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Facultat de biociències Departament de Biologia cel·∙lular, Fisiologia i Immunologia 2013
Influencia del eje interleucina-‐10/p38 MAPK en el epitelio intestinal sobre la respuesta al tratamiento con glucocorticoides en la colitis ulcerosa. Memoria de la Tesis Doctoral presentada para optar al grado de Doctor en Biología celular por la Universitat Autònoma de Barcelona Doctorante. Violeta Loren Moreno Director: Dr. Josep Manyé Almero Tutora: Dra. Rosa Miró Ametller
El Dr. Josep Manyé Almero, coordinador de la Unitat CIBER-‐EHD de recerca sobre la malaltia inflamatòria intestinal de l’Institut d’Investigació “Germans Trias i Pujol” de Badalona; i la Dra. Rosa Miró Ametller, catedràtica del departament de Biologia Cel·∙lular, Fisiología i Immunologia de la Universitat Autònoma de Barcelona, certifiquen que la tesi titulada: Influencia del eje Interleucina-‐10/p38 MAPK en el epitelio intestinal sobre la respuesta al tratamiento con glucocorticoides en la colitis ulcerosa realitzada per la Doctorant Violeta Lorén Moreno, reuneix els requisists científics necessaris per ser defensada davant d’un tribunal per optar al grau de doctor en Biologia Cel·∙lular.
Violeta Lorén Moreno Doctorante
Dr. Josep Manyé Almero Director
Dra. Rosa Miró Ametller Tutora
Índice de contenidos
I. Abreviaciones ............................................................................................... 5 II. Índice Figuras ............................................................................................... 9 III. Índice Tablas ............................................................................................. 11 1. Función barrera y homeostasis intestinal .................................................. 15 1.1 Fisiología del epitelio intestinal. .............................................................. 15 1.1.1. Células del epitelio intestinal. .............................................................. 16 1.2. Función barrera en el epitelio intestinal ................................................. 18 1.2.1. Secreción de substancias anti-‐microbianas ......................................... 18 1.2.2. Relación de vecindad de las células epiteliales .................................... 23 1.2.3. Mecanismos moleculares de regulación de Tight-‐junction ................. 26 1.3. Sistema inmune de la mucosa gastrointestinal ...................................... 27 1.4. Regulación de la actividad inmunológica en la mucosa intestinal .......... 30 2. Fisiopatología de la enfermedad inflamatoria intestinal y de sus complicaciones. ............................................................................................. 35 2.1. Enfermedad Inflamatoria Intestinal. ....................................................... 35 2.1.1. Descripción y definición. ...................................................................... 35 2.1.2. Etiopatogenia ....................................................................................... 37 2.1.3. Epidemiología. ..................................................................................... 46 2.1.4. Tratamiento. ........................................................................................ 48 2.1.5. Complicaciones evolutivas y terapéuticas. .......................................... 53 3. Bases patológicas de la respuesta inadecuada al tratamiento con glucocorticoides ............................................................................................. 57 3.1. Glucocorticoides: Definición y sus acciones ........................................... 57 3.2. Mecanismos de acción de los Glucocorticoides ..................................... 58 3.2.1. Mecanismos genómicos. ..................................................................... 59 3.2.2.Mecanismos no genómicos. ................................................................. 62 3.2.3. Bloqueo de la actividad NF-‐kB 1 por los Glucocorticoides .................. 63 3.3. Glucocorticoides en la enfermedad inflamatoria intestinal. .................. 65 3.3.1. Consecuencia de la respuesta inadecuada a los esteroides en enfermedad inflamatoria intestinal ............................................................... 66 3.4. Fisiopatología de la corticorresistencia .................................................. 67 1
3.4.1. Mecanismos de corticorresistencia ..................................................... 68 4. Antecedentes e hipótesis .......................................................................... 75 5. Objetivos .................................................................................................... 77 6. Métodos ..................................................................................................... 81 6.1. Evaluación de la apoptosis inducida por dexametasona en células T aisladas de sangre de controles sanos ........................................................... 81 6.1.1. Muestras y procedencia ...................................................................... 81 6.1.2. Aislamiento de linfocitos T de sangre periférica .................................. 81 6.1.3. Diseño experimental ............................................................................ 82 6.1.4. Valoración del grado de apoptosis en linfocitos CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo ......................................................................... 84 6.2. Estudios in vitro sobre monocapas de células Caco-‐2 confluentes. ....... 87 6.2.1. Muestras y procedencia ...................................................................... 87 6.2.2. Cultivo celulares sobre transwells y estimulaciones ............................ 87 6.2.3. Diseño experimental ............................................................................ 89 6.2.4. Medida de la Resistencia Eléctrica Transepitelial ................................ 90 6.2.5. Cuantificación de IL-‐8 mediante ELISA ................................................. 92 6.2.6. Extracción proteica y determinación de proteínas mediante Western blot .................................................................................................. 