EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS

ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá D.C., Colombia Julio 18 de 2008

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS

ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C. Julio 18 de 2008

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS

ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

APROBADO

_____________________________ María Eugenia Torres Microbióloga Industrial Director

___________________________ Alberto Gómez Mejía Doctoris Scientiae Juridicae Codirector

______________________________ Prof. Miguel Pinzón Asesor Estadístico

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS

ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

APROBADO

______________________________

________________________________

Ingrid Schuler. Phd Decana Académica Facultad de Ciencias

Janeth Arias Palacios M.Sc. Directora de Carrera Microbiología Industrial

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DEDICATORIA

Durante estos años ha habido momentos inolvidables, para alegrarse, para entristecerse pero sobre todo para sentirse orgulloso de haber terminado un camino bastante largo. Cuando ya estoy a unas pocas semanas de graduarme, es que me doy cuenta de tantos momentos que tal vez, pasaron desapercibidos, y ahora llegan como buenos recuerdos. Muchísima gente involucrada en estos años han hecho que este tiempo no fuera una lucha sino más bien, como una aventura. A todos ellos….Muchas Gracias. Dedico esta página a mis padres: Eduardo y Elizabeth, mis hermanos: Eli, Caro y Jorge, mi novio Héctor, a Dios, Ecopetrol y amigos, a los que me han enseñado que tenemos algo muy importante para ofrecernos unos a otros y a todos aquellos que han logrado pasar toda la clase de experiencias, mirando el miedo cara a cara, con fuerza, valor y confianza, para con orgullo decir: “ He sobrevivido una vez más, y estoy en capacidad de manejar lo que venga ”. Jenny Lisseth Vergara González Dedico este trabajo a todas las personas que me acompañaron en el transcurso de mi vida, en especial, a mi papá, mí mamá, mis hermanas (Martha y Liliana), mi tía Libia por apoyarme en los momentos en que mas los necesite, ayudarme y aconsejarme en los momentos más duros. Aquellas personas que me soportaron durante estos años, a quienes con regaños y un poco de afán por verme crecer como persona supieron comprenderme y aquellos que tal vez no me vieron como la mejor pero siempre con un pensamiento de que podría serlo. A todos ellos Gracias. Andrea Jimena Lizcano Ramón

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AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Jardín Botánico de Bogotá D.C José Celestino Mutis por facilitarnos materiales y equipos para el desarrollo de este trabajo. Al equipo de trabajo de las instalaciones de Subdirección Científica por su colaboración, paciencia y dedicación para la culminación de nuestro trabajo de grado. A la Microbióloga Industrial María Eugenia Torres por sus consejos y por compartir desinteresadamente sus amplios conocimientos y experiencia. A Freddy Alejandro Ramos por transmitirnos sus conocimientos y darnos seguridad Al Dr. Alberto Gómez Mejía por su confianza y apoyo incondicional A Héctor Lancheros por su contribución a la realización de este estudio aportándonos su orientación estadística en la elaboración y discusión de nuestro trabajo de grado. Al profesor Miguel Pinzón por su compromiso y conocimientos estadísticos

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LISTA DE ABREVIATURAS

PDA (Agar papa dextrosa) DCM (Diclorometano) EX1 (Extracto etanólico hojas de Valeriana pilosa) EX2 (Extracto etanólico hojas de Hesperomeles ferruginea) EX3 (Extracto etanólico hojas de Myrcianthes rhopaloides) EX4 (Extracto etanólico hojas de Passiflora manicata) CDC (Centro para el Control y Prevención de Enfermedades) FR1 (Fase acuosa de Extracto hojas Passiflora manicata) FR2 (Fase diclorometano de Extracto hojas Passiflora manicata) FR3 (Fase alcohol isoamílico de Extracto hojas Passiflora manicata) AE1 (Aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides) C+

(Control positivo)

C-

(Control Negativo)

Cm (Cloramfenicol) gl

(Grados de libertad)

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TABLA DE CONTENIDO Pág 1. INTRODUCCIÓN 2. MARCO TEÓRICO 2.1 GENERALIDADES METABOLITOS SECUNDARIOS 2.1.1 Antecedentes de los metabolitos secundarios de origen vegetal 2.1.2 Importancia de los metabolitos secundarios 2.1.3 Metabolito secundario 2.1.4 Metabolismo secundario 2.2 EXTRACTOS 2.2.1 Consistencia de los extractos 2.2.1.1 Extractos blandos 2.2.1.2 Extractos firmes o de consistencia pilular 2.2.1.3 Extractos secos 2.2.1.4 Extractos fluidos 2.2.2 Características de los extractos 2.2.3 Conservación de los extractos 2.3 METODOS 2.3.1 Métodos de extracción 2.4 MOLÉCULAS ACTIVAS EN EL ÁMBITO MEDICINAL E INDUSTRIAL 2.4.1 Los Alcoholes 2.4.2 Los Fenoles 2.4.3 Cumarinas 2.4.4 Alcaloides 2.4.5 Los Aldehídos 2.4.6 Los Terpenoides 2.4.7 Flavonas 2.4.8 Los Isoflavonoides 2.4.9 Los Alcaloides

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2.4.10 Quinonas 2.4.11 Tanoides o Taninos 2.4.12 Los aceites esenciales 2.4.13 Saponinas 2.4.14 Esteroides y Triterpenos 2.4.15 Cromenos y Benzofuranos 2.4.16 Sesquiterpenlactonas 2.5 ESPECIES VEGETALES 2.5.1 Valeriana pilosa 2.5.1.1 Características generales 2.5.1.1.1 Descripción 2.5.1.1.2 Distribución geográfica 2.5.1.1.3 Fitoquímica 2.5.1.1.4 Usos 2.5.2 Myrcianthes rhopaloides 2.5.2.1 Características generales de la especie 2.5.2.1.1 Descripción 2.5.2.1.2 Distribución Geográfica 2.5.2.1.3 Propagación tradicional: 2.5.2.1.4 Cosecha 2.5.2.1.5 Usos 2.5.2.1.6 Bromatología y Aporte Nutricional 2.5.2.1.7 Fitoquímica 2.5.3 Passiflora manicata 2.5.3.1 Características generales de las especies 2.5.3.1.1 Descripción 2.5.3.1.2 Distribución geográfica 2.5.3.1.3 Usos 2.5.4 Hesperomeles ferruginea 2.5.4.1 Características generales de las especies

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2.5.4.1.1 Descripción 2.5.4.1.2 Distribución geográfica 2.5.4.1.3 Usos 2.5.4.1.4 Fitogeografía y ecología 2.5.4.1.5 Fitoquímica 2.6 MICROORGANISMOS SELECCIONADOS 2.6.1 Hongo fitopatógeno 2.6.1.1 Alternaria sp. 2.6.2 Microorganismos patógenos 2.6.2.1 Candida albicans 2.6.2.2 Staphylococcus aureus 2.6.2.3 Escherichia coli 2.6.2.4 Bacillus subtillis 2.7 ANTIMICROBIANOS 2.7.1 CLORAMFENICOL 2.7.1.1 Origen 2.7.1.2 Mecanismos de acción del cloramfenicol 2.7.1.3 Mecanismos de resistencia bacteriana al cloramfenicol 2.7.1.4 Constitución química 2.7.1.5 Propiedades 2.7.2 GRISEOFULVINA 2.8 MÉTODOS DE EVALUACIÓN ANTIMICROBIANA 2.8.1 Método de difusión en gel 2.8.2 Método de dilución 2.8.3 Método de Bioautografia 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Formulación del problema 3.2 Justificación de la Investigación 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo General

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4.2 Objetivos Específicos 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 LOCALIZACIÒN 5.2 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS 5.3 TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL 5.4 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS 5.4.1 Extracto Etanólico 5.4.2 Aceite Esencial 5.5 MICROORGANISMOS 5.5.1 Cepas 5.5.2 Aislamiento de las cepas 5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS 5.6.1 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana 5.6.1.1 Técnica de difusión de disco en Agar 5.6.1.1.1 Bacterias 5.6.1.1.2 Levadura 5.6.1.1.2.1 Evaluación antifúngica 5.6.1.1.3 Hongo 5.6.2 Ensayo biodirijido 5.7 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN 5.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7. CONCLUSIONES 8. RECOMENDACIONES 9. BIBLIOGRAFANEXOS

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ÍNDICE DE GRÁFICAS Gráfica 1. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para S. aureus. Gráfica 2. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para E. coli. Gráfica 3. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para B. subtillis. Gráfica 4. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para C. albicans. Gráfica 5. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para Alternaria sp Gráfica 6. Diámetro de halos de inhibición Vs. Microorganismos seleccionados para las diferentes fases. Gráfica 7. Halos de inhibición Vs. Fracciones para cada microorganismo Gráfica 8. Halos de inhibición Vs Microorganismos seleccionados frente al aceite esencial de M. rhopaloides

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INDICE DE FIGURAS Figura 1. Valeriana pilosa Figura 2. Myrcianthes rhopaloides Figura 3. Passiflora manicata Figura 4. Hesperomeles ferruginea Figura 5. Características Macro y Microscópicas de Alternaria sp Figura 6. Características Macro y Microscópicas de Candida albicans. Figura 7. Características Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus Figura 8. Características Macro y Microscópicas de Escherichia coli Figura 9. Características Macro y Microscópicas de Bacillus subtillis Figura 10. Rotavapor Heidolph LABOROTA 4000-EFFICIENT Figura 11. Proceso para la obtención de extractos a partir del material vegetal Figura 12. Montaje Hidrodestilación hojas de Myrcianthes rhopaloides Figura 13. Fraccionamiento hojas de Passiflora manicata Figura 14. Fase diclorometano (DCM) de extracto hojas Passiflora manicata Figura 15. Fase Acuosa - Fase Alcohol Isoamílico de extracto hojas de Passiflora manicata Figura 16. Proceso para la obtención de fracciones a partir del material vegetal Figura 17. Ensayos biológicos con extractos vegetales EX1 (Valeriana pilosa), EX2 (Hesperomeles ferruginea), EX3 (Myrcianthes rhopaloides), EX4 (Passiflora manicata), C+ (Control positivo), C- (Control Negativo) frente a microorganismos patógenos y fitopatógenos A. Escherichia coli, B. Candida albicans, C. Staphylococcus aureus, D. Bacillus subtillis, E. Alternaria sp. Figura 18. Ensayo biológico de las fracciones (FR1: Fase acuosa, FR2: Fase Diclorometano, FR3: Alcohol isoamilico) del extracto de Passiflora manicata frente a E. coli Figura 19. Ensayo biológico del aceite esencial del extracto de M. rhopaloides frente A. B. subtillis y B. C. albicans

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INDICE TABLAS

Tabla 1. Análisis bromatológicos proximales para M. rhopaloides (contenido/100g de pulpa) Tabla 2. Peso en gramos del material vegetal a extraer. Tabla 3. Especies, Parte a estudiar y Extractos a evaluar Tabla 4. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para S. aureus. Tabla 5. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para E. coli. Tabla 6. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para B. subtillis. Tabla 7. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para C.albicans. Tabla 8. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rophaloides y Passiflora manicata para Alternaria sp.. Tabla 9. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos seleccionados Tabla 11. Prueba de comparación de medias de Tukey para extractos Tabla 12. Análisis de varianza para S. aureus Tabla 13. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus Tabla 14. Análisis de varianza para E. coli Tabla 15. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli

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Tabla 16. Análisis de varianza para B. subtillis Tabla 17. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis Tabla 18. Análisis de varianza para Candida albicans. Tabla 19. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans Tabla 20. Análisis de varianza para Alternaria sp. Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp. Tabla 22. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para E. coli. Tabla 23. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para S. aureus. Tabla 24. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para B. subtillis. Tabla 25. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Candida albicans. Tabla 26. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar y de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Alternaria sp. Tabla 27. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores Tabla 28. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos seleccionados Tabla 29. Prueba de comparación de medias de Tukey para fracciones. Tabla 30. Análisis de varianza para S. aureus con las diferentes fracciones Tabla 31. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus Tabla 32. Análisis de varianza para E. coli Tabla 33. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli Tabla 34. Análisis de varianza para B. subtillis Tabla 35. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis Tabla 36. Análisis de varianza para Candida albicans. Tabla 37. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans Tabla 38. Análisis de varianza para Alternaria sp. Tabla 39. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.

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Tabla 40. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para B. subtillis. Tabla 41. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para S. aureus. Tabla 42. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para E. coli. Tabla 43. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Alternaria sp. Tabla 44. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Candida albicans. Tabla 45. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores Tabla 46. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos seleccionados con respecto al aceite esencial.

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INDICE DE ANEXOS

ANEXO 1

PREPARACIÓN AGAR MUELLER HINTON

ANEXO 2

PREPARACIÓN AGAR CHROMOCULT

ANEXO 3

PREPARACIÓN AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

ANEXO 4

PREPARACIÓN AGAR BAIRD PARKER

ANEXO 5

PREPARACIÓN DE AGAR BPLS (Verde brillante, Rojo de fenol,

Lactosa y Sacarosa)

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RESUMEN El presente trabajo se realizó en los laboratorios de las

instalaciones de la

Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis, con el fin de observar y determinar el efecto antimicrobiano de extractos etanólicos vegetales

y aceite esencial obtenidos a partir de 4 especies Valeriana pilosa,

Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata priorizadas dentro del proyecto de Uso Sostenible del Distrito Capital y la región frente a microorganismos patógenos

Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus

aureus, Candida albicans y un hongo fitopatógeno Alternaria sp, cepas adquiridas de la Pontificia Universidad Javeriana. Para la obtención de los extractos etanólicos se utilizó el material vegetal seco previamente triturado, el cual fue macerado en frio utilizando como solvente etanol durante 48 horas, se realizó

reflujo con etanol-agua(9:1) para su posterior

concentración a presión reducida. Para obtener aceite esencial a partir de las hojas de Myrcianthes rhopaloides se utilizó la técnica de hidrodestilación. Luego de obtener los extractos a evaluar se midió la actividad antimicrobiana utilizando la técnica de difusión de disco en agar de Kirby-Bauer, prueba que permitió medir la suceptibilidad In Vitro de los microorganismos patógenos y fitopatógenos seleccionados frente a sustancias de origen natural con potencial antimicrobiano, utilizando 300 μg de

extracto obtenido por especie vegetal,

utilizando de igual manera como control positivo 10 μg de cloramfenicol y agua estéril como control negativo. Al analizar los resultados de los diferentes ensayos se observó que el extracto etanólico de Passiflora manicata presentó mayor actividad antimicrobiana frente a E. coli, Candida albicans y B. subtillis, razón por la cual se seleccionó para fraccionar el extracto crudo utilizando como solventes diclorometano, agua y alcohol isoamílico, xviii

demostrando que la fase acuosa fue la de mayor efecto inhibitorio frente a todos los microorganismos evaluados. Los resultados obtenidos para el aceite esencial obtenido con las hojas de Myrcianthes rhopaloides mostraron inhibición solo frente a Candida albicans. En este trabajo se concluyó que Passiflora manicata fue el extracto etanólico que presentó mayor acción frente a todos los microorganismos, permitiendo realizar el fraccionamiento con los diferentes solventes identificando a la fase acuosa como la responsable del principio activo con potencial antimicrobiano; cabe anotar que para dar continuidad a futuras investigaciones entorno a la potencialidad antimicrobiana de la especies es necesario el aislamiento y la elucidación de la molécula capaz de inhibir a los microorganismo seleccionados.

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ABSTRACT The present work was performed in the Laboratories of the Scientific Subdirection of Botanical Garden of Bogotá José Celestino Mutis, in order to observe and determine the antimicrobial effect of ethanolic plant extracts and essential oil, obtained from 4 species Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rophaloides and Passiflora manicata chosen for the Sostenible Use project of the Capital District and the Region. These species were tested against the pathogen microorganisms Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans and the phythopathogen fungus Alternaria sp, which were acquired from the storage of the Pontificia Universidad Javeriana. For the obtainment of the ethanolic extracts we used dried plant material that was previously crushed; this was cold macerated using ethanol as a solvent during 48 hours. We used reflux ethanol-water (9:1) in order to concentrate it in a reduced pressure. For the obtainment of the essential oil from the leaves of Myrcianthes rophaloides we used the hydrodistillation technique. After, we measured the antimicrobial activity using the difussion disc agar technique of Kirby-Bauer. This technique allows us to measure the In vitro oversensitivity of the pathogen and phytophatogen microorganisms, to the natural origin substances which have antimicrobian potential. We took 300 μg of each extract, using 10 μg of cloramfenicol as a postive control and water as a negative control. As a result of the different tests, we observed that the ethanolic extract of Passiflora manicata had a better antimicrobial activity against E.coli, Candida albicans and B. subtillis. For this reason we chose the extract of Passiflora manicata and divided it using dichloromethane, water and isoamilic alcohol as solvents. We found that the

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aqueous phase showed the highest antimicrobial effect against all the evaluated microorganisms. The results for the essential oil which was obtained from the leaves of Myrcianthes rophaloides showed that Candida albicans was inhibited the most. In this work we concluded that Passiflora manicata was the ethanolic extract that showed the best results against all the microorganisms, permiting the division with the different solvents. We identified that the aqueous phase was responsible for all of the principle actions because there was the antimicrobial potential. In order to continue fututre investigations about antimicrobial potential of plant species it is necessary to find and isolate the specific molecule able to inhibit the microorganism chosen.

