RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

NMX-F-336-S-1979. HUEVO. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EGG. DETERMINATION OF CHOLESTEROL. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS. PREFACIO En la elaboración de esta Norma participaron los siguientes Organismos: Panificadora Bimbo, S.A. Secretaría de Salubridad y Asistencia. Dirección General de Control de Alimentos, Bebidas y Medicamentos. Dirección General de Laboratorios en Salud Pública. Alimentos Deshidratados, S.A. Dehidro, S.A. 1.

OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

La presente Norma Mexicana establece el método de prueba para la determinación de colesterol en huevo. 2.

REFERENCIA

Para la correcta aplicación de esta Norma, debe consultarse la siguiente Norma Mexicana: NMX-B-231 Requisitos de las cribas para la clasificación de materiales. 3.

FUNDAMENTO

El presente método se basa en la separación de la materia insaponificable del huevo y la posterior determinación de colesterol en ella. 4.

REACTIVOS Y MATERIALES

4.1

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico, a menos que se indique lo contrario, cuando se mencione agua, debe entenderse agua destilada. 4.1.1 Reactivos para la separación de materia insaponificable a) b) c)

Solución concentrada de hidróxido de potasio.- Disolver 60 g de hidróxido de potasio (KOH) en 40 ml de agua. Solución diluida de hidróxido de potasio.- Disolver 10 g de hidróxido de potasio (KOH) en un litro de agua. Éter.- (Libre de peróxido).- Probar inmediatamente antes de usar.

d)

e) f)

Éter seco.- Inmediatamente antes de usar agitar el éter libre de peróxido con cloruro de calcio (CaCl2) anhidro en cantidad igual al 10% del volumen del éter, y filtrar. Sulfato de sodio anhidro.- Deberá pasar por una criba con una abertura de malla de 0.250 mm. Ácido clorhídrico (HCl) 1:4

4.1.2 Reactivos insaponificable

para

la

determinación

de

colesterol

en

la

materia

a)

Hielo.- Tener disponibles aproximadamente 11 litros de hielo picado para cuatro determinaciones.

b)

Agua de Bromo.- Determinar la masa con una aproximación de 0.1 g de un matraz de 25 ml, de boca angosta, conteniendo 5 ml de tetracloruro de carbono (CCl4). Añadir 0.6 ml de agua de bromo mediante una pipeta graduada de un ml. Determinar la masa nuevamente, y diluir con tetracloruro de carbono (CCl4) hasta una concentración final calculada de 0.22 + 0.02g Br/ml. Usar este reactivo dentro de las siguientes 48 horas después de la preparación.

c)

Solución de ácido acético.- Pipetear 200 ml de ácido acético dentro de un matraz volumétrico de 250 ml; diluir con agua y mezclar cuidadosamente, aforar con agua y mezclar de nuevo.

d)

Asbestos.- Digerir los asbestos, variedad anfibol en ácido clorhídrico (HCl) 1:3 durante 2 a 3 días. Lavar hasta dejar libre de ácido, digerir durante un período similar con hidróxido de sodio (NaOH) al 10%, y tratar durante pocas horas con solución caliente alcalina de tartrato (disolver 173 g de tartrato de sodio tetrahidratado (sal de Rechelle) y 50 g de hidróxido de sodio (NaOH), en agua, diluir a 500 ml, dejar reposar 2 días, y filtrar a través de asbestos preparados). Lavar los asbestos con agua hasta estar libres de alcali; digerir varias horas con ácido nítrico (HNO3) 1:3, y después que los lavados ésten libre de ácido, agitar con agua hasta que quede una pulpa fina.

e)

Arena.- Tamizar la arena limpia a través de una criba con una abertura de malla de 0.250 mm y tratarla con ácido clorhídrico caliente hasta que los extractos estén prácticamente incoloros. Lavar, secar y calcinar.

f)

Solución de hipoclorito de sodio.- Disolver 88 g de hidróxido de sodio en 200 ml de agua dentro de un matraz de boca ancha de 3 litros. Adicionar aproximadamente 1.5 litros de hielo picado y burbujear cloro hasta que se hayan absorbido 71 g; diluir hasta 2 litros y conservar en frascos color ámbar dentro de un refrigerador. (La solución deberá ser alcalina a la fenolftaleína). Antes de usarse, comprobar la concentración del cloro disponible como sigue: Pipetear 5 ml dentro de un matraz conteniendo una solución de 2 g de yoduro de potasio (KI) disueltos en 100 ml de agua, añadir 5 ml de ácido clorhídrico (HCl) 6 N, y titular con solución 0.1 N de tiosulfato de sodio (Na2S2O3). La solución deberá ser equivalente en cloro disponible a 0.95 - 1.05 N de hipoclorito de sodio grado reactivo o compuesto, al 5%, comprobada su concentración como se indica arriba, también es satisfactoria.