92 6.2.7. Inmunofluorescencia en células Caco-‐2 .............................................. 95 6.2.8. Expresión de genes mediante PCR en tiempo real .............................. 96 6.2.9. Microscopia electrónica de transmisión ............................................ 101 6.3. Estudios con biopsias procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa e individuos sanos ............................................................................. 103 6.3.1. Procedencia de las biopsias ............................................................... 103 6.3.2. Inmunohistoquímica en muestras de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal e individuos sanos ................................................... 104 6.3.3. Inmunofluorescencia en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa y controles ................................................................................................... 105 6.4. Estudio estadístico ................................................................................ 107 7. Material ................................................................................................... 109 7.1. Reactivos utilizados .............................................................................. 109 7.2. Soluciones y medios de cultivo utilizados ............................................ 112 8. Resultados ............................................................................................... 117 2
8.1. La estimulación prolongada vía TCR de la población CD3+CD4+ disminuye la inducción de apoptosis por dexametasona en comparación a un estímulo breve ..................................................................................... 117 8.2. La cooperación entre la interleucina-‐10 y los glucocorticoides refuerza la unión intercelular del epitelio intestinal ................................... 118 8.3. La fosforilación de la p38 MAPK constituye un elemento clave en las acciones sinérgicas entre la IL-‐10 y los glucocorticoides ............................ 120 8.4. La inhibición de la fosforilación de la p38 MAPK revierte la colaboración entre la IL-‐10 y los esteroides ................................................ 122 8.5. Fosforilación de la p38 MAPK en la mucosa intestinal de pacientes con colitis ulcerosa activa ............................................................................ 124 8.6. La IL-‐10 facilita la nuclearización de la p38 MAPK fosforilada en presencia de TNF-‐α y GCs ............................................................................ 125 8.7. Rastreo de los mecanismos implicados en el eje IL-‐10/p38 MAPK ....... 129 8.8. Efecto de la inhibición de p38 MAPK sobre las adherens junctions y los desmosomas .......................................................................................... 131 8.9. Determinación de los cambios de expresión de los receptores α de IL-‐10 y Glucocorticoides en la mucosa de pacientes con colitis ulcerosa activa ........................................................................................................... 134 9. Discusión .................................................................................................. 139 10. Conclusiones .......................................................................................... 149 11. Anexos ................................................................................................... 153 12. Referencias bibliográficas ...................................................................... 165
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Abreviaciones AJ AkT AP-‐1 APCs ATP BSA CBP CCR CCR6 CDAI cDNA COX-‐2 DMSO DOC DSS EII ERK ES FBS GCR GCs GREs GWAS HDAC2 HKG Hsp iCAM IELs IFN-‐γ
Uniones adherentes (del inglés Adherens Junctions) Del inglés Protein kinasa B Del inglés Activator protein -‐1 Células presentadoras de antígeno (del inglés antigen-‐presenting cell) Del inglés Adenosine triphosphate Albúmina sérica bovina (del inglés Bovine serum albumin) Del inglés CREB binding protein Cáncer colorectal Receptor de la quimioquina 6 Índice de actividad en la enfermedad de Crohn ( del inglés Crohn’s Disease Activity Index DNA complementario Cyclooxygenasa-‐2 Dimetilsulfóxido Na-‐deoxycolato Dextrán sulfato sódico (del inglés Dextran sodium sulfate) Enfermedad inflamatoria intestinal Del inglés Extracellular-‐signal-‐regulated kinases Error estándard Suero fetal bovino (del inglés fetal bovine serum) Receptor de glucocorticoides Glucocorticoides Elementos de respuesta a glucocorticoides (del inglés glucocorticoid response elements) Del inglés Genome-‐wide association studies Del inglés Histone deacetylase 2 Gen de referencia (del inglés Housekeeping gene) Proteína de choque térmico (del inglés Hot shock protein) Del inglés intercellular Adhesion Molecule Linfocitos intraepiteliales (del inglés intraepithelial lymphocyte) Interferón-‐ gamma (del inglés gamma-‐interferon) 5
Ig IIQ IkB IL iNOS
Inmunoglobulina Intervalo intercuartil Inhibidor del NF-‐kB (del inglés inhibitor of NF-‐kB) Interleucina Sintasa del oxido nítrico (del inglés Inducible Nitric oxide synthase) JNK Quinasa c-‐Jun N-‐terminal (del inglés c-‐Jun N-‐terminal kinase) MAPK Quinasas Activadas por Mitógenos (del inglés Mitogen-‐activated protein kinase) MDR-‐1 Gen de resistencia a multidrogas (del inglés Multidrug resistance gene) MET Microscopia electrónica de transmisión MHC Complejo Mayor de histocompatibilidad (del inglés Major histocompatibility complex) MIF Factor de migración de macrófagos (del inglés Macrophage migration inhibitory factor) MKP-‐1 Inhibidor de la MAP quinasas (del inglés MAPK phosphatase-‐1) MLC Del inglés Myosin light chain MLCK Del inglés Myosin light chain kinase MM Del inglés Master mix NEAA Aminoácidos no esenciales (del inglés Non-‐essential amino acids) NF-‐kB Factor nuclear-‐ kB (del inglés Nuclear factor-‐kappa B) NK Células Natural Killer (del inglés Natural killer cells) NKT Células T Natural Killer (del inglés Natural killer T cells) NOD Del inglés Nucleotide-‐binding oligomerization domain n.s. No significativo OCTN Del inglés organic cation transporter PBMC Célula mononuclear de sangre periférica (del inglés Peripheral blood mononuclear cells) Pgp-‐170 Glicoproteína p-‐170 (del inglés P-‐Glycoprotein) PI3K Fosfoinositol 3 quinasa (del inglés Phosphoinositide 3-‐kinase) PKC Proteína quinasa C (del inglés Protein kinase C) p-‐TEFb Del inglés Positive transcription elongation factor RNAm RNA mensajero 6
