Emisión:

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1.

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OBJETIVO Estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes, como indicador sanitario en alimentos.

2.

CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar a todas las muestras de alimentos en las cuales se presume que tienen baja contaminación microbiana y a las cuales según reglamento sanitario o a petición del interesado se requiere este análisis.

3.

FUNDAMENTO Los métodos utilizados en la determinación de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua o como indicador de las condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos, se basan en la fermentación de la lactosa. El método de número más probable NMP, es un método estadístico, compuesto por una etapa presuntiva y confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la muestra en medios líquidos, basándose en la combinación de tubos positivos se puede estimar el número de microorganismos presentes por gramo de alimento, con el uso de la tabla estadística aportada por la referencia.

4.

DOCUMENTOS DE REFERENCIAS

4.1

Bacteriological Analytical Manual online. September 2002, actualizado 2013. Capítulo 4 puntos C, D, E y F

5.

TERMINOLOGÍA

5.1

Grupo coliformes: El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 48 hrs.a 35ºC. Este grupo incluye a los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter.

5.2

Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativos aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 24 hrs a 45,5 ± 0,2ºC para análisis de alimentos.

5.3

Escherichia coli: E. coli es una bacteria cuyo hábitat es el intestino del hombre y animales y debido a esto se ha usado como índice de contaminación fecal. Dentro del

DUEÑO DE PROCESO: Jefe Sección Microbiología de Alimentos

ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA

APROBADO: Jefe Subdepartamento Alimentos y Nutrición

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grupo coliformes, es el microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperación se hace de acuerdo a la metodología establecida para la enumeración de coliformes. 6.

REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

REACTIVOS

6.1.1

Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)

6.1.2

Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)

6.1.3

Caldo EC

6.1.4

Agar Levine Eosina Azul de Metileno (LEAM)

6.1.5

Caldo Triptona

6.1.6

Caldo RM-VP

6.1.7

Caldo citrato Koser

6.1.8

Agua de Dilución Buffer Fosfato

6.1.9

Agua Peptonada 0,1%

6.1.10

Reactivo Kovacs

6.1.11

Rectivos solución de  Naftol y solución KOH al 40 %

6.1.12

Reactivos Tinción de Gram

6.1.13

Indicador Rojo de Metilo

6.1.14

Agar TSI

6.1.15

Agar LIA

6.1.16

Agar MIO

6.1.17

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL

6.1.18

Tubos o botellas de dilución, de vidrio borosilicato con tapas herméticas.

6.1.19

Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm-.

6.1.20

Asa de 3 mm de diámetro.

6.2

CEPAS CONTROL

6.2.1

Caldo LST y caldo BVB Control positivo: Escherichia coli ATCC 25922 o 8739 o equivalente. Control negativo: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Proteus vulgaris, Pseudomona aeuroginosa ATCC 27853 o equivalente.

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Caldo EC Control positivo: Escherichia coli ATCC 25922 o 8739 o equivalente. Control negativo: Enterobacter aerogenes

6.3

EQUIPOS

6.3.1

Incubadora a 35º ± 1ºC.

6.3.2

Baño de agua termorregulado a 45,5º ± 0,2º C con agitación y con cubierta.

6.3.3

Sensor de temperatura calibrado a 35 ± 0,5ºC.

7.

DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES

7.1

Muestreo(Si aplica)/Muestra No Aplica.

7.2

Preparación de reactivos (Si aplica) Preparar los medios y reactivos, de acuerdo a la referencia o a las instrucciones del fabricante.

7.3

Preparación de curva de calibración (Si aplica). No aplica

7.4

Preparación de controles (Si aplica).

7.4.1 En cada etapa de incubación incluir cultivos control. Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incluir tubos sin inocular para realizar control de esterilidad de medios de cultivo. Utilizar cepas controles positivos y negativos de acuerdo a punto 6.2 7.5

Preparación de la muestra o etapas previas a realizar la medición

7.5.1 Preparar la muestra y primera dilución (10-1), según IT-712.01-112 punto 3.4 Instructivo Procesamiento muestras para análisis microbiológico 7.6

Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales. (cuando corresponda).

