Universidad de los Lago Departamento Ciencias y Tecnología Alimentos

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

CAPITULO 3: MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Profesor: Héctor Mancilla Chávez

Osorno- 2007

Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

CAPITULO 3 MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL 1. 2. 3. 4.

Microorganismos utilizados a nivel industrial. Actividades y características de interés. Principales tipos. Fisiología del crecimiento Metabolismo microbiano.

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Microorganismos utilizados a nivel industrial

No todos los microorganismos tienen un uso industrial. Mientras que los microorganismos aislados de la naturaleza muestran el crecimiento celular como su principal propiedad fisiológica, los microorganismos industriales son organismos que se han seleccionado cuidadosamente para que produzcan uno o más productos específicos. Incluso cuando el microorganismo industrial es uno que se ha aislado por las técnicas tradicionales, se convierte en un organismo altamente "modificado" antes de entrar en las industrias a gran escala. En gran parte, los microorganismos industriales son especialistas metabólicos capaces de producir específicamente determinados metabolitos y con gran rendimiento. Con el fin de lograr esta elevada especialización, las cepas industriales están alteradas genéticamente, por mutación o por recombinación. Habitualmente se reprimen o se eliminan las vías metabólicas menores y frecuentemente existe en ellas un desequilibrio metabólico. Los microorganismos industriales pueden presentar muchas propiedades celulares y bioquímicas alteradas. Aunque las cepas industriales pueden crecer satisfactoriamente bajo las condiciones altamente especializadas de un fermentador, pueden mostrar un crecimiento pobre en ambientes naturales competitivos. 1.1

Origen de las cepas industriales La fuente última de todas las cepas de microorganismos industriales es el ambiente natural. Pero a través de los años, a medida que los procesos microbianos a gran escala se han ido perfeccionando, un cierto número de cepas industriales se han ido depositando en las

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colecciones de cultivos. Cuando se patenta un nuevo proceso industrial, al solicitante de la patente se le requiere para que deposite una cepa capaz de llevar a cabo el proceso, en una colección de cultivos reconocida. Hay varias colecciones de cultivos que actúan de depositarias y suministradoras de cultivos microbianos. Aunque estas colecciones pueden ser una fuente rápida y fácil de cultivos, es comprensible que la mayoría de las compañías industriales se sientan poco dispuestas a depositar sus mejores cultivos en las colecciones de cultivos. Además de cultivos de microorganismos, muchas colecciones de cultivos tienen también colecciones de varios plásmidos, de genes clonados y de vectores para su uso en ingeniería genética, de líneas celulares animales para el cultivo de virus animales, y de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales.

ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES 1. Alimentos fermentados a) Selección involuntaria según las características del proceso b) Selección in vitro de aquellas cepas que presentaran unas características más interesantes 2. Producción de aditivos y enzimas de uso alimentario a) Selección a partir de cualquier fuente natural b) Colecciones de cultivo públicas y privadas

1.2

Mejora de cepas Corno hemos indicado, la fuente inicial de un microorganismo industrial es el ambiente natural, pero el aislamiento original se modifica en gran medida en el laboratorio. Como resultado de esta modificación, es posible anticipar una mejora progresiva en el rendimiento de un producto. El ejemplo más espectacular de tal mejora progresiva es el de la penicilina, el antibiótico producido por el hongo Penicillium chrysogenum. Cuando se produjo por primera vez la penicilina a gran escala, se obtuvieron rendimientos de 1- 10 µg/ml. A lo largo de los años, como resultado de la mejora de las cepas acoplada a cambios en el medio y en las condiciones de cultivo, el rendimiento de penicilina aumentó hasta 50.000 µg/ml. Es interesante decir que todo este incremento de 50.000 veces el rendimiento, se obtuvo por mutación y selección; no estuvo implicada ninguna manipulación genética. La introducción de nuevas

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técnicas genéticas ha conducido a posteriores, aunque mucho más modestos, incrementos del rendimiento. 2

Actividades y características de interés. Principales tipos.

2.1

Propiedades de un microorganismo industrial Un microorganismo adecuado para su utilización industrial debe producir la sustancia de interés, pero hay muchos otros aspectos a considerar. Es preciso disponer del organismo en cultivo axénico (puro), debe ser genéticamente estable, y debe crecer en cultivo a gran escala. Además, debe ser posible mantener cultivos del organismo durante un período de tiempo largo en el laboratorio y en la planta industrial. El cultivo debe producir preferentemente esporas o alguna otra forma celular reproductora, para que los organismos se puedan inocular fácilmente en los grandes fermentadores. Una característica importante es que el organismo. industrial crezca rápidamente y produzca el compuesto deseado en un período de tiempo relativamente corto. El organismo, además, debe ser capaz de crecer en un medio de cultivo líquido y relativamente barato, que se pueda obtener en grandes cantidades. Muchos procesos microbiológicos industriales utilizan fuentes carbonadas de desecho de otras industrias, como principal ingrediente o como suplemento para los medios de cultivo a escala industrial. Algunas de estas fuentes son, por ejemplo, el licor de maceración de maíz (un producto rico en nitrógeno y factores de crecimiento), el suero (un producto líquido de desecho de la industria lechera, que contiene lactosa y sales minerales) y otros materiales de desecho industriales, que tienen elevado contenido de carbono orgánico. (La utilización de estos materiales carbonados de desecho ayuda también a resolver los problemas de eliminación de residuos, creados por la elevada demanda biológica de oxígeno (BOD) de los residuos orgánicos de desecho). Además, un microorganismo industrial debería no ser dañino para las personas ni para los animales y plantas económicamente importantes. Debido al gran tamaño de la población dentro del fermentador y a la imposibilidad práctica de evitar la contaminación del ambiente fuera del fermentador, un patógeno podría plantear problemas potenciales desastrosos. Otro requisito importante de un microorganismo industrial es que sea posible eliminar las células microbianas del medio de cultivo con relativa facilidad. En el laboratorio, las células se retiran principalmente por centrifugación, pero la centrifugación a gran escala puede ser difícil o cara. Los organismos industriales más favorables son aquellos que tienen un tamaño de célula grande,

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porque las células más grandes se depositan rápidamente en un cultivo o pueden filtrarse fácilmente con materiales de filtro relativamente baratos. Los preferidos son los hongos, las levaduras y las bacterias filamentosas. Las bacterias unicelulares, debido a su pequeño tamaño, son difíciles de separar del fluido de cultivo. Finalmente, un microorganismo industrial debería ser susceptible de manipulación genética. En microbiología industrial, el incremento del rendimiento se ha obtenido primordialmente por medio de la mutación y selección. También es deseable que el organismo industrial sea capaz de sufrir recombinación genética, bien por un proceso sexual o por algún tipo de proceso parasexual1. La recombinación genética permite incorporar en un solo genoma, características genéticas de más de un organismo. Sin embargo, muchas cepas industriales se han mejorado enormemente por mutación y selección, sin el uso de la recombinación genética. REQUISITOS DE LAS CEPAS INDUSTRIALES 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

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Posibilidad de obtener cultivos puros Genéticamente estables Fácil de mantener por largos períodos de tiempo Tasa rápida de producción de formas de propagación Tasa rápida de crecimiento en preinóculo y en fermentador Ausencia de problemas tecnológicos durante el escalado Nutricionalmente poco exigentes Autoprotección (bajada de pH, temperatura óptima extrema, producción de agentes antagonistas, etc). Producción rápida de los metabolitos de interés Fácil separación entre el producto y el microorganismo Producción mayoritaria del metabolito de interés Falta de producción de sustancias tóxicas Susceptible de mejora genética

Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño tamaño de la célula 1

Ciclo que implica cambios en el número cromosómico, pero que difiere en lugar y tiempo del ciclo sexual; tiene lugar en los hongos cuyo ciclo normal está suprimido o aparentemente ausente. Cuando es Homocariótico los núcleos presentes en una hifa son del mismo tipo genético. Para el caso Heterocariótico dos o más núcleos son genéticamente distintos. En la Heterocariosis se produce la fusión de micelios genéticamente distintos, el par formado sufre mitosis o, puede suceder en la mutación de un micelio Homocariótico. La Parasexualidad consiste en los siguientes procesos: Heterocariosis, cariogamia, recombinación, segregación mediante entrecruzamiento mitótico y haploidización. Los procesos parasexuales se asemejan a la reproducción sexual, pero estos pueden tener lugar cuando el micelio está en desarrollo, mientras que la fase sexual (sí la hay) depende de las condiciones nutritivas y del hábitat

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microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos.

Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar. 2.2

Diferentes tipos de microorganismos industriales

Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros métodos.

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2.2.1

Levaduras

Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluídos algunos que son tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.

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2.2.2

Hongos filamentosos

Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

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2.2.3

Bacterias

Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a compuestos volátiles (geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc

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Fisiología del crecimiento Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la población. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: ƒ ƒ

A escala individual A escala poblacional

Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas: ¾ inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos); ¾ segregación de cromosoma y plásmidos a las células hijas; ¾ síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular ¾ señales que coordinan la replicación genómica con la división celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos: ¾ cinética del crecimiento; ¾ factores que afectan al tiempo de generación (g); ¾ factores ambientales que limitan el crecimiento. 3.1

Ciclo celular Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior.

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Ciclo eucariótico Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M. Ciclo eucariótico Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M.

Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M. Ciclo procariótico Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo. Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procariótico son:

Ciclo procariótico Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo. Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en

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medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procariótico son: ¾ fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del ADN cromosómico; ¾ fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de división celular; ¾ fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de división celular; Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generación (g), lo hace a expensas de la fase "G1". Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.

3.1.1

Ciclo celular en función del tiempo de generación Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qué ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generación.

Cuando g>C+D

existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicación). En estas condiciones podemos observar nítidamente periodos diferenciados entre sí (de síntesis de ADN y de división celular).

Cuando g=C+D

ya no existe G1, y cada ronda de replicación comienza inmediatamente tras la precedente división celular (es decir, cada célula hija recién nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la célula inicia la división celular).

Cuando g NADPH + H+

Mecanismos de obtencion de ATP

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En el metabolismo, el ATP se genera por dos mecanismos bioquímicos fundamentalmente diferentes: Fosforilación a nivel de sustrato y fosforilación oxidativa. 1.- Fosforilación a nivel de sustrato: Mediante la fosforilación a nivel de sustrato, el ATP se forma a partir de ADP por transferencia de un grupo fosfato de alta energía de un intermediario de una ruta catabólica. La siguiente reacción sirve de ejemplo:

Acido 2 fosfoglicérico -----> Acido fosfoenolpirúvico + ADP -----> Acido pirúvico + ATP Como consecuencia de la pérdida de una molécula de H2O, el enlace éster de baja energía del fosfato del ácido 2-fosfoglicérico se convierte en un enlace enólico de alta energía en el ácido fosfoenolpirúvico. Este fosfato de alta energía puede luego ser transferido al ADP con lo que se produce una molécula de ATP. 2.- Fosforilación oxidativa (Transporte de electrones): En los diferentes modos de metabolismo microbiano, incluyendo la respiración y la fotosíntesis, el ATP se genera por transporte de electrones a través de una cadena de moléculas transportadoras que tienen una orientación fijada en la membrana celular. Los componentes de la cadena son moléculas transportadoras capaces de sufrir oxidaciones y reducciones de modo reversible de tal manera que cada miembro de la cadena es capaz de ser reducido por la molécula transportadora que le precede y oxidado por la que le sigue. En la cadena de transporte de electrones algunos miembros transportan átomos de hidrógeno (un electrón más un protón), mientras que otros transportan sólamente un electrón. La orientación de los transportadores en la membrana celular es tal que los transportadores de átomos de hidrógeno realizan el transporte hacia fuera de la célula y los transportadores de electrones lo realizan hacia el interior con lo que en cada confluencia se transporta fuera de la célula un protón. La membrana celular es impermeable a los protones; como resultado, el transporte de electrones retiene una porción de energía química liberada por la reacción global de la cadena (oxidación del donador primario de electrones por el aceptor terminal de electrones). Esta energía se utiliza en los sistemas de permeasas, movilidad celular por flagelos y en la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Esta síntesis de ATP está catalizada por un enzima complejo unido a la membrana la ATP fosfohidrolasa (ATPasa). La fosforilación oxidativa se puede explicar

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aplicando el símil de la generación de energía eléctrica a través de agua embalsada. La membrana actúa como una presa que retiene el agua (en este caso los protones que se transportan fuera de la célula a través de la cadena transportadora de electrones); en el momento que se abren las compuertas (ATPasa) este agua liberada (protones) mueve la turbina (ATPasa) que genera energía eléctrica (síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico).

4.2

Metabolismo primario Suma de los procesos esenciales para las funciones básicas de la célula, como la glucólisis. Un proceso microbiano típico, en el que el producto se forma durante la fase primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentación3. El etanol es un producto del metabolismo anóxico de la levadura y de algunas bacterias y se forma como parte del metabolismo de la energía. Debido a que el crecimiento sólo puede tener lugar si puede producirse energía, la formación de etanol tiene lugar en paralelo con el crecimiento. En la imagen inferior, se muestra una típica fermentación alcohólica indicando la formación de células, de etanol, y la utilización del azúcar.

Sustrato de crecimiento

Células

Metabolito Primario

Las células y el metabolito se producen más o menos simultáneamente

En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, sea o no sea bioquímicamente una fermentación. De hecho, la mayoría de las fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se denomina fermentador y el microorganismo implicado es el agente de la fermentación 3

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4.3

Metabolismo secundario Suma de los procesos no esenciales para las funciones metabólicas básicas de la célula. Estos procesos están asociados a ciertas ventajas adaptativas, como los mecanismos de defensa (antibióticos, toxinas, etc.).

Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes y más importantes de interés industrial. Los más conocidos y más ampliamente estudiados son los antibióticos y en la imagen inferior puede verse la cinética del proceso de obtención de la penicilina. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del metabolismo secundario son: 1. Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos. 2. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción. 3. La formación de metabolitos secundarios es extremadamente dependiente de las condiciones de crecimiento, especialmente de la composición del medio. Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario. 4. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras estrechamente relacionadas. Por ejemplo, se ha visto que una sola cepa de una especia del Streptomyces produce 32 antibióticos distintos pero relacionados, del tipo antraciclina. 5. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como están al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan espectacular. Trofofase e idiofase. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que

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las condiciones se alteren adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del producto sea excelente. En el metabolismo secundario, la producción en cuestión puede no derivarse del sustrato primario del crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó a partir del sustrato primario del crecimiento. Por tanto, el metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las células, durante el metabolismo primario. Una característica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas en la producción del metabolito secundario están regulados separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores específicos de la producción de metabolitos secundarios. Por ejemplo, se ha identificado un inductor específico de la producción de estreptomicina, un compuesto denominado Factor A.

