) y añadirse después al tampón de lisis (AL). Antes de mezclarlo con el tampón de lisis (AL), asegúrese de que el "carrier" de ARN está completamente disuelto en el volumen apropiado de tampón de elución (AVE).
i
Use siempre el control interno correcto para el método de ensayo posterior. Consulte las instrucciones del fabricante para obtener información adicional.
Calcule el volumen necesario de mezcla de tampón de lisis (AL)/"carrier" de ARN por lote de muestras seleccionando en la Tabla 4 (página 18) el número de muestras que se van a procesar simultáneamente. Los volúmenes se calculan con las fórmulas siguientes: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl donde: n = número de muestras que se van a procesar simultáneamente y = volumen calculado de tampón de lisis (AL) z = volumen de "carrier" de ARN/tampón de elución (AVE) a añadir al tampón de lisis (AL)
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Tabla 4. Volúmenes de tampón de lisis (AL) y "carrier" de ARN/tampón de elución (AVE) requeridos para el procedimiento QIAamp DSP Virus N.º de muestras
Vol. AL (ml)
Vol. de "carrier" ARN/AVE (µl)
N.º de muestras
Vol. AL Vol. de "carrier" (ml) ARN/AVE (µl)
1
0,55
6,2
13
7,15
80,0
2
1,10
12,3
14
7,70
86,0
3
1,65
18,5
15
8,25
92,4
4
2,20
24,6
16
8,80
98,6
5
2,75
30,8
17
9,35
104,7
6
3,30
37,0
18
9,90
110,9
7
3,85
43,1
19
10,45
117,0
8
4,40
49,3
20
11,00
123,2
9
4,95
55,0
21
11,55
129,4
10
5,50
61,6
22
12,10
135,5
11
6,05
67,8
23
12,65
141,7
12
6,60
73,9
24
13,20
147,8
Preparación del tampón de lavado 1 Usando una probeta graduada, añada 25 ml de etanol (96–100%) al frasco que contiene 19 ml de tampón de lavado 1 (AW1) concentrado. Guarde el tampón de lavado 1 (AW1) reconstituido a temperatura ambiente (15–25°C).
i
Mezcle siempre el tampón de lavado 1 (AW1) reconstituido invirtiendo el frasco varias veces antes de comenzar el procedimiento.
Preparación del tampón de lavado 2 Usando una probeta graduada, añada 30 ml de etanol (96–100%) al frasco que contiene 13 ml de tampón de lavado 2 (AW2) concentrado. Guarde el tampón de lavado 2 (AW2) reconstituido a temperatura ambiente (15–25°C).
i
Mezcle siempre el tampón de lavado 2 (AW2) reconstituido invirtiendo el frasco varias veces antes de comenzar el procedimiento.
Preparación del tampón de elución En el kit se incluyen cuatro tubos de tampón de elución (AVE). Procure no contaminar el tampón con ribonucleasas. Si con un determinado kit se van a realizar 4 procedimientos de purificación o menos, se recomienda desechar el tubo de tampón de elución (AVE) al final de cada procedimiento.
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Elución de los ácidos nucleicos víricos Para las aplicaciones posteriores que requieran volúmenes iniciales pequeños (como algunos métodos de PCR y RT-PCR), la elución de los ácidos nucleicos víricos en 20 µl de tampón de elución (AVE) puede aumentar la sensibilidad del ensayo. El volumen de ácidos nucleicos víricos eluidos de la columna QIAamp MinElute puede ser hasta 5 µl menor que el volumen del tampón de elución (AVE) aplicado a la columna. Por ejemplo, la elución de ácidos nucleicos víricos con 60 µl de tampón de elución (AVE) produce un eluido de aproximadamente 55 µl, mientras que la elución con 20 µl produce aproximadamente 15 µl de eluido. El volumen del eluido recuperado depende de la naturaleza de la muestra. Si el volumen del eluido recuperado es demasiado bajo para el análisis posterior, aumente el volumen añadiendo más tampón de elución (AVE). Los ácidos nucleicos víricos eluidos se recogen en tubos de elución (ET). Para conservar los ácidos nucleicos víricos hasta 24 horas es conveniente guardarlos a 2–8°C.
Rendimiento y calidad de los ácidos nucleicos víricos El rendimiento y la calidad de los ácidos nucleicos víricos aislados son adecuados para todos los tipos de procedimientos de detección utilizados en el diagnóstico molecular. Los análisis diagnósticos deben realizarse siguiendo las instrucciones del fabricante.