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TEST PRESUNTIVO PARA COLIFORMES

7.6.1 Preparar diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, agitar en Vortex por 7 segundos. Inocular 9 tubos de caldo LST (3 diluciones y 3 tubos por dilución). Dejar descansar el borde de la pipeta contra el tubo y drenar por 2 a 3 segundos. Se puede utilizar caldo lactosado. 3 tubos con 1 mL de la dilución 1:10 3 tubos con 1 mL de la dilución 1:100 3 tubos con 1 mL de la dilución 1:1000 7.6.2 Agitar la gradilla suavemente. El tiempo entre la preparación de la muestra y su inoculación en un medio no debe ser superior a 15 minutos. 7.6.3 Incubar a 35º ± 0,5 ºC por 24 horas, observar formación de gas. Si existen tubos que no presentan formación de gas a las 24 horas, incubar nuevamente hasta completar 48 h y observar la formación de gas, en los tubos de fermentación. 7.6.4 La presencia de gas o efervescencia significa un Test Presuntivo positivo para coliformes y se registra como positivo, cualquiera sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas a las 48 horas significa un Test Presuntivo negativo para coliformes. 7.6.5 Registrar lectura positiva y/o negativa a las 24 y 48 horas, controles positivos y negativos en RG–002.712.02 TEST CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES

7.6.6 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se transfieren a caldo BVB para confirmar coliformes. 7.6.7 Mezclar por agitación el tubo del test presuntivo y transferir un inóculo con un asa de 3 mm. de diámetro, si se ha formado una película en la superficie del medio se debe evitar tomar ésta en el inoculo, a tubos de fermentación conteniendo caldo BVB. Se debe tener la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable. 7.6.8 Incubar los tubos con caldo BVB a 35 ± 0,5 ºC por 48 +/- 2 hrs. 7.6.9 Al término del período de incubación se observa la formación de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo BVB. 7.6.10 La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo BVB significa test confirmativo positivo para coliformes, ausencia de gas constituye un test negativo para coliformes. 7.6.11 Registrar lectura y controles RG–002.712.02.

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METODO CALDO EC PARA PARA COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACIÓN PARA Escherichia

coli

7.6.12 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se transfieren a caldo EC para confirmar coliformes fecales y consecutivamente E. coli. 7.6.13 Mezclar por agitación el tubo del test presuntivo y transferir un inóculo con un asa de 3 mm. de diámetro o con aplicador de madera, a tubos de fermentación conteniendo caldo EC. Se debe tener la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable. 7.6.14 Los tubos con caldo EC se incuban en un baño de agua con cubierta a 45.5 º ± 0,2º C por 24 horas +/- 2 horas, examinar si se produce producción de gas, si la producción de gas es negativa incubar nuevamente hasta completar 48 +/- 2 horas. El nivel de agua del baño debe sobrepasar el nivel de caldo dentro de los tubos. 7.6.15 Al término del período de incubación se observa la formación de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo EC. 7.6.16 La presencia de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo EC significa un test confirmativo positivo para coliformes fecales; la no formación de gas significa test negativo para coliformes fecales. 7.6.17 Registrar lectura positiva y/o negativa a las 24 y 48 horas, controles positivos y negativos en RG–002.712.02. CONFIRMATIVO PARA E.coli

7.6.18 De cada tubo de caldo E.C. que presente formación de gas, transferir un inóculo a una placa de agar LEAM para obtener colonias aisladas. 7.6.19 Incubar las placas invertidas 18 a 24 horas a 35 ± 0,5 ºC. 7.6.20 Al término del período de incubación observar las colonias sospechosas, con centro oscuro con o sin brillo metálico en el caso de usar Agar LEAM.

7.6.21 Registrar lectura en RG–002.712.02. 7.6.22 De cada placa de agar transferir 5 colonias aisladas a un tubo de agar nutritivo o agar standard, incubar por 18 a 24 horas a 35 ± 0,5 ºC para realizar pruebas: morfológicas mediante Tinción de Gram según IT-700.00-005 y bioquímica utilizando las reacciones IMViC (Indol, Rojo Metilo, Vogues Prokauer y Citrato). Repetir la inoculación en caldo

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LST para confirmar la producción de gas. Alternativamente se puede realizar un API 20 E o VITEK. Si una de las 5 colonias es identificada como positiva para E. coli, se considera el tubo EC como positivo y no es necesario realizar pruebas a la demás colonias. INTERPRETACIÓN 7.6.23 Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de 48 hrs a

35ºC, aparezcan como bacilos Gram negativos no esporulados y cuyo test IMVIC sea + + - - (biotipo 1) o - + - - (biotipo 2), son considerados E. coli. 7.7

Cálculo de resultados

7.7.1

La combinación de tubos positivos y/o negativos en los tests confirmativos en caldo BVB y caldo EC para el cálculo de coliformes fecales y Escherichia coli respectivamente, es referida a la Tabla Nº 2 (BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1). Registrar en RG–002.712.02.