RT-‐qPCR STAT SWI/SNF TCA TCR TEER
PCR a tiempo real Del inglés Signal transducer and activator of transcription Del inglés Switch/Sucrose non fermentable Ác. Tricloroacético (del inglés trichloroacetic acid) Receptor de células T (del inglés T cell receptor) Resistencia eléctrica transepitelial (del inglés Trans-‐epithelial electrical resistance ) TEERf Resistencia eléctrica transepitelial final TEERi Resistencia eléctrica transepitelial basal TGF-‐β Del inglés Transforming growth factor beta Th Del inglés T helper cells TJ Uniones estrechas (del inglés Tight Junctions) TLR Del inglés Toll-‐Like receptor TNF-‐α Del inglés Tumor necrosis factor-‐ alpha Treg Células T reguladoras ufc Unidades formadoras de colonias vCAM Del inglés Vascular Adhesion Molecule vs Versus ZO Zonula Ocludens NOTA: en esta tesis ninguna abreviación se ha incluido en los títulos principales.
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Índice de figuras Figura 1: Esquema de las capas del intestino. ............................................... 15 Figura 2: Esquema de las uniones intercelulares: uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y uniones comunicantes. ....................... 23 Figura 3: Sistema GALT. ................................................................................. 28 Figura 4: Fenotipos de células Th CD4+. ........................................................ 31 Figura 5: Subtipos de células Treg. ................................................................ 33 Figura 6: Factores implicados en la aparición de la EII. ................................. 38 Figura 7: Posibles causas por lo que la microflora comensal desencadenaría la respuesta inflamatoria en los pacientes de EII. ............... 43 Figura 8: Teoría de la higiene. ....................................................................... 47 Figura 9: Mecanismos de acción genómicos de los GCs. ............................... 61 Figura 10: Sistema y principio de separación por selección negativa MACS para células T. ..................................................................................... 82 Figura 11: Esquema de estimulación y diseño experimental con células T estimuladas con CD3/CD28 y tratadas con o sin GCs y/o PD98059. ............. 84 Figura 12: Cuadrantes de identificación del grado de apoptosis mediante los marcadores Anexina V y 7-‐AAD por citometría de flujo. ......................... 85 Figura 13: Plots de citometria de flujo donde se valoran los marcadores fenotípicos de los linfocitos T, CD4 y CD8, además del grado de apoptosis mediante Anexina V-‐PE y 7-‐ADD. .................................................. 86 Figura 14: Detalle del sistema transwell usado para el cultivo de monocapas de células Caco-‐2. ....................................................................... 88 Figura 15: Diseño experimental de las estimulaciones con células Caco-‐2 ... 89 Figura 16: Detalle de la medida de TEER ....................................................... 91 Figura 17: Esquema del “sandwich” para la transferencia húmeda .............. 94 Figura 18: Imagen virtual de la electroforesis con chip de RNA .................... 98 Figura 19: Diseño experimental de recogida de biopsias en pacientes con EII y controles ........................................................................................ 104 Figura 20: Baremo de tinción nuclear para la p38 MAPK fosforilada .......... 105 Figura 21: Baremo de intensidad de marcaje para los receptores GCRα e IL10Rα en biopsias de pacientes con colitis activa ...................................... 106 9
Figura 22: Variaciones en la apoptosis inducida por GCs en las células T sanguíneas en función del tiempo de estímulo. .......................................... 118 Figura 23: Incrementos de TEER en cultivos monocapas de células Caco-‐ 2 a las 48h de ser estimuladas o no con TNF-‐α ........................................... 119 Figura 24: Niveles de IL-‐8 en el sobrenadante basal a las 24h (A) y a las 48h (B) del cultivo celular. ........................................................................... 120 Figura 25: Representación de la búsqueda de mediadores moleculares implicados en la sinergia IL-‐10/GCs mediante western blot. ...................... 121 Figura 26: Influencia del bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK sobre la TEER en monocapas de células Caco-‐2. 12¡Error! Marcador no definido. Figura 27: Efecto de la IL-‐10 y de la inhibición de p38 MAPK sobre la producción de IL-‐8 por parte de las células Caco-‐2 tratadas con TNFα y GCs. ............................................................... 1¡Error! Marcador no definido.3 Figura 28: Detección de p38 MAPK fosforilada en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa ....................................................... 124 Figura 29: Disposición nuclear o periférica de de la p38 MAPK fosforilada en cultivos de células Caco-‐2 a 24h y 48h. .................................................. 126 Figura 30: Inmunotinción de p38 MAPK fosforilada en monocapas de células Caco-‐2 a 24h y 48h. .......................................................................... 127 Figura 31: Expresión de genes influenciados por la IL-‐10 vía fosforilación de la quinasa p38. ........................................................................................ 130 Figura 32: Resultados obtenidos mediante MET de las uniones paracelulares en las monocapas de células Caco-‐2. .................................... 131 Figura 33: Medias ± ES de las valoraciones de las tinciones por inmunofluorescencia para los GCRα e IL-‐10Rα, en muestras de mucosa cólica procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa, sensibles y refractarios al tratamiento con GCs. ........................................................... 134 Figura 34: Marcaje por inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en biopsias de pacientes con CU activa. ........................................................... 136 Figura 35: Detalle del patrón observado para la inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en pacientes con CU activa y sensibles al tratamiento con glucocorticoides. ................................................................................... 136 10
