RuizBovino Palomo López, Yagüe, S. A.

Ruiz López, S.

OVUM PICK UP (OPU) en bovinos: Aplicaciones en Biotecnología de la reproducción Dr. Salvador Ruiz López Dpto. Fisiología. Facultad de Veterinaria Universidad de Murcia E-mail: [email protected] - www.um.es/grupo-fisiovet En 1981, nació el primero ternero (Virgil) mediante la aplicación de sistemas de producción in vitro de embriones (PIV). Hasta la fecha, se puede estimar que más de 200.000 terneros han nacido en todo el mundo mediante PIV (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006).

58

❱ Introducción

reproducción asistida veterinaria se inicia en 1994 (Kruip et al. 1994).

La técnica de aspiración folicular transvaginal guiada por ultrasonografía (OPU, Ovum Pick-Up), desarrollada originalmente para la reproducción asistida en la especie humana (Lenz & Lauritsen, 1982), es usada por primera vez, en ganado vacuno en Holanda al final de las década de los 80 (Pieterse et al., 1988). El empleo de la OPU de forma rutinaria en

En la actualidad, y según datos de la Asociación Europea de Transferencia de Embriones (AETE), el número total de sesiones de OPU realizadas solo en Europa en 2008 fue de 3.753, lo que supone un aumento del 8´1% con respecto al año anterior. Con una producción, en ese año, de 6.751 embriones transferibles y una media de eficiencia de producción

de embriones de 1´80 por sesión. En 2008, cuatro países de Europa (Países Bajos, Alemania, Italia y Francia) aplicaron sistemas de OPU/PIV para la producción comercial de embriones (Merton, 2009). La OPU es una técnica con muchas posibilidades ya que puede ser usada en vacas adultas en varios estados fisiológicos: cíclicas, no cíclicas, durante el primer tercio de la gestación y en las que no responden a estímulos hormonales, pero

OVUM PICK UP (OPU) EN BOVINOS: aplicaciones en Biotecnología de la reproducción

también en animales viejos con desórdenes reproductivos de origen no genético (Galli et al., 2001), y en terneras y novillas prepúberes a partir del 6º-8º mes de edad (Taneja et al., 2000). La OPU supone una alternativa a la PIV de embriones bovinos realizada mediante el empleo de ovocitos procedentes de matadero. En la OPU trabajamos con ovocitos obtenidos de vacas vivas utilizando material genético de origen conocido. Se consigue producir mediante esta técnica un mayor número de embriones (hasta 100 embriones al año por vaca) que los obtenidos mediante protocolos estándar de transferencia

de aspiración y la presión de vacío (Bols et al., 1995, 1996) con lo que se ha conseguido mejorar la calidad de los ovocitos recogidos reduciendo el número de ovocitos denudados, aunque sin que se haya provocado un incremento del número total de ovocitos obtenidos por sesión de OPU. La mejora técnica más significativa ha sido la sustitución de la aguja original de 50 cm de longitud por una aguja mucho más corta (7 cm), estéril, descartable y fácilmente reemplazable entre diferentes donantes, reduciendo así el riesgo de contaminación. Además, estas agujas tienen un volumen muerto menor lo que minimiza el tiempo en el que los

nº 31

2. Factores Biológicos. Entre éstos podemos incluir los siguientes: el animal donante, la pre-estimulación hormonal, el tiempo y frecuencia de la OPU y la experiencia del operador. Animal donante. Al igual que en los sistemas MOET, la vaca donante puede explicar aproximadamente un 20% de la variación observada en términos de ovocitos por OPU y de eficiencia en la producción de embriones. Pre-estimulación con FSH (Fig. 1). La mejora más significativa con respecto al rendimiento en la calidad de los ovocitos

Figura 1. Imagen ecográfica de ovario de vaca que ha sido previamente estimulado con FSH (izquierda) y ovario sin estimulación (derecha), donde se aprecia un folículo y un cuerpo lúteo.

