ASOCIACION GANADERA DE OVINOCULTORES DE CHIAPAS SPR DE RL DE C.V COMITÉ ESTATAL SISTEMA PRODUCTO OVINO DEL ESTADO DE CHIAPAS A.C FUNDACION PRODUCE CHIAPAS A.C

PROGRAMA DE TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍA EN APLICACIÓN DE TÉCNICAS REPRODUCTIVAS ASISTIDAS PARAS OVINOS EN EL TRÓPICO

MEMORIAS CURSO TALLER DE CAPACITACION EN COLECTA Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS TUXTLA GUTIERREZ CHIAPAS ENERO 2014

TRAMSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS

Ciclo estral

DR. OCTAVIO MEJIA VILLANUEVA

F o t o p e r i o d o

Verano

Verano Primavera

Primavera Otoño

Invierno

Invierno

Otoño

dic ene feb mar abr may jun jul ago sep oct nov dic ene feb mar abr may jun jul ago sep oct nov

REPRODUCCIÓN

REPRODUC

ANESTRO

REPRODUC

ANESTRO

Ciclo estral - oveja Ovulación (24-30 hrs)

/

Luteólisis (PGF2)

/

[------------------------------------------------] 0 2 5 13 15 17 --------------------------------Estro --------- Diestro (cuerpo lúteo) -------Metaestro

P4 > 1 ng/ml

Proestro

Estro El estro dura de 24 a 36 hrs, está afectado por la raza, edad, época del año, efectos sociales (proporción de hembras en celo y presencia de machos), así como por el momento en que reciben monta

Estro La presentación de las características de celo conductual (búsqueda activa del macho y quietud ante la monta, secreción de moco cervical, edema vulvar) dependen de niveles elevados de E2 Los folículos de mayor tamaño son los que producen las mayores cantidades de E2, la máxima concentración se alcanza horas antes del estro conductual y disminuyen rápidamente con el pico preovulatorio de LH (10-12 hrs de iniciado el estro)

Estro

Algunas ovejas pueden presentar conducta homosexual, particularmente al ser sincronizadas con P4 natural (CIDR)

Otras conductas: abrir tren posterior, orinar y “banderilleo” En primalas es difícil la detección del celo, aún con el empleo de machos celadores experimentados

Ovulación • Para que ocurra la ovulación se presenta una liberación masiva de GnRH y posteriormente el pico preovulatorio de LH • Para que un folículo sea ovulado es fundamental que haya sido esteroidogénico • No obstante las células de la granulosa producen PGF2 son las de la teca las mayores responsables de su producción

• Inhibidores de GnRH, LH, esteroides o prostaglandinas evitan la ovulación

Ovulación • La PGF2 participa en la ruptura folicular, ya que favorece las contracciones ováricas del músculo liso ricamente inervado, presente en los folículos preovulatorios

Cuerpo lúteo • Durante el metaestro inicia la formación del cuerpo lúteo y se completa en 3 días • Durante la luteinización, ocurre mitosis de las células de la teca, sufren hipertrofia y se dispersan entre las de la granulosa, dando lugar a las células lúteas chicas • Las células de la granulosa se hipertrofian y dan origen a las células lúteas grandes

Cuerpo lúteo • Las células grandes secretan aproximadamente el 80% de la progesterona lútea y al parecer no dependen de LH • Las células pequeñas dependen de LH

Lúteolisis • Al final del diestro ocurre la destrucción del cuerpo lúteo

Lúteolisis

Foliculogénesis

El desarrollo folicular durante un ciclo estral está caracterizado por la presentación de una serie de oleadas foliculares consecutivas (Webb et al., 1992, Gibbons et al., 1999, Fortune et al.,2001)

En la mayoría de las ovejas se presentan 3 oleadas de desarrollo folicular, a intervalos de 4 a 6 días (Ginther et al., 1989, Webb et al., 1999, Evans et al., 2000)

Control artificial del ciclo estral

Sincronización del ciclo estral Se realiza en hembras ciclando durante la época de reproducción a) Progesterona sintética o natural Inhibe al hipotálamo (no se secreta GnRH) Inhibe a la hipófisis (no se secretan FSH ni LH) Suprime el desarrollo folicular y la ovulación Administrar durante 9-14 días + 100-300 UI de eCG al retiro Al finalizar el tratamiento se reanuda el desarrollo folicular en forma sincronizada y ocurre la ovulación