Índice tablas Tabla 1: Secuencias de los primers forward y reverse para la valoración por RT-‐PCR ................................................................................................... 100 Tabla 2: Composición y concentraciones de la MM para la RT-‐PCR ............ 100 Tabla 3: Condiciones de la PCR .................................................................... 100 Tabla 4: Medianas IIQ de edad, sexo, meses de diagnostico e índice de truelove-‐witts de los pacientes incluidos. .................................................... 103
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1. Función barrera y homeostasis intestinal
1.1.-‐ Fisiología del epitelio intestinal La función principal del epitelio intestinal es la de abastecer de electrolitos, agua y nutrientes al cuerpo para su supervivencia. La mayor parte de esta función nutritiva, se lleva a cabo en el intestino delgado, el cual fisiológicamente está diseñado, mediante sus vellosidades y microvellosidades, para presentar una gran superficie de absorción. Así mismo, en el colon se absorbe la mayor cantidad de agua para la hidratación del cuerpo. A la vez, esta mucosa ejerce otras funciones donde se incluye la de barrera selectivamente permeable, tanto para nutrientes y fluidos, como de antígenos luminales (1) además de modular la respuesta inmunológica. El epitelio está formado por diversos tipos celulares, cada uno con una función definida y distinta, que en cooperación con las demás capas del intestino (Figura 1), consigue llevar a cabo todas estas funciones.
FIGURA 1: Esquema de las capas del intestino. Fuente: www.saludalia.com/.../digestiv o/gif/f158b2g.gif
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1.1.1.-‐ Células del epitelio intestinal Los diferentes tipos celulares se distribuyen a lo largo de las vellosidades y criptas de Lieberkühn, entre los que se encuentran células progenitoras, enterocitos, células caliciformes, células de Paneth, células enteroendocrinas y células M. Las células migran por las vellosidades, siendo por lo general las de la parte basal las menos diferenciadas, mientras en la zona apical se da el fenómeno de anoikis, que es la muerte celular programada que se da en las células epiteliales del intestino. Este tipo de apoptosis supone un factor protector imprescindible para el mantenimiento de la homeostasis intestinal. Mediante el anoikis, el epitelio se desprende de células potencialmente patógenas por el acúmulo de actividad durante el ciclo (2). • Células progenitoras La renovación del conjunto celular se consigue gracias a la pluri-‐ potencialidad de las células progenitoras. Se localizan en los laterales de la cripta y las células nuevas van diferenciándose y especializándose a medida que van migrando por la vellosidad, para adquirir las diferentes funciones de absorción y secreción. • Enterocitos Los enterocitos son el grupo celular mayoritario en el epitelio intestinal. Son células columnares polarizadas, con el borde apical en forma de organizadas microvellosidades, denominado “en cepillo”. Esta población celular está especializada en la absorción y transporte de iones, electrolitos y nutrientes. Pero también son capaces de secretar substancias antimicrobianas (3), presentar antígenos a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) I y II, reconocer bacterias y virus gracias a la expresión de receptores tipo Toll-‐like (TLR) y nucleotide oligomerization domain (NOD). Además producen citocinas y quimiocinas que influyen en la respuesta inmune subepitelial (4). 16
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• Células caliciformes Se distribuyen a lo largo de toda la vellosidad, alternándose con el resto de las células epiteliales, tanto en el intestino delgado como en el grueso y el número aumenta en la parte distal del intestino. Estas células son las responsables de la secreción de las mucinas, componente del mucus intestinal. Las mucinas, se sintetizan en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi, y son almacenadas en gránulos en el citoplasma de estas células. Su secreción viene estimulada por factores del ambiente, como infecciones bacterianas o como señales provenientes de la flora residente. • Células de Paneth Se localizan en la base de las criptas del intestino delgado y contienen gránulos citoplasmáticos, dónde se almacenan proteínas antimicrobianas, como defensinas, lisoenzima y fosfolipasa A2. La secreción de estos gránulos juega un importante papel en la respuesta inmune innata frente al contenido luminal, previniendo la proliferación de microorganismos. Las células de Paneth liberan los componentes de los gránulos citoplasmáticos, en respuesta de la exposición a bacterias o componentes bacterianos del lumen intestinal, probablemente a través de mecanismos relacionados con TLR y NOD (5). • Células enteroendocrinas Se encuentran a lo largo de todo del tracto gastrointestinal, situadas en las criptas de Lieberkühn. Su función principal es segregar hormonas y neuropéptidos, como la somastatina y la gastrina entre otros, al tejido conectivo en respuesta a cambios del medio externo. • Células M Son células epiteliales aplanadas, sin borde en cepillo y con la capa de glicocálix más fina. Se encuentran en la zona del epitelio que reviste el tejido linfoide de las placas de Peyer y que se denomina epitelio asociado al folículo de las mucosas. Están especializadas en la defensa del huésped frente al 17
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ambiente, por su capacidad de muestrear y presentar antígenos luminales a las células dendríticas del sistema inmune subepitelial. También ejercen un amplio abanico de funciones efectoras mediante la liberación de proteasas, histamina, heparina, mediadores lipídicos y citocinas pro-‐inflamatorias (6).
