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supresión del fármaco, ha aumentado el estudio de la función visual en personas que toman este antiepiléptico. Objetivo. Valorar la repercusión ocular de la monoterapia con carbamacepina (CBZ), valproato (VPA) y VGB en niños con epilepsia. Pacientes y métodos. Se realiza un estudio retrospectivo ciego en el que se valoran los efectos adversos visuales mediante campimetría Goldmann y oftalmoscopia directa en 9 niños tratados durante 2,1 años con CBZ, 12 niños tratados durante 3,1 años con VPA y 12 niños tratados durante 2,1 años con VGB, siempre en monoterapia. En estos últimos se valoran también los potenciales evocados visuales (PEV), antes de comenzar el tratamiento y cada 6 meses a lo largo del mismo. Resultados. Un niño tratado con CBZ refirió alteraciones visuales (visión borrosa que desapareció al reducir la dosis), 3 tratados con VGB (diplopía que desapareció espontáneamente en 2 y tras reducir la dosis en 1) y ninguno del grupo tratado con VPA. Todas las campimetrías realizadas fueron normales. Dos de los 12 niños tratados con VGB presentaron disminución de la amplitud en los PEV, con normalización posterior. Conclusiones. Dado que las alteraciones visuales producidas por la VGB parecen ser irreversibles, y en la mayoría de los casos asintomáticas, es recomendable el estudio campimétrico en pacientes que toman VGB, tanto al principio del tratamiento como durante el mismo [REV NEUROL 1999; 28: 741-5]. Palabras clave. Campos visuales. Niños. Vigabatrina.

ções após a supressão do fármaco, aumentaram os estudos da função visual nos doentes medicados com este anti-epiléptico. Objectivo. Avaliar a repercussão ocular da monoterapia com carbamazepina (CBZ), valproato (VPA) e VGB em crianças com epilepsia. Doentes e métodos. Realizou-se um estudo retrospectivo, cego, com campimetria Goldmann e oftalmoscopia directa, avaliando os efeitos adversos visuais em 9 crianças tratadas durante 2,1 anos com CBZ, 12 crianças tratadas durante 3,1 anos com VPA e 12 crianças tratadas durante 2,1 anos com VGB, sempre em monoterapia. Nestes últimos avaliaram-se também os potenciais evocados visuais (PEV), antes de iniciar o tratamento, e cada 6 meses ao longo do mesmo. Resultados. Uma criança tratada com CBZ referiu alterações visuais (visão turva que desapareceu ao reduzir a dose), 3 tratados com VGB (diplopia que desapareceu espontaneamente em 2 e após reduzir a dose em 1) e nenhum do grupo tratado com VPA. Todas as campimetrias realizadas foram normais. Duas das 12 crianças tratadas com VGB apresentaram diminuição da amplitude nos PEV, com normalização posterior. Conclusões. Visto que as alterações visuais produzidas pela VGB parecem ser irreversíveis, e na maioria dos casos assintomáticas, é recomendável o estudo campimétrico em doentes que tomam VGB, tanto no início do tratamento como durante o mesmo [REV NEUROL 1999; 28: 741-5]. Palavras chave. Campos visuais. Crianças. Vigabatrina.

Modelo matemático de la acción dual de la proteína G sobre la corriente de Ca2+ en neuronas identificadas del caracol Helix aspersa J. Pastor-Gómez MATHEMATICAL MODEL OF THE DUAL ACTION OF THE G PROTEIN ON THE Ca 2+ CURRENT IN IDENTIFIED NEURONS OF THE SNAIL HELIX ASPERSA Summary. Introduction. The effect of the dopamine on the calcium current of identified cells of the snail Helix aspersa consists on an initial decrease, followed by a subsequent increase when the drug is removed. It had been previously demonstrated that this effect is mediated by a G protein, supposing that the decrease of the current would be mediated by the Gα subunit, while the increase would be produced by the Gβγ subunit. Objective. A mathematical model has been developed with the object to test if the hypothesis of the dual action of the G protein could explain the experimental results. Material and methods. It has been recording by means of the ‘patch-clamp’ (whole cell) in identified cells of snail. On the other hand, it has been developed a mathematical model of the calcium current using a Hodgkin-Huxley model, and a simulation of the action of the G protein on this current. Results. Adjusting the kinetic parameters of the channel by means of the experimental data, it has reproduced in a faithful way the behavior of the calcium current. The simulation of the action of dopamine reproduces the decrease and increase of the current by means of the serial action of the G protein’s subunits. Conclusion. Although a mathematical model cannot demonstrate the logic necessity of the hypotheses on that is based, it is unequivocally demonstrated that the hypothesis is fully compatible with experimental results [REV NEUROL 1999; 28: 745-51]. Key words. Calcium current. G-protein. Helix aspersa. Mathematical model.