Sincronización del ciclo estral a) PROGESTERONA SINTÉTICA (progestágeno) Esponja intravaginal con 20 - 40 mg de acetato de fluorogestona (FGA) + 200 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG) CHRONOGEST INTERVET

Esponja intravaginal con 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MAP) + 200 UI de eCG SINCROGEST OVEJERO EN ESTOS DOS MÉTODOS RECOMIENDAN EL USO DE PGF2 Y UNA DOSIS MÁS ALTA DE eCG (300-500 UI)

Sincronización del ciclo estral b) PROGESTERONA NATURAL

CIDR – dispositivo intravaginal, 300 mg P4 + 200 UI eCG

CRONIPRES CO – dispositivo intravaginal, 160 mg P4 + 200 UI eCG

Sincronización del ciclo estral c) OTROS PROGESTÁGENOS - Orales (mezclar en alimento, MGA y MAP) Acetato de melengestrol, 0.11 - 2 mg diarios/hembra Dosis común ( 0.22 mg = 1 g de producto comercial)

Acetato de medroxiprogesterona, 10 mg diarios/hembra - Implante subcutáneo (norgestomet), 2-3 mg

Sincronización del ciclo estral Ventajas de la administración vaginal La mayoría de las hembras presentan celo a las 36-48 hrs del retiro Buena fertilidad en el estro sincronizado Los celos siguientes se manifiestan sincronizados

Desventajas de la administración vaginal Mayor manejo y costo de las hembras a sincronizar Combinación de P4 con PGF2 (o eCG + PGF2) se usaba en transferencia de embriones (mayor sincronía entre el celo de la donadora y receptora) uso en esquemas cortos de sincronización (5-7 días)

Sincronización del ciclo estral Ventajas de la administración oral Menor costo

Desventajas de la administración oral Complica la administración y dosificación de la hormona Los progestágenos tardan más en ser degradados Pueden permanecer en el rumen días después de finalizado el tratamiento El periodo de presentación de estros es más abierto ( 2-5 días) Tratamientos prolongados originan baja fertilidad

Costos de la sincronización INTERVET CHRONOGEST (números redondos/DIC 13) ESPONJA eCG (FOLLIGON) PGF2 (PROSOLVIN-C)

Sin PGF2 Aplicador de esponjas

$ 64.00 $ 26.00 $ 12.00 ----------$ 102.00

(200 UI) (0.075 mg)

$ 90.00 /hembra sincronizada $ 250.00

¿MEDIAS ESPONJAS DE 40 mg? ¿MEDIAS ESPONJAS de 20 mg? + 0.20 ml de Progesvit AE

Costos de la sincronización SINCROGEST OVEJERO ESPONJA eCG (OVEJERO) PGF2 (PROSOLVIN-C)

Sin PGF2

(números redondos/DIC 13) $ 48.00 $ 50.00 $ 12.00 ----------$ 110.00

(500 UI) (0.075 mg)

$ 98.00 / hembra sincronizada

Aplicador de esponjas (NO SE USA), Venta en paquete

SEGURAMENTE 200 UI DE eCG son suficientes, sin P GF2 $ 68.00 / hembra sincronizada

Costos de la sincronización CIDR (números redondos/DIC 13)

CIDR eCG (FOLLIGON)

$ 80.00 $ 26.00 (200 UI) ----------$ 106.00 /hembra sincronizada

Aplicador de CIDR

$ 150.00

¿RECICLAR CIDR?

Costos de la sincronización CRONIPRES CO (números redondos/DIC 13)

CRONIPRES eCG (FOLLIGON)

Aplicador de CRONIPRES

$ 32.00 $ 26.00 (200 UI) ----------$ 58.00 /hembra sincronizada $ 150.00

Costos de la sincronización

MGA (números redondos/DIC 13)

MGA

$ 3,500.00 / 20 Kg

dosis .22 mg = 1 g diario x 12 días $ 2.20 / hembra sincronizada

Sincronización del ciclo estral c) Prostaglandina F2 Provoca la destrucción del cuerpo lúteo en diestro o gestación

Ventajas Completa regresión lútea 15- 20 horas después Manifestación de estro entre las 36-72 horas de aplicada