Sustrato de crecimiento

Células

Metabolito Primario

Metabolito Secundario Después de producidas las células y el metabolito primario, las células convierten el metabolito primario en uno secundario

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Sustrato de crecimiento

Células

Metabolito Primario

Metabolito Secundario Después de producidas las células el sustrato se convierte en un metabolito secundario durante un posterior crecimiento Características de los metabolitos secundarios • • • • 9 •

Específicos de un grupo de organismos No esenciales para el crecimiento Dependiente de las condiciones de crecimiento Producidos como grupo de estructuras relacionadas: Una cepa de Streptomyces produce 32 antibióticos distintos del tipo antraciclina Puede obtenerse una superproducción espectacular

Relación entre el metabolismo primario y el secundario. La mayoría de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas complejas que para su formación requieren un gran número de reacciones enzimáticas específicas. Se sabe, por ejemplo, que en la síntesis del antibiótico tetraciclina están implicados al menos 72 pasos enzimáticos separados y más de 25 en la síntesis de la eritromicina, y que ninguna de estas reacciones tiene lugar durante el metabolismo primario. Sin embargo, las vías metabólicas de estos metabolitos secundarios arrancan del metabolismo primario porque los materiales de partida para el metabolismo secundario vienen de las vías biosintéticas principales. Muchos metabolitos secundarios estructuralmente complejos, se originan a partir de precursores estructuralmente muy similares.

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4.4

Mecanismos de obtención de energía por microorganismos quimioheterotrofos Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterotrofos para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la energía en ATP se pueden dividir en dos grupos: 1.- Fermentación: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia de cualquier aceptor terminal de electrones. 2.- Respiración: cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica: oxígeno; Anaeróbica: Nitrato, Sulfato, Fumarato, Oxido de Trimetilamina.

Fermentación Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la energía disponible. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato orgánico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas). Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico a ácido

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láctico. En el caso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico se descarboxila primero para formar acetaldehído y la reoxidación del NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para formar etanol. Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar varios productos finales, pero ninguna fermentación da lugar a todos los productos finales. Resultados de la fermentación de la glucosa. El resultado final de la glicolisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la producción de productos de fermentación. Para el organismo el producto más importante es el ATP y los productos de la fermentación son productos de desecho. Sin embargo, estos productos son muy importantes para el cervecero, panadero, quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras produce etanol que es el producto principal de las bebidas alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso. Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan. El efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica, pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en su medio ambiente. Pasteur fué el primero en observar que el azúcar es convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto indica el mayor rendimiento energético de la respiración sobre la fermentación. Respiración aeróbica (Rutas de utilización del piruvato por aerobios) La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las siguientes rutas: ¾ Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas)

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¾ Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas) ¾ Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariotas como alternativa a la ruta Embden-Meyerhof)

Embden-Meyerhof

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Entner Doudoroff

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En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetilcoenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor que puede entrar en rutas biosintéticas; alternativamente, puede ser oxidado completamente a CO2 a través de una ruta conocida como ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es la principal vía de generación de ATP en los heterotrofos aeróbicos (por paso de electrones a través de una cadena transportadora de electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo TCA genera además tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efectúa la oxidación completa de una molécula de ácido acético a CO2, produce tres moléculas de piridín nucleótidos reducidos, una molécula de ATP y una molécula de FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de transporte independiente de piridín nucleótidos). Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son utilizados en la biosíntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de los metabolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía acetil-CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato. Ciclo del glioxilato. Durante la oxidación de ácido acético o ácidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (anapleróticas) ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa con el glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato. Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite el funcionamiento normal del ciclo TCA. Balance energético de la respiración aeróbica. El TCA produce la

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completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El NADH y FADH pueden ser reoxidados a través del sistema de transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y 2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de acetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de ácido pirúvico, en total serían 30 moléculas de ATP. A estos hay que añadir las 2 moléculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por cada molécula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en la fermentación. 4.5

Mecanismos de obtención de energía por microorganismos autótrofos A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del CO2, tienen lugar en dos fases bioquímicas distintas: 1.- Síntesis de metabolitos precursores 2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos

Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson Este ciclo es compartido por la mayoría de los fotoautotrofos y los quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5difosfato en ácido 3-fosfoglicérico, a partir del cual se sintetizan todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2 depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente, parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizarse para regenerar este aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede dividirse en 3 fases: 1.- Fijación de CO2 2.- Reducción del CO2 fijado 3.- Regeneración del aceptor de CO2 El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

nucleótidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se sintetizan por otros mecanismos. Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos A.- Quimioautotrofos Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden servir como fuente de energía son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilación oxidativa). El aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son. Estos agentes reductores débiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridín nucleótidos por un proceso llamado transporte inverso de electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se utiliza para impulsar electrones en una dirección inversa, que de otro modo sería termodinámicamente desfavorable, a través de otra cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín nucleótidos oxidados que resultan por ello reducidos. B.- Fotoautotrofos Los fotoautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la fotofosforilación, proceso por el que los organismos fototrofos convierten la energía radiante de la luz en energía metabólica y poder reductor. Existen dos tipos de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Fotosíntesis oxigénica: La generación de ATP y poder reductor se lleva a cabo en dos centros de reacción fotoquímica diferentes llamados fotosistema I (PSI) y fotosistema II (PSII), los cuales contienen clorofila y se localizan en las membranas de los tilacoides. Estos dos fotosistemas actúan de una manera conjunta en cianobacterias, algas y plantas. i) Cuando la luz es absorbida por las moléculas de clorofila existentes en el PSI, éstas moléculas de clorofila se fotoactivan lo que les permite oxidarse. Los electrones eliminados de las moléculas de clorofila del PSI son aceptados por el NADP reduciéndose a NADPH2. Todo esto deja a las moléculas de clorofila del PSI temporalmente deficientes en electrones lo que les confiere una carga positiva. ii) De la misma manera, la luz absorbida

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

por las moléculas de clorofila existentes en el PSII provoca que un electrón sea eliminado de cada molécula. Estos electrones pasan a través de un sistema transportador de electrones hasta que llegan al PSI donde son aceptados por las moléculas de clorofila deficientes en electrones que se reducen. Este sistema transportador de electrones es parecido al descrito en la fosforilación oxidativa, utilizándose la energía liberada para la síntesis de ATP. La diferencia radica en que el donador primario de electrones es la clorofila del PSII y el aceptor terminal de electrones es la clorofila del PSI (NADH2 y O2 respectivamente en la fosforilación oxidativa). iii) En este punto la clorofila del PSII es deficiente en electrones. Sin embargo, esta clorofila es un fuerte agente oxidante que obtiene los electrones necesarios para reducirse de las moléculas de H2O. Esta oxidación del H2O genera oxígeno gaseoso. Las cianobacterias, algas y plantas son organismos que generan oxígeno mediante la fotosíntesis oxigénica, siendo los responsables de la producción mayoritaria del oxígeno que existe en la atmósfera terrestre. La atmósfera de la primitiva Tierra no contenía oxígeno hasta que se desarrollaron las cianobacterias hace entre 1000 y 3000 millones de años. El desarrollo de los organismos aerobios sólo fué posible después de que se acumularan en la atmósfera apreciables cantidades de O2 (generado mediante la fotosíntesis oxigénica de las cianobacterias). Fotosíntesis anoxigénica: Los fototrofos anoxigénicos convierten la energía de la luz en energía química necesaria para el crecimiento; sin embargo, y al contrario que las plantas, algas y cianobacterias en este proceso de transformación de la energía no se produce oxígeno y por ello se le llama fotosíntesis anoxigénica. Otra diferencia es que los fototrofos anoxigénicos contienen un tipo de clrofila, bacterioclorofila, diferente a la clorofila de las plantas. Estas bacterias contienen además carotenoides, pigmentos encargados de la absorción de la energía de la luz y posterior transmisión a la bacterioclorofila. El color de estos pigmentos son los que le dan el nombre a estas bacterias: bacterias rojas y bacterias verdes. En las cianobacterias estos pigmentos captadores de luz son las ficobilinas, de ahí su nombre: bacterias azules (cianobacterias). En las bacterias rojas y bacterias verdes sólo existe un fotosistema, de tal manera que la energía absorbida de la luz se utiliza para transportar un electrón desde la clorofila a la cadena de transporte de electrones que finalmente cede el electrón a la misma clorofila. En esta cadena de transporte de electrones se genera la energía necesaria para sintetizar ATP. Sin embargo, el transporte de electrones es cíclico (el donador primario de electrones y el aceptor terminal de electrones es la misma clorofila) no existiendo por lo tanto reducción de NADP a NADPH. Esta reducción se lleva a cabo mediante transporte inverso de electrones gracias a los electrones donados por el hidrógeno