INTRODUCCIÓN Las proteínas que unen GTP, denominadas proteínas G (PG), son moléculas unidas a receptores de neurotransmisores localizadas en la región postsináptica. En estado inactivo, están unidas a una molécula de GDP. La unión de un neurotransmisor –o neuromodulador– al receptor produce la activación de la PG que da lugar a la sustitución del GDP por GTP y a la separación de las subunidades que forman dicha PG, la subunidad alfa (Gα) y la subunidad beta-gamma (Gβγ). La subunidad Gα, unida a la molécula de GTP, Recibido: 04.01.99. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones: 16.01.99. Servicio de Neurofisiología Clínica. Hospital Ramón y Cajal. Madrid, España.

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se unirá al blanco (adenilatociclasa, fosfolipasa C, fosfolipasa A2 o canales iónicos), dando lugar a la respuesta fisiológica [1-3]. Cuando ha transcurrido un cierto tiempo, la subunidad Gα hidrolizará la molécula de GTP, convirtiéndola en GDP y liberando P04H2- inorgánico, con lo que pierde su actividad catalítica, se separa del blanco y se une a la subunidad Gβγ y a la porción intracelular del receptor, para formar nuevamente la molécula de PG inactiva. En general, los mecanismos de actuación de las PG sobre canales de Ca2+, donde actúan disminuyendo la corriente, están Correspondencia: Dr. Jesús Pastor Gómez. Servicio de Neurofisiología Clínica. Hospital Ramón y Cajal. Carretera de Colmenar km 9,100. E-28034 Madrid. E-mail: [email protected]  1999, REVISTA DE NEUROLOGÍA

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mediados por una fosforilación del canal por medio de alguna proteincinasa [4]. Se han descrito en vertebrados [5] y en invertebrados [6] efectos bifásicos de modulación sobre corrientes de Ca2+. Por otro lado, se ha aventurado la hipótesis de que la Gβγ, en respuesta a la aplicación de dopamina (DA), actúa sobre el canal de Ca2+ de alto voltaje de células identificadas del caracol común Helix aspersa, originando una respuesta fisiológica opuesta a la mediada por la subunidad Gα, que consiste en una disminución de la corriente vehiculada por dicho canal [7,8]. Asimismo, en este último caso se ha probado que la doble acción observada sobre la corriente de Ca2+ tras la aplicación de DA está mediada por una PG y que, con toda probabilidad, la actuación de la misma se llevaba a cabo sobre el mismo tipo de canal. Se atribuyó a la subunidad Gα la acción de disminuir la corriente durante la aplicación de DA, mientras que, cuando se retiraba la DA, se observaba un aumento de la corriente que se atribuyó a la acción de la Gβγ sobre el mismo canal. Sin embargo, no se probó definitivamente la hipótesis de la actuación de la Gβγ mediante la inyección intracelular de la subunidad Gβγ para comprobar su efecto sobre la corriente de Ca2+. Con objeto de comprobar si la hipótesis de actuación de ambas subunidades de la PG sobre el canal es compatible con los hechos experimentales, se ha desarrollado un modelo matemático de la PG y la corriente de Ca2+. MATERIALES Registro de células reales de caracol Los experimentos se han realizado sobre neuronas del ganglio parietal derecho de Helix aspersa. Se aisló el anillo ganglionar periesofágico, se inmovilizó por medio de micro-alfileres sobre una placa de Petri con el fondo cubierto de Sylgard y se expuso la superficie dorsal. El sistema de tierra se conectó al baño a través de un puente salino de agar al 4%. Antes de retirar la última capa de tejido conectivo, la región del ganglio que contiene las células [7,8] se retiró por medio de micro-tijeras y se colocó en una solución de medio de cultivo con tripsina 1,5 mg/ml (Tipo III, Sigma). Tras 45-50 minutos, las células se transfirieron a una solución que contenía 1,5 mg/ml de inhibidor de tripsina (tipo I-S, Sigma) en medio de cultivo durante 15 minutos. La células se disociaron posteriormente de forma mecánica por medio de succión con una pipeta de Pasteur pulida a la llama y se colocaron en placas de Petri de plástico (Falcon 3801) en medio de cultivo. Este medio consistió en un 50% de medio Leibovitz L15 (Gibco) más un 50% de solución suplementaria (en mM: NaCl 100, ClK 4, Cl2Ca 11, Cl2Mg 5, glucosa 20, HEPES 20, pH 7.2). Tras permitir a las células la adhesión al sustrato durante 60 minutos, se bañaron en salino normal filtrado de caracol antes de intentar el sello, cuya composición era: (en mM): ClNa 120, ClK 5, Cl2Ca 6, Cl2Mg 3.5, HEPES 10, pH 7.4. Una vez establecida la configuración de whole cell, el experimento entero se realizó en una solución sin Ba2+ utilizada previamente por Yakel [6,9] en células parietales disociadas para aislar este tipo de corriente (en mM): Tris-Cl 90, TEA 30, ClCs 5, Cl2Ba 6, Cl2Mg 3.5, 4-AP 1, 3,4-AP 1, sucrosa 20, HEPES 20, pH 7.2. A pesar de ser Ba2+ el catión empleado, se denominará corriente de Ca2+ a lo largo de todo el artículo, por ser éste el ión fisiológicamente significativo. La DA (Sigma) se disolvió directamente en el baño y se aplicó de manera extracelular. Las pipetas de patch se estiraron a partir de vidrio blando de tubos capilares de hematocrito, cubiertos con cera de abeja con una solución intracelular que contenía (en mM): ClCs 130, TEA 10, Cl2Ca 0.5, Cl2Mg 1, EGTA 5, MgGTP 2, HEPES 20, pH 7.0 para una concentración de Ca2+ libre de 4 x 10-8 M. Las resistencias de los electrodos variaron entre 1 y 4 MΩ y la mayoría de las células se redondearon con diámetros de 50 a 80 mm con neurita muy pequeña o ausencia de la misma por completo. Se empleó un amplificador L/M EPC-7 para patch clamp (List-electronic, Darmstadt-Eberstadt) en la configuración de whole cell [10] con compensación de resistencias en serie entre 80 y 90%. Las corrientes fueron producidas y digitalizadas mediante el empleo de un programa pClamp (Axons Instruments, CA) y la utilización del método de