1.2.-‐ Función barrera en el epitelio intestinal El tracto gastrointestinal contiene la mucosa de mayor superficie en el cuerpo humano, la cual se encuentra en continuo contacto con gran cantidad de antígenos procedentes tanto de la dieta, como de los microorganismos de la flora comensal. El hecho que la mucosa sea el lugar de contacto entre el medio externo y el tejido linfoide asociado a mucosa, hace necesario la existencia de mecanismos que impidan la penetración de substancias o moléculas nocivas del lumen hacia el interior de esta. El concepto de barrera intestinal engloba factores tanto celulares como extracelulares, que en conjunto impiden la invasión de forma masiva de la mucosa por parte de antígenos nocivos, todo ello sin comprometer la absorción de nutrientes y fluidos vía paracelular como transcelular. Dentro de los factores extracelulares que intervienen en la función barrera del intestino, encontramos el mucus intestinal, que crea una barrera que impide el contacto directo de las bacterias con el epitelio. Por otro lado, entre los factores celulares encontramos la monocapa de células epiteliales, incluyendo la membrana plasmática, el contenido intracelular y las uniones intercelulares (7, 8).
1.2.1.-‐ Secreción de substancias anti-‐microbianas • Mucus intestinal: mucinas A lo largo del tracto gastrointestinal se extiende una línea de mucus, con doble función: la primera como lubricante y la segunda, como la primera barrera física entre la mucosa intestinal y el contenido luminal. El mucus está 18
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formado principalmente por agua y glucoproteínas llamadas mucinas. Estas están formadas por oligosacáridos unidos a un núcleo proteico (9) y se han diferenciado dos tipos de mucinas, las ancladas en la membrana apical de células epiteliales y las secretadas, siendo estas últimas las que constituyen la película gelatinosa de la superficie de la mucosa. El grado y patrón de glicosilación de las mucinas confiere al mucus la capacidad de ser resistente a la digestión de enzimas producidas por la flora residente, protegiendo así al epitelio de la degradación enzimática. También lo protege contra la adhesión de microorganismos luminales, mediante la inmovilización de estos en el interior de la película gelatinosa y por el recubrimiento de los sitios de unión bacterianos al epitelio por mucinas e Inmunoglobulina (Ig) A (10). El papel de las mucinas en la protección del epitelio es importante, ya que cambios bioquímicos como en la longitud de las cadenas de oligosacáridos de las mucinas, se asocian a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Estudios han demostrado que existe una disminución del grosor del mucus en pacientes con colitis ulcerosa, posiblemente asociado a una disminución en el número de células caliciformes (11, 12). En modelos experimentales la ausencia de la proteína principal en la composición del mucus, MUC2, se asocia al desarrollo de la colitis espontánea (13). Embebidos en el mucus encontramos también Igs, defensinas, enzimas y unos pequeños péptidos llamados trefoils. • Ig Son proteínas anticuerpo muy específicas, producidas por células B de forma constitutiva en algunos casos y mayoritariamente en respuesta a antígenos. En su forma unida a membrana constituye el receptor de antígeno de la célula B. Existen varios isotipos: IgA, IgG, IgM, IgE e IgD. La IgA es la clase predominante en las secreciones de las mucosas del organismo, como por ejemplo saliva, lágrimas, calostro y secreciones respiratorias, gastrointestinales y genitourinarias. En sangre se encuentra 19
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como una molécula monomérica y en forma dimérica en las mucosas. Su principal función es identificar antígenos e impedir que se adhieran a las mucosas, además de neutralizar toxinas y microorganismos infecciosos (14). • Defensinas Son pequeños péptidos de unos 29-‐45 aminoácidos, que realizan su función antimicrobiana mediante la creación de poros en la membrana celular de las bacterias, dando lugar a la lisis bacteriana. Se encuentran divididos en dos familias: α-‐ y β-‐defensinas. En humanos, existen 4 α-‐defensinas sintetizadas por neutrófilos y dos α-‐defensinas sintetizadas por las células de Paneth en el intestino delgado. Las β-‐defensinas en cambio, son sintetizadas por la mayoría de células epiteliales del intestino. La función de la defensinas entéricas es mantener la esterilidad de las criptas, para ello cuentan con un amplio espectro antimicrobiano, siendo activas tanto frente a Gram positivas como frente a Gram negativas y también tienen la capacidad de lisar hongos y protozoos (15). La actividad de estas moléculas es inespecífica, es decir, no es necesario el reconocimiento entre receptor y diana. Algunas son producidas constitutivamente, mientras que otras son inducidas por citocinas pro-‐inflamatorias o productos bacterianos. Además de la función antimicrobiana, las defensinas pueden actuar como señales las cuales inician, movilizan y amplifican la respuesta adaptativa. Esta acción se basa en la capacidad quimio-‐atrayente de células inmunes que poseen estas moléculas (16-‐18). Dada su implicación en la homeostasis intestinal, una disminución de los niveles de α-‐defensinas se han relacionado con la predisposición a padecer enfermedad de Crohn ileal (19). Esta reducción se ha asociado con mutaciones en el gen NOD2 (20) o con una defectuosa activación de la vía de señalización Wtn/Tcf-‐4 (21,22). Pero existen otros estudios donde esta reducción se relaciona con una pérdida de células epiteliales debido a la inflamación (22). 20