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1. INTRODUCCIÓN Se puede afirmar que el uso de las plantas medicinales nació con el hombre. Desde tiempos prehistóricos hasta comienzos del siglo XIX se utilizaron por ensayo error, aquellos extractos que brindaban curar enfermedades. Esta práctica médica pasaba y se perfeccionaba de generación en generación, por lo cual se denominó medicina tradicional. Hasta el siglo XVIII se conocieron las propiedades curativas de las plantas, su efecto sobre el organismo y su modo de aplicación, desconociendo en muchas de los casos la composición y caracterización de principios activos. Con el desarrollo de las teorías de la evolución, herencia genética, el uso del microscopio y el nacimiento de ciencias como la fitoquímica, fue posible el reconocimiento y el aislamiento de principios activos de muchas especies vegetales. La gran mayoría de los principios activos se han obtenido sintéticamente en laboratorios, para su posterior uso en la preparación de medicamentos químicos. Con el paso de los años el consumo de medicamentos sintéticos se incrementó, desplazando cada vez más el uso directo de plantas medicinales alejándose así de la medicina tradicional. Desde tiempos muy remotos las plantas han cumplido un papel importante en el área terapéutica gracias a las múltiples propiedades que ellas poseen. Por esta razón en las últimas décadas ha ido tomando cada día mayor importancia su estudio y el desarrollo de técnicas analíticas que permitan la determinación e identificación de las sustancias o principios activos contenidos en especies vegetales. En la actualidad, el gran desafío para los países ricos en biodiversidad es poder vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte del aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en beneficio de la sociedad.

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Colombia cuenta con un extenso banco de germoplasma, rico en moléculas activas de gran interés para la industria farmacéutica y

dada la gran disminución de

disponibilidad, uso y aprovechamiento de especies vegetales que se encuentran en ecosistemas de Distrito Capital y la región, para entidades como el Jardín Botánico José Celestino Mutis (JBJCM) como centro de investigación y desarrolló científico en cumplimiento de sus objetivos misionales, contribuye con la generación del conocimiento en cuanto al uso y el aprovechamiento de especies vegetales promisorias presentes en los ecosistemas del Distrito Capital y la región. Con base en lo anterior en aras de buscar alternativas de aprovechamiento y conocer la presencia de principios activos en especies como Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata,

priorizadas como

potenciales dentro del proyecto de “ Uso Sostenible de los recursos vegetales del Distrito Capital y la regióni”, se planteó evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos o aceites esenciales obtenidos a partir de las especies, frente a microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp utilizando la técnica de susceptibilidad microbiana., para determinar cual de los extractos presenta mayor actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados.

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2. MARCO TEÓRICO 2.1 GENERALIDADES METABOLITOS SECUNDARIOS 2.1.1 Antecedentes de los metabolitos secundarios de origen vegetal Aproximadamente hasta el año 1800, apenas se había progresado en el campo de la Fitoquímicaii. Solo se conocían unas cuantas sustancias como el azúcar de caña, almidón, alcanfor y ácido benzoico, debido a que su preparación era sumamente sencilla. Mezclas complejas como grasas, aceites, esencias, breas y resinas, se habían utilizado y elaborado, aunque prácticamente no se sabía nada acerca de su composición. Los primeros investigadores en el campo de la Fitoquímica no llegaron a apreciar la extrema complejidad de las materias con que realizaban sus investigaciones y carecieron casi por completo de las técnicas necesarias para conseguir un proceso auténtico. Se quemaron grandes cantidades de plantas para obtener cenizas y esos primitivos investigadores se desanimaron al encontrar diferencias mínimas entre las cenizas de una planta venenosa y otra inocua. La expresión, la extracción acuosa y la evaporación se habían empleado tiempo atrás en la obtención de azúcar a partir de la caña de azúcar. El farmacéutico francés Nicolás Lémery (1645-1715) extendió el empleo de los procesos de extracción y utilizó el alcohol como disolvente (Torres C, 2004). Robert Boyle (1627-1691) abandonó la antigua teoría de Aristóteles de que la materia está compuesta de cuatro elementos y aunque jamás llegó a aislar ningún alcaloide es evidente que iba bien encaminado cuando trató el opio con carbonato potásico y alcohol (Torres C, 2004). En 1747 se aisló la sacarosa de muchas plantas, entre ellas de la remolacha, por el farmacéutico alemán A.S. Marggraf (1707-1780). K. W. scheele (1742-1786), obtuvo un gran éxito en el campo de la Fitoquímica, al aislar los ácidos cítrico, gálico, málico, oxálico, tartárico y prúsicoiii (Torres C, 2004).

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En el siglo XIX, los progresos alcanzan mayor rapidez. En 1803 se aísla el primer alcaloide, la narcotina, y le siguieron rápidamente muchos otros, como morfina, estricnina, emetina. Entre 1813 y1823, Chevreul dilucidó la naturaleza química de las grasas y los aceites fijos (Torres C, 2004). Hasta mediados del siglo XX, el principal empeño, en cuanto a la química de los productos naturales, siguió siendo el aislamiento y determinación de la estructura de una amplia gama de compuestos. Resulta claro que se habían establecido los principales tipos estructurales encontrados comúnmente en las plantas. A partir de entonces, la atención de los químicos respecto a los productos naturales fue virando hacia la disolución de las rutas biosintéticas halladas en la planta (Torres C, 2004). 2.1.2 Importancia de los metabolitos secundarios A lo largo de la historia, los metabolitos secundarios de las plantas han sido utilizados por la humanidad convirtiéndose en una fuente inagotable de compuestos químicos y complejas sustancias activas, que desde hace muchos años han sido explotadas por el hombre (Torres C, 2004). Así mismo es importante destacar que a pesar de todos los esfuerzos de naciones, instituciones gubernamentales y no gubernamentales e investigadores en aumentar el nivel y el caudal de conocimientos adquiridos sobre las trasformación secundaria (de frutos, flores,

metodologías de

semillas, hojas y tallos) y de la

identificación y caracterización de los metabolitos secundarios de especies vegetales priorizadas, en la actualidad sólo unos pocos metabolitos se utilizan de forma industrial, por lo que se ha creado la necesidad de generar opciones y alternativas de producción enfocadas al

uso sostenible de todos aquellos recursos vegetales

disponible en el entorno trabajando activamente en la detección y caracterización de sustancias producidas por diferentes especies promisorias

que pueden tener

aplicación en la industria (cosmética, farmacéutica, textilera y agroalimentaria) (Torres C, 2004).

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2.1.3 Metabolito secundario Son todas aquellas moléculas activas generadas por diversas especies vegetales. Los metabolitos son moléculas que no son necesarias para el crecimiento y la reproducción de las plantas, pero cumplen con roles muy importantes en el reino vegetal, pueden suponer una ventaja competitiva considerable (Torres C, 2004). 2.1.4 Metabolismo secundario El metabolismo secundario compromete aquellos procesos químicos que son únicos para una planta dada y no son universales. Dicho metabolismo es la química que conduce a la formación de un producto natural. Algunas porciones de esta química son comunes para un número de plantas diferentes o familias de plantas, pero actualmente la química de los metabolitos secundarios es usualmente diferente de una planta a otra, pues precursores químicos comunes pueden conducir a resultados totalmente diferentes (Torres C, 2004). 2.2 EXTRACTOS VEGETALES Los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido por tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados, tales como agua, etanol o éter, de elementos solubles, constituidos por una mezcla de principios activos y sustancias inertes que se producen de la totalidad o de partes de una planta fresca o seca (Ruiz & Susunaga, 2000). 2.2.1 Consistencia de los extractos Alzate en 1990, descubrió la consistencia ideal que debían tener los extractos. De acuerdo con este aspecto comúnmente los extractos se clasifican en cuatro grupos: blandos, firmes, secos y fluidos (Barreto J, 1997).

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2.2.1.1 Extractos blandos Tienen la consistencia de la miel espesa; algunas veces, debido a la absorción de la humedad atmosférica, presentan una consistencia menos densa (Barreto J, 1997). 2.2.1.2 Extractos firmes o de consistencia pilular Como su nombre lo indica deben tener una estrecha semejanza con la masa con la cual se fabrican o manufacturan las píldoras; deben tener la característica especial de no adherirse a los dedos (Barreto J, 1997). 2.2.1.3 Extractos secos Anteriorrmente se les conocía con la denominación de “sales esenciales”. Son los extractos en los cuales el disolvente ha sido casi completamente eliminado. Contiene tan solo del 5 al 8% de agua. Se reducen fácilmente a polvo y facilitan su manipulación y dosificación. La forma farmacéutica de extractos secos aparece en varias farmacopeas (Belga, Norteamericana, noruega y mexicana), pero no indican un método exacto para la preparación de este tipo de extractos. Golaz (1973) les dio el nombre de extractos unitarios y los recomienda para la preparación de tinturas y jarabe (Barreto J, 1997). 2.2.1.4 Extractos fluidos Son preparados en una forma tal que el peso del extracto corresponde exactamente al peso de la sustancia empleada como medicamento, desecada al aire y pulverizada (Barreto J, 1997).

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2.2.2 Características de los extractos Estudios realizados por Corpas y Barrero entre 1988 y 1991, permitieron fundamentar las siguientes características específicas de los extractos: a. Los extractos bien preparados son de color más o menos oscuros; cuando han sido preparados al vacío, son ligeramente más claros. b. Algunos son de color café amarillento, otros rojizos; los extractos provenientes de hojas son verdosos debido a la clorofila. c. Su aspecto debe ser liso, fino y homogéneo. d. Su olor y sabor son propiedades características de la materia prima que les ha dado su origen. Cuando son mal preparados, adquieren olor a caramelo o confitura poco conocida. e. La solubilidad de los extractos es variable y está en relación directa con el tipo de preparación al cual fueron sometidos. f. Los extractos acuosos son completamente solubles en agua y producen una solución transparente, algunas veces ligeramente turbia, debido a que han sido preparados con mucha anterioridad. g. Los extractos alcohólicos son parcialmente solubles en agua y algunas veces son totalmente insolubles, especialmente los extractos que han sido preparados con alcohol fuerte tienen un excelente índice de disolución, en el mismo título alcoholimétrico del alcohol con el cual han sido preparados. h. Los extractos alcohólicos preparados con hojas, dan soluciones coloreadas de verde, pues la eliminación de la clorofila no puede ser total. Cordell (1995) propuso ensayos generales para someter a los extractos a pruebas específicas

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para observar su calidad

y composición final. Estos trabajos fueron

remontados por Corpas, quien propuso realizar ensayos de identidad a los extractos obtenidos (Barreto J, 1997). 2.2.3 Conservación de los extractos Labfarve (1995) determinó las alteraciones y los diferentes métodos de conservación de los extractos. Los extractos son medicamentos en donde la alteración modifica y varia notoriamente la naturaleza del producto. En principio, un extracto seco o de tipo pilular se conserva mejor que un extracto acuoso. Esto no es totalmente exacto, pues la naturaleza del producto interviene igualmente. Algunos extractos se descomponen al aire, otros absorben humedad atmosférica. Algunos se recubren de hongos y permiten el desarrollo de gérmenes bacterianos. Por otra parte, las alteraciones más frecuentes consisten en modificaciones químicas no aparentes como sucede con los extractos de flores verdes que por la oxidación de la clorofila pierden su color. Los extractos a base de alcaloides, bajan de título, según lo demuestran las investigaciones de Fricotel y Métin (1970). Esta disminución del título alcalóidico, es especialmente sensible a los extractos blandos y de aspecto pilular y bastante menos notorio en los extractos secos (Barreto J, 1997). Según Corpas y Barriga (1993), la conservación de los extractos es indispensable y deben cumplir las siguientes condiciones: a. Se deben conservar protegiéndolos de la luz. b. Los envases deben estar bien tapados. c. Se deben conservar en un medio ambiente seco (Barreto J, 1997). Desde luego, son numerosos los métodos que se han indicado para la conservación de los extractos. Para mayor comodidad ellos se pueden clasificar, en dos categorías (Barreto J, 1997).

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En el primer grupo tenemos aquellos a los cuales no se les ha adicionado ninguna materia extraña. Al segundo grupo, por el contrario, pertenecen aquellos extractos que han sido objeto de la adición de productos extraños, de naturaleza físico-química definida (Barreto J, 1997). 2.3 METODOS DE EXTRACCIÓN Deben obedecer a la información de la naturaleza química de las sustancias, presentes en la planta y al propósito de la investigación. En el caso de búsqueda de sustancias para la comprobación de actividad biológica, la extracción del material vegetal debe hacerse en agua o con solución disotónica (0.9 % NaCl). Frecuentemente se usa la extracción con solventes orgánicos de bajo punto de ebullición (alcohol, acetato de etilo) y de baja reactividad. Algunas veces es conveniente desengrasar el material vegetal con éter de petróleo (extracto etéreo) o hexano. El alcohol es generalmente mas eficaz para recuperar la mayoría de los metabolitos secundarios. Los extractos son evaporados bajo presión reducida o liofilizados, en el caso de extracción con agua (Arévalo A, 1996). Los métodos de extracción se basan en las diferentes solubilidades de los diversos compuestos encontrados en el material vegetal, así , para sustancias de baja polaridad ( lípidos) se utilizan como solventes el éter de petróleo y cloroformo; para sustancias de mediana y alta polaridad el acetato de etilo, el etanol y la acetona . Las extracciones pueden hacerse por “extracción continua en soxhlet”, en la cual el material seco se sitúa en una cámara central y el solvente se hace evaporar en caliente, en un recipiente inferior, el vapor del solvente asciende al condensador y gotea sobre el material vegetal. Por “reflujo”, el material vegetal y el solvente se colocan en un balón el cual tiene acoplado un refrigerante, se calienta, el solvente evaporado se condensa y vuelve a mezclarse con el material vegetal. Y por “maceración en frío “, el material se mezcla con el solvente triturado continuamente en frío (Arévalo A, 1996). xxx

2.4 MOLÉCULAS ACTIVAS EN EL ÁMBITO MEDICINAL E INDUSTRIAL No todos los componentes químicos elaborados por la planta, poseen igual interés para la Fitoquímica. Los denominados principios activos son frecuentemente alcaloides o heterósidos; ambos merecen por ello especial atención. Otros grupos, como los glúcidos, grasas y proteínas, tienen importancia dietética y muchos, como los almidones y las gomas, se emplean en técnica farmacéutica, aunque carecen de señalada acción farmacológica. Otras sustancias como el oxalato cálcico, sílice, lignina y materiales colorantes, pueden ser materias primas coadyuvantes en diferentes procesos en la industria (Torres C, 2004). 2.4.1 Los Alcoholes: Los alcoholes libres no están generalmente presentes más que en forma de trazas en las plantas vivas. Son esterificados y combinados bajo la forma de heterósidos. Se encuentran sobre todo en los aceites esenciales. El olor de ciertos alcoholes les da gran aplicación en la perfumería o como aromatizante (Carey, 2003). Los alcoholes alifáticos son tensoactivos e hipotensores1. Todos los alcoholes son tóxicos en grado diverso. Los alcoholes de las plantas umbelíferas, tienen una toxicidad muy elevada (Carey, 2003). 2.4.2 Los Fenoles: Entre los fenoles encontrados en estado libre, se encuentran constituyentes importantes de las esencias como el timol, el carbacrol (esencias de tomillo), el eugenol y el chavicol. Muchos de los fenoles están en estado de éter oxidado en las esencias, entre ellos citaremos el estragol, la miristicina, el apiol y el atenol (Carey, 2003). Los fenoles tienen una actividad fisiológica marcada porque poseen propiedades antisépticas. Hidroquinol, timol (este último también antihelmíntico), eugenol (igualmente anestésico local), el apiol es emenagogo, el anetol es carminativo2 y 1 2

Fitoterapia que actúa a nivel de los vasos sanguíneos.