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Tabla. Constantes cinéticas empleadas en el modelo del efecto de la PG sobre el canal de Ca2+. Parámetro

Valor

Función fisiológica

α1

0,005

Constante de liberación de las subunidades Gα y Gβγ

Constante. Se verá afectada por la PTx

Dependencia

α2

0,1

Constante de unión de la subunidad Gα-ATP al receptor R1

Constante

α3

0,003

Constante de hidrólisis del ATP, separándose la Gα-ADP del R1

Depende de tiempo

α4

0,003

Constante de unión de Gβγ al R2

Constante

α5

0,0025

Constante de unión de la Gα-ADP y Gβγ al receptor de DA

Constante

β1

0,004

Constante de disociación de Gβγ del R2

Constante

sustracción de la corriente de fuga p/4. Para la medición de corriente se han empleado pulsos de 60 ms cada 10 s. Los experimentos se realizaron sobre un microscopio invertido Nikon equipado con modulación óptica Hoffman y perfusión continua a temperatura ambiente con una solución de salino con un flujo de 1-2 ml/min. Modelo matemático Se desarrolló, en lenguaje de programación QuikBasic, un programa que pretende modelar, de forma simple, el sistema celular estudiado. Dicho programa comprende, básicamente, dos partes: 1) modelización de la acción de la PG sobre el canal de calcio, y 2) comportamiento de la corriente de calcio en respuesta a un pulso despolarizante, que se ha simulado siguiendo una adaptación para canal de Ca2+ del modelo de Hodgking-Huxley (HH) [11]. Dicho programa se ha hecho funcionar en un ordenador personal Pentium, 133 MHz. Hipótesis sobre el modelo matemático de acción de la proteína G Se han hecho las siguientes suposiciones acerca del modelo: 1. La DA se aplica sobre la superficie de la membrana celular y, durante ese tiempo, activa de manera dependiente de la dosis una parte de la población total de receptores de DA. La activación de los receptores da lugar, a su vez, a la activación de las PG. 2. La activación de las PG libera dos subunidades: la Gα y la Gβγ, cada una de las cuales se va a unir a una región diferente del canal de Ca2+ (R1 y R2 por ‘receptores’ 1 y 2), comenzando así sus acciones moleculares sobre el mismo. En la figura 1 se muestra un esquema del modelo de la hipótesis. 3. Acción de la subunidad Gα. Esta subunidad se liga a un canal de Ca 2+, disminuyendo la conductancia unitaria del mismo. Su unión al canal (R1) se mantendrá mientras no se hidrolice la molécula de GTP. Esta hidrólisis depende del tiempo. 4. Acción de la subunidad Gβγ. Esta subunidad se liga al mismo canal de Ca2+ (R2). Aumenta la conductancia unitaria del canal. Su ligazón al canal no depende de la hidrólisis de GTP, sino de la cinética de partículas Gβγ libres en el citoplasma. La Gβγ depende de la existencia de partículas Gα-GDP, cuya presencia ‘arrastra’ las partículas Gβγ, para formar PG inactivas, separando de esta manera las subunidades Gβγ del canal. La ecuación general que va a regir la evolución del sistema es: α α α4 α α α1 α α1 α α α2 α α α3 GDP α R2 −Gβγ   →Gβγ   →Gαβγ  →GαGTP  →GαGTP  →GαGDP βγ βγ βγ ββγ← βγ βγ βγ ββγ← αβγ αβγ βγ ββ  α α  α α − R1  α α + Pi + R1 βββββ α α α5 1 α α α5