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• El sistema del complemento El sistema del complemento lo comprenden un conjunto de más 30 proteínas muy conservadas evolutivamente. A través de la interacción entre ellas y otras moléculas, se desencadenan cascadas proteolíticas que culminan en: a) la eliminación de microorganismos, ayudando así al control de la infección. El complemento lisa a los organismos a través de la inserción de los complejos MAC (conjunto de proteínas del complemento) en la membrana celular, lo que facilita la eliminación de estos por opsonización y por reclutamiento de fagocitos (23). b) la eliminación de células apoptóticas e inmunocomplejos (complejo antígeno-‐anticuerpo) para reducir la respuesta inflamatoria (24). c) el desarrollo de respuestas inmunes adaptativas. Las proteínas del complemento interaccionan con receptores de células dendríticas, linfocitos B y T, regulando así la respuesta frente a antígenos, promoviendo la formación de anticuerpos y manteniendo la memoria inmunológica (24). Se activa mediante tres vías diferentes : a) la vía clásica, dónde las proteínas del complemento reconocen las Igs unidas a su antígeno; b) la vía de la lectina, homóloga a la clásica pero independiente de Igs. La activación se hará a través de la unión de lectinas o proteínas llamadas ficolinas, con los azúcares y polisacáridos de la superficie bacteriana; y c) la vía alternativa, la cual se iniciará por el bajo nivel de hidrólisis del factor C3 del complemento. Las tres vías convergen en un punto en común, a partir del cual dará lugar a: i) la lisis celular por el complejo MAC, ii) creación de mediadores proinflamatorios llamados anafilotoxinas, que alertarán e iniciaran respuestas inmunológicas y por último iii) recubrimiento y eliminación de superficies marcadas por proteínas del complemento, llamadas opsoninas (25) . 21
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• Lisoenzima Proteína antimicrobiana presente en lágrimas, leche materna, saliva y secreciones gástricas. En el tracto gastrointestinal la secretan diferentes células: glándulas gástricas y pilóricas, glándulas de Brunner, células de Paneth, macrófagos y granulocitos (5). Es especialmente activa frente a bacterias Gram positivas, ya que su mecanismo de acción se basa en la rotura de los enlaces glucosídicos (los cuales estabilizan el peptidoglicano presentes en la pared bacteriana) resultando en la lisis celular. • Fosfolipasa A2 Componente de los gránulos de las células de Paneth. Son proteínas de fase aguda, que actúan como mediadores inflamatorios. A través de su actividad enzimática hidroliza los enlaces éster de los fosfolípidos de las membranas celulares, liberando el ácido araquidónico, para la síntesis de prostaglandinas. Otra función que se les atribuye es la de agente anti-‐ bacteriano mediante la hidrolisis de la membrana bacteriana, sobretodo de Gran positivas (26).
• Trefoils Son pequeños péptidos ricos en cisteínas, que están altamente expresados en tejidos que presentan células productoras de mucus. Hasta la fecha se han descubierto tres factores de esta familia (Trefoil 1-‐3). Estos péptidos, los encontramos en la mucosa intestinal colocalizando con algunas mucinas. En estudios donde se usan diferentes modelos experimentales de EII, se ha observado un incremento de la expresión de estos factores después de la inducción y fase aguda de la enfermedad. Este hecho ha asociado estos péptidos a roles de protección y reparación del tejido intestinal, como función más relevante (27). También pueden jugar un papel como supresores tumorales como demuestran estudios genéticos (28) y se ha observado que pueden estar involucrados en la respuesta inmune, disminuyendo mediadores pro-‐inflamatorios como la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) (29). 22
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1.2.2.-‐ Relación de vecindad de las células epiteliales
Las células del epitelio intestinal se relacionan estrechamente con sus adyacentes, mediante tres tipos uniones con diferente función cada una. Se distinguen uniones de oclusión donde encontramos las uniones estrechas, uniones de anclaje que pertenecen a este subgrupo las uniones de adhesión y desmosomas y uniones con función de comunicación que corresponden a las uniones comunicantes (Figura 2).