g)

Solución de formato de sodio.- Preparar una solución acuosa que contenga 0.5 g de formato de sodio (Na-CHO2) por ml.

h)

Acido clorhídrico.- Aproximadamente 6 N; mezclar 520 ml de ácido clorhídrico con agua y diluir hasta un litro.

i)

Indicador Rojo de Metilo.- Disolver 0.5 g de Rojo de Metilo en 50 ml de alcohol, diluir hasta 100 ml con agua y filtrar. Ya que la solución deberá quedar libre de materia insoluble volver a filtrar inmediatamente antes de usarla si se hace necesario.

j)

Solución de yoduro de potasio.- Al 20% (la solución debe ser incolora cuando se acidifique con ácido clorhídrico).

k)

Solución de almidón.- Solución al 1% de almidón soluble.

l)

Solución de tiosulfato de sodio.- 0.02 N. Preparar diariamente diluyendo la solución 0.1 N.

m)

Solución de hidróxido de potasio.- Disolver 10 g de hidróxido de potasio en 10 ml de agua.

n)

Solución de molibdato de amonio.- Disolver 5 g de molibdato de amonio (NH4)6 Mo7O24. 4H2O en 100 ml de agua.

4.2

Materiales

a) Equipo común de laboratorio 5.

APARATOS E INSTRUMENTOS

5.1

Aparatos e instrumentos para la separación de materia insaponificable

a)

Embudos de separación..- Uno de 250 ml y otro de 500 ml. Lavarlos para que queden libres de grasa. No deberá escapar el éter cuando se lubrique únicamente con agua. Matraz Kitasato de 300 ml de capacidad. Balanza analítica, con un grado de precisión de ± 0.1 g.

b) c)

5.2 Aparatos e instrumentos para la determinación de colesterol en la materia insaponificable: a) b) c)

Baño de hielo.- Recipiente con una capacidad para unos cuatro litros, de 10-15 cm de profundidad, lleno con hielo picado. Pipetas Mohr.- Una graduada en divisiones de 0.01 ml y otra cosa graduada en divisiones de 0.1 ml. Matraz para filtración al vacío.- De 300 ml y provisto con una llave de doble paso para controlar el vacío.

d)

Dispositivo para filtración a 0 0C (Fig.1).- Tubo de filtración de Knorr, del tipo tubo de extracción, de unos 20 mm de diámetro exterior, aproximadamente de 10 cm de largo, provisto con un disco removible al fondo del tubo más grande, el material del dispositivo puede ser vidrio, porcelana, metal monel o de níquel perforado que ajuste estrechamente. (Puede usarse un filtro de vidrio de porosidad gruesa).

Remover el vástago en el punto de unión de un embudo de vidrio de 600, de 11 cm de diámetro. Ensanchar la abertura resultante hasta aproximadamente un cm de diámetro, moliendo o frotando el vidrio. Recortar un cm del extremo angosto de un tapón de hule mono - horadado de una medida que ajuste adecuadamente en la abertura del embudo. Pasar el vástago de tubo de filtración de Knorr a través del tapón en el punto de unión del embudo y después a través del tapón en el matraz para filtración al vacío. Preparar el colchón de asbesto, (4.1.2 (d)), de 6.8 mm de espesor dentro del tubo de filtración de Knorr y cubrir con una capa de arena de unos 12 mm de espesor, (4.1.2(e)). 6.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, determinar la masa de 2.5 g de huevo entero, 1.5 g de yema, un g de huevo entero deshidratado ó 0.7 g de yema seca, según el caso y agregar 10 ml de la solución de hidróxido de potasio concentrado. 7.

PROCEDIMIENTO

7.1

Separación de materia insaponificable

7.1.1 Cubrir el matraz conteniendo la muestra con un vidrio de reloj pequeño. Calentar 3 horas en un baño maría y agitar ocasionalmente para desintegrar cualquier grumo. 7.1.2 Enfriar hasta unos 40 0C, agregar 30 ml de alcohol y agitar con una varilla de vidrio hasta que toda la materia insoluble este finamente dispersa. 7.1.3 Agregar 50 ml de éter, mezclar completamente con una varilla de vidrio y transferir a un embudo de separación de 500 ml. 7.1.4 Lavar el matraz con 2 alícuotas adicionales de 50 ml de éter, mezclando completamente la solución de éter con una varilla de vidrio. 7.1.5 Lavar el matraz de saponificación con 100 ml de la solución diluida de hidróxido de potasio, verter la solución lentamente dentro del embudo de separación, mientras se agita ligeramente el líquido y continuar la agitación suave durante 10-15 segundos. 7.1.6 Dejar que el líquido se separe (aproximadamente 10 minutos) y lentamente drenar la solución de jabón dentro de un embudo de separación de 250 ml, pero no drenar cualquier emulsión o materia insoluble en la interfase.