↑

GαGDP α α

← 

GαGDP α α

↵

Las características de cada una de las constantes se indican en la tabla. Se ha supuesto que la cinética de las transiciones entre los diversos estados

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a

a

b

Ca2+

Ca2+

1 nA 20 ms GDP

GTP GTP

b

Ca2+

c

Ca2+

d

GDP

Pulso (mV)

GDP Pi

Figura 1. Esquema del modelo de actuación de la PG sobre el canal de calcio. a) La DA momentos antes de unirse al receptor de membrana. La PG presenta las subunidades Gα-GDP y Gβγ unidas al receptor de DA. b) La unión de DA al receptor sustituye GDP por GTP y se liberan las subunidades que se unen al canal de Ca 2+ (R1 para la subunidad Gα-GTP y R2 para la G βγ). La acción más intensa de la subunidad Gα reduce la corriente de Ca2+. c) La hidrólisis del GTP libera Pi y separa la G α-GDP del R1, quedando la única acción de la subunidad Gβγ sobre el canal de Ca2+, que consiste en un aumento de la corriente. d) Se libera la subunidad Gβγ del R2, por ‘arrastre’ de la subunidad Gα y se cierra el canal de Ca2+.

de las moléculas implicadas son de orden cero [12], de modo que el cálculo de la evolución temporal de cada una de dichas moléculas se realiza mediante una ecuación diferencial lineal de primer orden, no homogénea. Supongamos que la disociación de una partícula AB se realiza de la siguiente manera [13]: α

AB ←  → A + B β de forma que las ecuaciones cinéticas que rigen las concentraciones de cada uno de los compuestos AB, A y B, en función del tiempo, son:

d [B ] d [A] d [AB ] = [A][B ]β − [AB ]α ; = [AB ]α − [A]β; = [AB ]α − [B ]β dt dt dt En nuestro sistema, casi todos los pasos especificados en el gráfico general son unidireccionales, con lo que estas ecuaciones quedarían modificadas de la siguiente manera:

d [B ] d [A] d [AB ] = [A][B ]α; = [AB ]α; = [AB ]α dt dt dt Modelo matemático de la corriente de calcio En los invertebrados, se puede distinguir entre canales de alto (HVA-ICa) y de bajo umbral (LVA-ICa) en el caso de corrientes de Ca2+ [14]. En este modelo se ha empleado un tipo de canal de Ca2+ similar al tipo L, ya que las características macroscópicas de la corriente [15] se ajustan muy bien a las observadas en los experimentos, aunque no se hayan realizado experimentos farmacológicos para identificar este canal como perteneciente a dicho subtipo. Empleando el modelo de HH, la corriente a través del canal de Ca2+ para un pulso de voltaje mientras se está fijando el potencial –esta técnica es conocida como voltage-clamp y así la llamaremos en este artículo– viene dada como:

I Ca = g Ca mCa hCa ( E − ECa ) 3

siendo –gCa la conductancia máxima del canal (parámetro que va a modificarse por la acción de las subunidades de la PG), mCa la partícula de activación, hCa la de inactivación, E el potencial de membrana y ECa el potencial de equilibrio de Ca2+, que viene dado por la ecuación de Nernst-Planck (E Ca= (RT/ 2F)ln[Ca2+]i/[Ca2+]o).

