MEMORIA DE PRÁCTICAS CSIC-REAL JARDÍN BOTÁNICO Daniel Pinto Carrasco 71106394-P Licenciado en Biología Verano de 2008





CSIC-Real Jardín Botánico

ÍNDICE - Introducción

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- Labores de herbario

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- Recolección de semillas

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- Recolección de muestras para análisis moleculares

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- Análisis cariológicos

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- Cartografía de Las Arribes del Duero

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- Flora protegida y microrreservas

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- Bibliografía

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INTRODUCCIÓN Para comenzar esta memoria de las prácticas en empresa que he realizado en el Real Jardín Botánica (CSIC) creo conveniente hacer un pequeño repaso a la historia de esta institución, la cual ya cuenta con más de 250 años en su haber. El 17 de octubre de 1755, Fernando VI ordenó la creación del Real Jardín Botánico de Madrid, que se instaló en la Huerta de Migas Calientes, en las inmediaciones de lo que hoy se denomina Puerta de Hierro, a orillas del río Manzanares. Contaba con más de 2000 plantas, recogidas por José Quer, en sus numerosos viajes por la Península u obtenidas por intercambio con otros botánicos europeos. En 1774, Carlos III dio instrucciones para su traslado al actual emplazamiento del paseo del Prado, donde se inaugura en 1781. Sabatini -arquitecto del Rey- y Juan de Villanueva se hicieron cargo del proyecto. En esos años se construyeron las tres terrazas escalonadas, se ordenaron las plantas según el método de Linneo y se construyeron también la verja que rodea el Jardín, los emparrados y el invernáculo llamado Pabellón Villanueva -en el que se encuentra la cátedra donde impartió sus clases Antonio José Cavanilles. Desde su creación, en el Real Jardín Botánico se desarrolló la enseñanza de la Botánica, se auspiciaron expediciones a América y al Pacífico, se encargaron los dibujos de grandes colecciones de láminas de plantas y se acopiaron importantes herbarios que sirvieron, entre otras cosas, de base para la descripción de nuevas especies para la Ciencia. En 1808, la Guerra de la Independencia trajo al Jardín años de abandono y tristeza, en los que son destacables los esfuerzos de Mariano de La Gasca por mantenerlo dentro de las corrientes científicas europeas. En 1857, siendo Mariano de la Paz Graells director del Real Jardín, se realizaron reformas importantes que aún perduran, como el invernadero que lleva su nombre y la remodelación de la terraza superior En la década de 1880 a 1890, el Jardín sufre importantes pérdidas. En 1882 se segregan dos hectáreas para construir el edificio que actualmente ocupa el Ministerio de Agricultura, con lo que su superficie queda ya reducida a las ocho hectáreas actuales. En 1886, un ciclón derribó en su recinto 564 árboles de gran valor. En el primer tercio de nuestro siglo se inician con seriedad las investigaciones en el campo de la micología, y adquieren un elevado nivel las desarrolladas en el de la micromicetología. Más tarde, en 1939, el Real Jardín Botánico pasa a depender del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. En 1974, tras décadas de penuria y abandono, fue cerrado al público para abordar profundas obras de restauración, que acabaron devolviéndole su estilo original. En 1981, coincidiendo con el bicentenario de su traslado, fueron inauguradas las reformas por SS.MM. los Reyes de España. En la actualidad, el Real Jardín Botánico es uno de los centros españoles con mayor producción científica en el ámbito de la Botánica y cuenta con el mayor herbario de la Península Ibérica. 2