Montaje del sistema de vacío QIAvac 24 Plus Compruebe que ha montado correctamente el extensor de columna (EXT), la columna QIAamp MinElute, el VacConnector (VC) y la VacValve (consulte la Figura 3).
4
3
2 1
Figura 3 Montaje de los componentes del kit QIAamp DSP Virus para el procesamiento al vacío de las muestras: 1: VacValve (incluido con el sistema de vacío)
3: Columna QIAamp MinElute
2: VacConnector (VC)
4: Extensor de columna (EXT)
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Al usar el sistema de vacío QIAvac 24 Plus, es recomendable etiquetar los tubos de lisis (LT), los tubos de elución (ET) y las columnas QIAamp MinElute según el esquema de la Figura 4 para no confundir las muestras. Esta figura se puede fotocopiar y marcar con los nombres de las muestras.
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01
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05
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Fecha: Operador: ID del ensayo:
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Figura 4 Esquema de etiquetado para los tubos de lisis (LT), tubos de elución (ET) y columnas QIAamp MinElute para usar con el sistema de vacío QIAvac 24 Plus.
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Protocolo
Protocolo: aislamiento y purificación de ácidos nucleicos víricos de suero y plasma Para el aislamiento y purificación de los ácidos nucleicos víricos a partir de 500 µl de suero o plasma tratado con EDTA o citrato. Antes de empezar
■
Deje equilibrar las muestras a temperatura ambiente (15–25°C) y compruebe que están bien mezcladas.
■
Añada el "carrier" de ARN reconstituido en tampón de elución (AVE), o el control interno, al tampón de lisis (AL) siguiendo las instrucciones de la página 16.
■
Asegúrese de que el tampón de lavado 1 (AW1), el tampón de lavado 2 (AW2) y la proteasa QIAGEN (QP) se han preparado según las instrucciones de la sección "Notas importantes" de la página 15.
■
Deje equilibrar el tampón de elución (AVE) a temperatura ambiente (15–25°C) para el paso 18. Si es posible, use tampón de elución (AVE) fresco en cada procedimiento (se incluyen 4 tubos).
■
Ajuste el bloque de calentamiento a 56°C para usarlo en los pasos 4 y 17.
■
Para evitar la contaminación cruzada, inserte un VacConnector (VC) en cada adaptador Luer del sistema de vacío.
■
Compruebe que el frasco de residuos del sistema de vacío está vacío, y que todas las conexiones son correctas.
■
Consulte la información sobre el funcionamiento del sistema de vacío, especialmente el mantenimiento, en el manual suministrado con el equipo.
Procedimiento 1.
Pipetee 75 µl de proteasa QIAGEN (QP) en un tubo de lisis (LT).
i
Compruebe la fecha de caducidad de la proteasa reconstituida antes de usarla.
2.
Añada 500 µl de plasma o suero al tubo de lisis (LT).
3.
Añada 500 µl de tampón de lisis (AL) (que contiene 11,2 µg/ml de "carrier" de ARN) al tubo de lisis (LT), cierre la tapa y mézclelo agitándolo en el vortex de forma intermitente durante 15 segundos. Para que la lisis sea eficaz, es esencial que la muestra y el tampón de lisis (AL) se mezclen a conciencia hasta obtener una solución homogénea.
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i
El tampón de lisis (AL) contiene control interno. Como el tampón de lisis (AL) es muy viscoso, asegúrese de añadir el volumen correcto del mismo ya sea pipeteándolo con mucho cuidado o utilizando una pipeta adecuada, como por ejemplo una Eppendorf de varios pasos u otra pipeta equivalente.
i
No añada la proteasa QIAGEN (QP) directamente al tampón de lisis (AL).
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4.
Incube a 56°C (± 1°C) durante 15 min. (±1 min.).
5.
Centrifugue el tubo de lisis (LT) durante ≥5 segundos a velocidad máxima para eliminar las gotas del interior de la tapa. Cámbiese los guantes y abra con cuidado el tubo de lisis (LT).
7.
Añada 600 µl de etanol (96–100%) al tubo de lisis (LT), cierre la tapa y mézclelo bien agitándolo en el vortex de forma intermitente durante ≥15 segundos. Incube durante 5 min. (±1 min.) a temperatura ambiente (15–25°C).