FIGURA 1.- DISPOSITIVO PARA FILTRACION A 0C° 7.1.7 Enjuagar las paredes del embudo de separación de 500 ml con 10 ml de la solución de hidróxido de potasio diluida y drenar esto dentro de un embudo de separación más pequeño. 7.1.8 Agregar 50 ml de éter al embudo de separación más pequeño y agitar vigorosamente. Después de que los líquidos se separen descartar la capa inferior. 7.1.9 Añadir la capa de éter al embudo de separación grande, enjuagando el embudo de separación de 250 ml con 10 ml de éter. 7.1.10 Lavar la solución etérea como en 7.1.5 con 100 ml de solución diluida de hidróxido de potasio, reteniendo cualquier materia insoluble o emulsión en el embudo de separación.

7.1.11 Agregar 20 ml de HCl (1:4) a la solución etérea, agitar, añadir 100 ml de agua y agitar de nuevo. Descartar los lavados ácidos. 7.1.12 Lavar la solución etérea como en 7.1.5 con dos alícuotas de 100 ml cada una de la solución de hidróxido de potasio diluida. Probar la porción de los últimos lavados para saber si contiene jabón acidificado con ácido clorhídrico (HCl) 1:4 (los lavados acidificados deberán ser claros o débilmente turbios). 7.1.12.1 Si es necesario, repetir los lavados con la solución de hidróxido de potasio diluido hasta que los lavados ácidos estén claros. 7.1.13 Lavar la solución etérea por agitaciones sucesivas con 50 ml de agua, conteniendo 0.5 ml de HCl 0.1 N y dos alícuotas adicionales de 50 ml de agua. 7.1.14 Drenar tanta agua como sea posible sin pérdida de la solución de éter. 7.1.15 Filtrar la solución etérea dentro de un matraz Kitasato seco de 300 ml a través de una capa de 15 g de Na2SO4 sobre un filtro de vidrio molido, sin usar succión para los primeros ml y succionar suavemente para la solución sobrante. 7.1.16 Lavar el embudo de separación y el filtro sucesivamente con 10, 5, 5 y 5 ml de éter. 7.1.17 Lavar el tallo del filtro con éter, agregar astillas de porcelana al matraz y evaporar el éter en baño maría. 7.1.18 Disolver al residuo en 20 ml de éter seco, transferir esta solución etérea sin interrupción a través de un embudo de tallo corto a un matraz Erlenmeyer de 50 ml conteniendo astillas de porcelana y lavar con 10, 5 y 5 ml de éter seco. 7.1.19 La materia insaponificable aproximada puede ser determinada colectando las soluciones etéreas en matraces previamente secados y tarados como sigue: 7.1.19.1 Secar el matraz conteniendo astillas y otro similar como contrapeso durante una hora a 100° – 105°C. 7.1.19.2 Removerlos del horno y colocarlos cerca de la balanza durante 30 minutos; determinar la masa del matraz usando el contrapeso. 7.1.19.3 Evaporar el éter en baño maría. 7.1.19.4 Secar el matraz con una toalla limpia y determinar la masa nuevamente con el contrapeso como se indica en el inciso 7.1.19.1. 7.1.20 De la materia insaponificable determinada, deducir el blanco obtenido de los reactivos usados en determinaciones similares. 7.2