CSIC-Real Jardín Botánico El departamento en el que he llevado a cabo las prácticas es el de Biodiversidad y Conservación. Las líneas de investigación del mismo giran en torno a la diversidad vegetal, en concreto de las plantas vasculares. Hay dos aproximaciones a estudios de biodiversidad. Por un lado, es posible estudiar qué especies existen en un área, lo que sería una aproximación más florística. Por otro, es posible investigar que especies integran un grupo de organismos determinado y cuáles son sus relaciones. Este enfoque (taxonómico o sistemático) se traduce en reunir, analizar y procesar todos los datos (morfológicos, anatómicos, fitoquímicos, palinológicos, ecológicos, biogeográficos, moleculares) para clasificar los organismos. Con esto, lo que se hace es proporcionar un sistema de referencia que pueda ser utilizado dentro y fuera de la comunidad científica. La base de la actividad investigadora del departamento es la Sistemática pero con orientaciones más o menos diversas como la producción de floras (tanto del ámbito mediterráneo como del tropical y subtropical), la evolución (reconstrucción filogenética y estudio del papel evolutivo de la hibridación), la biología de las plantas acuáticas…. Asimismo, se estudian líneas encuadrables en la biogeografía (cartografía botánica), la conservación y gestión de zonas húmedas, la etnobotánica y la palinología. Mi tutor en el CSIC ha sido Santiago Castroviejo Bolivar, cuyas líneas de investigación se centran en la taxonomía, ecología y corología de las plantas vasculares. Los proyectos que tiene en marcha actualmente son: -Anthos. Sistema de información sobre las plantas de España. -Estudio integrado sobre la biodiversidad de la región de Bahía Honda (Veraguas, Panamá). -Euro+MedPlantBase. -Flora Iberica. -SPP-Flora of the World La mayor parte de labor que he realizado a lo largo de estas prácticas en empresa se puede encuadrar en los proyectos Anthos y Flora iberica. Además, como complemento, he ayudado en proyectos que están desarrollando el Departamento de Botánica de la USAL, como estudios moleculares de Odontites s.l., la cartografía de las Arribes del Duero y la creación de una microrreserva de flora para Microcnemum coralloides. Esta actividad ha sido desarrollada casi en su totalidad en las provincias de Salamanca, Zamora, Valladolid Ávila y Burgos, tanto en campo como en gabinete y herbario. De forma general, y para una mejor descripción de las actividades realizadas, se puede dividir mi trabajo en los siguientes apartados: - Labores de herbario - Recolección de diásporas - Recolección de muestras para análisis moleculares - Análisis cariológicos - Cartografía de Las Arribes del Duero - Flora protegida y microrreservas A continuación haré una exposición algo más detallada de mi labor en cada uno de estos grandes apartados.

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LABORES DE HERBARIO

Mi trabajo en el herbario de la universidad de Salamanca (SALA) se encuadra dentro del proyecto Flora iberica ya que es uno de los 12 herbarios básicos para la realización de esta flora. Los herbarios básicos son aquellos cuyo material debe ser estudiado por los autores a la hora de preparar las correspondientes síntesis genéricas, tanto para estudios taxonómicos como para establecer la corología y ecología de las especies. Los herbarios se comprometen a cederlo y los autores, por su parte, se comprometen a devolverlo en un plazo razonable con las correspondientes etiquetas de revisión incluidas en cada pliego. Actualmente, el herbario SALA agrupa el material procedente de los herbarios de la facultad de ciencias (SALA) y de farmacia (SALAF). Todo este material, más lo incluido desde la fusión de los dos herbarios, suman un total de unos 135.000 pliegos, con una representación de casi todas las especies ibéricas así como de muchas de otros lugares. A lo largo del verano he realizado una buena parte de labores básicas que se realizan en un herbario. Desde la congelación del nuevo material que llega, hasta la inclusión de los pliegos en sus respectivas cajas, y su préstamo a otros herbarios para su estudio. Para detallar un poco el trabajo realizado voy a relatar brevemente todo el proceso que sufre un pliego hasta que es incluido en el herbario. Al herbario llega nuevo material seco, metido en papel de periódico y con una etiqueta de campo donde figura la especie de la que se trata, localidad de recolección,

altitud, fecha de recolección, breve descripción del ambiente, y nombre de la persona que realizó la recolección. Este material al ser recibido se congela durante 3-4 días a -20ºC. para evitar que entren al herbario insectos y hongos que puedan dañar el material ya depositado. Tras la congelación hay que dar un nº de herbario a cada pliego para tener controlados todos los pliegos que posee el herbario. Además se sustituye la etiqueta de campo por la etiqueta definitiva del herbario. El herbario SALA está informatizando sus colecciones para tener acceso a toda la información de las etiquetas de una forma rápida y fácil. Por ello, en este punto se introducen todos los datos de la etiqueta del pliego en una gran base de datos por medio del programa Herbar 3.5d. Además como el herbario SALA forma parte de GBIF España (Global Biodiversity Information Facility in Spain) todos los datos han de ser introducidos en la base de datos de GBIF. Después de todo esto hay que sustituir el papel de periódico donde vienen las plantas secas por las camisas de pliego definitivas. Para ello se ha de pegar la etiqueta de herbario a la camisa, y pasar todo el material con cuidado para que sufra los mínimos 4