Dícese de los agentes que previenen la formación de gases en el tubo digestivo o provocan la expulsión de los mismos

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antidiarreico

a

pequeñas

dosis

y

veneno

del

SNC

a

altas

dosis.

El

3

tetrahidrocannabinol es alucinógeno. Los polifenoles del helecho son antihelmínticos (Carey, 2003). Son los compuestos más simples y consisten en un anillo fenólico sustituido. Algunos ejemplos los constituyen el catecol, el pirogalol y los ácidos cinámicos y cafeico. Plantas productoras de compuestos de estas características son el tomillo, la manzanilla y la gayuba, cuyo principio activo, la arbutina, ha sido utilizado a lo largo de los años en el tratamiento de la infección urinaria (Domingo D., 2003). El mecanismo parece estar relacionado con la inhibición enzimática por los compuestos oxidados, posiblemente mediante reacciones de grupos sulfihidrilo o por interacciones no específicas con proteínas (Domingo D., 2003). 2.4.3 Cumarinas: Son compuestos derivados de la benzo-α-pirona, como la cumarina, la esculetina, la umbeliferona y la escopoletina. Están presentes en las margaritas y tienen propiedades antiinflamatorias, antitrombóticas y vasodilatadoras. Parece que su mecanismo de acción antimicrobiano es mediante interacción con el ADN eucariota, lo que explica también su actividad antiviral (Domingo D., 2003). 2.4.4 Alcaloides: Reciben esta denominación los compuestos nitrogenados heterocíclicos. Pertenecen a este grupo, entre otros, sustancias como la morfina, la heroína y la cocaína. El mecanismo de acción de los alcaloides parece ser mediante intercalación entre la pared celular y el DNA del microorganismo (Domingo D., 2003). 2.4.5 Los Aldehídos: Son derivados de los alcoholes primarios por deshidrogenación. Muchos aldehídos son aromatizantes como la vainilla y el citral. Así mismo este

3

El tetrahidrocannabinol (THC) es uno de los compuestos activos de la marihuana que está siendo objeto de un gran número de estudios debido a las propiedades beneficiosas que puede ejercer sobre algunas patologías.

xxxii

grupo fitoquímico tienen propiedades antisépticas. La vainilla por ejemplo tienen efectos coleréticos (Carey, 2003). 2.4.6 Los Terpenoides: Son compuestos a menudo no saturados formados por carbono, hidrógeno y oxígeno de estructura no aromática y que se encuentran sobre todo en los aceites esenciales y en las resinas (Carey, 2003). Muchas de las plantas, deben a sus compuestos terpénicos de las esencias, sus propiedades aromáticas. Pero estas sustancias, poseen también propiedades farmacodinámicas muy variadas en relación con las diferentes funciones ligadas a su esqueleto terpénico. Algunas, son irritantes de la piel y de las mucosas, utilizándose como rubefacientes4 (pineno en la esencia de trementina). Los azulenos tienen propiedades antinflamatorias. El geraniol, cineol y linalol

tienen propiedades

antisépticas. El ascaridol, tiene propiedades vermífugas. La tuyona tiene propiedades abortivas y estupefacientes. Las cucurbitáceas, poseen propiedades tóxicas y necrosantes. El ácido glicirricético tiene propiedades antinflamatorias (Torres C, 2004). 2.4.7 Flavonas: Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo carbonilo. Constituyen la familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente a los microorganismos probablemente se debe a que forman complejos con las proteínas solubles y extracelulares y con las células de la pared bacteriana, de forma similar a las quinonas. Mención especial merecen las catequinas, presentes en el té verde, las cuales ejercen actividad frente a Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans, Shigella y otros microorganismos. Otros flavonoides tienen en general actividad antiviral. 2.4.8 Los Isoflavonoides: Actúan como efectivas fitoalexinas, las cuales pueden ser definidas como compuestos antimicrobianos de pequeño peso molecular o 4

Rubefaciente se refiere a la sustancia que produce un enrojecimiento en la piel debido al flujo de la sangre de los vasos capilares.

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metabolitos de estrés biológico. Ellos pueden ser constitutivos o también ser inducidos por ataque biológico o heridas. Los constituyentes varían entre especies, y también varían dependiendo la edad y el ambiente en el que se encuentra la planta. Estos flavonoides inhiben la germinación de esporas de hongos y causan daño a los sistemas de membrana. El recubrimiento de algunas semillas y algunas resinas de árboles son particularmente ricas en flavonoides antimicrobianos. Esta cita e información se debe incluir. 2.4.9 Los Alcaloides: Estos compuestos constituyen

con los heterósidos y los

antibióticos la mayor parte de los principios activos de las plantas medicinales. Son sustancias de origen biológico y sobre todo de origen vegetal, ya que en el reino animal se encuentran raramente representadas. Los alcaloides contienen siempre carbono, hidrógeno,

nitrógeno y oxígeno. Excepcionalmente algunos alcaloides

contienen azufre (Torres C, 2004). 2.4.10 Quinonas: Las quinonas son anillos aromáticos con dos funciones ceto. Son ubicuas en la naturaleza y causantes del color marrón que se produce en las frutas cuando son dañadas. Poseen una alta reactividad, formando complejos con los aminoácidos hidrofílicos de las proteínas, la mayoría de las veces inactivando la proteína y anulando su función. Debido a esto, el potencial antimicrobiano de este grupo es amplio (Domingo D., 2003). 2.4.11 Tanoides o Taninos: Son sustancias de origen vegetal, no nitrogenadas de estructura polifenólica, solubles en agua, alcohol y acetona. Estas sustancias son de sabor astringente y tienen la propiedad común de curtir la piel, haciéndola imputrescible e impermeable al fijarse sobre sus proteínas (Domingo D., 2003). El término tanino se empleó para denominar ciertas sustancias presentes en extractos vegetales capaces de combinarse con proteínas de la piel animal, evitando su putrefacción y convirtiéndola en cuero. Constituyen un grupo de sustancias fenólicas

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poliméricas y se pueden dividir en hidrolizables y condensados, en función de que puedan o no ser hidrolizados. Se han descrito más de 30 taninos que pueden inhibir hongos y bacterias (Domingo D., 2003). 2.4.12 Los aceites esenciales: Estos productos llamados comúnmente esencias son sustancias olorosas volátiles contenidas en los vegetales. Su volatilidad les diferencia de los aceites fijos que producen de los lípidos. Son particularmente abundantes en las Coníferas, Rutáceas, Umbelíferas, Mirtáceas y Labiadas (Torres C, 2004). Son compuestos causantes del agradable olor de determinadas plantas y algunos con poder antimicrobiano, como el mentol obtenido de la menta (Menta piperita) y la capsaicina de la planta conocida como el pimiento rojo o chile (Capsicumm annum). (Domingo D., 2003). 2.4.13 Saponinas: son los compenentes principales de varios extractos de plantas, tienen actividad antiprotozoaria. Las saponinas se unen al colesterol y otros esteroles de la membrana celular de los protozoos causando su inestabilidad, lisis y muerte celular (Calsamiglia S, 2005). 2.4.14 Esteroides y Triterpenos: Los compuestos esteroidales pueden interferir determinados procesos de síntesis vitales en la célula bacteriana y los triterpenos, por su parte, pueden actuar siguiendo diversos mecanismos en dependencia de su naturaleza química: los de naturaleza hidrocarbúrica, por ejemplo, tienen generalmente acción depresora sobre la tensión superficial lo cual, cuando tiene lugar en el entorno de la célula bacteriana, altera la selectividad de la membrana citoplasmática para el intercambio de sustancias. Los triterpenos de naturaleza alcohólica pueden alterar la naturaleza coloidal del protoplasma de la célula provocando su muerte (Pelczar M., 1992).

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2.4.15 Cromenos y Benzofuranos: Los cromenos y benzofuranos son productos naturales que se han encontrado en algunas especies de Rutaceae, Liliaceae, ciperaceae y principalmente en ciertas tribus de las Asteraceae, entre las cuales parece ser exclusivos de las Asterreae, Eupatorieae, Heliantheae, Inulaeae y Senecioneae (Scherriber, K., 1963). Estos compuestos se encuentran presentes generalmente en hojas y tallos, y menos comúnmente en raíces habiéndose encontrado en los primeros hasta un 5% sobre el peso seco (Scherriber, K., 1963). Muchos cromenos y benzofuranos han mostrado ser biológicamente activos como el toxol y la dehidrotrementona que son bacteriostáticos; la tremetona, la dehidrotremetona y la hidroxitremetona son tóxicos a los peces; el toxol y el angelato de toxilo exhiben una debil actividad antitumor contra la leucemia linfocitica P-388; el encecalin, el 7-hidroxiencalin y la 6- metaoxieuparina son fototóxicos a varios hongos y bacterías; el encecalin también ha mostrado acción insecticida; así mismo los precocenos I y II actuan como hormonas antijuveniles en los insectos (Scherriber, K., 1963). 2.4.16 Sesquiterpenlactonas: derivadas biogenéticamente de los sesquiterpenos, son una clase de productos naturales distribuidos menos ampliamente que estos últimos y de ocurrencia predominante en la familia Asteraceae (notablemente en géneros Artemisia y ambrosia), de allí que su distribución permite ser aplicada a problemas taxonómicos especialmente en los géneros nombrados y en otras taxas (Scherriber, K., 1963). Son sustancias amargas que se encuentran en todas las partes de las plantas, en concentraciones que varían entre 0,01 y 8% del peso seco, siendo las concentraciones mayores generalmente en las hojas; son bastantes solubles en cloroformo y en eter etílico. Presentan gran importancia por la variada acción biológica que han

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demostrado: acción citotóxica, antitumoral, analgésica, inhibidoras del crecimiento de bacterias, entre otras (Scherriber, K., 1963). Estos compuestos lactónicos son primariamente clasificados en base a su esqueleto carbocíclico como germacranólidos, guaianólidos, eudesmanólidos y pseudoguaianólidos, entre otros (el sufijo olido se refiere a la función lactona) (Scherriber, K., 1963). 2.5 ESPECIES VEGETALES 2.5.1 Valeriana pilosa

Figura 1. Valeriana pilosa Fuente: Autores Orden: DIPSACALES Especie: Valeriana pilosa Ruiz & Pavón Familia: VALERIANACEAE

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Sinónimos: Valeriana longifolia H.B.K., Valeriana longifolia var. pilosa (Ruiz & Pav.) Wedd. Nombre Común: valeriana, Mata de gato 2.5.1.1 Características generales 2.5.1.1.1 Descripción: Hierba perenne con las hojas en una roseta basal, 10-75 cm de alto, ramificada desde la base. Raíz central obcónica. Hojas simples, pecioladas; lámina de la hoja lanceolada, 5-35 x 0.5-2.5 cm, subcoriácea, en la parte superior glabra a pilosa, en la parte inferior glabra o pilosa, ocasionalmente con el nervio medio piloso, aguda en el ápice, los márgenes enteros con pequeñas berrugas en la parte superior que dan la impresión de dientes; peciolos dilatados y generalmente ciliados en la base. Inflorescencia paniculoide, 2-41 x 1-8 cm, el eje piloso; eje principal de la inflorescencia con 1-3 pares de hojas sésiles, lanceoladas a linear lanceoladas, generalmente con el margen verrugoso, con o sin inflorescencias parciales en sus axilas, brácteas y bracteolas superiores espatuladas, 2-10 x 1-4 mm, glabras o pilosas en la base. Flores ginodioicas, corola infundibuliforme, la de flores perfectas de 2-3 mm de longitud, la de flores pistiladas de 1-2.5 mm de longitud, blanca, a menudo teñida de púrpura, glabra, 5-lobada; estambres o estilo exsertos. Aquenios de 1.5-2 mm de longitud, de forma creciente en corte transversal, el vilano de 3-5 mm de longitud, usualmente con 6 radios (Guzmán, 2005) 2.5.1.1.2 Distribución geográfica: El género Valeriana tiene 150 especies distribuidas por todo el mundo, la mayoría en Sudamérica, especialmente en la Cordillera de los Andes. Esta especie se distribuye en Ecuador, Perú y Colombia entre los 2700 a 4250m. En Colombia se encuentra en los departamentos de Antioquía, Caldas, Santander, Boyacá y Cundinamarca entre los 2700 a 3800m. En Cundinamarca se halla en los páramos de Cruz verde, Sumapáz, El Tablazo, Chingaza, San Cayetano, Chipaque, Chisacá. Esta especie crece en bosques alto andino y páramo (Torres, 2007).

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2.5.1.1.3 Fitoquímica: Los análisis fitoquímicos preeliminares uno realizado en las hojas y otro en los rizomas de V. pilosa mostraron la presencia de alcaloides, esteroides y/o triterpenoides, flavonoides y taninos. Las pruebas realizadas para cumarinas y lactonas terpénicas, glicósidos cardiotónicos y saponinas dieron resultados negativos. La presencia de alcaloides puede estar relacionada con alcaloides iridoidales similares a los aislados de las raíces de V. officinalis (Guzmán, 2005). Los iridoides son la familia de compuestos monoterpenicos mas comunes en el genero Valeriana y en la familia Valerianaceae. Aunque en un principio se creía que estos compuestos eran los responsables de la actividad sedante de la valeriana, algunos autores consideran que los ácidos valerénicos y otros sesquiterpenos estructuralmente similares, que se encuentran en el aceite esencial de las raíces de V. officinalis son los responsables de esta actividad y no los valeropotriatos (epoxiridoides encontrados en la Valeriana). Estos resultados sugieren la necesidad de caracterizar química y farmacológicamente la especie V. pilosa, con el fin de evaluar su aprovechamiento como una novedosa fuente de extractos sedativos (Guzmán, 2005). 2.5.1.1.4 Usos: En general, las especies pertenecientes al género Valeriana, son usadas con fines medicinales. En Bogotá y alrededores se encuentra muy difundido el uso de los tallos y hojas de estas plantas, como tranquilizante, para la conciliación del sueño y otras afecciones del sistema nervioso. Sin embargo, la mayoría de las personas adquieren los fragmentos de estas plantas en la sección de plantas medicinales de las plazas de mercado y en centros naturistas, muchas veces sin tener certeza sobre la identidad de la especie a la cual corresponde dicho fragmento, ya que son pocas las personas que reconocen esta planta en su ambiente natural (Guzmán, 2005).