Desventajas Sincroniza únicamente hembras ciclando y con cuerpo lúteo Dos aplicaciones para sincronizar al mayor número de hembras Menor fertilidad en relación al uso de progestágenos Provoca aborto en ovejas con menos de 50 días de Gx y en cabras gestantes en cualquier etapa

Costos de la sincronización

PGF2 (números redondos/DIC 13) 2 dosis 0.075 mg (D-cloprostenol) PROSOLVIN C $ 24.00 / hembra sincronizada

2 dosis 7.5 mg

(Lupostriol)

LUTALYSE

$ 17.50 / hembra sincronizada

Inducción del estro y la ovulación

Se realiza en hembras en anestro estacional o posparto a) Progesterona sintética o natural Imita un ciclo estral de la época reproductiva 12-14 días de P4 + 300 - 500 UI eCG

Inducción del estro y la ovulación b) Efecto macho - Induce estro y ovulación en hembras anéstricas - Efecto mediado por feromonas - 1 ó 2 meses antes de la época introducir machos - Novedoso e intenso (4-8% machos), ovulación 2- 6 días después de presentar los machos (sin celo) Primer ciclo estral “normal” entre 18 y 24 días después Combinarlo con P4 o progestágeno sin eCG

Inducción del estro y la ovulación c) Efecto hembra Ovejas inducidas estimulan a las que permanecen en anestro Efecto mediado por feromonas Grupo 1 Tratadas y en estro 92%, con CL 87.5% Grupos 2,3, 4 y 5 Sin tratamiento en corrales adyacentes Estro 40 , 10, 8 y 4%, con CL 52, 37.5, 32 y 13 %, respectivamente d) Manejo del fotoperiodo Al menos 40 días con fotoperiodo controlado 8 horas luz - 16 horas oscuridad Poco práctico, costoso

Inducción del estro y la ovulación e) Melatonina Traducción hormonal del fotoperiodo Alimentación o implantes S.C. con melatonina imitan días cortos 18 mg durante al menos 40 días En mayo o junio melatonina, julio o agosto actividad ovárica Puede adelantar pubertad y época reproductiva

f) GnRH (20-50 µg), hCG (1000-1500 UI) o eCG (500-1500 UI) Inducen ovulación No hay estro conductual, ciclos estrales cortos Uso experimental para estudios sobre luteólisis prematura En combinación con P4 o progestágeno ciclos estrales normales

Incremento de la prolificidad a) Cruzamientos con razas prolíficas Finnish Landrace, Romanov, Polipay, East Friesian, Merino Booroola Razas de pelo más prolíficas (Pelibuey, Panza negra) que las de lana Determinado por varios genes - Gen Booroola, Gen Inverdale -

b) Seleccionar dentro de la raza las hembras más prolíficas c) Flushing Elevación del plano nutricional - final de lactación o inicio época Proporcionar más proteína y energía (granos, melaza) Incremento en la oferta de folículos para ser ovulados Mayor liberación de GnRH, FSH y LH - 20-30% más ovulaciones No es útil en hembras en mala ni en excelente condición corporal

Incremento de la prolificidad d) Gonadotropinas exógenas Originan estro y ovulación en anestro y en época reproductiva Principalmente eCG - 500 UI en promedio En combinación con P4 o progestágeno e) Inmunización contra inhibina Uso experimental de inhibina o de líquido folicular Incrementa 2 ó 3 veces la tasa ovulatoria Inmunizaciones de recuerdo

Incremento de la prolificidad f) Inmunización contra esteroides

Reduce la inhibición de esteroides sobre hipotálamo e hipofisis Incrementa la secreción de FSH Inmunizar antes de la época, reforzar al inicio y al año siguiente No usar en hembras prolíficas, posibles pérdidas embrionarias FECUNDIN y ANDROVAX vs androstenediona MULTIVAC vs androstenediona, testosterona y estradiol

Superovulación Gonadotropinas exógenas a) FSH (Folltropin 180 mg, Pluset 200 UI, Ovagen 8.80 mg) Dosis total dividida en 6-8 aplicaciones Origen porcino vs origen ovino Administración única S.C., inyectores o bombas micro-osmóticas

b) eCG Una sola aplicación de 1500-3000 UI Folículos anovulatorios, regresión lútea prematura Dosis reducidas, anti-eCG, combinación con GnRH o hCG