CSIC-Real Jardín Botánico daños. Un buen nº de herbarios después pegan la muestra a la camisa utilizando diversos métodos (cola, cinta adhesiva,…). A esta operación se la denomina montar el pliego. En el herbario SALA no se hace esto habitualmente debido a la falta de tiempo y personal de modo que la planta queda suelta en su camisa. En un futuro más o menos cercano se va a intentar montar todo el material depositado, pero por el momento no es una operación viable. Los pliegos ya etiquetados y, en algunos casos, montados han de ser incluidos en las cajas del herbario. Éstas están en armarios corredizos y ordenadas alfabéticamente

por familias. Dentro de cada familia los géneros se ordenan alfabéticamente, al igual que las especies dentro de su género. Todos los pliegos de una misma especie se incluyen dentro de una camisa de especie con una etiqueta externa para una localización más rápida. En el caso de que haya demasiado material para un pliego se hace un duplicado. Se separa aproximadamente la mitad de la muestra, de forma que en los dos pliegos resultantes haya una muestra representativa del pliego original. Esto se hace siempre evitando romper el material. Con esto quiero decir que si hay solamente una rama de un árbol, por muy grande que sea, no se puede separar un duplicado ya que habría que cortarlo en dos. Los duplicados siguen un procesado diferente ya que no se incluyen en el herbario, sino que se almacenan aparte y se usan en intercambios con otros herbarios. Se dejan en hojas de periódico y se mete su etiqueta correspondiente. Cuando llegue a otro herbario debido a un intercambio se mantendrá esa etiqueta y se adjuntará otra del herbario de destino. De esta forma se sabe por qué herbarios ha pasado ese pliego. Otra de las actividades realizadas en el herbario SALA ha sido el préstamo de pliegos para su estudio. En concreto se prestaron los pliegos del género Crocus (fam. Iridaceae) del ámbito iberobalear, para la descripción del género para Flora iberica. Lo primero que se hace en estos casos tras recibir la solicitud de préstamo, es hacer un listado de los pliegos existentes en el herbario y que se van a prestar. Como el herbario SALA está informatizado esta labor es muy fácil de realizar. Después se buscan las cajas que contienen dichos pliegos y se comprueba que están todos. Después se embalan con plástico de burbujas cuidadosamente para evitar que se estropeen. Además por fuera se colocan pegatinas que avisan del contenido del paquete para que los repartidores tengan el máximo cuidado. Después de todo esto se mandan. 5

CSIC-Real Jardín Botánico Los préstamos se hacen de un año de duración tras el cual el destinatario debe devolverlos. Cuando se recibe una devolución se comprueba que han sido devueltos todos los pliegos. Además se observa en cada pliego si el botánico que los ha estudiado ha incluido alguna tarjeta de revisión (nueva determinación de la especie que no concuerda con la inicial) o de identificación confirmada. En caso de que si las hubiese también se informatizarian.

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CSIC-Real Jardín Botánico RECOLECCIÓN DE DIÁSPORAS