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En Perú, se reporta además el uso de las hojas y tallos de la Valeriana pilosa para curar las irritaciones, como desinfectante y para combatir la fiebre interna. Las raíces de esta especie se hierven por pocos minutos y el té es utilizado como un sedante y para disminuir el stress (Gúzman, 2005). 2.5.2 Myrcianthes rhopaloides

Figura 2. Myrcianthes rhopaloides. Fuente : Autores

Orden: MYRTALES Familia: MYRTACEAE Especie: Myrcianthes rhopaloides (H.B.K.) McVaugh xl

Nombres comunes: Hueso,

Guayabo, Almanegra, Arrayán, Arrayán guayabón,

Guayabón, Arrayán negro, Arrayán de los Andes. Sinónimos: Eugenia porphyroclada O. Berg, Eugenia rhopaloides (Kunth) DC., Myrtus rhopaloides Kunth 2.5.2.1 Características generales de la especie 2.5.2.1.1 Descripción: Árbol de hasta 15 m de altura, tronco cilíndrico, copa regular. Corteza color rojizo, escamosa, resinosa y desprendible. Hojas simples, opuestas, de limbo ovalado, consistencia coriácea; con el borde entero, a veces involuto; con ápice marginado y base redondeada; haz glabro y lustroso, de color verde oscuro, envés verde amarillento con la nervadura central prominente. Pecíolo corto lignificado. Flores hermafroditas, completas y estaminoideas; cáliz dialisépalo, color verde; corola con pétalos libres, color blanco; estambres muy numerosos, de 9-10 mm de largo; ovario ínfero, estilo largo y estigma capitado. Fruto en drupa, carnoso, de forma orbiculada, color rojo oscuro cuando maduro, con una sola semilla. Los frutos pesan 2.88 g promedio; las semillas miden aproximadamente 0.82 cm de largo y 0.61 de ancho y 100 semillas pesan 0.172 g en promedio (Pico, 2004). 2.5.2.1.2 Distribución Geográfica: Se encuentra distribuida en Costa Rica, Colombia, Ecuador, Panamá, Perú, y Venezuela desde los 2300 a 2800 m. En Colombia se le encuentra en la cordillera Central y Oriental en el departamento de Cundinamarca, en el altiplano Cundiboyacense y sus alrededores y en el Tolima. En Cundinamarca en los municipios de la Calera (Santa Isabel), Facatativa. En Bogotá D.C se encuentra en las zonas rurales de Usme (Pasquilla) y Sumapaz (Capitolio) dentro de un rango altitudinal de 2500 a 3200m (Guzmán, 2005). Crece en laderas bajas y pies de ladera, suelos pesados con drenaje lento, no anegados. Frecuentemente se halla aislada en potreros junto con otros elementos relictuales de los bosques de susca y de tíbar, como elemento silvopastoril tradicional

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(potrero arbolado de arrayanes, común en toda la región andina con otros géneros y especies de la misma familia). Es inductor preclimácico de la sere de laderas bajas, vinculado a la mesosere del bosque de susca (Ocotea heterophylla) y la del tibaral (bosque de Escallonia paniculata) (DAMA, 2000). 2.5.2.1.3 Propagación tradicional: Las semillas se extraen de los frutos con bisturí, con presión de pinzas con punta delgada o bien de manera manual al presionar el fruto carnoso, se lavan 2 a 3 veces con agua durante 2 minutos máximo cada vez. No se realiza aplicación de jabones ni detergentes, dado el carácter fotosintético del embrión y los cotiledones, desde el momento de maduración de los frutos. Deben mantenerse en humedad superior al 60% desde la extracción del fruto y el lavado. No requiere etapa de secado, posterior al lavado, por el contrario, debe mantenerse la humedad. En medio estéril utilizando cajas de petri con papel absorbente, luz solar parcial y temperatura ambiente en condiciones de laboratorio (17°C promedio), se registra germinación desde el tercer día después de la hidratación hasta el séptimo día, siendo la germinación del 100% para el día 7 (Pico, 2004). La germinación es tipo hipogea, puesto que los cotiledones verdes permanecen en el sustrato, en el lugar de siembra y emerge la radícula y posteriormente la plúmula entre los cotiledones. Se deben sembrar 2 semillas por alvéolo, con una profundidad de 1 cm, el riego debe ser cada 2 días y de manera suave (Pico, 2004). 2.5.2.1.4 Cosecha: La colecta se realiza de manera manual, halando de la parte apical, para propagación se pueden colectar frutos con pocos días de caída en el suelo. El ciclo reproductivo de esta especie es poco constante y depende del tipo de suelo pues plantas de una misma región inician fases reproductivas a diferentes épocas. En el mes de abril en Pasquilla y Guachetá se han encontrado plantas de esta especie en floración, plantas con frutos se encuentran en los meses de febrero en Duitama, abril

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en Sumapaz, junio en el Verjón alto localidad de Chapinero y julio en la Calera. En el JBJCM la floración generalmente inicia a principios de año en los meses de febrero a abril y los frutos maduros son colectados cinco meses después (Pico, 2004). 2.5.2.1.5 Usos: Los frutos de ésta especie son comestibles y por su agradable sabor se consumen directamente, en jugos con leche y dulces. La planta al igual que Myrcianthes leucoxyla, es maderable y es empleada con fines medicinales. El uso medicinal más frecuente en las áreas rurales de Bogotá es para combatir la diabetes, utilizando diferentes partes de la planta. También se usa como tranquilizante preparando las hojas en infusión y como antidiarreico, cocinando las hojas en agua junto con el laurel (Laurus nobilis) (Molina, 2004). Esta planta también es usada en la inducción de matorrales de Miconia spp., en la formación de corredores y estribones ornitócoros, como barrera antiganado, cercas vivas, ornamental y en la fabricación de postes y cabos de herramienta (DAMA, 2000). 2.5.2.1.6 Bromatología y Aporte Nutricional: Los resultados del análisis bromatológico proximal expresados en base húmeda para M. rhopaloides son presentados en la tabla 1, los cuales al ser comparados con los mismos obtenidos para M. leucoxyla, evidencian que un menor aporte nutricional. Sin embargo, esta especie representa un potencial de aprovechamiento muy interesante desde el punto de vista de alimentos (Molina, 2004).

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Nutriente

Contenido

Proteína (g)

2.9

Grasa (g)

0.3

Fibra (g)

2.4

Cenizas(g)

1.4

Calcio (mg)

100mg

Fósforo (mg)

38

Hierro ppm

28

Tabla 1. Análisis bromatológicos proximales para M. rhopaloides (contenido/100g de pulpa) 2.5.2.1.7 Fitoquímica: El aceite esencial obtenido por hidrodestilación de hojas M. rhopaloides recolectadas en Ecuador fue caracterizado por CGAR y CGAR-EM, identificando 40 compuestos de los cuales la mayoría corresponden a alcoholes y aldehídos monoterpenicos como geranial (34%), neral (25%), α-pineno (7%), βpineno (9%) y algunos sesquiterpenos (1.5%). Al comparar estos resultados con lo reportado por Guzmán et al. 2005 para M. leucoxyla, se encuentra que los aceites tienen en común el alto contenido de monoterpenos tales como el α-pineno y βpineno, aunque detectados en concentraciones mayores para el aceite esencial de M. rhopaloides, además de 1,8-cineol, mirceno, linalol, terpinen-4-ol, y nerolidiol (Guzmán, 2005).

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2.5.3 Passiflora manicata

Figura 3. Passiflora manicata Fuente: Autores

Familia: PASSIFLORACEAE Especie: Passiflora manicata (Juss.) Pers. Sinónimos: Passiflora meridensis H. Karst., Passiflora rhodantha Harms, Tacsonia manicata Juss. Nombre Común: Flor de la pasión, Tacso (Nariño), Curubo de Monte (Quindío), Diablito (Ecuador)

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2.5.3.1 Características generales de las especies 2.5.3.1.1 Descripción: Plantas pubescentes o glabras en las superficies adaxiales de las láminas foliares, flores y frutos. Tallos angulares, esencialmente glabros o pubescentes. Hojas ovadas, trilobuladas, de 4.2 a 10.0 cm de largo y 5.0 a 12.0 cm de ancho, con ángulos de aproximadamente 45º entre lóbulos medios y laterales, con lóbulos oblongos u ovados, agudos o acuminados en el ápice, redondeadas o ligeramente acorazonadas en la base, glandular-aserradas en las márgenes, densamente pubescentes en la superficie abaxial, con tricomas ondulados, transparentes, blancuzcos, de aproximadamente 0.3 mm de largo, glabras en la superficie adaxial, con tricomas escasos repartidos sobre las venas foliares; pecíolos de 1.4 a 4.1 cm de largo, con 4 a 9 nectarios generalmente estipitados, de 1 a 2 mm de largo repartidos sobre la superficie adaxial; estípulas generalmente suborbiculares, de 1.5 a 2.0 cm de largo y 0.5-1.0 cm de ancho, con dentaciones gruesas en el margen. Pedúnculo grueso, de 4.6 a 7.5 cm de largo; brácteas ovadas, libres hasta la base o unidas cerca de la base, de 2.0 a 4.0 cm de largo y 1.0 a 2.0 cm de ancho, acuminadas o agudas en el ápice, cuneadas o redondeadas en la base. Flores erectas de 5.0 a 5.6 cm de largo; hipantios cilíndricos, de aproximadamente 2 cm de largo; sépalos oblongos o lanceolados de 3.0 a 3.6 cm de largo, de aproximadamente 6 mm de ancho, verdosos abaxialmente, rojos adaxialmente; pétalos sub-iguales a los sépalos, rojos; corona en 3 o 4 series, con filamentos de hasta 4 mm de largo, con series más exteriores color morado, con la serie interior de color blanco; opérculo localizado aproximadamente a 1 cm de la base del hipantio, de aproximadamente 1 cm de largo, doblado, membranáceo, blanco. Frutos obovados u oblongos, de 3.5 a 5.5 cm de largo y 2.0 a 3.7 cm de ancho, con pericarpio coriáceo, verde al madurar; semillas obovadas a acorazonadas, de 3.5 a 5.1 mm de largo y 2.0 a 3.0 mm de ancho, con testa reticulada, color café oscuro; arilo anaranjado poco suculento (Escobar, 1988). Esta especie presenta características intermedias entre los subgéneros Tacsonia y Passiflora. La flor es erecta, presenta una corola color rojo intenso, con un hipantio

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más corto que en el subgénero Tacsonia, pero más largo que en subgénero Passiflora; es autógama y altamente polimórfica (Escobar, 1988). 2.5.3.1.2 Distribución geográfica: Es nativa de Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú. Posiblemente es originaria de los Andes de Perú y Chile, entre 1400m -2800 m de altitud. Crece de forma silvestre como una enredadera (Torres, 2007). 2.5.3.1.3 Usos: El fruto no es considerado como comestible porque no se puede diferenciar claramente el estado maduro del estado inmaduro, durante el cual los frutos pueden tener efectos tóxicos y sicótropos (de ahí su nombre de “diablito” en el Ecuador). El interés de esta especie proviene de su potencial para el mejoramiento genético de las curubas, por su cercanía con ellas y su rusticidad. Es resistente a los nemátodos y a las enfermedades fúngicas (antracnosis, oidio y Alternaria sp) (Torres, 2007)

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2.5.4 Hesperomeles ferruginea

Figura 4. Hesperomeles ferruginea. Fuente: Autores

Orden: ROSALES Familia: ROSACEAE Especie: Hesperomeles ferruginea (Pers.) Benth. Nombres Comunes: Mortiño (Cordillera Central, Cundinamarca), noro (Cordillera central, Valle del Cauca), cerote (Cauca, Huila), guayabo de páramo (Cauca, Valle), manzano (Cauca, Santander). Huagra manzana, jalo, pujín, quique (Ecuador).

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Sinónimos: Crataegus ferruginea Pers., Eriobotrya cordata Lindl., Hesperomeles lanuginosa Ruiz & Pav. ex Hook., Hesperomeles oblonga Lindl., Mespilus ferruginea (Pers.) Poir., Osteomeles ferruginea (Pers.) Kunth. 2.5.4.1.1 Descripción: Arbustos hasta 5 m de altura, ramas pubescentes o glabras hacia las puntas. Estipulas, 2 a 6 mm de largo y 0.5 a 1 mm de ancho, pubescentes a glabras, usualmente persistentes; pecíolos 0.5 a 2 cm de longitud, pubescentes. Hojas más o menos oblongas, elípticas u ovadas, 3 a 10 cm de largo y 1.5 a 8 cm de ancho, coriaceas o subcoriaceas, ápice redondeado, base redondeada, obtusa o subcordada, margen serrado o biserrado, superficie adaxial frecuentemente puberula a glabra, reticuladas o suavemente abullada, con venas inmersas, superfice abaxial pubescente con venas prominentes. Inflorescencia en forma de cima con 10 a 100 flores, densamente pubescentes; pedúnculo de 5 a 40 mm. Brácteas florales, 5 a 10 mm de largo y 1 a 1.5 mm de ancho; pedícelo de 2 a 5 mm de longitud. Flores 5 a 9 mm de largo; hipantio urceolado a crateriforme; sépalos 1.5 a 3 mm de largo, ápice agudo; pétalos ampliamente elípticos u obovados, 2.5 a 5 mm de largo, glabros, pubérulos o ciliados, blancos o cremas comúnmente teñidos de rosa o rojo. Fruto de 5 a 8 mm de largo y 6 a 8 mm de ancho, rojo. Semillas de 2.5 a 3 mm de largo y 1 a 1.5 mm de ancho (Guzmán, 2005). 2.5.4.1.2 Distribución geográfica: Se encuentra distribuida a lo largo de Suramerica, en Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela. Se encuentra entre los 2800 y 3900 m. En Cundinamarca se localiza en los municipios de Cogua, La Aguadita, San Miguel y Represa del Neusa. En Bogotá D.C. en las Localidades de Ciudad Bolívar, Sumapaz, Usme y en los Cerros Orientales. También se encuentra en los departamentos del Boyacá, Cauca, Cesar, Magdalena, Norte de Santander y Risaralda. Esta especie se encuentra en relictos de bosque andino, asociada a matorrales densos en cañadas y ocasionalmente en linderos de predios en forma aislada, es una especie persistente en zonas de disturbio antrópico (Rangel, 2000).

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Se desarrolla en suelos ácidos orgánicos y algo arcillosos, se han encontrado asociaciones micorríticas de tipo vesículo arbuscular, en cuanto a aspectos climáticos no soporta heladas prolongadas y se producen defoliaciones frecuentes. Esta planta esta más adaptada a paramos húmedos que H. goudotiana (Rangel, 2000). 2.5.4.1.3 Usos: En las áreas rurales del sur de Bogotá D. C. esta especie al igual que H. goudotiana es bastante conocida y utilizada. El fruto maduro se consume directamente, o se usa para preparar mermeladas, dulces y yogurt. En el departamento de Boyacá los frutos de mortiño se tuestan con azúcar o panela, y se prepara “masato” para las fiestas de San Pedro a finales de Junio (Cardozo, 2005). Por otra parte, a partir de esta planta se obtiene la madera para fabricar cabos de azadón y cercas vivas (Molina, 2004), lo que esta ocasionando una gran disminución en las poblaciones de esta especie, hecho que también se evidencia en países como Ecuador, donde H. ferruginea se encuentra amenazada por la fragmentación de hábitat y por la tala a la que es sometida por la calidad de su madera; además la regeneración natural no es eficiente y los pocos árboles que alcanzan a rebrotar en las áreas intervenidas son muy susceptibles a enfermedades (Ordóñez, 2006). 2.5.4.1.4 Fitogeografía y ecología: Posición sucesional: inductores preclimácicos priserales. Aparece como subordinada en las priseres del encenillal, denotando las facies de suelos húmedos. Es un importante elemento protector de los bordes relictuales, por sus espinas. Su papel como subdominante del clímax de subpáramo húmedo, indica también su función mediadora del ascenso del límite superior del bosque y la regeneración del encenillal sobre subpáramos húmedos y potreros por encima de los 3200 msnm. Es uno de los precursores leñosos más frecuentes en los pastizales altos de Holcus lanatus en el subpáramo degradado (Torres, 2007). 2.5.4.1.5 Fitoquímica: Aún no se han publicado estudios acerca de la composición química de los frutos, hojas y otras partes de H. ferruginea, sin embargo cabe esperar

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que no difiera de la composición de otras especies de su mismo género, como la observada en H. goudotiana donde se encuentran esteroides, triterpenoides, flavonoides y taninos. Además por la coloración de sus frutos es muy probable que contenga compuestos polifenólicos tipo antocianinas que pueden ser utilizadas como colorantes en la industria de alimentos y posiblemente como antioxidantes (Garzón, 2006). No se han publicado estudios sobre la actividad biológica que pueda tener H. ferruginea, sin embargo en otras especies como H. cuneata Lindl., H. obtusiofolia (Pers.) Lindl. H. heterophylla Hook., se ha encontrado que los frutos y las hojas tienen actividad antiinflamatoria sobre los riñones y el hígado (Garzón, 2006). 2.6 MICROORGANISMOS SELECCIONADOS 2.6.1 Hongo fitopatógeno La mayoría de los hongos fitopatógenos forman hifas, es decir, talos tubulares, que se extienden mediante crecimiento apical y un sistema organizado de ramificación. La red de hifas que resultan de dicho crecimiento se conoce como micelio y el micelio interconectado producto de un propágulo o de la fusión de hifas de dos o más propágalos se denomina colonia (Ayala S, 1998).

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2.6.1.1 Alternaria sp.