7.7.2

Por cada lote de muestras procesadas o si el lote de muestras es mayor a 10, realizar una muestra en duplicado. Ingresar los resultados en la carpeta compartida para el cálculo de precisión y evaluar si se ajusta al criterio de precisión calculado por el laboratorio.

Tabla Nº 1: Ejemplos de determinación de NMP en series de 3 tubos Cantidad Muestra (g. o ml. ) Ejemplo Lectura 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 a 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3 2 0 b 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3 2 0 c 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0 1 0 d 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3 2 2 e 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3 3 3 Número de tubos positivos / Número de tubos inoculados

NMP 930 9300 30 2100 110000

7.8 7.8.1 7.8.2

Aseguramiento de la calidad del ensayo Participación periódica en ensayos de intercomparación. Verificar que los resultados se encuentran dentro del criterio de precisión establecido por el laboratorio, analizando una muestra en duplicado por cada lote o por cada 10 muestras ingresadas.

7.9 7.9.1

Expresión de los resultados. Expresar como NMP de coliformes/g o mL de muestra y NMP de Escherichia coli / g o mL de muestra.

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Si en lugar de las porciones de muestra 0,1-0,01-0,001, se utiliza 0,01-0,001-0,0001, se lee el resultado de la tabla y se multiplica por 10. Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla de NMP y multiplicar por 10, 100, 1000, etc. Según las porciones de muestra consideradas.

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Tabla Nº 2. Para serie de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g. NMP por gramo con un 95% de confianza. (BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1) Tubos Positivos NMP Lim. Conf. Tubos Positivos Lim. Conf. NMP/g /g 0.1 0.01 0.001 Bajo Alto 0.1 0.01 0.001 Bajo Alto 0 0 0 1100 420 --

8.

CONTROL DE REGISTROS

IDENTIFICACION

RESPONSABLE

RG–002.712.02 (EX-712.02-072) Registro de resultados análisis Encargado de de coliformes, E. laboratorio coli y Salmonella en muestras de alimentos

TIEMPO

ALMACENAMIENTO LUGAR MEDIO RESPONSABLE/ SOPORTE RECUPERACION

1 años

DISPOSICION

Lab ensayos microbiológicos de alimentos y aguas.. Archivador

Trasladar a bodega Depto SA hasta completar 5 años

Bodega Dpto Salud Ambiental en cajas indicando Sección-año y teléfono

Basura doméstica

Papel 4 años

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CONTROL DE CAMBIOS VERSION

FECHA

PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADOS

9

15-05-2014

Formato

9

15-05-2014

4.1

Cambio de formato de PRT-712.02-004 a ME-712.02004 Se actualiza referencia

9

15-05-2014

5.2

Se complementa más la definición

9

15-05-2014

6.2.1 6.2.2

Se incluyen cepas control

9

10 10

10.

RESUMEN DE MODIFICACIONES

Se complementa redacción de los puntos 7.6.1, 7.6.2, 7.6.5, 7.6.9, 7.6.11, 7.6.15, 7.6.17, 7.6.21, 7.7.1, 7.7.2. Se incorpora rango de temperaturas de incubación en 15-05-2014 7 7.6. 3, 8, 19, 22. Se cambia PRT-712.02-002 por IT712.00-112. Se modifica redacción. Se eliminan registros RG-712.00-004, -006 y -009. Se cambia IT712.00-066 por IT-700.00-005 10-12-2014 Nombre Se incluye basado en BAM on line Se establece el registro de lectura a las 24 y 48 horas 10-12-2014 7.6.5 y 7.6.17 en etapa presuntiva y confirmativa

CUADRO DE RESPONSABILIDADES

Responsabilidades con la ejecución del Método Ejecuta el método

Técnico de laboratorio y Encargado de Laboratorio

11.

ANEXOS No Aplica

Elabora el informe de resultados

Aprueba el informe de resultados

Jefe Sección

Jefe Subdepto. Alimentos y Nutrición