45

Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

gaseoso (H2) o el sulfuro de hidrógeno (H2S). En cualquier caso nunca se produce O2.

4.6

Biosíntesis La célula es una excelente "industria química" encargada de ensamblar las intrincadas moléculas de la vida. Muchas de estas sustancias químicas "fabricadas" por las células son tan complejas que todavía no han podido ser sintetizadas artificialmente por los químicos en el laboratorio. Sin embargo, las bacterias pueden sintetizarlas a partir de los nutrientes y a temperatura ambiente. Estas sustancias son: 1.- Sustancias nitrogenadas, incluyendo proteínas (como son los enzimas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA). 2.- Carbohidratos, donde se incluyen polisacáridos complejos como es la parte correspondiente del peptidoglucano de la pared celular. 3.- Fosfolípidos, los cuales son componentes importantes de la membrana citoplásmica.

4.6.1

Sustancias nitrogenadas A.-

Proteínas

El ácido glutámico es el aminoácido más importante a partir del cual las bacterias sintetizan otros aminoácidos. En Escherichia coli el ácido glutámico se obtiene por reducción aminada del ácido acetoglutárico. Este ácido glutámico se puede transformar en otros aminoácidos por dos mecanismos:

Transaminación: el grupo amino del ácido glutámico se intercambia por un átomo de oxígeno de diversos ácidos orgánicos convirtiéndolos en aminoácidos. Por ejemplo, la síntesis de alanina a partir de la transaminación del ácido pirúvico:

Acido glutámico (-NH2) + Acido pirúvico (=O) --------> Acido a-cetoglutárico

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

(=O) + Alanina (-NH2)

Alteración de la estructura molecular: la otra vía por la cual el ácido glutámico se utiliza para sintetizar otros aminoácidos es alterando su estructura molecular. Estos cambios estructurales requieren energía en forma de ATP. Un ejemplo es la síntesis de prolina:

Acido glutámico + ATP + NADH2 --------> Semialdehido del ácido glutámico + ADP + P + NAD --------> H2O + Pirrolina-5-ácido carboxílico + NADPH2 -------> Prolina + NAD Una vez sintetizados, estos aminoácidos deben activarse para así poder ser utilizados en la síntesis de proteínas. Las células activan los aminoácidos usando la energía del ATP de la siguiente manera:

Aminoácido + ATP --------> Aminoácido-AMP + Pirofosfato

La

síntesis

de

proteínas

se

verá

en

capítulos

posteriores.

B.- Acidos nucleicos Los aminoácidos son utilizados también por las células para sintetizar nucleótidos (bloques constituyentes de los ácidos nucleicos). Existen dos tipos de nucleótidos según el azúcar que contengan:

¾ Ribonucleótidos: ribosa; síntesis de RNA ¾ Deoxiribonucleótidos: deoxiribosa; síntesis de DNA Estos nucleótidos también se clasifican en dos grupos según la base nitrogenada que contengan: Purinas: adenina o guanina Pirimidinas: citosina, timina o uracilo En la biosíntesis de las purinas se requieren los aminoácidos glicina, aspártico y glutamina además de energía en forma de ATP y GTP (guanosina trifosfato). En la biosíntesis de las pirimidinas se requieren los aminoácidos glutamina y ácido aspártico así como

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

energía en forma de ATP. En ambos casos la ribosa fosfato se obtiene a partir de glucosa. Una vez que se han sintetizado los nucleótidos, éstos se activan por ATP. En este proceso el nucleótido, que ya contiene un grupo fosfato, adquiere otros dos grupos fosfato. Por ejemplo, la guanosina monofosfato se activa a guanosina trifosfato:

GMP + 2 ATP --------> GTP + 2 ADP El ATP, además de ser una molécula que intercambia energía, es la forma activa de un nucleótido, la adenosina monofosfato (AMP), que se utiliza para sintetizar ácidos nucleicos.

La biosíntesis de DNA y RNA a partir de los nucleótidos activados la veremos en capítulos posteriores Carbohidratos Los microorganismos sintetizan carbohidratos mediante diferentes mecanismos según sean autotrofos (CO2) o heterotrofos (compuestos orgánicos como la glucosa) a partir de los cuales obtienen los diferentes monosacáridos. Estos monosacáridos deben ser activados para poder ser ensamblados en los polisacáridos correspondientes. Por ejemplo, la forma activada de la glucosa es uridin difosfato glucosa (UDP-Glucosa) y la fuente de energía usada es ATP y UTP:

Glucosa + ATP + UTP --------> UDP-Glucosa + ADP + Pirofosfato Biosíntesis del peptidoglucano de la pared celular: La síntesis de los polisacáridos bacterianos se puede ilustrar mediante la biosíntesis del peptidoglucano. Si bien este peptidoglucano está localizado en la pared celular, la mayoría de la energía utilizada en este proceso biosintético se consume dentro de la célula. Los distintos pasos involucrados en este proceso se sumarizan en: (i)

A partir de glucosa y utilizando ATP y UTP se obtiene Nacetilglucosamina-UDP (NAG-UDP).

(ii)

Algunas de estas moléculas de NAG-UDP se utilizan para obtener N-acetilmurámico-UDP (NAM-UDP). La energía requerida en este paso se obtiene a partir del fosfoenolpirúvico.

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

(iii)

A cada molécula de NAM-UDP se le unen 5 aminoácidos para formar una cadena pentapeptídica. La adición de cada aminoácido requiere energía en forma de ATP.

(iv)

El grupo UDP del NAM-pentapéptido-UDP se reemplaza por un lípido llamado lípido transportador.

(v)

A este NAM-pentapéptido-lípido transportador se le une una molécula de NAG-UDP para formar una unidad completa activada que se insertará en la cadena de peptidoglucano.

(vi)

Esta unidad completa activada se transporta, con la ayuda del lípido transportador, a través de la membrana hacia la pared celular.

(vii)

Una vez en la pared celular, esta unidad completa activada se une a una cadena de peptidoglucano alargándose esta cadena en una unidad.

(viii)

El último paso es la unión de esta cadena a otras cadenas para formar la malla del peptidoglucano que constituye la estructura de la pared celular. Esta unión se inicia con la eliminación del quinto aminoácido de la cadena pentapeptídica, reacción catalizada por el enzima transpeptidasa. La rotura de este enlace libera energía que es utilizada por la transpeptidasa para unir los tetrapéptidos de dos cadenas distintas (el tercer aminoácido de una con el cuarto aminoácido de otra).