embrionaria (TE). La aplicación conjunta de ambas tecnologías (OPU/PIV) permite la producción de más de 50 terneros por vaca donante y año. Por lo que, ambas se convierten en las herramientas adecuadas para obtener nacimientos adicionales de donantes de alto valor genético que no pueden ser sometidos a un programa convencional de superovulación (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006).

complejos cúmulo-ovocito (COCs) están expuestos a un ambiente desfavorable y permite la obtención de fluido folicular de folículos individuales para propósitos de investigación.

y, por consiguiente para la producción de embriones fue la pre-estimulación hormonal previa a la OPU mediante el uso de gonadotropinas (De Roover et al., 2005, 2008). Muchos autores han

La recuperación repetida de ovocitos mediante OPU permite obtener la mayor descendencia posible de animales con alto valor genético y acelerar los procesos de selección y mejora animal (vía paterna y materna) a la vez que supone una fuente extraordinaria de ovocitos para clonación y transgénesis (Ding et al., 2008).

❱ Factores que afectan a la OPU Después del desarrollo inicial de la técnica de OPU, se han llevado a cabo muchos estudios investigando diversos factores que puedan incrementar los resultados. Éstos pueden ser divididos en factores técnicos y biológicos. 1. Factores Técnicos. Se ha investigado sobre la geometría de la aguja

Figura 2. La experiencia del operador es de gran importancia para la obtención de buenos resultados en OPU.

59

BovinoYagüe, A. Palomo

Ruiz López, S.

7 en comparación con la obtención cada 3 ó 4 días. Sin embargo, la calidad de los ovocitos, en cuanto al número de capas de células del cúmulo, resulta mayor con OPU a intervalos de 3 días y menor con intervalos de 7 días, el desarrollo embrionario también se ve afectado (19’7% vs. 13’5%) (Merton et al., 2003). Estos resultados son coincidentes con la hipótesis de que el folículo dominante ejerce un efecto negativo sobre el posterior desarrollo de los ovocitos. Con la técnica más utilizada de obtención cada 3-4 días (lunes/jueves) ó 2-5 días (lunes/miércoles) no se ve afectado el número de ovocitos recogidos por sesión, sin embargo, la calidad fue mayor en el intervalo de 2 días, lo que puede ser atribuido al efecto del folículo dominante. Figura 3. Administración de inyección epidural de procaína (detalle).

descrito un efecto positivo general de la pre-estimulación con FSH antes de la OPU sobre el desarrollo posterior de los ovocitos. Blondin et al. (1997) observaron que el mejor desarrollo aparece cuando la estimulación es seguida por 48 h de la aspiración. Chaubal et al. (2006) realizan un estudio comparativo entre sistemas de OPU con y sin estimulación hormonal y concluyen que, la retirada del folículo dominante seguida de la administración de FSH y de OPU 48 h

Aunque los sistemas de estimulación hormonal pueden dar lugar a una mayor producción de embriones por vaca y OPU, el rendimiento de embriones por unidad de tiempo por vaca puede no ser superior, ya que la estimulación hormonal sólo puede hacerse una vez a la semana (Merton et al., 2003). Sin embargo, la combinación de un período de OPU con estimulación con uno sin estimulación en la misma semana puede dar lugar a una

Experiencia del operador (Fig. 2). La técnica de OPU se realiza por 1 ó 2 personas y, en determinadas empresas, la misma persona lleva a cabo el desarrollo de la técnica de una forma similar durante años, usando las mismas condiciones técnicas. La experiencia del operador (en un sistema de una sola persona) o del operador y el ayudante (en un sistema de dos personas) tiene un efecto significativo en el número y la calidad de los ovocitos recolectados (Merton et al., 2003) y hasta cierto punto una adecuada selección de los operadores y/o asistentes puede ayudar a mejorar los resultados.