Figura 5. Características Macro y Microscópicas de Alternaria sp. Forma parte de los llamados hongos imperfectos. Produce manchas en hojas, frutos y tallos, además de necrosis foliar (Arévalo A, 1996). Algunas de la enfermedades más comunes causadas por Alternaria spp, incluye el tizón temprano de la papa, el tomate y el brócoli; mancha de la hoja del tabaco, del geranio, hule, gladiola y kenaf; tizón de la zanahoria, macha circular en la remolacha, mancha concéntrica del cártamo, pudrición negra del fruto en el chile. Causa manchas y tizón en la cebolla, manchas en frutas como la manzana, el limón y la naranja. Estas manchas son generalmente café oscuras o negras, frecuentemente numerosas y dispuestas en anillos concéntricos que le dan la apariencia de tablero de tiro (Ayala S, 1998). Sobre las ramas y tallos de plantas tales como el tomate, aparecen varias manchas obscuras, profundas y con frecuencia en forma de blanco. A veces las lesiones del tallo en las plántulas forman cánceres que pueden extenderse, cubrir el tallo y matar a la planta, o si se forman cerca de la superficie del suelo pueden desarrollarse y originar una pudrición del cuello. (Forero N, 1997) Características macroscópicas: Colonias vellosas, de superficie rugosa y borde regular, de color gris intenso en el anverso y negro en el reverso (Ayala S, 1998). Características microscópicas: Conidios grandes y pequeños entre lazados (Ayala S, 1998). lii

2.6.2 Microorganismos patógenos 2.6.2.1 Candida albicans

Figura 6. Características Macro y Microscópicas de Candida albicans. La especie patógena más frecuente en el hombre es la Candida albicans. Estos hongos viven como saprofitos sobre la piel y las mucosas del tracto respiratorio, digestivo y genital femenino, de preferencia en pacientes diabéticos y durante el embarazo (Roncancio B, 2001). Es una levadura, redonda u ovoide con 3 mcm de diámetro, con o sin gemación. Forma parte de la flora normal de la boca, tubo digestivo y vagina. Y esta considerada como la más patógena de este género (Arévalo A, 1995). Es frecuente ver las invasiones superficiales (piel y mucosas) producidas por este hongo (Roncancio B, 2001). La forma generalizada se produce por vía hemática y se manifiesta por lesiones o abscesos en casi todos los órganos y tejidos. Microscópicamente se puede observar que en el tejido se forma un micelio con hifas delgadas y seudohifas, además de células micéticas levaduriformes pequeñas. Estas células pueden mostrar gemación. Las hifas y seudohifas penetran en el tejido como lo hacen las raíces de una planta (Roncancio B, 2001). Se relaciona con los alimentos ya que es una levadura presente en la fermentación de éstos, atacando alimentos ricos en grasa, a pesar de ello otras especies de Candida sp

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tienen importancia industrial produciendo ácidos orgánicos, etanol a partir de nutrientes especiales, enzimas como la lipasa utilizada en la producción de jabón, lípidos en sustratos ricos en glucosa y vitaminas como la riboflavina, entre otras (Roncancio B, 2001). Presenta rasgos clínicos como dolor de esófago y dificultad para comer, infección del torrente sanguíneo y enfermedad diseminada normalmente con fiebre, raramente: pulmonía, osteomelitis y artritis. Según el CDC y la división de enfermedades bacterianas y micóticas posee una incidencia de 8 casos/100000 en la población general, en los pacientes VIH positivos se presenta como una infección oportunista (Roncancio B, 2001). 2.6.2.2 Staphylococcus aureus

Figura 7. Caracterísiticas Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus. Son cocos Gram positivos de 0,5 - 1 mcm de diámetro, inmóviles, aerobios o anaerobios facultativos, caracterizados por su agrupación en forma de racimo. Crecen a una temperatura óptima de 37 °C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente alcalino de 7.6 la adición de glucosa favorece el crecimiento (Peñaranda, 2003). Forma parte de la flora normal de mucosas y piel e intervienen en procesos patológicos diversos como infecciones supurativas e intoxicaciones alimenticias (Arévalo A, 1996). Más del 95% de los Staphylococcus aureus producen proteína A,

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la cual puede estar asociada a la célula o al medio extracelular, con una importante afinidad por la fracción Fc de la Ig G. La presencia de proteína A o coagulasa es de gran utilidad clínica para diferenciar Staphylococcus aureus de otras especies de Estafilococos (Uribe C, 2003). Staphylococcus aureus es una bacteria que puede causar infección en todos los grupos de edad tanto en forma esporádica como epidémica y se ha identificado como una de las principales causas de infección de heridas quirúrgicas. Su principal forma de transmisión es por contacto (Uribe C, 2003). La capacidad de S. aureus para fermentar los azúcares como maltosa, manitol, trehalosa es positiva. La producción de una nucleasa termoestable es un buen indicador de la presencia S. aureus, al igual que la conversión de nitratos a nitritos (Peñaranda O, 2003). Elaboran diversas enzimas: proteasas, lipasas, fosfatasas, gelatinasas, catalasas y coagulasas (Peñaranda O, 2003). En cultivo puro resisten una concentración de fenol al 1% durante 15 minutos, pero solo los mata una concentración al 2%. Soportan el calor húmedo a 60 °C durante 30 minutos. Muchas cepas de S. aureus toleran concentraciones altas de cloruro de sodio (7,5 a 10%), y son fácilmente inhibidos por colorantes como el violeta de genciana (Peñaranda O, 2003).

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2.6.2.3 Escherichia coli

Figura 8. Características Macro y Microscópicas de Escherichia coli. Es un bacilo de 1 – 3 µm por 0.5 µm, que se presenta sólo, en pares, en cortas cadenas o formando grupos. En general es móvil (por flagelos perítricos), aunque existen variantes inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general es no cápsulado y Gram negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente; en los viejos se presentan formas de una dimensión mayor (Peñaranda O, 2003). En agar forma colonias circulares de 3 a 5 mm convexas, de borde continuo o un tanto ondulado, brillantes y de coloración blanca un poco amarillenta. Con producción de ácido y gas, fermenta la lactosa y un gran número de carbohidratos; algunas cepas son lactosa negativas. Es indol positiva, rojo de metilo positiva, Voges Proskauer (VP) negativa y no utiliza el citrato. Produce H2S en determinados medios. Acidifica y coagula la leche. Pueden necesitarse pruebas adicionales en casos de E. coli aislada de colitis hemorrágicas, las cuales son típicamente negativas a sorbitol. Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37 °C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de temperaturas; el pH favorable es de 7 alguna cepas producen hemolisina (Peñaranda O, 2003). Se ha considerado inicialmente sólo como un habitante del intestino, desde hace cerca lvi

de tres décadas se empezó a estudiar su poder enteropatógeno. Se ha visto que las cepas toxigénicas de E. coli pueden producir una enterotoxina termolábil (TL),una termoestable (TS) o ambas. La TL es una proteína de alto peso molecular, que bioquímicamente es muy similar a la toxina de Vibrio cholerae, activando la adenilciclasa. Es inactivada a 60 ºC. La TS es una pequeña molécula relativamente estable al ser hervida (Rodríguez V, 1995). 2.6.2.4 Bacillus subtillis

Figura 9. Características Macro y Microscópicas de Bacillus subtillis. Son bacilos Gram positivos de tamaño 1 por 8 mcm, inmóviles, aerobios o anaerobios facultativos, formadores de endosporas. Habitan en el suelo, agua, aire y son contaminantes del ambiente de laboratorio. Este microorganismo es obligado en esta clase de bioensayos por su gran sensibilidad. (Arévalo A. 1996) Se encuentra con frecuencia en tierra y en vegetales, también se encuentra en diversos productos alimenticios, produciendo infecciones aéreas o por contacto, se considera un microorganismo perjudicial pero no peligroso en carne en la cual ataca las proteínas. Este bacilo hidroliza el almidón y reduce los nitratos, no produce indol a veces forma una escasa cantidad de ácido sulfúrico, sus esporas son menos termorresistentes que las de los géneros térmofilos. (López L., 2001) Esta bacteria no se desarrolla en la leche cruda porque mediante la acidificación

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continuada producida por los streptococcus lácticos, se entorpece su crecimiento; a pesar de esto a una temperatura alta adecuada, este bacilo muchas veces puede coagular la leche pasteurizada por medio de los fermentos de laboratorio sin previa acidificación y tras reposar un largo período puede sobrevenir la peptonización. Esta bacteria también es importante porque produce subtilicina, una bacteriocina que inhibe o mata especies estrechamente relacionadas o incluso a cepas diferentes de la misma especie. (López L., 2001) Algunas enfermedades causadas por este son: -

Mancha blanca del trigo

-

Daños en cultivo de tejidos de la palma datilera

-

Daños en óvulos y semillas de papa (López L., 2001)

2.7 ANTIMICROBIANOS Desde el siglo XVIII se han empleado sustancias químicas para el tratamiento de las emnfermedades infecciosas. Paul Ehrlich, quien formulo los principios de toxicidad selectiva, reconoció las reacciones químicas específicas entre microorganismos y medicamento, la aparición de la resistencia a estos y el papel de la terapéutica combinada para combatirlos. Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se acrecentó el interés en sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas antibióticos, de ahí surgió la penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, etc. Las cuales también han sido obtenidas sintéticamente, a través de modificación química, total o parcial, de las moléculas por biosíntesis (Manrique E, 1997). El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de diferentes maneras: por inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones de la membrana celular, de la traducción de material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos (Manrique E, 1997). El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es

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perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades, estas sustancias pueden actuar de dos maneras: a. Como microbiocidas, es decir, que matan las formas vegetativas de los gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias y fungicidas refiriéndose a hongos. b. Como microbiostatico, es decir que inhibe el crecimiento de microorganismos y se denominará, bacteriostático o fungistático, según se refiera a bacterias o a hongos, respectivamente (Barreto J, 1997) 2.7.1 CLORAMFENICOL 2.7.1.1 Origen El Cloramfenicol (Cm) es un antibiótico clásico de amplio espectro que es producido por diversas especies del género bacteriano Streptomyces. Este agente antimicrobiano es único entre los compuestos naturales ya que contiene un grupo nitrobenceno conectado a un grupo propanol, así como un grupo amino conectado a un derivado del ácido dicloroacético. El Cm es una de las moléculas más simples, razón por la que fue el primer antibiótico cuya síntesis química fue desarrollada para la producción comercial a gran escala y que ha sido modificado en múltiples para la obtención de moléculas análogas con mejor actividad antimicrobiana. A pesar de la toxicidad del Cm, algunas veces éste se usa como antibiótico sistémico debido a su efectividad contra infecciones causadas por Samonella typhi y se recomienda en pacientes con meningitis de tipo bacteriana causada por Enterococcus faecium, Haemofilus influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae, especialmente en aquellos que son alérgicos a los β – lactámicos. Además, debido a que la molécula de Cm es pequeña y con características poco polares, este antibiótico es capaz de difundir a través de células eucarióticas y paredes de células procarióticas. De hecho, la solubilidad lipídica de este antibiótico es la que permite que el Cm penetre bien

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dentro del cerebro, razón por las que sus potencialidades se aumentan para tratar infecciones en estos sitios donde otros antibióticos no podrían llegar a producir los efectos deseados. Además el Cm sigue siendo un antibiótico de elección para el tratamiento tópico de una amplia variedad de infecciones bacterianas incluyendo las causadas por anaerobios (Morales Y, 2007). 2.7.1.2 Mecanismos de acción del cloramfenicol El mecanismo de acción principal del Cm sobre diversas bacterias, involucra la inhibición de la síntesis de proteínas en las cepas sensibles. El ácido ribonucleico mensajero (ARNm), derivado del proceso de transcripción es usado como molde por el complejo ribosomal donde la información es convertida a proteínas (traducción). Los ribosomas son la unidad funcional de la traducción y actúan como un catalizador. El Cloramfenicol se une a la subunidad 50S bloqueando las funciones principales de los ribosomas como la reacción de la PTasa, la terminación de la traducción y causando un proceso de traducción impreciso. La inhibición de la síntesis de las proteínas causada por el Cm en la mayoría de los microorganismos susceptibles produce un efecto bacteriostático (Morales Y, 2007). Los ribosomas eucarióticos son más largos, complejos y difieren significativamente de los procariotas, razón por la cual los agentes antimicrobianos como el Cloramfenicol no interfieren considerablemente con ribosomas eucarióticos y poseen más especificidad sobre los ribosomas de las células procariotas (Morales Y, 2007). 2.7.1.3 Mecanismos de resistencia bacteriana al cloramfenicol Los microorganismos han desarrollado distintas estrategias para competir por los nutrientes en su hábitat, algunos han mejorado sus sistemas de quimiotaxis y otros han elaborado compuestos antimicrobianos para inhibir a otros miembros del ambiente. Diversas son las sustancias antagónicas que los microorganismos producen para dominar su hábitat, por ejemplo los antibióticos de amplio espectro, los

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productos del metabolismo como ácidos orgánicos, las moléculas quelantes de hierro (sideróforos) y las bacteriocinas (Morales Y, 2007). 2.7.1.4 Constitución química Fórmula global C11H12Cl2N2O5 Peso molecular: 323.13 Estructura química

2.7.1.5 Propiedades Es un polvo blanco o blanco amarillento, inodoro, intensamente amargo; es poco soluble en agua, muy soluble en alcohol, propilenglicol, acetona y acetato de etilo. Es prácticamente estable en soluciones neutras o ligeramente ácidas, pero se destruye rápidamente en solución alcalina (Morales Y, 2007).

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2.7.2 GRISEOFULVINA Obtenida de especies de Penicillium. Utilizada en infecciones micóticas. Es un análogo de las purinas y así conlleva a un error de la secuencia de los aminoácidos para la lectura del RNAm, inhibiendo así, la mitosis fúngica. La resistencia está dada por cambios en la permeabilidad de la membrana celular. Tiene acción fungistática, bloquea la reproducción del hongo, inhibiendo la mitosis fúngica. (Manrique E, 1997). 2.8 MÉTODOS DE EVALUACIÓN ANTIMICROBIANA Estas técnicas fueron desarrolladas al observar que los microorganismos eran capaces de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado contra él durante un período largo de tiempo, esta resistencia puede deberse a diversos mecanismos como: a. Producción de una sustancia que destruye el antibiótico. b. Adaptación del metabolismo bacteriano para inhibir el antibiótico. c. La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al antibiótico. d. Un fago comunica la resistencia por transducción e. Desaparición de cepas sensibles y supervivencia de cepas resistentes por un fenómeno de selección natural. f. Producción de cepas mutantes (Arévalo A, 1996). Existen varias técnicas para evaluar los antimicrobianos: métodos de dilución, método de difusión en gel y método de bioautografía (Arévalo A, 1996). 2.8.1 Método de difusión en gel Se basa fundamentalmente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico o el microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio se adicione la contraparte y observar inhibición de crecimiento o halos de inhibición según la técnica utilizada. Esta técnica también abarca la llamada de discos de papel,

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en la cual el antibiótico a ensayar viene incorporado a discos de papel absorbente en concentración conocida, los cuales se colocan sobre la superficie de una caja de agar sembrado masivamente con el microorganismo en estudio, luego de incubar a la temperatura y tiempo adecuados se observan halos de inhibición de crecimiento (Arévalo A, 1996). Las ventajas de los métodos de difusión son que utilizan una pequeña cantidad de la muestra evaluar y ofrecen la posibilidad de ensayar varias sustancias contra un mismo microorganismo (Arévalo A, 1996). Con éstas técnicas y realizando diluciones de los diferentes antimicrobianos a probar se puede la concentración Mínima Inhibitoria (MIC), que se define como la menor concentración de antibiótico en µg/mL capaz de inhibir el desarrollo in vitro del microorganismo en estudio y la concentración Mínima Bactericida (MBC), considerándose como la menor concentración del antibiótico en µg/mL que mata los microorganismos in vitro (Arévalo A, 1996). 2.8.2 Método de dilución También llamado turbidimétrico, consiste en hacer diluciones seriadas del antibiótico en µg/ml en caldo de cultivo y un tubo como control de crecimiento de microorganismo, los tubos se inoculan con una suspensión calibrada del microorganismo y se incuban a temperatura y tiempo determinados, finalizado el período de incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la existencia o no de turbidez. (Manrique E, 1997) 2.8.3 Método de Bioautografia Este método consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por cromatografía en capa fina en un medio de cultivo. Para ello se utilizan placas cromatográficas de sílica gel 60f 254 de MERCK o de celulosa las cuales se colocan en las cajas petri

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correspondientes. Previamente se procede a eliminar el disolvente para evitar falsas bandas de inhibición. (Manrique E, 1997) La bioautografía ha sido considerada como el ensayo más eficiente para la detección de componentes antimicrobiales, porque esta permite la localización de la actividad en un complejo matriz y por lo tanto permite un directo aislamiento de los constituyentes activos. El ensayo de bioautografia puede dividirse en tres grupos: a. bioautografía directa: Donde los microorganismos crecen directamente sobre la capa fina cromatográfica. b. bioautografia de contacto: Donde los componentes antimicrobiales son transferidos de la fina capa cromatográfica y son inoculados en una caja de agar a través de contacto directo. c. bioautografia cubierta de agar o inmersión de bioautografia: Es donde el medio de agar sembrado es aplicado encima de la fina capa cromatografica. (Manrique E, 1997)

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3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Formulación del problema ¿Tendrán actividad antimicrobiana los extractos etanólicos o aceites esenciales obtenidos a partir de las ferruginea,

Myrcianthes

especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles rhopaloides

y

Passiflora

manicata

contra

los

microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp ? 3.2 Justificación de la Investigación En la actualidad, el gran desafío para los países ricos en biodiversidad es poder vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte del aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en beneficio de la sociedad. El Distrito Capital posee especies cuyas propiedades medicinales no han sido estudiadas por completo, y con el fin de de generar conocimiento en cuanto a las posibles propiedades farmacológicas

se han seleccionado las especies

Myrcianthes rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa que posiblemente pueden tener propiedades antimicrobianas, ya que especies de su misma familia y género han sido estudiadas preliminarmente por tener principios activos bactericidas y fungicidas. Este trabajo de grado se basa en evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para demostrar la capacidad inhibitoria que ejercen éstas sustancias obtenidas de estas plantas contra los microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus

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aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp para formar parte del desarrollo científico de la sociedad, estudiar microbiológicamente las propiedades terapéuticas de plantas colombianas ya que resulta imprescindible descubrir nuevas sustancias con actividad antibiótica frente a microorganismos resistentes y con alta capacidad infectiva, aumentando la calidad de vida del hombre.