Lípidos Los lípidos más importantes de las células bacterianas son los fosfolípidos que, junto con las proteínas, forman la estructura de la membrana citoplásmica. La vía general por la cual los microorganismos sintetizan fosfolípidos comienza a partir de glucosa (6C) que a través de la glucolisis se oxida originando dos moléculas de ácido pirúvico (3C) que a su vez se descarboxila a acetil-CoA (2C); este acetil-CoA puede carboxilarse para formar malonil-CoA (3C). Esta última reacción consume energía en forma de ATP:

Acetil-CoA + CO2 + ATP --------> Malonil-CoA + ADP + P El acetil-CoA y malonil-CoA son las formas activas del ácido acético y malónico respectivamente las cuales se utilizan para sintetizar ácidos grasos de cadena larga:

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

(2C) Acetil-CoA + (3C) Malonil-CoA --------> Acetil-proteína + Malonilproteína --------> (4C) Butiril-proteína + CO2 --------> + Malonil-proteína -------> (6C)-proteína + CO2 --------> + Malonil-proteína --------> --------> --------> -------> --------> (16C ó 18C)-proteína + CO2

Una vez formados los ácidos grasos de cadena larga, éstos se utilizan para sintetizar los fosfolípidos. Para ello se necesita además glicerol fosfato, compuesto que se obtiene por reducción de la dihidroxiacetona fosfato que es un intermediario en la glucolisis. A cada molécula de glicerol fosfato se le unen dos moléculas de ácidos grasos de cadena larga para formar una molécula de ácido fosfatídico que es un fosfolípido sencillo a partir del cual se sintetizan otros fosfolípidos mediante la unión de otros grupos químicos al grupo fosfato. Por ejemplo, el aminoácido serina se puede adiccionar al ácido fosfatídico para formar fosfatidilserina. La energía que se requiere en esta reacción se obtiene a partir de la citidina trifosfato (CTP):

Acido fosfatídico + CTP + Serina --------> Fosfatidilserina + CMP + Pirofosfato

4.7

Mecanismos de obtención de energía por microorganismos quimioheterotrofos Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterotrofos para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la energía en ATP se pueden dividir en dos grupos:

1.- Fermentación: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia de cualquier aceptor terminal de electrones. 2.- Respiración: cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica:

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

oxígeno; Anaeróbica: Trimetilamina.

Nitrato,

Sulfato,

Fumarato,

Oxido

de

Fermentación Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la energía disponible. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato orgánico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas). Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico a ácido láctico. En el caso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico se descarboxila primero para formar acetaldehído y la reoxidación del NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para formar etanol. Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar varios productos finales, pero ninguna fermentación da lugar a todos los productos finales. Resultados de la fermentación de la glucosa. El resultado final de la glicolisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la producción de productos de fermentación. Para el organismo el producto más importante es el ATP y los productos de la fermentación son productos de desecho. Sin embargo, estos productos son muy importantes para el cervecero, panadero, quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

produce etanol que es el producto principal de las bebidas alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso. Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan. El efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica, pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en su medio ambiente. Pasteur fué el primero en observar que el azúcar es convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el CO2 el principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto indica el mayor rendimiento energético de la respiración sobre la fermentación.

Respiracion aerobica (Rutas de utilización del piruvato por aerobios) La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las siguientes rutas:

a) Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas) b) Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas) c) Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariotas como alternativa a la ruta Embden-Meyerhof)

En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetilcoenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor que puede entrar en rutas biosintéticas; alternativamente, puede ser oxidado completamente a CO2 a través de una ruta conocida como ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es la principal vía de generación de ATP en los heterotrofos aeróbicos (por paso de electrones a través de una cadena transportadora de electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo TCA genera además tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efectúa la oxidación completa de una molécula de ácido acético a CO2, produce tres moléculas de piridín nucleótidos reducidos, una molécula de ATP y una molécula de

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FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de transporte independiente de piridín nucleótidos). Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son utilizados en la biosíntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de los metabolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía acetil-CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato. Ciclo del glioxilato. Durante la oxidación de ácido acético o ácidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (anapleróticas) ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa con el glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato. Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite el funcionamiento normal del ciclo TCA. Balance energético de la respiración aeróbica. El TCA produce la completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El NADH y FADH pueden ser reoxidados a través del sistema de transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y 2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de acetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de ácido pirúvico, en total serían 30 moléculas de ATP. A estos hay que añadir las 2 moléculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por cada molécula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en la fermentación

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

4.8

Mecanismos de obtencion de energia por microorganismos autotrofos A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del CO2, tienen lugar en dos fases bioquímicas distintas: 1.- Síntesis de metabolitos precursores 2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos

Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson Este ciclo es compartido por la mayoría de los fotoautotrofos y los quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5difosfato en ácido 3-fosfoglicérico, a partir del cual se sintetizan todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2 depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente, parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizarse para regenerar este aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede dividirse en 3 fases: 1.- Fijación de CO2 2.- Reducción del CO2 fijado 3.- Regeneración del aceptor de CO2

El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín nucleótidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se sintetizan por otros mecanismos.

Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden servir como fuente de energía son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilación oxidativa). El

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son. Estos agentes reductores débiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridín nucleótidos por un proceso llamado transporte inverso de electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se utiliza para impulsar electrones en una dirección inversa, que de otro modo sería termodinámicamente desfavorable, a través de otra cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín nucleótidos oxidados que resultan por ello reducidos.

4.9

Relaciones de las bacterias con el oxígeno Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno: Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas. ¾ Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas). ¾ Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando

crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales). Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia

de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo.

Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno.(Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas). Anaerobias aerotolerantes (= aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes. Lectura completaría Anexo 1

CRECIMIENTO MICROBIANO Dr. Pedro F. Mateos Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca

I.- TIEMPO DE GENERACION II.- CURVA DE CRECIMIENTO III.- CRECIMIENTO SINCRONICO IV.- CULTIVO CONTINUO V.- DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO VI.- EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO • • • •

Temperatura pH Agua Oxígeno

I.- TIEMPO DE GENERACION Las principales reacciones de la síntesis celular son reacciones de polimerización, proceso por el cual los polímeros (macromoléculas) se sintetizan a partir de monómeros: síntesis de DNA, RNA y proteínas; que una vez sintetizadas se ensamblan formando las estructuras celulares tales como la envuelta celular, flagelos, ribosomas, cuerpos de inclusión, etc. En la mayor parte de los microorganismos este crecimiento continúa hasta que las células se dividen en dos nuevas células. El tiempo que requiere una célula para completar su ciclo es muy variable y depende de factores nutricionales y genéticos. El intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una célula se llama generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de generación.