Determinación de colesterol

7.2.1 Empacar en hielo la solución de bromo y una probeta graduada de 25 ml. Cubrir con hielo alrededor de los tubos de filtración, teniendo cuidado que el hielo no penetre en ellos. 7.2.2 Enfriar la solución de ácido acético a aproximadamente 5°C en una mezcla de hielo y NaCl. 7.2.3 Lavar las paredes de los matraces Erlenmeyer de 50 ml conteniendo la materia insaponificable, dándoles movimientos de rotación con 2.0 ml de éter absoluto vertido con una pipeta Mohr; tapar con corcho, revolver hasta que las astillas de porcelana ya no se adhieran a las paredes de los matraces, y empacar los matraces en un baño de hielo cubriéndolos hasta el cuello durante no menos de 10 minutos. 7.2.4 A uno de los matraces agregar con pipeta Mohr, 0.20 ml de la solución de bromo enfriada, mezclar revolviendo, taparlo y regresarlo al baño de hielo. Iniciar este procedimiento con intervalos de 3 minutos con respecto a los otros matraces (se pueden hacer hasta 4 determinaciones simultáneas si se tienen matraces Kitasatos disponibles). 7.2.5 Después de 10 minutos, agregar rápidamente 15 ml de ácido acético de la probeta enfriada de 25 ml, agitar 3 minutos mientras se mantiene en un baño de hielo - agua y volver a colocar en el baño de hielo 10 minutos. 7.2.6 Operando la succión, verter toda la mezcla ayudándose con un agitador de vidrio dentro del tubo de filtración, dejando el agitador dentro de este tubo. 7.2.7 Lavar las paredes del matraz con 5 ml de ácido acético frío y regresar al baño de hielo. 7.2.8 Cuando el nivel del líquido en el tubo de filtración pase totalmente la superficie de la capa de arena, agregar ácido acético del matraz. Repetir lavando de igual manera con 5 ml de la solución de ácido acético, enfriada y aspirar el exceso de líquido del tubo de filtración. 7.2.9 Lavar el matraz y el filtro con agua fría, llenando el tubo de filtración aproximadamente 3 veces. 7.2.10 Vaciar el matraz completamente y aplicar succión al tubo de filtración hasta que cesen de caer las gotas de agua del vástago. Quitar el empaque de hielo que esta alrededor del tubo de filtración y descartar el líquido filtrado y los lavados. 7.2.11 Colocar un matraz Kitasato de 300 ml debajo del tubo de filtración de tal manera que el tallo quede bien adentro del cuello del matraz. 7.2.12 Lavar el tubo de filtración y filtrar con 10 ml de alcohol; 10, 5 y 5 porciones de éter y finalmente con 10 ml de alcohol agitar suavemente la arena con cada porción del solvente y dejar reposar la mezcla aproximadamente un minuto antes de aplicar la succión.

7.2.13 Lavar el tallo del tubo de filtración con pocos ml de éter, agregar un ml de la solución de hidróxido de potasio, mezclar y lavar las paredes del matraz con 5ml de éter. 7.2.14 Evaporar el éter y alcohol completamente en el baño maría y finalmente con una corriente de aire limpio remover los últimos vapores de alcohol. 7.2.15 Agregar 40 ml de agua caliente al líquido residual alcalino, mezclar y neutralizar el álcali con HCl 6 N, usando una gota de rojo de metilo (esta neutralización puede ser únicamente aproximada). 7.2.16 Agregar 10 g de NaC1, 3 g de fosfato ácido de sodio (NaH2 PO4 . H2O) y 20 ml de la solución de NaOCl (hipoclorito de sodio) 7.2.17 Llevar la solución hasta una ebullición vigorosa, remover de la fuente de calentamiento y agregar inmediatamente, con cuidado 5 ml de solución NaCHO2 (formato de sodio). 7.2.18 Enfriar y diluir hasta aproximadamente 150 ml con agua. Adicionar 5 ml de la solución de KI, una o dos gotas de molibdato de amonio 25 ml de HCl 6 N. 7.2.19 Titular rápidamente de una sola vez, con la solución de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) usando solución de almidón como indicador. 7.1.19.1 Corregir el resultado de la titulación con un blanco de los reactivos, empezando en el punto donde la solución de KOH es agregada a la solución de alcohol éter. 8.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS

El número de mg de colesterol presentes en la muestra se calcula por la siguiente fórmula. mg de colesterol = 0.55 + 0.688 x N Donde: N=

ml de Na2S2O3

9.

REPETIBILIDAD

9.1

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones duplicadas (resultados obtenidos simultáneamente o en rápida sucesión por el mismo analista) no debe exceder de ± 2.5 %.

10.

BIBLIOGRAFÍA

a)

William Horwitz, Editor Oficial Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C.) 12 th Edition. Published by the Association of Official Analytical Chemists. Washington, D.C. 1975. Parts 17.017, 17.018, 17.019. pp. 295-296.

APÉNDICE A

0.02 N usados en la titulación.

A.1 La presente Norma coincide con el método del A.O.A.C. (véase 10) Cholesterol - Official Final Action. A.2 Las Normas NMX que se mencionan en esta Norma, corresponden a las Normas DGN vigentes de la misma letra y número. Fecha de aprobación y publicación: Agosto 29, 1979.