❱ Metodología y técnica de OPU Figura 4. Foto superior: sonda transvaginal, mango de OPU y guía de punción. Foto inferior: sonda montada para OPU (detalle).

producción de embriones superior por unidad de tiempo y animal.

más tarde, fue el mejor protocolo en base a la respuesta folicular, la recuperación de ovocitos y la producción de embriones. El ensayo fue realizado con éxito, durante 10 semanas seguidas. Estos autores emplean una dosis semanal única de FSH, reducida en comparación con la dosis completa estándar que se utiliza en la ovulación múltiple de rutina y el sistema MOET. Este sistema además de evitar la hiperestimulación ovárica reduce el estrés asociado con múltiples inyecciones de FSH.

60

La desventaja de usar la pre-estimulación es la reintroducción de hormonas y, por lo tanto, se pierde una de las consideradas ventajas (la no necesidad de uso de hormonas en la OPU) con respecto a los sistemas MOET. Aunque en el caso de la OPU no son necesarias múltiples inyecciones y un manejo extra, lo que representa una ventaja desde el punto de vista del bienestar animal. Frecuencia de OPU. El intervalo entre sesiones de OPU tiene influencia sobre la cantidad y calidad de los ovocitos obtenidos. El periodo de tiempo entre dos aspiraciones afecta, de forma significativa, la tasa de producción de ovocitos. Obteniéndose un mayor número en el día

La OPU precisa de la tranquilización previa del animal, ésta se llevará a cabo con el animal en pie en un potro de contención, mediante xilacina (i.m.) al 2% (Rompún, 0’25 ml/100 kg). Posteriormente, se debe administrar procaína (Procasel 2%, 3-4 ml para novillas, 5-7 ml vacas adultas) vía epidural (Fig. 3), para reducir los esfuerzos expulsivos y facilitar la manipulación del ovario. Tras el vaciamiento del recto y la limpieza y desinfección de la vulva y área perineal se introducirá el transductor en la vagina, convenientemente lubricado y protegido por una cubierta sanitaria de látex. Para la visualización de los folículos ováricos empleamos un ecógrafo Pie Medical (mod. FalcoVET) equipado con una sonda transvaginal (Pie Medical R-10) de 5-7’5 MHz y un “handgrip” o mango de OPU de 60 cm de longitud donde se colocará la guía de punción (Fig. 4). Por la guía se introducirá una aguja de punción desechable (20 G, 0’9 x 70 mm) conectada a un tubo estéril de 50 ml mediante una conducción de Teflón. El equipo de OPU se completa con una bomba de vacío accionada por pedal con la que se aplicará una aspiración constan-

OVUM PICK UP (OPU) EN BOVINOS: aplicaciones en Biotecnología de la reproducción

te de 50-53 mm Hg (20 ml/min). El tubo de recogida debe mantenerse atemperado a 37ºC en baño termostático. Los ovarios se posicionarán vía rectal delante de la sonda para ováricos visibles de más de 3 mm de diámetro. Antes de iniciar la sesión de punción se drenará el sistema aspirando una pequeña cantidad de medio de recogida. Tras la aspiración

de cada 3-4 folículos se realizará un lavado exhaustivo del fluido folicular en la aguja de aspiración y en el sistema de recolección con medio de lavado y recogida [PBS suplementado con heparina sódica (2’2 UI/ml) y suero fetal bovino (1%)].

∅), los restos de sangre serán eliminados por continuos lavados en PBS fresco y se pasará a una placa de Petri para localizar y evaluar morfológicamente bajo estereomicroscopio los complejos cumulusovocito (COCs) aspirados (Fig. 6).

El fluido obtenido de cada animal contenido en un tubo de recogida de 50 ml será inmediatamente filtrado (50 μm

Clasificaremos los COCs obtenidos en cinco categorías, según homogeneidad, morfología del citoplasma y compactibilidad de las células del cúmulo (Oropeza et al., 2004):

nº 31 nº 13

- Categoría I: Ovocitos con más de tres capas de células de cúmulo compactas y con citoplasma homogéneo uniformemente granulado. - Categoría II: Ovocitos con menos de tres capas de células del cúmulo y citoplasma generalmente homogéneo. - Categoría III: Ovocitos con una sola capa de células del cúmulo y citoplasma de aspecto irregular con áreas oscuras. - Categoría IV: Ovocitos denudados. - Categoría V: Ovocitos madurados in vivo, con cúmulo expandido. Los COCs de las categorías I-III se considerarán aptos para su procesamiento en maduración, fecundación y pos-

Figura 5. Sujeción del ovario (mano izquierda) y manejo del mango de OPU (mano derecha).