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Cálculo del tiempo de generación Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique. t G = ----n

Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en cada generación. Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresión geométrica: 1 generación -------------> 2 células = 21 2 generaciones -------------> 4 células = 22 3 generaciones -------------> 8 células = 23 4 generaciones -------------> 16 células = 24 5 generaciones -------------> 32 células = 25 Si partimos de N células (en microbiología los estudios se realizan con poblaciones), a un tiempo determinado (Ta) tenemos un número de células determinadas (Na). En la primera generación se duplicará el número de células (2Na) y así sucesivamente de tal manera que al cabo de un tiempo determinado Tb el número de células determinadas será Nb (Nb = 2n Na) donde n es el número de generaciones transcurridas desde Ta hasta Tb. En esta fórmula (Nb = 2n Na) conocemos todos los parámetros excepto el número n de generaciones transcurridas por lo que aplicando logaritmos será posible calcularlo. Una vez obtenido el número de generaciones n transcurridas en un tiempo t podremos calcular el tiempo de generación G para ese microorganismo. Ta -------------> Na 1 generación -------------> 2Na = 21 Na 2 generaciones -------------> 4Na = 22 Na 3 generaciones -------------> 8Na = 23 Na 4 generaciones -------------> 16Na = 24 Na 5 generaciones -------------> 32Na = 25 Na n generaciones (Tb) -------------> Nb = 2n Na

Nb = 2n Na

lg Nb = n lg 2 + lg Na lg Nb - lg Na n = -----------------------lg 2 lg Nb / Na n = ----------------

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Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

lg 2 Nb n = 3,3 lg -------Na t G = -------------------3,3 lg Nb / Na

El tiempo de generación de la levadura Saccharomyces cerevisiae es de 90 minutos y el de la bacteria Escherichia coli es 20 minutos. Esta bacteria tiene un crecimiento muy rápido de tal manera que a partir de una sóla célula se obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480 minutos; 480 : 20 = 24 generaciones; 224 = 2 x 106 células) 2 millones de células. Esta misma bacteria al cabo de dos días se habría multiplicado hasta 2,2 x 1043 células. Una bacteria pesa aproximadamente 10-15 - 10-11 gramos por lo que el peso de todas estas células es de aproximadamente 2,2 x 1030 gramos que equivalen a 8 veces el peso de la Tierra.

II.- CURVA DE CRECIMIENTO Es la representación gráfica del logaritmo del número de células frente al tiempo. La curva teórica sería una recta pues los microorganismos estarían creciendo constantemente pero en la práctica la curva presenta distintas fases: • • • •

Fase de latencia: período de adaptación de un microorganismo a un nuevo medio de cultivo. Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (G). Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos tóxicos, etc. Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen.

Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que se encuentren (la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase estacionaria).

III.- CRECIMIENTO SINCRONICO Hasta ahora se ha descrito el modelo de crecimiento de poblaciones bacterianas. Estos estudios no permiten concluir nada sobre el tipo de crecimiento de las distintas células ya que en la mayoría de los cultivos bacterianos el tamaño celular está distribuido al azar. Para

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obtener información sobre el tipo de crecimiento de las distintas bacterias debe recurrirse a los cultivos sincrónicos, es decir, cultivos en los que todos los individuos de una población están en la misma etapa del ciclo celular. Esto se puede conseguir por diversas técnicas: Inducción: cambios repetitivos de temperatura o suministrando nutrientes. Selección: filtración o centrifugación diferencial. Una curva de crecimiento sincrónico es del siguiente tipo: el número de células del cultivo permanece aproximadamente constante durante el tiempo en el que las células recién formadas aumentan de tamaño; luego, el número de células se duplica de manera brusca.

IV.- CULTIVO CONTINUO Consiste en mantener la población microbiana en fase exponencial de crecimiento. Se utiliza en fermentaciones industriales que requieren actividad metabólica máxima. Los sistemas de cultivo contínuo pueden hacerse funcionar como quimiostatos o como turbidostatos. En un quimiostato la velocidad de flujo de entrada y salida de nutrientes se mantiene a un valor determinado de tal manera que la velocidad de crecimiento del cultivo queda ajustada a esa velocidad de flujo. En un turbidostato el sistema incluye un dispositivo óptico que regula la turbidez controlando la velocidad de flujo.

V.- DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad bioquímica en relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos. •

Métodos directos: o o o o

•

Recuento del número de células en una cámara Thoma Peso seco celular Determinación de nitrógeno o de proteínas totales Determinación de DNA

Métodos indirectos: o o o o o

Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxígeno Liberación de dióxido de carbono Concentración de un enzima constitutivo

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o o o

Decoloración de un colorante Incorporación de precursores radiactivos Medida de la turbidez

VI.- EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO No todos los microorganismos responden de la misma manera a los factores ambientales, lo que para unos puede ser beneficioso para otros es perjudicial. Temperatura Es de los factores ambientales que más influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas hasta una cierta temperatura a la cual las proteínas, DNA y otras macromoléculas son sensibles y se desnaturalizan. Cada microorganismo tiene una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. La temperatura óptima siempre está más cerca de la temperatura máxima que de la mínima. Psicrófilos: temperatura óptima baja (Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes) Mesófilos: temperatura óptima normal (la mayor parte de los organismos) Termófilos: temperatura óptima alta (microorganismos aislados de áreas volcánicas) Termófilos extremos: temperatura óptima muy alta (Thermococcus celer 103° C) pH Debido a que los microorganismos cambian el pH del medio cuando crecen se debe añadir un tampón en el medio para mantener el pH constante. Estos tampones funcionan en un rango de pH por lo que se deben utilizar diferentes tampones dependiendo del pH que se quiera en el medio. Para pH neutros se utiliza el tampón fosfato. Los ambientes naturales tienen un rango de pH que oscila entre 5 y 9. Los microorganismos que crecen a pH inferiores a 5 se denominan acidófilos (Thiobacillus pH: 0,5). Los microorganismos que crecen a pH superiores a 9 se denominan alcalinófilos (Bacillus pH: 11). Agua Todos los organismos requieren H2O para vivir. Las sustancias absorben en mayor o menor medida moléculas de H2O que no están disponibles para los organismos. Esta disponibilidad del H2O es lo que se llama potencial de agua (aw) cuyos valores van de 0 a 1. El aw del H2O pura es 1; el aw de los frutos secos es 0,7; el aw de los campos de cultivo se sitúa entre 0,9 y 1,0. Halófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de sales. Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares.

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Xerófilos: microorganismos que viven en ambientes secos. Oxígeno •

Aerobios o o

Obligados Requieren O2 para crecer (21 %) Facultativos No requieren pero crecen mejor en presencia de O2

•

Micraerófilos Requieren pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1 - 15 %)

•

Anaerobios o o

Aerotolerantes No requieren y crecen peor cuando el O2 está presente Obligados La presencia de O2 es letal

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La importancia de ser pequeño

ƒ ƒ

ƒ

Relación superficie/volumen favorece a células de menor radio Permite a los procariotas alcanzar mayores tamaños poblacionales en la mayoría de los habitats microbianos, debido a mayor tasa de crecimiento La mayor tasa de crecimiento y el mayor tamaño poblacional permites a estos m.o. causar importantes cambios en los parámetros físicoquímicos de un ecosistema en un tiempo relativamente corto

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Anexo 1

Metabolismo microbiano

Llamamos metabolismo al conjunto de reacciones de un organismo. Para los microorganismos con los que vamos a trabajar, normalmente quimiohetero-(organo)-trofos, podemos hacer el siguiente esquema general del metabolismo:

Los microorganismos son sistemas que necesitan una gran cantidad de energía para mantenerse ordenados. Esta energía se obtiene de la oxidación de compuestos orgánicos reducidos. Los nutrientes proporcionan esos compuestos reducidos y, en el curso de la oxidación, se libera energía (que se acumula en forma de moléculas almacenadoras de energía, especialmente el ATP) y se producen elementos estructurales que servirán para la construcción de nuevas células (crecimiento y diferenciación). Al proceso por el que se obtiene energía y elementos estructurales básicos a partir de nutrientes se le denomina catabolismo y al que utiliza la energía obtenida en el catabolismo para sintetizar nuevos componentes celulares se le denomina anabolismo. Es importante tener en cuenta que aunque se estudie de forma separada el anabolismo y el catabolismo, ambos tipos de procesos ocurren simultáneamente de forma que conforme se van produciendo elementos estructurales y energía en el catabolismo, esos elementos se usan para formar nuevos componentes celulares en procesos anabólicos. A los productos metabólicos generados durante el catabolismo y el anabolismo que tiene lugar durante el crecimiento (trofofase) se les