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Corriente (nA) Figura 2. Comparación entre los resultados obtenidos en células reales y el modelo matemático. a) Corriente de Ca2+ en un célula real en respuesta a un pulso de voltaje (izquierda); obsérvese los transitorios capacitivos al inicio y final del pulso. Simulación de corriente obtenida a partir del modelo en respuesta a un pulso de voltaje (derecha). b) Curva I-V para la corriente de Ca2+ en la célula real (círculos sólidos) y el modelo matemático (cuadrados blancos).

La cinética de la partícula de activación mCa vendrá dada por la siguiente ecuación de primer orden: Ca 1 − mCa ← α→  mCa βCa

de modo que

d [mCa ] = [1 − mCa ]α Ca − [mCa ]β Ca dt La partícula mCa depende del tiempo según la expresión siguiente [16]: ∞ ∞ 0 mCa ( t ) = mCa − ( mCa − mCa )e − t / τm

donde cada una de las variables siguientes, de las que va a depender mCa(t) dependen a su vez del voltaje según estas expresiones: ∞ = mCa

τττm =

α α αCa ( E ) α α αCa ( E ) + βββββCa ( E )

1 α α αCa ( E ) + βββββCa ( E )

donde mCa0 implica las partículas de mCa cuando el tiempo es t= 0 y tm indica la constante de tiempo. La inactivación (hCa) depende de la corriente más que del voltaje, como ocurre con el canal de Na+, y refleja el bloqueo del canal por el Ca2+ acumulado por debajo de la membrana [17]. La cinética del canal, descrito por la ecuación superior [11], requiere que la inactivación hCa dependa de la concentración de Ca2+ según esta expresión:

hCa =

K

K + [Ca ] 2+

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Proteínas G

a

b

1 nA 1 nA

20 ms

10 min

Gα-R1

Gβγ-R2

c

1 nA 20 ms Figura 3. Evolución temporal de las subunidades Gα, Gβγ (unidas a los receptores R1 y R2, respectivamente) y PG según el modelo matemático en respuesta a la aplicación de DA (barra horizontal superior).

que es la ecuación de Michaelis-Menten [13]. No se ha calculado, sin embargo, la difusión espacio-temporal del Ca2+.

1 nA 10 min

RESULTADOS Comportamiento del modelo matemático de la corriente de calcio En la parte izquierda de figura 2a se muestra un ejemplo de la corriente de Ca2+ obtenida a partir de un registro en una célula real. Dado que no se caracterizó ni la conductancia ni las constantes de activación/ inactivación de la misma [7,8], los parámetros del modelo matemático se han elegido de modo que reproduzca, de una manera suficientemente fidedigna, la corriente real. En la parte derecha de la figura 2a se muestra un ejemplo de simulación de corriente. Para determinar los parámetros de activación e inactivación, se han ajustado los parámetros cinéticos y de conductancia comparándolos con las curvas de corriente-voltaje estudiadas. En la figura 2b se muestra la curva I-V para el modelo, comparada con una curva I-V realizada en una célula real. Una vez realizados estos ajustes en los datos empíricos, se ha obtenido un Em= -65 mV y un potencial de reversión de 35 mV lo que concuerda magníficamente bien con los datos experimentales. Por tanto, queda bien establecido que el modelo matemático reproduce muy bien el comportamiento de la corriente de Ca2+ de las células identificadas de Helix aspersa. Simulación del efecto de la DA sobre la corriente de calcio El modelo matemático, con las constantes cinéticas empleadas (Tabla), da lugar a una evolución temporal de las subunidades Gα y Gβγ como la mostrada en la figura 3, en la que puede verse como la aplicación de DA (barra horizontal superior) produce una disminución de la población de PG inactivas, con un aumento inicial de las subunidades Gα-GTP unidas a R1, que alcanzan un valor mayor y más rápidamente que las subunidades Gβγ unidas a R2. No obstante, puede verse como estas últimas se mantienen durante más tiempo activas, en tanto que las primeras, una vez realizada la hidrólisis del GTP, se separan de R1 y disminuye rápidamente su concentración. La estabilidad de este modelo se ha comprobado para diferentes aplicaciones de DA y para diferentes valores de las constantes cinéticas, obteniéndose en todos los casos resultados cualitativamente similares.