Tabla 1. Recuperación y capacidad de desarrollo embrionario de ovocitos de OPU en ganado bovino en diferentes estados reproductivos y con y sin pre-estimulación hormonal.

Tipo animal Donante

Nº OPUs

Nº ovos OPU/animal

Nº ovos viables OPU/animal

% Blastos / OPU / animal

Vacas Lactantes

34

7’2

5’0

1’1

Vacas Secas

40

6’9

4’4

1’0

Vacas Gestantes

36

5’0

4’8

0’4

41

5’7

3’9

0’5

Terneras Gestantes

130

3’9

1’8

0’4

Vacas Gestantes

214

4’1

2’0

0’4

Vacas en puerperio

780

5’7

3’8

0’8

Kniep (2001)

Vacas Lactantes

80

8’9

5’7

1’3

Oropeza et al. (2004)

Vacas estimuladas con FSH

60

3’4 -7’1 (según dosis FSH)

2’6 - 5’8

0’9 - 2’4

De Roover et al. (2005)

Vacas sin estimulación

30

3’9 - 5’3

3’8 - 5’2

0’8 -1’4

Vacas estimuladas con FSH

30

4’9 - 10’6

4’8 - 10’1

1’1 - 2’4

Vacas Secas

84

5’1

4’2

-

Terneras

Referencias

Bungartz et al. (1995)

Rust et al. (1999)

Chaubal et al. (2006) Ruiz et al. (2009a, b)

61

BovinoYagüe, A. Palomo

Ruiz López, S.

Figura 6. Filtrado del líquido folicular obtenido en OPU (izquierda). Búsqueda y evaluación morfológica por estereomicroscopio de los COCs aspirados (derecha).

terior producción in vitro de embriones, los ovocitos de categorías IV y V no se utilizarán para PIV, considerándose ovocitos no viables.

needle diameter on cumulus oocytes complex mor-

JQ, Cheng GX. Different Intervals of Ovum Pick-

phology and developmental capacity of bovine

Up Affect the competence of Oocytes to Support

oocytes. Theriogenology. 45: 1001-14. 1996.

the Preimplantation Development of Cloned Bovine Embryos. Mol Reprod Dev. 75: 1710-1715. 2008

Bungartz L, Lucas-Hahn A, Rath D, Niemann H.

❱ Resultados En la tabla 1 mostramos algunos resultados de obtención de ovocitos y embriones producidos por OPU/PIV en distintos tipos de animales con y sin preestimulación hormonal.

Collection of oocytes from cattle via follicular

Galli C, Crotti G, Notari C, Turini P, Duchi R, Lazzari G.

aspiration aided by ultrasound with or without

Embryo production by ovum pick up from live donors.

gonadotropin

Theriogenology. 55: 1341-1357. 2001.

pretreatment

and

in

different

reproductive stages. Theriogenology. 43: 667-675. 1995.

Kniep G. Collection of competent oocytes from post-

Chaubal SA, Molina JA, Ohlrichs CL, Ferre LB, Faber

tion and its effects on donor fertility. Dissertation

DC, Bols PEJ, Riesen JW, Tian X, Yang X. Comparison

Thesis. Hannover Tierärztliche Hochschule. 2001.

partum cows by ultrasound guided follicular aspira-

of different transvaginal ovum pick-up protocols to optimise oocyte retrieval and embryo production

❱ Bibliografía Blondin P, Guilbault LA, Sirard MA. The time interval between FSH-P administration and slaughter can influence the developmental competence of beef heifer oocytes. Theriogenology. 48: 803-13. 1997. Bols PEJ, Vandenheede JMM, Van Soom A, de Kruif A. Transvaginal ovum pick up (OPU) in the cow: a new disposable needle guidance system. Theriogenology. 43: 677-87. 1995.