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denomina metabolitos primarios y su producción es paralela al crecimiento celular. Por el contrario, los productos metabólicos que se acumulan cuando no hay crecimiento sino diferenciación celular (idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. En general, puede decirse que los metabolitos secundarios se producen después de que se han producido los primarios; aunque en ciertas condiciones (como en cultivo continuo) se pueden producir simultáneamente. Es conveniente considerar el metabolismo como un flujo de materia reducida que puede oxidarse para la producción de energía o utilizarse para la biosíntesis de nuevos elementos estructurales. No todo el carbono presente en los nutrientes va a oxidarse completamente ya que parte se utilizará para sintetizar nueva biomasa. Por otra parte, no todo el carbono de los nutrientes se utiliza para la producción de biomasa y, por consiguiente, el rendimiento (medido tal y como se describió en otro apartado de estas notas >>>) es siempre inferior a la unidad (en torno al 50% en muchos casos). La oxidación de los nutrientes consiste en la capitación de electrones de un compuesto reducido por parte de un agente oxidante que llamaremos aceptor final de electrones. Este aceptor final puede ser inorgánico: oxígeno (con DG0`= -237 kJ) o NO3- con DG0`= -163 kJ; o compuestos orgánicos tales como el fumarato con DG0`= -86 kJ. Cuanto más negativo sea el valor de DG0`, mayor cantidad de energía se podrá obtener de la oxidación y más eficiente será el proceso. Por esto, puede verse que la oxidación en la que el aceptor final de electrones es el O2 es la que más rendimiento de producción de energía permite. En las páginas siguientes vamos a seguir el proceso de oxidación biológica de una molécula reducida señalando los pasos en los que se produce la liberación de energía. El esquema general del metabolismo se construye en torno al proceso de oxidación de la glucosa. La ecuación general de oxidación de la glucosa es la siguiente: C6H12O6 + 6 O2 ® 6 CO2 + 6 H2O

DG0`= -1330 kJ/mol

En el proceso de oxidación biológica de la glucosa, los productos finales (CO2, H2O y la energía) se producen en sitios diferentes en la célula: el CO2 se produce en reacciones de descarboxilación, mientras que el H2O y la energía se producen principamente en la membrana celualr como resultado de la cadena transportadora de electrones y de la actividad de la ATPasa de membrana. 2.- Catabolismo de la glucosa (glucolisis)

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El catabolismo de la glucosa (compuesto de seis carbonos al que nos referiremos como C6) puede ocurrir por cuatro vías diferentes: (1) Ruta de Embden-Meyerhof (EM). Es la más común en todo tipo de organisos incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchos tipos de bacterias. Esta ruta puede funcionar tanto en condiciones aerobias como en anaerobias y se lleva a cabo por una serie de 10 enzimas citoplásmicas. La mayoría de los pasos de la ruta son reversibles, aunque hay tres (los catalizados por las enzimas hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa) que son irreversibles. En los procesos anabólicos hay unos desvíos metabólicos para evitar estos pasos irreversibles. El resultado de la ruta EM es el siguiente: Glucosa (C6) + 2ADP + 2NAD+ ® 2 piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H+ Como resultado de esta ruta se obtiene una pequeña cantidad de energía (dos moles de ATP por mol de glucosa) por procesos de fosforilación a nivel de substrato, se obtienen dos moles de NAD reducido (NADH+ H+) y se ha logrado una oxidación parcial del carbono de la glucosa para producir como metabolito final dos moles de piruvato por mol de glucosa catabolizada. (2) Ruta de las Pentosas Fosfato (PF). Esta ruta está presente en muchas bacterias y en la mayoría de los eucariontes. En muchos casos se lleva a cabo simultáneamente a la tura EM descrita antes. Por ejemplo: en levaduras, entre el 10 y el 20% de la glucosa se metaboliza porla ruta PF (el porcentaje puede ser aún mayor en condiciones de crecimiento rápido) y el resto por la EM. La ruta PF funciona en condiciones aerobias y anaerobias y tiene importancia en procesos catabólicos y en anabólicos tales como en la síntesis de nucleótidos y de aminoácidos aromáticos. La ecuación general de la ruta PF es la siguiente: 3 Glucosa-6-fosfato (C6) + 6NADP+ + 3H2O ® 2 fructosa-6-fosfato (C6) + gliceraldehido-3-fosfato (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H+ Como resultado, no se produce energía, aunque sí ocurre una descarboxilación.La fructosa-6-fosfato y el gliceraldehido-3-fosfato son intermediarios comunes de las rutas EM y PF. Por último, los seis moles de NADPH+ H+ producidos en la ecuación se usan como "poder reductor" en procesos anabólicos. (3) Ruta de Etner-Doudoroff (ED). Es una ruta usada por un número reducido de microorganismos carentes de la ruta EM. La mayoría son bacterias Gramnegativas tales como Pseudomonas, Rhizobium, Xhantomonas, Azotobacter y Zymomonas. La ruta ED es muy rara en hongos. El resultado general de la ruta ED es el siguiente: Glucosa (C6) + ADP + NAD+ + NADP+ ® 2 piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+

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Como puede verse, el rendimiento energético es menor que en la ruta EM. (4) Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD).Es la ruta que siguen ciertas bacterias lácticas (especialmente Lactobacillus y Leuconostoc). Se puede considerar una variante de la ruta de las PF puesto que se forma un azucar C5 y, por consiguiente, tiene lugar una descarboxilación. sin emabrgo, en la ruta WD, la enzima fosfocetolasa rompe el azucar C5 y da lugar a dos ramas que condicen a la formación de lactato y etanol en un proceso de feremntación heteroláctica. El metabolito final más relevante de esta primera fase del catabolismo de la glucosa es el ácido pirúvico (piruvato) que se forma en las rutas EM, ED y PF (en esta ruta, tal y como se ha descrito, se forman intermediarios que pueden conducir a la formación de piruvato). El metabolismo central continúa, pues, con el catabolismo del piruvato

Procesos metabólicos fermentativos I

1.- Concepto de fermentación La palabra «fermentación» es confusa en Microbiología porque con ella se hace referencia a cuatro tipos de procesos diferentes: el metabolismo microbiano en ausencia de oxígeno, la producción de metabolitos secundarios, la modificación de compuestos químicos por microorganismos en crecimiento y el crecimiento bacteriano en sí cuando el interés del cultivo es la producción de biomasa. El sentido en que vamos a utilizarla en la clase de hoy es el primero: fermentación es el proceso por el que las células pueden obtener energía sin llevar a cabo un proceso de fosforilación oxidativa. Esto es: en la fermentación, la energía se obtiene mediante un proceso químico de fosforilación a nivel de substrato sin que se produzca una variación neta del poder reductor de la célula. Los primeros estudios científicos serios sobre procesos de fermentación se llevaron a cabo por Pasteur en el análisis de los procesos de producción y alteración del alcohol durante la fabricación del vino. Los procesos de fermentación son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas más antiguas de conservación de la energía. 1.1.- Diferencias entre fermentación y respiración: en los procesos de fermentación la energía química también deriva de la oxidación de compuestos reducidos. En cualquier proceso de oxidación se produce una transferencia de electrones desde el compuesto reducido que se oxida hasta el compuesto oxidado que se reduce, y en esa transferencia de electrones se produce la