ZO-‐2/3
JAM-‐A
Uniones estrechas
ZO-‐1
Uniones comunicantes
Cingulina Ocludina/Claudina
Filamentos Actina-‐ miosina
Uniones adherentes E-‐Cadherina/Nectina
βCatenina/Afadina
αCatenina Filamentos Intermedios de queratina
Desmoplaquina
Desmosomas Desmocolina/Desmogleina
Placoglobina/placofilina
FIGURA 2: Esquema de las uniones intercelulares: uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y uniones comunicantes.
• Uniones estrechas o Tight Junctions (TJ) La monocapa epitelial del intestino desempeña una función de barrera, tanto regulando el paso de substancias y fluidos hacia el interior del epitelio, como impidiendo la interacción entre patógenos y el sistema inmune de la mucosa. Implicadas en esta función se encuentran las TJ, que separan el medio externo del interno y actúan como barrera selectiva tanto de nutrientes y fluidos, como de microorganismos. Estas uniones las constituyen un 23
Introducción
conjunto de proteínas de membrana y citoplasmáticas (figura 2), localizadas en la parte latero-‐apical de la membrana de los enterocitos (30). -‐Proteínas de membrana: en este subgrupo encontramos proteínas de la familia de las Claudinas, Ocludinas y la molécula de adhesión JAM-‐A, las cuales se encuentran unidas a proteínas citoplasmáticas. Este conjunto de proteínas, llevan a cabo la unión mecánica entre las membranas plasmáticas de dos células adyacentes. Concretamente la función de las claudinas es formar poros que determinan, mediante carga iónica, el paso paracelular de substancias (31-‐33). -‐Proteínas citoplasmáticas: pertenecen a este subgrupo las proteínas de la familia de Zonula ocludens (ZO) y la cingulina. Estas establecen la unión entre las proteínas de membrana y los microfilamentos de actina y miosina del citoesqueleto de la célula. • Uniones adherentes o Adherens Junctions (AJ) La principal función de estas uniones es la de anclar una célula con la adyacente. Se sitúan por debajo de las TJ y se distribuyen uniformemente a lo largo de la membrana plasmática rodeando la célula en forma de cinturón. Las componen unas proteínas de membrana, que a través de moléculas adaptadoras citoplasmáticas, se anclan a los microfilamentos de actina del citoesqueleto. Junto con las TJ forman un complejo apical de uniones, que regulan la función barrera del epitelio. También son esenciales para una correcta polarización, diferenciación y proliferación celular (34). -‐Proteínas de membrana: Lo constituyen proteínas de la familia de las cadherinas y por miembros de la familia de las nectinas. Las cadherinas se unen con sus homologas de la célula adyacente, anclando así una célula con otra. Mientras que las nectinas ejercen además, funciones de reclutamiento y agrupación de las cadherinas en las uniones nacientes. 24
Introducción
-‐Proteínas adaptadoras: son las responsables de unir las proteínas de membrana a los microfilamentos de actina. Dentro de este grupo las proteínas más representativas que podemos encontrar, son las de la familia de las cateninas. • Desmosomas Son las uniones más basales que encontramos, y tienen también función de adhesión de una célula con su adyacente. Este tipo de uniones son cruciales en tejidos sometidos a estrés mecánico, como la mucosa gastrointestinal entre otros. El conjunto de proteínas que forman estas uniones se dividen en tres regiones morfológicas: -‐Región extracelular: En esta región encontramos glicoproteínas de la familia de las cadherinas, llamadas desmogleinas y desmocolinas. -‐Placa densa externa: Se encuentra en el interior del citoplasma y la componen las colas de las glicoproteínas de la región extracelular unidas a proteínas de unión como, desmoplaquina, placoglobina o placofilina. -‐Placa densa interna: Es la región donde se acomplejan las proteínas de unión con los filamentos de intermedios de queratina, formando el complejo de redes para la adhesión y distribución de las fuerzas mecánicas. • Uniones comunicantes o Gap Junctions Son dominios en la membrana plasmática lateral de la célula, compuestos por canales de comunicación que conectan el citoplasma de dos células adyacentes. Estos permiten un intercambio rápido de iones y pequeñas moléculas 20mg/L), cirugía previa, CDAI inicial elevado o inicio de la enfermedad en edad temprana son factores asociados no tan solo a la refractariedad a los GCs, sino también incrementan el riesgo de recidiva en la enfermedad de Crohn (182, 183).