MC. Potential use of ovum pick-up for embryo

1631-48. 2006.

production and breeding in cattle. Theriogenology 42:675-684. 1994.

De Roover R, Genicot G, Leonarda S, Bols P, Dessy F. Ovum pick up and in vitro production in cows

Lenz

superstimulated with an individually adapted

percutaneous aspiration of human follicles under

superstimulation protocol. Anim Reprod Sci. 86:

local anesthesia: a new method of collecting oocytes

13-25. 2005.

for in vitro fertilization. Fert Steril. 38: 673-677.

Lauritsen

JG.

Ultrasonically

guided

1982. Hanzen C. Effects of Ovum Pick-Up Frequency and

Merton JS, de Roos APW, Mullaart E, Ruigh Ld. Kaal

FSH Stimulation: A Retrospective Study on Seven

L, Vos PLAM, Dieleman SJ. Factors affecting oocyte

Years of Beef Cattle In Vitro Embryo Production.

quality and quantity in commercial application of

Reprod Dom Anim. 43: 239-245. 2008.

embryo technologies in the cattle breeding industry. Theriogenology. 59: 651-74. 2003.

Ding LJ, Tian HB, Wang JJ, Chen J, Sha HY, Chen

Figura 7. COCs categorías I y II aptos para su procesamiento en producción in vitro de embriones.

62

S,

De Roover R, Feugang JMN, Bols PEJ, Genicot G,

Bols PEJ, Van Soom A, Ysebaert MT, Vandenheede JMM, de Kruif A. Effects of aspiration vacuum and

Kruip TA, Boni R, Wurth YA, Roelofsen MW, Pieterse

over a 10-week period in cows. Theriogenology. 65:

Merton S. European statistical data of bovine embryo

OVUM PICK UP (OPU) EN BOVINOS: aplicaciones en Biotecnología de la reproducción

transfer activity 2008. AETE Newsletter. 32: 12-14.

variation and repeated gonadotropin stimulation. Biol

2009.

Reprod. 62: 206-213. 2000.

Oropeza A, Wrenzycki, C, Herrmann D, Hadeler KG,

van Wagtendonk-de Leeuw AM. Ovum Pick Up and

Niemann H. Improvement of the Developmental

In Vitro Production in the bovine after use in several

Capacity of Oocytes from Prepubertal Cattle by

generations: A 2005 status. Theriogenology. 65: 914-

Intraovarian Insulin-Like Growth Factor-I Application.

925. 2006.

nº 31 nº 13

Biol Reprod. 70: 1634-43. 2004. Pieterse MC, Kappen KA, Kruip TAM, Taverne MA. Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries. Theriogenology. 30: 751-62. 1988. Ruiz S, De Ondiz A, Zaraza J, Rath D. Early Fertilization Events in Bovine IVF Employing OPU-Oocytes and Sex-Sorted Frozen/Thawed Sperm. Reprod Dom Anim. 44: 130. 2009a. Ruiz S, De Ondiz A, Zaraza J, Rath D. Rendimiento de la OPU en vacas secas no estimuladas para el uso de ovocitos en la producción in vitro de embriones. XIII Jornadas Producción Animal. Joy M, et al. eds. 681-683. 2009b. Rust JM, Eikelmann E, Frank KU, Niemann H. A comparison between the in vitro embryo production potential of superstimulated and non-stimulated pregnant holstein friesland cows. Theriogenology. 51: 329. 1999. Taneja M, Bols PE, Van de Velde A, Ju JC, Schreiber D, Tripp MW. Developmental competence of juvenile calf

LSC bovin 220x145 SPand5/05/06 11:16 Page 1 oocytes in vitro in vivo: influence of donor animal

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