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liberación de energía. En los procesos oxidativos el aceptor final de los electrones de la oxidación es el oxígeno o, de una manera más general, cualquier compuesto inorgánico oxidado. Sin embargo, en los procesos fermentativos, la transferencia de electrones se produce hasta llegar a un aceptor final que es un compuesto orgánico oxidado. Por consiguiente, en un proceso de fermentación tanto el donador de electrones como el aceptor son compuestos orgánicos, mientras que en un proceso de respiración el donador de los electrones es orgánico y el aceptor inorgánico. Otra manera de plantear el mismo proceso es considerar que en un proceso de respiración el aceptor final de electrones es siempre externo mientras que en un proceso de fermentación el aceptor final es interno. La respiración es mucho más efectiva energéticamente que la fermentación porque en aquélla la oxidación del compuesto orgánico es más completa que en esta y, como resultado de ello, se liberan 688 kcal/mol (DGo) en la respiración de glucosa y sólo 58 kcal/mol en la fermentación. (Estos valores hay que considerarlos a la luz de la necesidad de 7.3 kcal/mol para la síntesis de ATP). Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxígeno como aceptor final de los electrones. Esto no quiere decir que en ausencia de oxígeno sólo se pueda producir fermentación: el aceptor final de los electrones puede ser un compuesto inorgánico oxidado que los reciba al final de la cadena respiratoria produciéndose un proceso de fosforilación oxidativa en ausencia de oxígeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras moléculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO3--) los sulfatos (SO4=). 2.- Rutas fermentativas para la utilización del piruvato En la oxidación de un mol de glucosa a piruvato se producen en total 2 moles de ATP como rendimiento neto (se producen 4 moles de ATP y se consumen dos) y se genera también un mol de NADH+H+. Cuando se produce la entrada en el ciclo de Krebs del piruvato se va a generar una gran cantidad de NADH+H+ que se reoxida principalmente mediante la fosforilación oxidativa. Cuando una célula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrógeno necesario para las primeras fases de la glicolisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario para los procesos metabólicos iniciales del catabolismo de la glucosa. Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentación que se conocen por sus productos finales.

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2.1.- Fermentación etanólica o alcohólica: el piruvato se reduce para formar etanol y CO2: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ® 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP este es el proceso de fermentación que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae y algunas (pocas) bacterias. Su importancia industrial es evidente: la fermentación alcohólica produce el alcohol presente en las bebidas fermentadas (vino cerveza, etc.) y el CO2 que se libera en esta fermentación es el causante del esponjamiento de la masa de pan durante su fermentación. En este último caso el proceso de cocción posterior durante la fabricación permite eliminar todo el alcohol de manera que no queda presente en el producto final. 2.2.- Fermentación homoláctica: se denomina así la fermentación cuyo único producto final es el ácido láctico. Su ecuación global es: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ® 2 ácido láctico + 2 ATP Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de Embden-Meyerhof (vía glucolítica clásica). Es un proceso de fermentación presente en muchas bacterias del grupo láctico: Streptococcus (grupo de enterococos), Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus. Su importancia industrial estriba en la bajada del pH de los productos donde se encuentran estas bacterias: esta bajada del pH como consecuencia de la liberación de ácido láctico es suficiente para producir unos cambios químicos en el producto (precipitación de proteínas durante el cuajado de la leche), cambios microbiológico (protección del deterioro microbiano de alimentos como consecuencia de la eliminación de la flora competidora) y organolépticos (los ácidos orgánicos de cadena corta, y entre ellos el ácido láctico tienen características de producción de sabor) que hacen de esta fermentación un proceso muy relevante en la producción de alimentos. La fermentación homoláctica es la causante de las agujetas producidas en los músculos después de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de oxígeno aportada a las fibras musculares no es suficiente para asegurar toda la reoxidación del NADH+H+. Las agujetas se producen por los depósitos de ácido láctico entre las fibras musculares. Asimismo, la fermentación homoláctica es responsable de la alteración del esmalte dental en la boca causado por bacterias láctica flora habitual. 2.3.- Fermentación heteroláctica: denominada así porque su producto final no es exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentación homoláctica como se desprende de la producción de sólo un

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mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La obtención del piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las pentosas. La reacción global es: Glucosa + ADP + Pi ® Ac. láctico + etanol + CO2 + ATP Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo láctico pertenecientes a los géneros Leuconostoc y Lactobacillus. Industrialmente el proceso es relevante en la producción de alimentos fermentados (por ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora de este tipo de fermentación es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la leche. 2.4.- Fermentación del ácido propiónico: las bacterias que presentan este tipo de fermentación se pueden utilizar tanto azúcares como lactato como puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y ácido propiónico como productos finales. Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo Propionibacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbívoros donde llevan a cabo una fermentación secundaria de los productos de las fermentaciones lácticas primarias. Industrialmente Propionibacterium es importante en la fermentación del queso para producir el tipo suizo: la fermentación propiónica utiliza en este caso el lactato producido en las fermentaciones lácticas primarias produciendo CO2 responsable de los «ojos» del queso suizo y acumulación de ácidos orgánicos de cadena corta responsables de características organolépticas. 2.5.- Fermentación ácido-mixta: La fermentación ácido mixta produce ácido acético, etanol, H2 ,CO2 y proporciones diferentes de ácido láctico o propiónico (fórmico) según las especies. Es un tipo de fermentación que llevan a cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentación se produce ATP además de la reoxidación del NADH+H+. La producción de formiato o CO2 + H2 depende de la presencia en la bacteria de una enzima denominada formiato-liasa responsable del paso. No todas las bacterias la tienen y su actividad es detectable por la producción de grandes cantidades de gas (el H2 es insoluble) como consecuencia de la fermentación del azúcar. 2.6.- Fermentación butanodiólica: es una variante de la anterior presente en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso

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intermedio de la ruta se produce acetoína que puede servir para la identificación de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reacción de Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter. 2.7.- Fermentación del butanol: es un tipo de fermentación llevado a cabo por bacterias anaerobias estrictas del género Clostridium. En el curso de esta fermentación se producen compuestos orgánicos disolventes de gran importancia industrial y que, históricamente, han sido los primeros productos industriales bacterianos de importancia económica relevante durante la 1ª Guerra Mundial (trabajo de Weizmann). 3.- Rutas fermentativas de utilización de aminoácidos En algunas bacterias del género Clostridium se producen procesos acoplados de oxidación de aminoácidos con el objeto de producción de energía. Como en estos procesos no se utiliza ningún aceptor externo de los electrones de la oxidación (el aceptor es el segundo aminoácido de la pareja) técnicamente constituyen procesos de fermentación de aminoácidos en los que se llega a la desaminación y descarboxilación de los aminoácidos que intervienen en la pareja. El ejemplo más representativo es la desaminación y descarboxilación oxidativa de la alanina a acetato acoplada con la desaminación reductiva de la glicina en el proceso conocido como reacción de Stickland. 4.- Conclusión Los procesos de fermentación, en sentido metabólico, son aquellos en los que se produce una oxidación de compuestos orgánicos reducidos siendo el aceptor final de electrones un compuesto orgánico interno que se reduce. En estos procesos puede producirse algún rendimiento energético; pero su principal función es la reoxidación del NADH+H+ a NAD necesario para poder iniciar los primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse por sus productos finales.

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