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4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo General Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata frente a los microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp.

mediante la Prueba de Sensibilidad

Antimicrobiana. 4.2 Objetivos Específicos - Realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana a cada uno de los extractos vegetales utilizando los microorganismos seleccionados. - Determinar cual de los extractos obtenidos presenta mayor acción contra los microorganismos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y Alternaria sp.

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5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 LOCALIZACIÒN El presente trabajo se llevó a cabo en las instalaciones de los laboratorios de la Subdirección Científica del Jardín Botánico José Celestino Mutis de la ciudad de Bogotá D.C (JBJCMB). 5.2 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS Se recolectó el material vegetal para cada especie vegetal de la siguiente forma: Myrcianthes rhopaloides Passiflora manicata

Jardín Botánico Bogotá José Celestino Mutis Ubate – 2800 mt

Hesperomeles ferruginea Valeriana pilosa

Guacheta - 2400 mt Páramo Cruz Verde (Choachí, Cundinamarca)

Tabla 2. Peso en gramos del material vegetal a extraer. Peso (g) de extracto total

Hojas

Peso (g) de material vegetal 220

0.348

Peso (g) extracto utilizado 0.03

Hojas

200

0.253

0.03

Hojas

200

0.222

0.03

Hojas

250

0.436

0.03

Especie vegetal

Parte de la planta

Myrcianthes rhopaloides Passiflora manicata Hesperomeles ferruginea Valeriana pilosa

5.3 TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL lxviii

Las plantas de las diferentes especies se separaron por partes, se lavaron con agua, para luego secarlas a temperatura ambiente; una vez secas se cortaron independientemente con el fin de obtener partículas uniformes, lo cual facilito el proceso de extracción, y se peso el material vegetal para conocer la cantidad exacta a extraer, ver Tabla 2. 5.4 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS Tabla 3. Especies, Parte a estudiar y Extractos a evaluar ESPECIES

PARTE A

EXTRACTOS A

ESTUDIAR

EVALUAR

Hojas

Extracto Etanólico y

Myrcianthes

aceite esencial

rhopaloides Passiflora manicata

Hojas

Extractó Etanólico

Hesperomeles

Hojas

Extracto Etanólico

Hojas

Extracto Etanólico

ferruginea Valeriana pilosa 5.4.1 Extracto Etanólico Se recolectó el material vegetal descrito en la Tabla 2, posteriormente se puso a secar a temperatura ambiente y cuando se secó se disminuyó el tamaño de partícula de forma manual. Para obtener el extracto se adicionó el solvente (etanol 90%) y se dejó en maceración fría durante 48 horas. Posteriormente se puso en reflujo a 60ºC en baño termostatado tres veces durante 4 horas, se concentró el extracto utilizando el rotavapor y se dejó secando el mismo a temperatura ambiente. Los extractos obtenidos se almacenaron hasta el momento de utilizarlos a 4ºC. (Torres, 2004)

lxix

Figura 10. Rotavapor Heidolph LABOROTA 4000-EFFICIENT De estos extractos se sacaron alícuotas para hallar la concentración en peso de cada extracto y su equivalencia en gramos (g), con ellos se evaluó la actividad antimicrobiana contra bacterias, hongo y levadura, a una concentración específica para cada caso. (Arévalo A, 1996)

lxx

RECOLECCIÓN DE LA PLANTA

SEPARACIÓN DE LAS PARTES DE LA PLANTA

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO

  FLÓCULO

FILTRADO

CONCENTRAR EXTRACTO

REFRIGERAR 4ºC

Figura 11. Proceso para la obtención de extractos a partir del material vegetal 5.4.2 Aceite Esencial: Con el material vegetal semi–seco se realizó una Hidrodestilación con arrastre a vapor durante 4 horas utilizando un destilador de aceites esenciales con capacidad 3 litros (Torres, 2007).

lxxi

Figura 12. Montaje hidrodestilación hojas de Myrcianthes rhopaloides. 5.5 MICROORGANISMOS 5.5.1 Cepas: Se utilizaron los siguientes microorganismos Escherichia coli, Bacillus subtillis y Sthaphylococcus aureus., los cuales fueron seleccionados bajo los siguientes criterios. •

representan diferentes grupos

•

Son agentes patógenos para humanos, por su relación con los diferentes cuadros clínicos que causan

•

Crean resistencia con mucha facilidad

lxxii

En el caso del hongo fitopatógeno, (Alternaria sp) se seleccionó bajo el criterio: •

Es un microorganismo que ataca con mucha frecuencia algunas de las especies vegetales presentes en el arbolado urbano.

5.5.2 Aislamiento de las cepas Patógenas: Se realizó la siembra de los microorganismos en Agar Mueller Hinton, las cuales se incubaron a 35 ºC durante 24 horas, posterior a esta incubación se sembró cada microorganismo en medio selectivo para cada uno. Para E. coli Chromocult (Colonias azul/violeta oscuro), para S. aureus Baird Parker (colonias negras, lustrosas, convexas, 1–5 mm de diámetro, rodeado de un halo claro de 2-5 mm de anchura. Dentro del halo claro presencia de anillos opacos no visibles antes de las 48h de incubación) y BPLS (colonias naranja) para B. subtillis. Se realizó la determinación de las características macroscópicas y microscópicas para cada microorganismo realizando Coloración de Gram (Torres, 2007). Fitopatógeno: Se realizó la siembra en medio PDA y se incubo a 27º C, durante 3- 5 Días. Posteriormente se determinaron las características macro y microscópicas realizando Coloración con azul de lactofenol (Torres, 2007). 5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS 5.6.1 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana: Se utilizó la técnica de difusión de disco en Agar de Kirby-Bauer, prueba que permite medir la susceptibilidad in Vitro de microorganismos patógenos y fitopatógenos frente a una sustancia o a la mezcla de varias sustancias desconocidas de origen vegetal con potencial antimicrobiano (Torres, 2007).

lxxiii

5.6.1.1 Técnica de difusión de disco en Agar 5.6.1.1.1 Bacterias Luego de tener las cepas totalmente aisladas en sus respectivos medios se tomó por cada microorganismo de 4 a 5 colonias y se colocó en 5 mL de solución salina al 0.85%, se ajustó las concentraciones con el Tubo No. 0.5 Mc Farland (1.5 x 106 UFC/mL). Luego la suspensión ajustada se sembró masivamente con escobillón estéril en el Agar Mueller Hinton para cada microorganismo. Posteriormente se tomaron los discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con una concentración de 30 mg/mL de acetona, se dejaron secar en una caja de petri cerrada luego se distribuyeron en cada una de las cajas que contenían Agar Mueller Hinton. El control positivo fue un disco con cloramfenicol (10mg/mL) y el control negativo fue agua estéril. Para hallar las concentraciones de los extractos se tomaron 0.03g y se adicionaron en 1mL de acetona, para la concentración del control positivo se tomaron 0.01g y se adicionaron en 1 mL de acetona. Se dejó incubando a 37ºC durante 24 horas, luego del periodo de incubación se realizó la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron cinco (5) veces.

5.6.1.1.2 Hongo 5.6.1.1.2.1 Evaluación antifúngica Comprende la realización de los ensayos biológicos para determinar la actividad antifúngica. Existen varios métodos para la evaluación de la actividad antifúngica de productos vegetales, los cuales se pueden agrupar en los tres siguientes: -

Método de crecimiento radial sobre un medio de Agar en caja de petri.

lxxiv

-

Método de crecimiento en cultivo líquido (el cual puede ser medido como un aumento en el peso seco o como un aumento en la turbidez).

-

El método conocido como bioautografía (el cual utiliza una suspensión de esporas fúngicas, mientras que el extraído a analizar se separa previamente por cromatografía en capa delgada (CCD).

Se prefirió en este caso el método de crecimiento radial puesto que es el bioensayo más adecuado para hongos de rápido crecimiento. Se utilizó Agar PDA, este se incubó a 27 ºC de 5 a 10 días. Después de la incubación se añadió 10 mL de agua destilada para remover las estructuras del hongo, de allí se tomaron 0,1 mL para realizar siembra masiva con escobillón estéril. Se tomaron los discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con una concentración de 30 mg/mL de acetona. Se utilizó Griseofulvina como control positivo y como control negativo agua estéril. Se dejaron incubando a 27 ºC de 3 – 5 días, luego del tiempo de incubación se realizó la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron cinco (5) veces. 5.6.1.1.3 Levadura Teniendo la cepa totalmente aislada de Candida albicans, se tomaron de 4 a 5 colonias y se colocaron en un tubo que contenía 5 mL de solución salina al 0,85%, se ajustó la concentración con el tubo Nº 0.5 Mc Farland (1.5 x 106 UFC/mL), luego la suspensión ajustada se sembró masivamente con escobillón estéril en Agar PDA. Posteriormente se tomaron discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con una concentración de 30 mg/mL de acetona. El control positivo fue un disco de papel con Griseofulvina (10mg/mL) y el control negativo fue agua estéril.

lxxv

En todos los ensayos la lectura de los halos de inhibición (mm) de la actividad antimicrobiana se determinó de la siguiente manera: C = A - B C = Tamaño del halo de inhibición ( mm) A = Tamaño del halo + disco de papel filtro B = Tamaño del disco de papel filtro(6 mm) 5.6.2 Ensayo biodirigido: Se realizó un estudio bioguiado al extracto que presentó mayor actividad antimicrobiana, realizando una serie de fraccionamientos utilizando diferentes solventes (diclorometano, alcohol isoamílico y agua) para determinar cual fracción es la responsable de la actividad antimicrobiana. Se tomó aproximadamente de 0.2 a 0.4 g de extracto vegetal y se disolvió en agua, se mezcló y se adicionó diclorometano (DCM), esto se agitó en un embudo de decantación y se le sacó el gas abriendo la llave, este proceso se realizó 3 veces. Se mantuvo sobre un soporte metálico dejando que se separaran las fases (acuosa – DCM) luego se sacó la fase acuosa en un vaso de precipitado y aparte la fase de diclorometano.

lxxvi

Figura 13. Fraccionamiento hojas de Passiflora manicata.

Figura 14. Fase diclorometano (DCM) de extracto hojas Passiflora manicata.

lxxvii

La fase acuosa se volvió adicionar al embudo de decantación y se agrego alcohol isoamílico, se agitó y se dejo escapar el gas abriendo la llave, este proceso se realizó 3 veces. Se dejo sobre el soporte esperando que se separaran las fases (acuosa – alcohol isoamílico), posteriormente se obtuvo la fase acuosa y la fase de alcohol isoamílico por separado.

Figura 15. Fase Acuosa - Fase Alcohol Isoamílico de extracto hojas de Passiflora manicata. Al final del procedimiento cada fase fue secada en el rotavapor para conocer el peso (g) extracto de la fracción obtenida.

lxxviii

Figura 16. Proceso para la obtención de fracciones a partir del material vegetal 5.7 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN La presente investigación estuvo basada en un estudio experimental cuantitativo que buscaba encontrar la mayor actividad antimicrobiana representada en halos de inhibición que tuvieran los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa y determinar cual de ellos era el mejor frente a microorganismos patógenos y fitopatógenos. En la experimentación se determinaron cinco (5) tratamientos diferentes, cada uno contó con cinco (5) repeticiones.

lxxix

5.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO La presente investigación estuvo basada en un estudio experimental cuantitativo, el análisis estadístico se determinó por medio de la prueba ANOVA (Análisis de varianza) y la comparación de medias de Tukey. Cada ensayo se realizó cinco (5) veces. Hipótesis nula: Ninguno de los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados de referencia (Patógenos y fitopatógenos). Hipótesis alterna: Todos los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados de referencia (Patógenos y fitopatógenos). Variables: Las variables planteadas en el presente trabajo contribuirán a la determinación de aquellas especies que tienen propiedades antimicrobianas. •

Dependiente: Tamaño de Halo de inhibición medido en mm.

•

Independiente: Tipo de microorganismo y tipo de extracto

lxxx

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Es común el empleo popular de partes vegetales con la finalidad de obtener diversos efectos terapéuticos. Varios estudios han validado científicamente la eficacia de numerosos usos de la medicina tradicional utilizada por la gente. Entre las variadas aplicaciones terapéuticas de los vegetales, se incluyen aquellas con finalidad antimicrobiana (Garzón, 2006). Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata frente a los microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y Alternaria sp, se diseñó un experimento en el que se compara la capacidad de los extractos vegetales de inhibir el crecimiento de los microorganismos a través de la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana, usando el Cloramfenicol (Cm) y la griseofulvina como control positivo, teniendo en cuenta que es un antibiótico de amplio espectro activo en técnicas in vitro contra un gran número de bacterias, ya que previene la formación de enlaces peptídicos y la síntesis proteica en gran variedad de organismos Gram negativos y Gram positivos. La inhibición de la síntesis de proteínas causada por el Cm en la mayoría de los microorganismos susceptibles produce un efecto bacteriostático (Morales Y., 2007). En el presente trabajo se utilizó una dosis de Cm (10 mg/mL), que al compararla con la dosis de los extractos etanólicos de las plantas (30 mg/mL), determinó que la concentración del extracto es tres (3) veces mayor que la del antibiótico, lo cual mostró efectividad presentando una no correlación con la dosis empleada para el antibiótico sintético, lo que nos permitió inferir que la concentración del extracto debe ser más elevada, por ser una mezcla compleja de sustancias, mientras que el Cm

lxxxi

es una molécula sintética, la cual contiene sus parámetros ya estandarizados (Torres, 2007). En este experimento, la capacidad antimicrobiana es medida a través del diámetro del halo de inhibición, el cual es afectado por dos factores: El microorganismo y el extracto vegetal, en donde la actividad antimicrobiana de varios extractos vegetales es evaluada sobre los diferentes microorganismos seleccionados. A continuación se presentan cinco gráficas (gráfica 1 - 5) que describen los resultados del experimento conducido. En todos los casos, los puntos representan los diámetros de los halos de inhibición que se obtuvieron en el experimento para cada extracto vegetal considerado. En todos los ensayos se tomó como patrón de referencia el control positivo para determinar cual era el que tenía mayor actividad antimicrobiana. Tabla 4. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para S. aureus.

Extractos

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

X

σ

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

EX1

4

6

5

4

4

4.6

0.894

EX2

5

4

4

3

4

4.0

0.707

EX3

9

9

6

6

7

7.4

1.516

EX4

1

0

1

2

2

1.2

0.836

Control

24

24

19

19

26

22.4

3.209

Positivo

lxxxii

Gráfica 1. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para S. aureus.

Se observa claramente que el diámetro de los halos de inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata fue menor al de los demás extractos en presencia del microorganismo Staphylococcus aureus, es decir, que el poder inhibidor de este extracto vegetal es mínimo. Se observa también que frente a este microorganismo el extracto que presentó mejor actividad fue el de Myrcianthes rhopaloides, el cual estuvo más cercano al valor obtenido para el control positivo (Gráfica 1). Las posibles razones para que el crecimiento del microorganismo se viera poco afectado es la existencia de mecanismos de resistencia por parte de S. aureus, la cual esta relacionada con la activación de una síntesis de la pared celular, con hiperproducción de proteínas ligadoras de penicilinas, engrosamiento de la pared y el encarcelamiento de fármacos por hiperproducción de los componentes de pared (Tavares, 2000). Otros mecanismos que posee la bacteria son la producción de la enzima coagulasa que hace que se deposite el material de fibrina sobre los cocos protegiéndoles del ataque por las células del hospedador, producción de proteasas, nucleasas y lipasas

lxxxiii

que sirven para despolimerizar las proteínas del hospedador, los ácidos nucleicos y las grasas, el desarrollo de una vía bioquímica resistente la cual puede tener lugar por intercambio genético bloqueando el agente antimicrobiano y por eflujo donde el microorganismo es capaz de bombear hacia afuera el antimicrobiano que va entrando en la célula. Estudios previos han demostrado que S. aureus posee genes que le permiten generar resistencia contra biocidas (Agentes químicos y antibióticos) (Tavares, 2000). Tabla 5. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para E. coli. Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Extractos

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

Σ

EX1

6

6

6

9

9

7.2

1.643

EX2

4

7

6

4

6

5.4

1.341

EX3

9

10

12

9

10

10

1.224

EX4

24

19

24

14

12

18.6

5.549

Control

24

24

24

19

19

22

2.738

Positivo

lxxxiv

Gráfica 2. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para E. coli.