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVEJAS

Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Ovina CEIEPO

DR OCTAVIO MEJIA VILLANUEVA

ANTECEDENTES 1890 primer experimento sobre transferencia de embriones en conejos

ANTECEDENTES 1932 transferencia de embriones en caprinos y ovinos

1970 a nivel comercial en Inglaterra, Estados Unidos, Australia, Nueva Zelanda, Francia, Sudáfrica, Canadá y Brasil

ANTECEDENTES

Consiste en la recolección de embriones de una hembra “donadora” y su transferencia a las “receptoras”, en las que se desarrolla la gestación hasta el parto

La genética de la cría nacida es la de la “donadora” de los embriones y la del padre que fertilizó los óvulos

VENTAJAS

Incremento del número de animales superiores genéticamente En algunas hembras se obtiene en una sola ocasión, un mayor número de crías de las que podría tener en toda su vida

VENTAJAS

Formación de rebaños uniformes

En México se ha usado principalmente para multiplicar los animales con fenotipo de interés Se puede usar para la conservación de especies en peligro de extinción

DESVENTAJAS

Es una técnica costosa en cuanto a materiales y equipo

Es necesario que sea realizada por personal capacitado En general los resultados no han sido óptimos

Técnica de transferencia de embriones Sincronización de donadoras y receptoras

Superovulación de donadoras, detección de celos y monta o inseminación artificial Detección de celos en receptoras

Superovulación Hormona folículo estimulante (FSH) Dosis total (180 a 200 mg) dividida en 6-8 aplicaciones Gonadotropina coriónica equina (eCG o PMSG) 1500-3000 UI Administración única S.C., inyectores o

bombas micro-osmóticas

Técnica de transferencia de embriones

Recolección de embriones de las donadoras

Evaluación de los embriones recolectados Transferencia a las receptoras

Diagnóstico de gestación en receptoras

Medio para lavado  D-PBS: Solución salina Dulbecco fosfatada y

agua bidestilada; cloruro de calcio, piruvato de sodio, glucosa, BSA (4%), penicilina, estreptomicina bufferada:

Solución de mantenimiento “Holding” Durante su evaluación los embriones se mantienen en una solución de PBS, 0.4 % BSA y antibióticos. Filtrar en acrodiscos de 0.2 (opcional).

Mantener a 37 °C o a temperatura ambiente. Lavar 4 a 6 veces en esta solución y transferir en fresco, o pasar al medio para congelar.

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CURSO TALLER DE CAPACITACION EN COLECTA Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN OVINOS

MORFOLOGIA DESARROLLO Y CLASIFICACION DE EMBRIONES MC BERNARDO SANCHEZ MUÑOZ

INTRODUCCIÓN

•La tecnología de la TE, se desarrollo con la finalidad de

optimizar los recursos genéticos y económicos de los rebaños. A pesar de los avances logrados, los resultados obtenidos no son del

todo

satisfactorios,

debido

posiblemente

a

factores

estacionales, geneticos, nutricionales y de manejo que afectan la calidad de los embriones o a que los métodos de evaluación no han sido totalmente efectivos.

TECNICAS DE EVALUACION DE EMBRIONES

MICROSCOPIA ESTEREOSCOPICA MICROSCOPIA ELECTRONICA INVASIVAS: TINCIONES

Desarrollo embrionario temprano Localización

Día

Etapa de desarrollo

Union ampula Istmo

0-2

una célula

Union ampula istmo

1-3

dos células

Istmo

2-3

cuatro células

Istmo

3-5

ocho células

Utero

4-5

sesenta células mórula temprana

Utero

5-8

Mórula

Día

etapa de desarrollo

6-7

Mórula madura o compacta

7-8

Blastocisto temprano

7-9

Blastocisto maduro Masa cel interna Forma el embrion

8-10

Blastocisto expandido

9-11

Blastocisto en eclosion

Blastocele

Trofoblasto Forma la placenta

Mórula temprana

Blastocele Blastocisto Blastocele

Mórula madura

Masa Cel Interna

Trofoectod

Comparación desde la ovulación a la entrada al útero en diferentes especies

especies

1 cel. 8 Cel (horas)

Blastocisto (Días)

Entrada útero

vaca

24

3

8

3.5

yegua

24

3

6

5

borrega

24

2.5

7

3

14-16

2

cerda

6

2

DESARROLLO EMBRIONARIO

Tiempo Núm. de células 36-48hrs. de iniciado el estro 2 células 3er. día 4-8 células 4º día 8-16 células

Clasificación según el desarrollo del embrión Mórula temprana Las células que tienden

a ser esféricas Se pueden observar blastómeros.