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Figura 4. Respuesta de la corriente de Ca2+ a la aplicación de DA en el baño. a) Registro realizado en una célula real. La línea de base no es horizontal por el fenómeno de run-down. b) Registros que muestran la corriente en respuesta al mismo pulso de voltaje durante el control (triángulo), la aplicación de DA (cuadrado) e inmediatamente después de retirada ésta (círculo). c) Simulación mediante el modelo matemático de la respuesta de la corriente de Ca2+ en respuesta a la aplicación de DA (barras horizontales). En el recuadro se muestran corrientes obtenidas a partir del modelo matemático durante el control, la aplicación de DA e inmediatamente después de retirada ésta.

La aplicación de DA directamente en el baño tiene un efecto dual sobre la corriente de Ca2+. En un primer momento, se produce una disminución de la corriente mientras se está aplicando la DA. En segundo lugar, cuando se retira la DA, se observa un aumento de la misma. En la figura 4a se muestran estos efectos en la célula real. La caída de la línea de base se debe a un fenómeno parásito habitual para las corrientes de Ca2+ denominado run-down, cuya explicación aún no está suficientemente aclarada. La disminución de la corriente durante la aplicación de DA en células reales con respecto a la corriente control fue de 38,0 ± 11,6%, mientras que el aumento subsiguiente resultó ser de 8,4 ± 3,5%. Ajustando la conductancia máxima del modelo y las constantes cinéticas, la disminución y aumento, respectivamente, resultaron ser de 38,7 y 8,5%. En la figura 4b se muestran tres registros realizados en la célula real: antes de la aplicación de DA (triángulo), que denota el valor control; durante la aplicación (cuadrado), que muestra una disminución de la corriente, y una vez retirada (círculo), que da lugar a un efecto rebote consistente en un aumento de la corriente. La simulación de la aplicación de DA mediante el modelo matemático reproduce con una gran exactitud cualitativa y cuantitativa los resultados de los experimentos, como puede verse en la figura 4c. Empleando pulsos de voltaje de 50 mV, para obtener una respuesta de corriente máxima, se observa que la aplicación de DA (barras horizontales bajo el trazado) da lugar a una disminución de la corriente de Ca2+ que, de forma casi inmediata, comien-

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aplicación de DA y tras la retirada de ésta) para cada una de las aplicaciones de DA, que muestran la disminución del efecto de la DA sobre la corriente sin modificación de la morfología de la misma, algo que también se puede apreciarse en la célula real [8].

2 nA 20 ms

DISCUSIÓN 1 nA 10 min

Se ha descrito un modelo matemático que reproduce de manera muy adecuada los efectos de la DA sobre la corriente de Ca2+ en células identificadas del caracol Helix aspersa. Dicho modelo utiliza la subunidad Gβγ para aumentar la corriente que atraviesa el canal. Verosimilitud del modelo

Figura 5. Simulación mediante el modelo matemático del efecto de la aplicación de PTx intracelularmente sobre la corriente de Ca2+ durante la aplicación de DA. Se observan tres aplicaciones de DA (barras horizontales) a lo largo de 72 minutos. Las simulaciones de corriente situadas encima de cada aplicación de DA muestran un registro control, durante la aplicación de DA y tras la retirada de la misma.

za a disminuir. Una vez retirada la DA, se produce un ‘rebote’ de la corriente, con un aumento. Estas fases (control, disminución y aumento) pueden verse en el recuadro de la figura 4c. Obviamente, no se ha simulado el fenómeno de run-down, por lo que la línea de base obtenida es constante. En la figura 3 se ha mostrado como la subunidad Gα-R1 aumenta rápidamente tras la aplicación de DA, lo que explica la disminución de la conductancia. Posteriormente y de forma más lenta, aumenta la Gβγ-R2, que inicialmente produce un leve aumento de la corriente manifestado más claramente cuando se retira la DA y la Gα se separa de R1, disminuyendo rápidamente su concentración. Hay que destacar que no se ha medido la dependencia de tiempo para la hidrólisis del GTP asumida por el modelo, por lo que la duración de la acción de la unión de Gα a R1 no se basa en determinaciones reales. Efecto de la PTx sobre la corriente de calcio Se ha descrito [7,8] que intracelularmente la aplicación de la toxina de B. pertussis (PTx), una molécula que bloquea la acción de la PG [6,18], amortigua de forma paralela tanto la disminución de la corriente durante la aplicación de DA como el aumento de rebote tras la retirada de la misma. El modelo debe, por tanto, simular de forma al menos cualitativa el efecto de la PTx sobre la corriente de Ca2+. El lugar de acción de la PTx es directamente sobre la PG, lo que impide la liberación de las subunidades Gα y Gβγ del complejo receptor de DA. El efecto observado se establece de forma paulatina, probablemente por una constante de difusión de la PTx pequeña. Esto supone que la constante de disociación α1 debe ir disminuyendo de forma progresiva. En la figura 5 puede verse una simulación matemática del efecto de la aplicación de PTx sobre la corriente de Ca2+. Utilizando una función lineal que simula la difusión de la PTx con el tiempo, se observa que tanto la disminución de la corriente por efecto de la DA, como el aumento tras la retirada de la misma, van disminuyendo de forma progresiva y paralela, lo que concuerda muy bien con los resultados obtenidos sobre la célula real. Sobre el trazado pueden verse tres registros (control, durante la