El Real Jardín Botánico está creando un banco de imágenes de las diásporas (unidad de dispersión) de los fanerófitos presentes en la Península Ibérica y Baleares a través del proyecto Anthos. Además estas diásporas se guardan en el banco de germoplasma del Jardín para su uso en el futuro. Este proyecto está en marcha desde hace cinco años, pero se ha ido desarrollando de forma intermitente de modo que por el momento solo hay unas 2200 imágenes. Estas imágenes tienen un gran valor en estudios morfológicos (taxonomía) ya que de la mayoría de los taxa no hay casi material de herbario con las semillas maduras, de modo que las descripciones de las especies son a veces incompletas. Además en ellas puede estar la clave para poder separar especies morfológicamente muy semejantes. Estas imágenes también son de gran interés para ecólogos y zoólogos en el sentido de que sirven para determinar la alimentación de muchos herbívoros a través de sus excrementos. También se pueden usar en paleobotánica para determinar las comunidades vegetales de una zona en tiempos remotos a partir de muestras de suelo. Actualmente lo prioritario es recolectar semillas o diásporas de al menos una especie de cada género de los presentes en el ámbito iberobalear, teniendo mayor interés las especies autóctonas que las alóctonas. Más adelante, cuando ya se haya conseguido este primer objetivo, se pretende seguir hasta conseguir imágenes de todas las especies. Este segundo objetivo es por ahora lejano. Las muestras que yo tenía que recoger de forma prioritaria eran las de géneros endémicos del occidente peninsular, no obstante podía recoges cualquier otra que aún no estuviese recolectada. Para ello me fue entregado un listado de especies ya recolectadas y otro de géneros pendientes de recolectar. En las 9 salidas de campo que he llevado a cabo durante las prácticas se han recolectado un total de 59 muestras, entre las cuales hay que señalar que 17 fueron de géneros todavía no recolectados, y aproximadamente 40 de especies no recolectadas. Las diásporas se recolectaban solo cuando se veía que estaban bien maduras para que en el proceso de secado no alterase su morfología. Además, así nos asegurábamos de mantener la viabilidad de las mismas en el banco de germoplasma. Las diásporas se metían en sobres de papel en los que se apuntaba el nº de colector, para así tener identificada cada muestra. El nº de colector es el nº que da cada colector a cada planta que ha recogido. Con ese nº es con el que registra la recolección en su cuaderno de campo, en el cual apunta todos los datos que han de incluirse en las etiquetas de herbario. Como las salidas de campo las realizamos en grupo, no siempre numeró las muestras la misma persona sino que unos días numeró Luis Delgado (LD-), otros María Santos (MS-), y otros yo mismo (DP-). De esta forma, a lo largo del verano he numerado 34 muestras (DP-34) que serán incluidas en los herbarios SALA y MA. Además de las diásporas también se recogía la planta de la que eran extraídas (o individuos de la misma especie cercanos) como pliego testigo. A dicho pliego se le asigna el mismo nº de colector. El pliego testigo es muy importante ya que es el que permite determinar de forma correcta e inequívoca la especie a la que pertenece el individuo, y por lo tanto también las diásporas. Así cuando ocurran cambios a nivel taxonómico que afecten a las especies colectadas, se podrá revisar el material y 7

CSIC-Real Jardín Botánico comprobar qué binómen es el que le corresponde en la actualidad. La falta de pliegos testigo fue uno de los fallos que tuvieron hace 5 años los primeros que recolectaron diásporas para este proyecto. Tras la recolección, los pliegos testigo se prensaban en prensas de mano, proceso que tardaba unos 15 días cambiando 2-3 veces las almohadillas. Por su parte, las muestras de diásporas se dejaban en ambiente seco durante unos días para que estuviesen completamente secas. Después se limpiaban de cualquier material extraño (restos de hojas, semillas mal formadas, arena….) poniendo especial interés en la eliminación de los insectos que pudieran estar presentes ya que en muchos casos son los responsables del deterioro de muchas muestras. El proceso de limpieza en algunos casos Microcnemum coralloides

Thymelaea passerina

Consolida cf. mauritanica

era muy tedioso ya que el tamaño de algunas semillas era inferior a los 0’2 mm, de modo que había que limpiarlas bajo lupa y haciendo uso de lancetas y pinzas. Tras la limpieza de las diásporas, y teniendo ya prensado el pliego testigo, había que confirmar la determinación de campo. Para ello se utilizo una serie de claves de determinación las cuales he incluido en el apartado bibliografía. Tras esto se crea la etiqueta de campo y se mandan (diasporás y pliegos) al Real Jardín Botánico para que allí incluyan los pliegos en el herbario MA y hagan las correspondientes fotos a las diásporas. Acer opalus

Adenocarpus telonensis

Achyranthes sicula

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CSIC-Real Jardín Botánico RECOLECCIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MOLECULARES