La masa celular ocupa el 80% del espacio perivitelino.

Mórula madura

Compactación de la masa celular y con blastómeros de forma poligonal. En la periferia de la masa celular las células son esféricas la masa celular ocupa el 60% o el 70% del espacio perivitelino

Blastocisto temprano

se empieza a formar una cavidad interna ocupada por fluido conocido como “blastocele”. El blastocisto tiene una apariencia de anillo y ocupa del 70% al 80% del espacio perivitelino.

El blastocele abarca menos del 50% de la masa celular del embrión.

Blastocisto maduro Diferenciación entre las células del trofoblasto y el disco embrionario. El blastocele abarca mas del 50% de la totalidad del embrión

El embrión ocupa el 90% del espacio perivitelino.

Blastocisto expandido Aumento del diámetro del embrión Adelgazamiento de la zona pelúcida El embrión ocupación del 100% en el espacio perivitelino

Blastocisto en eclosión Ruptura pelúcida

de

la

zona

El embrión puede tener la forma esférica de un blastocisto expandido o bien estar colapsado.

Parámetros que se toman en cuenta para la evaluación de los embriones 1. Estado de desarrollo de acuerdo con la edad Si se colecta en el 6º día, habrá mórulas compactas, blastocistos jóvenes y blastocistos maduros. Cualquier embrión que se encuentre en un estadío de desarrollo más joven será un embrión retrasado de 1 a 1.5 días y esto disminuye los porcentajes de gestación. También se pueden colectar embriones con una edad de 7 a 7.5 días, corriendo el riesgo de encontrar embriones eclosionados no resisten la congelación.

2.- Número de células (blastómeros)

Cuando un embrión tiene menos de 30 células al colectarse en el 7º día es un embrión no transferible Solo cuando el número de blastómeros sea difícil de contar será un embrión apto para la transferencia.

3.- Compactación de células forma poligonal al centro apariencia de mora. Mala

Buena

4.- Color Los embriones con una excelente calidad deben tener un color ámbar

Los embriones con una calidad buena presentan un color mas oscuro pero uniforme La presencia de manchas claras y oscuras o la existencia de vesículas, se asocian con problemas metabólicos.

Blastómeros extruidos

Los blastómeros extruidos son células que se quedaron en una etapa temprana de desarrollo y se observan como las células grandes fuera de lo que es la masa celular del embrión, entre la masa y la zona pelúcida, mientras mas blastómeros extruidos tenga un embrión menor será su calidad.

Clasificación de embriones respecto a su calidad Los embriones pueden clasificarse en cuatro grupos:

Excelente o calidad 1 Embrión compacto, esférico, desarrollo adecuado a su edad, pocas vesículas, sin desechos celulares, sin blastómeros extruidos y color ámbar uniforme.

Bueno o calidad 2

No transferibles o calidad 4

Son los embriones no transferibles con marcada degeneración, masa pequeña menor al 50% de lo normal, descompactación, retraso en el desarrollo (mas de 2 dias), color oscuro, zonas claras y oscuras e irregularidades en los

Codificación de las estructuras embrionarias Según su estadío

Óvulo Excelente

código

según su calidad

1

2

1

Embrión de 2 a 163células Bueno 2 4 Mórula temprana 5 Regular 3 6 Mórula compacta

código

EVALUACION POS DESCONGELADO EXCELENTE Cuando la apariencia es similar a un embrión fresco 40% a 50% de fertilidad BUENO Se encuentra mas obscuro que uno fresco, pero sin mayores alteraciones 35-40% preñez

REGULAR Cuando es mas obscuro y pequeño, con material extruido, vacuolas, zona pelucida rota,forma irregular. 15-20% preñez. NO TRANSFERIBLE Zona pelucida vacia, embrion degenerado, cambio de color, Masa embrionaria obscura y de menor tamaño, 0% de preñez.