8.
Centrifugue el tubo de lisis (LT) durante ≥5 segundos a velocidad máxima para eliminar las gotas del interior de la tapa.
9.
Inserte la columna QIAamp MinElute en el VacConnector (VC) del sistema de vacío (consulte la Figura 3, página 19). Inserte un extensor de columna (EXT) en la columna QIAamp MinElute abierta.
i Reserve el tubo de lavado (WT) para el secado por centrifugación del paso 16. 10.
Cámbiese los guantes y abra solamente un tubo cada vez.
11. Dispense con cuidado todo el lisado obtenido en el paso 7 dentro el extensor (EXT) de la columna QIAamp MinElute procurando no mojar el borde. Procure no tocar la membrana de la columna QIAamp MinElute con la punta de la pipeta. 12. Encienda la bomba de vacío. Una vez que el lisado haya pasado a través de la columna QIAamp MinElute, abra la válvula del sistema de vacío y libere la presión negativa. Si se procesan varias columnas QIAamp MinElute al mismo tiempo, se recomienda cerrar la VacValve de cada columna después de que el lisado haya pasado a su través con el fin de reducir la duración de este paso de vacío.
i
Si al cabo de 15 minutos el lisado aún no ha terminado de atravesar la membrana, deseche la columna QIAamp MinElute y repita el procedimiento con una nueva muestra.
i
La válvula del sistema de vacío permite liberar rápidamente la presión de vacío.
13. Añada 600 µl de tampón de lavado 1 (AW1) a la columna QIAamp MinElute. Retire con cuidado y deseche el extensor de columna (EXT), y cierre la válvula del sistema de vacío. Una vez que el tampón de lavado 1 (AW1) haya pasado a través de la columna QIAamp MinElute, abra la válvula y libere la presión negativa.
i
Para evitar la contaminación cruzada, al quitar los extensores de columna procure no pasarlos (EXT) por encima de las columnas QIAamp MinElute vecinas.
14. Añada 750 µl de tampón de lavado 2 (AW2) a la columna QIAamp MinElute procurando no mojar el borde. Procure no tocar la membrana de la columna QIAamp MinElute con la punta de la pipeta. Deje abierta la tapa de la columna y cierre la válvula del sistema de vacío. Una vez que el tampón de lavado 2 (AW2) haya pasado a través de la columna QIAamp MinElute, abra la válvula y libere la presión negativa.
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Protocolo
6.
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15. Añada 750 µl de etanol (96–100%) a la columna QIAamp MinElute procurando no mojar el borde. Procure no tocar la membrana de la columna QIAamp MinElute con la punta de la pipeta. Deje abierta la tapa de la columna y cierre la válvula del sistema de vacío. Una vez que el etanol haya pasado a través de la columna QIAamp MinElute, abra la válvula y libere la presión negativa.
i
Para aplicar el etanol a la columna QIAamp MinElute use puntas de pipeta con barrera de aerosol.
16. Cierre la tapa de la columna QIAamp MinElute, retírela del sistema de vacío y deseche el VacConnector (VC). Ponga la columna QIAamp MinElute en el tubo de lavado (WT), reservado en el paso 9, y centrifúguela a velocidad máxima (aproximadamente 20.000 g, o 14.000 rpm) durante 1 minuto para secar completamente la membrana. Deseche el tubo de lavado (WT) que contiene el filtrado.
i
La omisión del secado por centrifugación puede producir una inhibición del ensayo posterior.
17. Ponga la columna QIAamp MinElute en un tubo de lavado (WT) nuevo e incúbela con la tapa abierta a 56°C durante 3 minutos para evaporar cualquier líquido residual. 18. Ponga la columna QIAamp MinElute en un tubo de elución (ET) limpio y deseche el tubo de lavado (WT). Abra con cuidado la tapa de la columna QIAamp MinElute y dispense 20 ó 60 µl de tampón de elución (AVE) (dependiendo del método de ensayo posterior) en el centro de la membrana. Cierre la tapa e incube a temperatura ambiente (15–25°C) durante ≥3 min. Centrifugue a velocidad máxima (aproximadamente 20.000 g o 14.000 rpm) durante 1 min. para eluir los ácidos nucleicos víricos.
i
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Después de este protocolo, siga el procedimiento de mantenimiento del sistema de vacío (para más detalles, consulte el manual suministrado con el sistema de vacío).
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