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Podría argumentarse que gran parte de las constantes cinéticas empleadas, tanto en la simulación de la acción de la PG, como en el propio canal de Ca2+ no son valores reales. En efecto, no se encuentran en la literatura valores para la cinética molecular de las PG y, aunque hay numerosas comunicaciones sobre diversos canales de Ca2+, no se ha descrito aún la cinética de este canal en concreto. Por tanto, no parece tener mucho sentido utilizar valores hallados para otros canales, o incluso para la cinética de las PG, cuando no van a tener mayor verosimilitud que los empleados aquí, los cuales se han obtenido por medio de la comparación con los datos experimentales, logrando una excelente concordancia con los mismos. Se han observado pequeñas discrepancias entre los resultados obtenidos en células reales y el modelo, como por ejemplo, en la cinética del aumento de la corriente tras la retirada de DA. Esto es lógico si se tiene en cuenta, como se ha mencionado anteriormente, que los valores de las constantes de transición no se han determinado en sistemas biológicos reales, sino que, de manera fenomenológica, se han obtenido por medio de su ajuste a los resultados macroscópicos. No se trataba de encontrar dichos valores para un sistema que no está demostrado en células reales (acción dual de la PG sobre corrientes de calcio), sino de demostrar, cuantitativamente, la adecuación de la hipótesis a los datos experimentales. En este sentido, sorprende que el modelo no sólo tiene un excelente comportamiento cualitativo, sino también desde el punto de vista cuantitativo. Ello permite, sin duda, aventurar hipótesis teóricas acerca del sistema estudiado que, posteriormente, podrían ser contrastadas o refutadas experimentalmente. Mecanismo de actuación de la PG sobre la corriente de calcio En los trabajos originarios [7,8] se ha sugerido que el efecto de la DA se debe, como ya se ha explicado, a una acción seriada de las subunidades Gα y Gβγ sobre el mismo tipo de canal de Ca2+. Existen numerosos modelos celulares en los que la subunidad Gβγ media el acoplamiento entre receptores y diversos sistemas de segundos mensajeros como la fosfolipasa A2 [19], adenilciclasa [20,21], fosfolipasa C [22-25] o canales iónicos [26-28]. No obstante, en la gran mayoría de los casos, la acción de las proteínas G sobre las corrientes de Ca2+ consiste en una disminución [29,30] que puede estar mediada por la subunidad α [31,32] o por la βγ [25,33-35]. Aunque también se ha descrito el aumento de la corriente a través de canales de Ca2+, este efecto no se debe a la acción positiva de PG, sino a la eliminación de una inhibición tónica de la corriente por parte de éstas [5,36]. No obstante, la doble acción de modulación de la PG sobre un canal de Ca2+, disminuyendo y aumentando la corriente, no está absolutamente demostrada a pesar de las evidencias que lo sugieren [7,8]. El empleo de modelos matemáticos para simular el comporta-

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miento de sistemas biológicos está siendo cada vez más utilizado. Se ha empleado esta estrategia en el análisis de la influencia de diversas conductancias en la función celular [37], en la dinámica de fármacos sobre receptores específicos [38,39], en la dinámica intercelular de calcio [40,41], en la cinética de las proteínas G y en su interacción sobre los canales de Ca2+ [30]. En este trabajo se demuestra que, si se asumen las hipótesis planteadas al principio del mismo, puede explicarse la acción de la subunidad Gα disminuyendo la corriente y de la subunidad Gβγ, con lo que se da lugar a un ‘rebote’ consistente en un aumento de la misma. Para concluir, señalaremos que el empleo de modelos matemáticos, incluso aquellos basados en hipótesis fisiológicas (modelo HH) o altamente probables (dinámica molecular simple), no puede demostrar nunca la necesidad lógica de que los sistemas biológicos deban comportarse de una determinada manera [42]. No obstante, sí tiene un alto valor de demarcación para estable-