En el caso de Escherichia coli se evidencia que el poder inhibidor del extracto vegetal Passiflora manicata es muy similar al del Control Positivo (C+), representando una buena actividad antimicrobiana para este. Sin embargo los demás extractos presentaron actividad aunque mucho menor en comparación con el control positivo y con el extracto de Passiflora manicata (Gráfica 2). E. coli hace parte de las bacterias Gram negativas, además del peptidoglicano, poseen una capa adicional en su pared que esta compuesta de lipopolisacáridos. Esta capa representa una segunda bicapa lipídica, que no consta solamente de fosfolípidos como la membrana plasmática, sino que contiene polisacáridos y proteínas. Los lípidos y polisacáridos están estrechamente unidos en la capa externa formando estructuras lipopolisacáridas específicas. La presencia del lipopolisacárido justifica que la membrana externa se denomine generalmente capa de lipopolisacárido o simplemente LPS. Los mecanismos de resistencia de estas bacterias pueden presentarse como alteración del sitio blanco o diana de antimicrobianos, disminución de la permeabilidad de la pared por poseer una pequeña capa de peptidoglicano, la cual es más sensible, adquisición de mecanismo de eflujo y cambio de vía metabólica

lxxxv

externa, lo anterior podría sugerir que el extracto etanólico de Passiflora manicata puede poseer sustancias capaces de contrarrestar los mecanismos de resistencia del microorganismo, como por ejemplo las saponinas las cuales actúan sobre los lípidos de la membrana ocasionando alteraciones y provocando muerte celular; así como lo indica la Tabla Nº 5 presentando solo una diferencia de 2 unidades frente al control positivo. Tabla 6. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para B. subtillis. Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Extractos

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

σ

EX1

7

5

6

9

9

7.2

1.789

EX2

5

7

6

4

4

5.2

1.303

EX3

14

14

19

24

22

18.6

4.560

EX4

34

36

39

34

36

35.8

2.049

Control

34

39

39

34

39

37

2.738

Positivo

lxxxvi

Gráfica 3. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para B. subtillis.

Se observa para Bacillus subtillis que el efecto inhibidor de los extractos es mayor al compararlos frente a los demás microorganismos evaluados, en este caso para Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata, siendo este último el más cercano al control positivo, definiendo que el extracto tiene el mejor poder inhibidor, lo cual se traduce en que dicha especie puede ser una fuente natural de antimicrobianos cumpliendo un papel importante en el área terapéutica capaz de inhibir un bacilo Gram positivo esporulado, de tomar una molécula de DNA y transformarla, siendo este un elemento natural que el microorganismo posee como factor de competencia y resistencia regulada, existiendo

proteínas especiales que juegan un papel en el

transporte y procesamiento del DNA. Estas proteínas específicas de competencia incluyen una proteína de unión del DNA que esta asociada a la membrana, una autolisina de la pared celular y varias nucleasas (Gutowski-Eckel, 1994) (Gráfica 3). de nutrientes esenciales como el nitrógeno y el carbono, proceso que solo dura 8 horas. Este microorganismo fue el más sensible en todos los ensayos biológicos posiblemente puede deberse a la estructura de su pared celular ya que como es un microorganismo Gram positivo es menos compleja pues esta compuesta por una lxxxvii

membrana citoplasmática y una capa gruesa de peptidoglicano en comparación con los microorganismos Gram negativos que tienen una pared más compleja ya que posee una membrana citoplasmática, un delgada capa de peptidoglicano, lipopolisacáridos y proteínas. Tabla 7. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para C.albicans. Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Extractos

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

σ

EX1

0

4

4

0

0

1.6

2.190

EX2

2

3

0

5

6

3.2

2.387

EX3

1

4

9

4

5

4.6

2.880

EX4

3

4

5

9

6

5.4

2.302

Control

8

8

9

9

8

8.4

0.547

Positivo

Tabla 8. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rophaloides y Passiflora manicata para Alternaria sp.. Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Extractos

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

σ

EX1

1

4

4

2

1

2.4

1.516

EX2

2

3

4

2

2

2.6

0.894

EX3

2

8

2

5

6

4.6

2.607

EX4

3

4

6

4

4

4.2

1.095

Control

5

8

8

5

6

6.4

1.516

Positivo

lxxxviii

Gráfica 4. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para C.albicans.

Gráfica 5. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al control positivo para Alternaria sp

En las gráficas 4 y 5 se puede apreciar que para la levadura y el hongo fitopatógeno ninguno de los extractos vegetales, incluido el Control Positivo (C+), logró generar halos con diámetro superior a 10 mm. Lo que indica que los extractos vegetales no presentaron una eficiente actividad antimicrobiana frente a este tipo de lxxxix

microorganismos, por ser complejos y adicionalmente poseer diversos mecanismos de resistencia entre las que encontramos la pared celular compuesta de polisacáridos, proteínas, lípidos, iones inorgánicos y mananos. Los polisacáridos (Quitina) y glucanos no celulósicos. Los resultados anteriormente expuestos sugieren que los extractos evaluados son más eficientes con bacterias debido a que sus estructuras y metabolismo celular es mucho menos complejo que el de los hongos (Tavares, 2000). Para el análisis de los datos se planteó el siguiente modelo: yij = µ + αi +βi+ (αβ)ij +Ԫij Donde yij es el valor del halo de inhibición en cada observación, µ es la media general, αi es el efecto del factor A (microorganismo), βj es el efecto del factor B (extracto utilizado), (αβ)ij es el efecto de la interacción de los dos factores €ij es el efecto de error aleatorio. ij = 5 Se plantean hipótesis para probar los efectos de cada factor y de la interacción de estos. Para los efectos del factor A (microorganismo) se plantea: H0: α1 = α2 = α3 = α4 = α5 = 0 Hi: al menos un αi ≠ 0 Para probar los efectos del factor B (extracto) se plantea: H0: β1 = β2 = β3 = β4 = β5 = 0 Hi: al menos un βi ≠ 0 Para probar el efecto de la interacción de los factores A y B se plantea:

xc

H0: (αβ)ij = 0 para toda i, j Hi: al menos una (αβ)ij ≠ 0 En todas las tablas están sombreados de rojo los microorganismos que presentaron mayor resistencia y los extractos que tuvieron mayor actividad antimicrobiana; de azul están sombreados los microorganismos más sensibles y los extractos con menor actividad antimicrobiana. Tabla 9. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores Fuente de variación MICR EXTRAC MICR * EXTRAC Error Total

Suma de cuadrados 4783,12 3993,68 3260,8

gl 4 4 16

536,4 12574

100 124

Cuadrados medios 1195,78 998,42 203,8

F 222,93 186,13 37,99

Sig. 0,000 0,000 0,000

5,36

R Squared = ,957 (Adjusted R Squared = ,947) La tabla 11 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores (Microorganismo – Extracto) y de la interacción es menor a 0.05, por lo tanto se rechazan las hipótesis nulas, es decir, existen diferencias significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se presenta un efecto significativo del extracto utilizado sobre el tamaño de los halos de inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción microorganismo*extracto.

xci

Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos seleccionados N

SUBSET

Alternaria sp.

25

4.04

C. Albicans

25

4.64

S. aureus

25

E. coli

25

B. subtillis

25

MICR

Sig.

7.92 12.64 20.76 0.89

1

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que Alternaria sp. y C. albicans son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, los otros microorganismos presentaron halos de inhibición significativamente superiores, en orden de menor a mayor inhibición están: S. aureus, E. coli y B. subtillis. Tabla 11. Prueba de comparación de medias de Tukey para extractos. N

SUBSET

Hesperomeles ferruginea

25

4.08

Valeriana pilosa

25

4.6

Myrcianthes rhopaloides

25

Passiflora manicata

25

Control positivo

25

EXT.

Sig.

9.04 13.04 19.24 0.93

1

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey entre extractos muestra que los extractos 2 y 1 presentaron menor efecto inhibidos, pues presentan los menores xcii

promedios de tamaño de halo; los extractos 3, 4 y 5 (control positivo) presentan tamaños de halo progresivamente superiores, con diferencias significativas entre sí. Como se presentó efecto significativo de la interacción entre los factores extracto y microorganismo, se evaluaron las diferencias por cada microorganismo, utilizando el siguiente modelo: yijk= µ + αi + ℇijk Donde yijk es el valor del halo de inhibición en cada observación, µ es la media general, αi es el efecto del extracto utilizado y ℇijkes el efecto de error aleatorio. Tabla 12. Análisis de varianza para S. aureus Fuente de variación EXTRAC Error Total

Suma de cuadrados 1407.44 58.4 1465.84

gl

Cuadrados medios 351.86 2.92

4 20 24

F 120.5

Sig. 0,000

R Squared = ,960 (Adjusted R Squared = ,952)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el halo de inhibición en S. aureus.

xciii

Tabla 13. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus

N

SUBSET

Passiflora manicata

5

1.2

Hesperomeles ferruginea

5

4

Valeriana pilosa

5

Myrcianthes rhopaloides

5

Control positivo

5

EXT.

4 4.6

4.6 7.4 22.4

Sig.

0.11

0.98

0.11

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los extractos; el extracto 3 presenta un efecto significativamente superior al del extracto 2. Tabla 14. Análisis de varianza para E. coli Fuente de variación EXTRAC Error Total

Suma de cuadrados 1060.56 177.2 1237.76

gl

Cuadrados medios 265.14 8.86

4 20 24

F 29.92551

Sig. 0,000

R Squared = ,857 (Adjusted R Squared = ,828)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el halo de inhibición en E. coli.

xciv

Tabla 15. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli

N

SUBSET

Hesperomeles ferruginea

5

5.4

Valeriana pilosa

5

7.2

Myrcianthes rhopaloides

5

10

Passiflora manicata

5

18.6

Control positivo

5

22

EXT.

Sig.

0.144481

0.397581

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los extractos 1,2 y 3. El extracto 4 presenta un efecto significativamente al del extracto 2. Tabla 16. Análisis de varianza para B. subtillis Fuente de variación EXTRAC Error Total

Suma de cuadrados 4602.96 149.6 4752.56

gl

Cuadrados medios 1150.74 7.48

4 20 24

F 153.8422

Sig. 0,000

R Squared = ,969 (Adjusted R Squared = ,962)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el halo de inhibición en B. subtillis.

xcv

Tabla 17. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis

N

SUBSET

Hesperomeles ferruginea

5

5.2

Valeriana pilosa

5

7.2

Myrcianthes rhopaloides

5

Passiflora manicata

5

35.8

Control positivo

5

37

EXT.

18.6

Sig.

0.775186

1

0.955519

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los extractos 1,2 y 3. El extracto 4 presenta un efecto significativamente al del extracto 2. Los extracto 4 y 5 no presentan diferencia significativa entre ellos. Tabla 18. Análisis de varianza para Candida albicans. Fuente de variación EXTRAC Error Total

Suma de cuadrados 130.16 97.6 227.76

gl

Cuadrados Medios 32.54 4.88

4 20 24

F 6.668033

Sig. 0,001

R Squared = ,571 (Adjusted R Squared = ,486)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el halo de inhibición en Candida albicans.

xcvi

Tabla 19. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans

N

SUBSET

Valeriana pilosa

5

1.6

Hesperomeles ferruginea

5

3.2

Myrcianthes rhopaloides

5

4.6

4.6

Passiflora manicata

5

5.4

5.4

Control positivo

5

EXT.

8.4

Sig.

0.086117

0.086117

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los extractos 1, 2. Los extractos 3 y 4 no presentan diferencias significativas entre ellos. Tabla 20. Análisis de varianza para Alternaria sp. Fuente de variación EXTRAC Error Total

Suma de cuadrados 53.36 53.6 106.96

gl

Cuadrados Medios 13.34 2.68

4 20 24

F 4.977612

Sig. 0,006

R Squared = ,499 (Adjusted R Squared = ,399)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el halo de inhibición en Alternaria sp.

xcvii

Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.

N

SUBSET

Valeriana pilosa

5

2.4

Hesperomeles ferruginea

5

2.6

Passiflora manicata

5

4.2

4.2

Myrcianthes rhopaloides

5

4.6

4.6

Control positivo

5

EXT.

6.4

Sig.

0.248543

0.248543

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición estadísticamente no significativo entre todos los extractos. Los extractos 1 y 2 no presentan diferencias significativas entre ellos, al igual que los extractos 3 y 4. Tabla 22. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para E. coli. Extracto Passiflora

Replica 1

manicata

(mm)

FR1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

X

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

10

8

8

9

8

8.6

0.894

FR2

0

0

0

0

0

0

0

FR3

0

1

0

2

0

0.6

0.894

Control

21

22

18

19

21

20.2

1.643

positivo

xcviii

Σ

Tabla 23. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para S. aureus. Extracto Passiflora

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

X

σ

manicata

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

FR1

5

4

3

3

5

4

1

FR2

0

0

0

0

0

0

0

FR3

0

0

0

0

0

0

0

Control

18

19

18

20

20

19

1

positivo

Tabla 24. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para B. subtillis. Extracto Passiflora

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

X

manicata

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

FR1

6

5

6

4

5

5.2

0.836

FR2

0

0

0

0

0

0

0

FR3

1

1

0

2

1

1

0.707

Control

30

32

34

32

34

32.4

1.673

positivo

xcix

Σ

Tabla 25. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Candida albicans. Extracto Passiflora

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

manicata

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

FR1

3

5

4

4

FR2

0

1

0

FR3

0

0

Control

12

11

Replica 5

X

Σ

3

3.8

0.836

1

0

0.4

0.547

0

0

0

0

0

13

11

13

12

1

(mm)

positivo

Tabla 26. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar y de fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Alternaria sp. Extracto Passiflora

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

X

manicata

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

FR1

4

5

0

0

5

4.7

0.577

FR2

0

0

0

0

0

0

0

FR3

0

0

0

0

0

0

0

Control

22

23

22

20

20

21.4

1.342

positivo

c

σ

Gráfica 6. Diámetro de halos de inhibición Vs. Microorganismos seleccionados para las diferentes fases.

Con base en el análisis de los resultados estadísticos se determinó que el extracto más eficiente frente a todos los microorganismos evaluados fue el de la especie Passiflora manicata, siendo este extracto el candidato para realizar el fraccionamiento para determinar cual fración era la responsable de la actividad antimicrobiana. En la Gráfica 6 se aprecian las diferencias entre el diámetro promedio del halo de inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata en presencia de los microorganismos seleccionados para cada una de las fases (FR1, FR2, FR3). Se observa que el comportamiento del halo de inhibición en FR2 y FR3 del extracto vegetal es muy similar, adicionalmente que el diámetro del halo de inhibición en FR1 es más parecido al halo del Control Positivo (C+) en comparación a las otras dos fases.

ci

Gráfica 7. Halos de inhibición Vs. Fracciones para cada microorganismo

En la Gráfica 7 se aprecian las diferencias entre el diámetro promedio del halo de inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata en sus tres fases para todos los microorganismos seleccionados. Se observa que el comportamiento de Bacillus subtillis es mayor para FR1 en comparación con las siguientes fases (FR2 y FR3). También se muestra que el microorganismo con menos actividad antimicrobiana fue C. albicans ya que el promedio de halos de inhibición fue tan solo 3.8 mm para FR1 en comparación con el mejor de B. subtillis que fue de 5.2 mm, en este caso el Control positivo (C+) fue de 12 mm. Por otra parte las tres fases evaluadas (FR1, FR2, FR3) estuvieron definidas de acuerdo a la polaridad de cada solvente, es decir, de mayor a menor polaridad. Donde FR1 es una mezcla de compuestos de alta polaridad en los cuales posiblemente se pueden encontrar taninos, proteínas hidrosolubles y azúcares responsables de la actividad antimicrobiana evaluada, tal como lo sugiere Domingo & Lopez Brea (2003) 1 al definir que los extractos vegetales poseen una gran cantidad de compuestos químicos con carácter antimicrobiano, algunos de los cuales muestran una actividad in Vitro comparable a los de los microbianos sintéticos utilizados en la

cii

clínica, lo que podemos comparar con el extracto etanólico de Passiflora manicata al observar los resultados obtenidos en el tamaño de halos de inhibición del extracto Vs. control positivo. De esta manera en la fase FR1 se observó halos de inhibición superiores a los de las demás fases indicando que en ella se encuentra la molécula responsable del principio activo con marcada actividad antimicrobiana. La fracción FR2 fue la que obtuvo el menor rendimiento en la evaluación antimicrobiana para el extracto vegetal de Passiflora manicata. Tabla 27. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores Fuente de variación MICR FRAC MICR * FRAC Error Total

Suma de cuadrados 347.76 7306.59 836.96

gl 4 3 12

83.2 8574.51

80 99

Cuadrados medios 86.94 2435.53 69.74667

F 83.59615 2341.856 67.0641

Sig. 0,000 0,000 0,000

1.04

R Squared = ,990 (Adjusted R Squared = ,988) La tabla 29 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores (Microorganismo – Extracto) y de la interacción es menor a 0.05. Existen diferencias significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se presenta un efecto significativo de la fracción utilizada sobre el tamaño de los halos de inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción microorganismo*fracción.

ciii

Tabla 28. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos seleccionados . N

SUBSET

C. albicans

20

4.05

S. aureus

20

5.75

Alternaria sp.