Uno de los proyectos más ambiciosos del Real Jardín Botánico es la realización de Flora Iberica, una publicación en la que se recogen de manera ordenada las descripciones de todos los taxa presentes en la Península Ibérica e Islas Baleares, así como una serie de claves dicotómicas para la determinación de dichos taxa. La taxonomía actual no solo se basa en la morfología como ocurría hace 60 años, sino que cada vez tienen más peso los análisis moleculares para llegar a una clasificación más real y filogenética. Por ello, la separación de los taxa, su nomenclatura…. se realizan tras llevar a cabo análisis moleculares tales como AFLPs, secuenciación de ITS, etc. a diversos niveles (familia, género, especie, población…). Actualmente, en el departamento de Botánica de Salamanca está realizando la descripción de varios géneros de compuestas tales como Inula, Jasonia, Logfia, Evax o Filago, pertenecientes a las tribus Gnaphalieae e Inuleae. Para dilucidar la verdadera filogenia de las tribus se ha recogido material en las salidas de campo para su posterior análisis. Se recogió material de las compuestas Filago lutescens e Inula salicina. Además, también se recogieron muestras de las escrofulariáceas Odontitella virgata, Odontites viscosus, O. vernus y Macrosyringion longiflorus ya el Departamento de Botánica de Salamanca pretende hacer un estudio biogeográfico de la especies de Odontites s.l.. Se recogían las hojas y brácteas, verdes y no dañadas por insectos ni hongos, de 10 individuos de la misma población. Las hojas de cada individuo se colocaban en un sobre de papel donde se echaba cierta cantidad de gel de sílice de grano fino. Cada sobre se marcaba con el correspondiente nº de colector para su posterior identificación. Los 10 sobres de la misma población se metían en una bolsa con gel de sílice de grano grueso, y se cerraba de forma hermética. De esta forma el gel de sílice absorbe la humedad y el DNA no se degrada. Además, se recogía un pliego testigo para la determinación inequívoca de la especie. Normalmente se recogía un solo pliego testigo por cada población, pero en el caso de Filago lutescens hubo que prensar los 10 individuos ya que es muy difícil de diferenciar de visu de Filago pyramidata.

Filago lutescens

Filago pyramidata

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CSIC-Real Jardín Botánico ANÁLISIS CARIOLÓGICOS

Como ya dije anteriormente, los caracteres morfológicos no son los únicos que se usan en taxonomía actualmente. Los datos cariológicos son otros de los caracteres que se pueden usar para determinar la filogenia de los taxa. Por ello en el Proyecto Flora Iberica también se contempla la realización de este tipo de análisis. El cambio en el nivel de ploidía y, en mayor medida, el cambio en el nº básico de cromosomas, en muchos casos implica un aislamiento reproductor que, al fin y al cabo, es lo que determina la aparición de un nuevo taxón. Durante el periodo de prácticas he podido recoger material para realizar los conteos de cromosomas, hacer algunas preparaciones e incluso hacer algunos recuentos. Las partes de la planta que se suelen recoger para cariología son los botones florales antes de la antesis debido a que en el gineceo y las anteras hay en ese preciso momento un gran nº de divisiones celulares. La recogida de las muestras se realiza cuidadosamente y fijando el material in situ ya que de esta forma se consigue un mayor nº de células en mitosis y meiosis, de acuerdo con lo expuesto por Delgado (2007) en el capítulo de Materiales y Metodología de su Tesis Doctoral. Se intenta recoger los botones florales de menor tamaño ya que en ellos hay tanto mitosis como meiosis. Así se puede obtener tanto n como 2n. Durante las prácticas se recogió de esta manera material de Odontitella virgata, Odontites vernus, O. viscosus y Macrosyringion longiflorus. En especies en las que la germinación de semillas in vitro es efectiva, se puede optar por utilizar ápices caulinares y/o radiculares. En ese caso se recogen semillas maduras y se hacen germinar en placas de Petri y después se fijan las plántulas enteras. Así se hizo con las muestras de Filago y Evax. En ambos casos, para la fijación del material se usa el fijador Carnoy I (fijador de Farmer), formado por una mezcla de etanol y ácido acético glacial en proporción 3:1, ya que el ácido acético desnaturaliza las histonas de tal modo que es más fácil el posterior teñido. Además, el etanol evita las roturas de la membrana plasmática que se producen por el choque osmótico por ácido acético, para las reacciones enzimáticas, y deshidrata la muestra sin influir en la morfología y el tamaño de los cromosomas. El fijador se mezcla en el campo usando pipitas Pasteur graduadas. Tras echar la muestra al fijador, hay que mantenerlo a una temperatura baja (aproximadamente 4ºC) para que no se descompongan los tejidos. Los siguientes pasos son la hidrólisis y la tinción de los cromosomas. En el “método orceína-acética por squash” ambos pasos ocurren a la vez. Se colocan sobre un porta algunos botones florales o ápices radiculares, se retira el exceso de fijador, y se vierten unas gotas de orceína solución A (solución de orceína acética 2% y HCl 1N en proporción 9:1). Después se calienta sobre mechero hasta la aparición de vapores y se deja enfriar 10 min. Se repite esto 2 veces más añadiendo orceína en caso necesario. Se retira el exceso de colorante y se lava con ácido acético 45%. Después se coloca un cubre y se aplasta la muestra con suaves golpecitos. Por último se sella la preparación con esmalte de uñas, y se conserva a 4ºC.