cer límites al comportamiento del sistema real considerado [43] o como herramienta heurística de contrastación de la hipótesis [42]. En este sentido, si bien un modelo no puede demostrar que el sistema real deba comportarse de una forma determinada, sí excluye hipótesis acerca del funcionamiento de dicho sistema cuando la predicción no concuerda con los resultados reales y los supuestos acerca del modelo son verosímiles. En resumen, aunque no es posible demostrar de forma inequívoca que el mecanismo de acción de la DA sea a través de una nueva acción de la subunidad Gβγ sobre el canal de Ca2+, sí muestra que el resultado experimental es perfectamente compatible con la hipótesis, hasta el punto de que no es posible explicar el efecto experimental dual de la DA sobre la corriente si no se postula una acción de la subunidad Gβγ sobre el canal de Ca2+. Este resultado confiere mayor credibilidad a la hipótesis planteada en trabajos previos [7,8].

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MODELO MATEMÁTICO DE LA ACCIÓN DUAL DE LA PROTEÍNA G SOBRE LA CORRIENTE DE Ca2+ EN NEURONAS IDENTIFICADAS DEL CARACOL HELIX ASPERSA Resumen. Introducción. El efecto de la dopamina sobre la corriente de calcio de células identificadas del caracol Helix aspersa consiste en una disminución inicial seguida por un aumento subsiguiente cuando se retira el fármaco. Previamente se había demostrado que este efecto está mediado por una proteína G, suponiéndose que la disminución de la corriente estaba mediada por la subunidad Gα, mientras que el aumento lo produciría la subunidad Gβγ. Objetivo. Se ha desarrollado un modelo matemático con objeto de comprobar si la hipótesis de la acción dual de la proteína G podría explicar los hallazgos experimentales. Material y métodos. Se registró mediante la técnica de patchclamp, en configuración de whole cell en células identificadas de caracol. Por otro lado, se desarrolló un modelo matemático de la corriente de calcio utilizando el modelo de Hodgkin y Huxley, y una simulación de la acción de la proteína G sobre dicha corriente. Resultados. Ajustando los parámetros cinéticos del canal por medio de los datos experimentales, se ha reproducido de forma fiel el comportamiento de la corriente de calcio. La simulación de la acción de la dopamina sobre dicha corriente reproduce los efectos de disminución y aumento de la corriente debidos a la acción consecutiva de las subunidades de la proteína G. Conclusiones. A pesar de que un modelo matemático no puede demostrar la necesidad lógica de las hipótesis en que se basa, sí se demuestra inequívocamente que la hipótesis es plenamente compatible con los resultados [REV NEUROL 1999; 28: 745-51]. Palabras clave. Corriente de calcio. Helix aspersa. Modelo matemático. Proteínas G.

MODELO MATEMÁTICO DA ACÇÃO DUAL DA PROTEÍNA G SOBRE A CORRENTE DE Ca2+ EM NEURÓNIOS IDENTIFICADOS NO CARACOL HELIX ASPERSA Resumo. Introdução. O efeito da dopamina sobre a corrente de cálcio de células identificadas do caracol Helix aspersa consiste numa diminuição inicial, seguida por um aumento subsequente, quando se retira o fármaco. Já anteriormente se tinha demonstrado que este efeito é mediado por uma proteína G, supondo-se que a diminuição da corrente é mediada pela subunidade Gα, enquanto que o aumento seria produzido pela subunidade Gβγ. Objectivo. Desenvolveu-se um modelo matemático, com o objectivo de comprovar se a hipótese da acção dual da proteína G poderia explicar os achados experimentais. Material e métodos. Registou-se com a técnica de patch-clamp, em configuração de whole cell em células identificadas no caracol. Por outro lado, desenvolveu-se um modelo matemático da corrente de cálcio utilizando o modelo de Hodgkin e Huxley, e uma simulação da acção da proteína G sobre essa corrente. Resultados. Ajustando os parâmetros cinéticos do canal, através dos dados experimentais, reproduziu-se, de forma fiel, o comportamento da corrente de cálcio. A simulação da acção da dopamina sobre essa corrente reproduz os efeitos de diminuição e aumento da corrente devidos à acção consecutiva das subunidades da proteína G. Conclusões. Apesar de que um modelo matemático não é passível de demonstrar a necessidade lógica das hipóteses em que se baseia, pode-se demonstrar inequivocamente que a hipótese é plenamente compatível com os resultados [REV NEUROL 1999; 28: 745-51]. Palavras chave. Corrente de cálcio. Helix aspersa. Modelo matemático. Proteínas G.

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