20

6.05

E. coli

20

B. subtillis

20

MICR

7.35 9.65

Sig.

1

0.884324

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que Candida albicans y S. aureus son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, los otros microorganismos presentaron halos de inhibición significativamente superiores, en orden de menor a mayor inhibición están: Alternaria sp., E. coli y B. subtillis. Tabla 29. Prueba de comparación de medias de Tukey para fracciones. N

SUBSET

FR2

25

0.08

FR3

25

0.32

FR1

25

C+

25

EXT.

Sig.

4.88 21 0.83908

civ

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey entre fracciones muestra que las fracciones 2 y 3 presentaron menor efecto inhibidor, pues presentan los menores promedios de tamaño de halo; las fracciones 1 y 4 (control positivo) presentan tamaños de halo progresivamente superiores, con grandes diferencias significativas entre sí. Tabla 31. Análisis de varianza para S. aureus con las diferentes fracciones Fuente de variación FRAC Error Total

Suma de cuadrados 1223.75 8 1231.75

gl

Cuadrados medios 407.9167 0.5

3 16 19

F 815.8333

Sig. 0,000

R Squared = ,994 (Adjusted R Squared = ,992)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el halo de inhibición en S. aureus. Tabla 30. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus N

SUBSET

FR2

5

0

FR3

5

0

FR1

5

C+

5

FRAC.

4 19 1

Sig.

cv

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las fracciones; la fracción 1 presenta un efecto significativamente al de las demás fracciones. Tabla 32. Análisis de varianza para E. coli con las diferentes fracciones Fuente de variación FRAC Error Total

Suma de cuadrados 1331.35 17.2 1348.55

gl

Cuadrados Medios 443.7833 1.075

3 16 19

F 412.8217

Sig. 0,000

R Squared = ,987 (Adjusted R Squared = ,985)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de las fracciones sobre el halo de inhibición en E. coli. Tabla 33. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli N

SUBSET

FR2

5

0

FR3

5

0.6

FR1

5

C+

5

FRAC.

Sig.

8.6 20.2 0.797264

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con todas

cvi

las fracciones. La fracción 1 presenta un efecto significativamente superior a las fracciones 2 y 3. Tabla 34. Análisis de varianza para B. subtillis con las diferentes fracciones Fuente de variación FRAC. Error Total

Suma de cuadrados 3526.55 16 3542.55

gl

Cuadrados medios 1175.517 1

3 16 19

F 1175.517

Sig. 0,000

R Squared = ,995 (Adjusted R Squared = ,995)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el halo de inhibición en B. subtillis. Tabla 35. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis N

SUBSET

FR2

5

0

FR3

5

1

FR1

5

C+

5

FRAC.

Sig.

5.2 32.4 0.416163

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las fracciones 1,2 y 3. La fracción 1 presenta un efecto significativamente superior al de las otras.

cvii

Tabla 36. Análisis de varianza para Candida albicans. Fuente de variación FRAC. Error Total

Suma de cuadrados 464.95 8 472.95

gl

Cuadrados Medios 154.9833 0.5

3 16 19

F 309.9667

Sig. 0,000

R Squared = ,983 (Adjusted R Squared = ,980)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el halo de inhibición en Candida albicans. Tabla 37. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans N

SUBSET

FR3

5

0

FR2

5

0.4

FR1

5

C+

5

FRAC.

Sig.

3.8 12 0.807829

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las fracciones. La fracción 1 presentan diferencias significativas con respecto a las fracciones 2 y 3.

cviii

Tabla 38. Análisis de varianza para Alternaria sp. Fuente de variación FRAC Error Total

Suma de cuadrados 1596.95 34 1630.95

gl

Cuadrados Medios 532.3167 2.125

3 16 19

F 250.502

Sig. 0,000

R Squared = ,979 (Adjusted R Squared = ,975)

La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el halo de inhibición en Alternaria sp. Tabla 39. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp. N

SUBSET

FR2

5

0

FR3

5

0

FR1

5

C+

5

FRAC.

Sig.

2.8 21.4 1

1

1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta un promedio de halo de inhibición estadísticamente significativo para todas las fracciones. La fracción 1 presenta diferencias significativas entre ellas.

cix

Tabla 40. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para B. subtillis. Aceite

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Esencial

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

σ

AE 1

9

1

2

9

9

6

4.123

Control

34

37

34

39

34

35.6

2.302

positivo

Tabla 41. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para S. aureus. Aceite

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Esencial

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

σ

AE 1

24

19

19

14

19

19

3.535

Control

27

27

30

29

29

28.4

1.341

positivo

Tabla 42. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para E. coli. Aceite

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Esencial

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

σ

AE 1

6

4

7

4

3

4.8

1.643

Control

16

15

15

17

15

15.6

0.894

positivo

cx

Tabla 43. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Alternaria sp. Aceite

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Esencial

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

X

Σ

AE 1

19

14

19

17

19

17.6

2.191

Control

28

27

27

29

29

28

1

positivo

Tabla 44. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Candida albicans. Aceite

Replica 1

Replica 2

Replica 3

Replica 4

Replica 5

Esencial

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

(mm)

AE 1

24

22

20

24

22

22.4

1.673

Control

26

24

29

27

24

26

2.121

X

Σ

positivo

Gráfica 8. Halos de inhibición Vs Microorganismos seleccionados frente al aceite esencial de M. rhopaloides

La Gráfica 8 muestra que el microorganismo que mejor se comporto frente al aceite cxi

esencial fue Candida albicans. En general las bacterias Gram positivas (Bacillus subtillis, S. aureus) fueron mas sensibles que la bacteria Gram negativa (E. coli) la cual fue más resistente frente a este, pudiendo tener su causa en la diferencia que presentan estas bacterias en cuanto a su pared celular, lo cual determinará la penetración o no del terpenoide a la célula bacteriana para que produzca su acción bacterioestatica ( Maguna, 2006). Según Maguna (2006) uno de los principales mecanismos de acción propuestos para los terpenoides consiste en la disrupción de la membrana celular bacteriana mediante tres (3)

posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones

pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos tres efectos produce la muerte en la célula bacteriana Entonces podríamos considerar que el hecho de que las bacterias Gram negativas presenten mayor sensibilidad, entre otras cosas, puede deberse a su pared celular menos compleja dado que tiene una capa simple (red de mureína delgada), mientras que en las Gram positivas es una estructura de multicapa (red de mureína muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas) (Maguna, 2006). Con base en lo anterior y de acuerdo con lo reportado por iii Hernández & Rodríguez (2001), se confirma con los resultados obtenidos para el aceite esencial evaluado de las hojas de Myrchianthes rhopaloides encontrando que también posee actividad antibacteriana y antifúngica como otras especies vegetales de familia de Myrtaceae. Finalmente se puede establecer que los extractos etanólicos de las especies vegetales evaluados poseen de leve a moderada actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados, encontrando que el que posee mas potencial bacteriostático y fungistático es el extracto obtenido a partir de las hojas de Passiflora manicata, el cual teniendo un amplio espectro de inhibición puede ser capaz de

cxii

inhibir tanto micoorganismos Gram positivos, Gram negativos y hongos siendo mas efectivos frente al primer grupo mencionado, adicionalmente la fracción del extracto crudo identificada con potencial antimicrobiano fue la fase en donde pueden encontrarse compuestos de alta polaridad como taninos y proteínas entre otros reportados por diversos autores como responsables de dicha actividad (Ver figura 18, 19 y 20 ) En cuanto Myrcinathes rhopaloides se confirma que al aceite esencial obtenido a partir de las hojas posee actividad antibacterina como lo han reportado para especies de la familia de las Mirtaceas. Tabla 45. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores Fuente de variación MICR ACEITE MICR * ACEITE Error Total

Suma de cuadrados 1352.72 2035.22 970.48

gl

212.8 4571.22

40 49

4 1 4

Cuadrados medios 338.18 2035.22 242.62

F 63.56767 382.5602 45.60526

Sig. 0,000 0,000 0,000

5.32

R Squared = ,953 (Adjusted R Squared = ,943) La Tabla 47 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores (Microorganismo – Aceite) y de la interacción es menor a 0.05. Existen diferencias significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se presenta un efecto significativo del aceite utilizado sobre el tamaño de los halos de inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción microorganismo*aceite.

cxiii

Tabla 46. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos seleccionados con respecto al aceite esencial. N

SUBSET

E. coli

10

10.2

B. subtillis

10

20.8

Alternaria sp.

10

22.8

22.8

S. aureus

10

23.7

23.7

C. albicans

10

MICR

Sig.

24.2 1

0.055535

0.657771

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que E. coli y S. aureus son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, en general no hay diferencias significativas entre el valor promedio de los halos de inhibición y los microorganismos seleccionados.

cxiv

A

B

D

C

E

Figura 17. Ensayos biológicos con extractos vegetales EX1 (Valeriana pilosa), EX2 (Hesperomeles ferruginea), EX3 (Myrcianthes rhopaloides), EX4(Passiflora manicata) , C+ (Control positivo), C- (Control Negativo) frente a microorganismos patógenos y fitopatógenos A. Escherichia coli, B. Candida albicans, C. Staphylococcus aureus, D. Bacillus subtillis, E. Alternaria sp.

Figura 18. Ensayo biológico de las fracciones (FR1: Fase acuosa, FR2: Fase Diclorometano, FR3: Alcohol isoamilico) del extracto de Passiflora manicata frente a E. coli

cxv

A

B

Figura 19. Ensayo biológico del aceite esencial del extracto de M. rhopaloides frente A. B. subtillis y B. C. albicans

cxvi

7. CONCLUSIONES

• El extracto etanólico de hojas de Passiflora manicata reveló la mayor actividad antimicrobiana contra los microorganismos seleccionados, siendo Bacillus subtillis el microorganismo con los valores más altos de inhibición. • Los microrganismos Gram positivos evaluados fueron más sensibles al poder inhibidor de los extractos etanólicos, siendo los hongos los que mostraron más resistencia. • La fase acuosa del extracto etanólico crudo manicata

mostró

mayor

actividad

de las

antimicrobiana

hojas de Passiflora con

todos

los

microorganismo seleccionados en comparación con la fase de diclorometano y la fase de alcohol isoamílico evaluada. • El aceite esencial obtenido de las hojas de Myrchiantes rhopaloides presentó mayor actividad antimicrobiana obtenida frente a los microorganismos evaluados. • El extracto etanólico obtenido de Passiflora manicata puede constituirse en una fuente de principios activos que contribuyan al descubrimiento de antimicrobianos de origen natural los cuales pueden ser utilizados como linea base para la sintesis de moléculas útiles a nível farmacéutico. • El estudio realizado permitió conocer algunas de las potencialidades de uso de las especies Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Valeriana pilosa

presentes en los ecositemas del Distrito

Capital y la región contribuyendo al aumento del conocimiento de las mismas.

cxvii

8.RECOMENDACIONES

•

Se recomienda identificar, separar y elucidar la molécula presente en la fase acuosa del extracto crudo de Passiflora manicata responsable de la actividad antimicrobiana reportada en el presente trabajo, con el fin de generar alternativas para la obtención de nuevos antimicrobianos de amplio espectro a partir de una fuente de origen natural .

•

Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la concentración inhibitoria mínima de la fase acuosa con el objetivo de utilizar el extracto obtenido en la formulación de nuevos productos con potencial biocida.

•

Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la estabilidad del extracto obtenido frente a agentes físicos y químicos que puedan interferir en la actividad antimicrobiana descrita en el presente trabajo.

cxviii

9.BIBLIOGRAFIA

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Chromatographie

von

Solanm

–

Steroidsapogeninen. J. Chromatogr. 12, 63 – 69 (R 2.12 2.15)

cxxiii

Seroidalkaloiden

und

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cxxiv

ANEXO 1 PREPARACIÓN AGAR MUELLER HINTON

Composición

g/L

Infusión de carne

2

Hidrolizado de caseína

17.5

Almidón Agar – Agar

1.5 13

Preparación Disolver 34 g/L, esterilizar con cuidado en autoclave (10 min a 115ºC). Enfriar eventualmente a 45 – 50 ºC para incorporar del 5 al 10% de sangre desfibrinada. Verter placas. pH: 7.4 ± 0.2. Las placas con medio de cultivo sin la sangre son claras y de color parduzco opalecescent.

cxxv

ANEXO 2 PREPARACIÓN AGAR CHROMOCULT

Composición

g/L

Peptona

3

Cloruro sódico

5

Dihidrógenofosfato potásico

1.7

Hidrógenofosfato dipotásico

3

Piruvato sódico

1

Triptófano

1

Lauril sulfato sódico

0.1

Mezcla de cromógenos

0.2

Agar – Agar

12

Preparación Disolver 27 g/L en agua desmineralizada por calentamiento en el baño de agua hirviendo o en vapor fluente, enfriar a 45 – 50 ºC y verter en placas. pH 6.8 ± 0.1 a 25 ºC. El empleo se rige según los correspondientes métodos de investigación para agua y alimentos. Incubación: 24 horas, eventualmente hasta 48 horas a 35 – 37 ºC.

cxxvi

ANEXO 3 PREPARACIÓN AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

Composición

g/L

Infusión de patata (preparada a partir de 200 g de patata)

4

Glucosa

20

Agar – Agar

15

Preparación Disolver 39 g/L y esterilizar en autoclave (15 min, a 121ºC). pH: 5,6 ± 0,1. Para ajustar el pH a aprox. 3,5, incorporar al medio de cultivo, a 45 – 50ºC, una solución estéril de ácido tartárico al 10%, a razón de 14 mL/L. Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras. Este medio de cultivo se siembra, por estría, en superficie, o mediante el procedimiento de incorporación. Incubación: hasta 5 días a temperatura ambiente. Levar a cabo la investigación de acuerdo con los correspondientes fines de empleo.

ANEXO 4

cxxvii

PREPARACIÓN AGAR BAIRD PARKER

Composición

g/L

Peptona de caseína

10

Extracto de carne

5

Extracto de levadura

1

Piruvato sódico

10

Glicina

12

Cloruro de Litio

5

Agar – Agar

15

Preparación Disolver 58 g en 0.95 L, esterilizar en autoclave (15 min, a 121ºC), enfriar a 45 – 50 ºC, añadir mezclando 50 mL de emulsión de yema de huevo telurito y, eventualmente, 50 mg/L de Sulfametacina. Verter en placas. pH: 6,8 ± 0,2. En tanto que el medio de cultivo basal puede guardarse de 1 a 2 meses a 4ºC, el medio de cultivo completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24 horas siguientes a su preparación. Diluir convenientemente el material a investigar y extenderlo finamente sobre la superficie del medio de cultivo. Incubación: desde 24 hasta 48 horas a 37ºC.

ANEXO 5

cxxviii

PREPARACIÓN DE AGAR BPLS (Verde brillante, Rojo de fenol, Lactosa y Sacarosa)

Composición

g/L

Peptona de

5

Peptona de caseína

5

Extracto de carne

5

Cloruro sódico

3

Hidrogenofosfato disódico

2

Lactosa

10

Sacarosa

10

Rojo de Fenol

0,08

Verde Brillante

0,0125

Agar – Agar

12

Preparación Disolver 52 g/L, esterilizar en autoclave (15 min, a 37ºC) y verter en placas. Ph: 6,9 ± 0,1. Las placas con medio de cultivo son claras con un color ligeramente rojizo. Sembrar directamente con el material objeto de investigación, o a partir de un cultivo de enriquecimiento. Deben utilizarse en paralelo medios de cultivo menos inhibidores. Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC.

cxxix

cxxx

cxxxi