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CSIC-Real Jardín Botánico Estas preparaciones es observan al microscopio de campo claro usando un objetivo de inmersión de 100X y un ocular de 10X. En el caso de cromosomas muy pequeños se puede cambiar el ocular por otros de 15X o 20X. Cuando se encuentra una célula no lisada, en la que se pueden contar los cromosomas, se apuntan los coordenadas del porta, y se hacen fotografías de la misma con una cámara acoplada al microscopio. Además, se hacen esquemas de los mismos a mano alzada.

Algunos ejemplos de células en mitosis teñidas

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CSIC-Real Jardín Botánico CARTOGRAFÍA DE LAS ARRIBES DEL DUERO

En cuatro de las salidas de campo viajamos hasta Las Arribes del Duero. Concretamente estuvimos en su parte zamorana, tanto en la vertiente Norte como Sur del río Duero que se corresponde con el LIC Cañones del Duero (13.611 ha.). Allí realizamos los trabajos correspondientes a la “Cartografía detallada de la vegetación a escala 1:10.000 de los espacios incluidos en la Red Natura 2000”.

La realización de esta cartografiación se lleva a cabo en tres etapas secuenciales. Hay una fase inicial o preparatoria centrada fundamentalmente en la delimitación de teselas sobre la ortofotografía (cedida por la Junta de CyL), y en la recopilación de información sobre las comunidades vegetales descritas en la zona, citas florísticas conocidas, etc. La segunda fase o fase central es en la que se desarrolla una intensa

prospección de campo. Y, por último, hay una fase terminal en la que se finaliza la informatización de datos, se revisa la delimitación de las teselas y se acaba redactando una memoria explicativa del trabajo realizado, las unidades descritas, su composición, fisonomía y características ecológicas, y una valoración de los distintos hábitats 12

CSIC-Real Jardín Botánico cartografiados particularizando en su caso la referente a las teselas en las que se hayan encontrados valores singulares.

Detalle de la delimitación de las teselas

Los trabajos realizados durante el periodo de prácticas se corresponde a la segunda fase o fase central. En ella se intenta delimitar correctamente y asignar adecuadamente a los tipos de vegetación de las distintas teselas cartografiadas, incorporar suficiente información sobre la composición florística de las comunidades vegetales presentes en el espacio, y obtener el mayor número de datos posible sobre la distribución de las especies incluidas en la lista de flora de mayor interés. Para ello hay que visitar cada tesela (a no ser que por sus características sea inaccesible) y comprobar los límites. También hay que realizar en las teselas inventarios de especies, pero no en todas ellas sino en un número mayor de 200 y distribuidos proporcionalmente según el tipo de vegetación existente. Se intenta que los inventarios sean representativos de las comunidades de modo que se intentan hacer en zonas donde no se aprecien ecotonías. Los inventarios se hacen sobre una superficie mínima de 100 m2, y en ellos se apuntan todas las especies encontradas, así como un dato de abundancia o cobertura [+ (presencia puntual), 1-(