3.4.-‐ Fisiopatología de la corticorresistencia Mientras las bases moleculares de la resistencia al tratamiento con GCs se conocen bastante en enfermedades inflamatorias como el asma o la artritis reumatoide, la fisiopatología de la respuesta inadecuada a corticosteroides en la EII ha sido poco estudiada. No obstante los pacientes con poca o nula respuesta a los corticoides padecen de todas formas los efectos no deseados de estos, considerándose el problema de la corticorresistencia es específica de tejido/órgano. Aunque la corticorresistencia es más frecuente en pacientes con enfermedad más grave, no se ha aclarado si la no respuesta al tratamiento convencional es un fenómeno primario o si la capacidad antiinflamatoria de los corticoides se ve desbordada por un exceso de mediadores inflamatorios. En favor a la primera opción Hearing y Cols. (184, 185) evaluaron la capacidad de la dexametasona en inhibir la proliferación de células T intestinales en pacientes con colitis ulcerosa activa clasificados en corticorresistentes, corticodependientes y corticosensibles. La inhibición de la proliferación en los dos primeros grupos fue < 60%, mientras que en los sensibles al tratamiento fue > 60%, demostrando así que la resistencia a la apoptosis en las células T es un factor clave en la respuesta de los GCs. En este sentido, recientemente se ha identificado al fenotipo de células T CD4+CD25int como responsable de la perpetuación de la inflamación después del tratamiento con esteroides (186). Además, estudios con linfocitos T procedentes de individuos sanos muestran una amplia variación en la respuesta frente a los corticoides (185). De aquí se desprende la idea de que la corticorresistencia sea una característica
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Introducción
intrínseca del individuo, y que la gravedad o extensión de la enfermedad per se no son suficientes para explicar este fenómeno.
3.4.1.-‐ Mecanismos de corticorresistencia
Se han descrito varios posibles mecanismos que explicarían la defectuosa capacidad inhibitoria sobre la inflamación por parte de los GCs, algunos de ellos a partir de estudios con pacientes de EII, mientras que otros han sido descritos en otras patologías inflamatorias como el asma o la artritis reumatoide. • A nivel de GCR Parece ser que existe una controversia en la implicación del número o cantidad de GRα en el mecanismo de la corticorresistencia en EII. En un estudio donde se cuantificaba los niveles de RNAm del GR, se observó un aumento en los pacientes en comparación con los controles, pero no hubo diferencia entre pacientes que responden y que no a los esteroides (187). Sin embargo, en otros estudios no se observaron diferencias de expresión del GCR, ni en la mucosa colónica ni en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), entre pacientes con colitis ulcerosa y controles pero sí una disminución de este en pacientes resistentes al tratamiento (103). Las conclusiones contradictorias pueden ser el resultado de los métodos de cuantificación y de las características de la población usada en cada uno de los estudios. Por otra parte, existe la idea que una afinidad por el ligando alterada por parte de los receptores podría ser otra posible explicación a la resistencia terapéutica. Esta disminución de la afinidad a ligando puede estar mediada por las citocinas IL-‐2 e IL-‐4 (188), aumentadas en la EII y que influirían en la fosforilación del receptor por parte de p38 MAPK (189). La isoforma GCRβ como regulador negativo del receptor funcional GcRα, puede ejercer un rol determinante en la corticorresistencia, abalado por diferentes estudios que han mostrado un aumento en la expresión de este, 68
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tanto en mucosa colónica como en PBMC de pacientes que no respondían al tratamiento en comparación a aquellos que sí lo hacían (190, 191). Pero esta explicación se encuentra con argumentos que los contradicen, ya sea porque no encuentran diferencias en la expresión por el tipo de respuesta (192) o porque lo niveles de GCRβ son mucho más bajos en casi todos los sistemas celulares, siendo incapaz de inhibir la función de la isoforma α (193). De un trabajo hecho con un modelo experimental de artritis reumatoide murino, donde además se ha mutado la capacidad de dimerización del GCR en linfocitos T, se desprende la idea de que una respuesta adecuada a los GCs y varios de sus efectos antiinflamatorios dependen de la formación correcta del dímero y su unión al DNA (194). Aunque se han descrito varios polimorfismos en gen del GCR (p.ej.: ER22/23EK, N363S, GCR-‐9β, etc.) no se ha podido establecer ninguna relación clara con la respuesta a corticoides en la EII (195). • A nivel del heterocomplejo proteico Una buena integridad del complejo proteico que retiene al GCR en el citoplasma es requerida para una unión óptima del ligando y la subsecuente activación de la respuesta transcripcional. Por lo que anomalías en las chaperonas y co-‐chaperonas que constituyen este multicomplejo, podrían estar implicadas en la mala respuesta a los esteroides. En este sentido, estudios con asmáticos resistentes a GCs han revelado una disminución de la Hsp90 en PBMC (196). • Gen MDR1 y la respuesta inadecuada a los GCs El gen MDR-‐1 codifica para la glicoproteína p-‐170 (Pgp-‐170) expresada en la membrana de linfocitos y células epiteliales. Pgp-‐70 es una bomba extractora de diferentes sustratos hacia el exterior de las células incluyendo fármacos como los GCs. El hecho de que diminuya la concentración intracelular de esteroides, puede ser una pieza clave en la aparición de su ineficacia. A favor de esta hipótesis, la elevada expresión encontrada del gen MDR-‐1 en linfocitos y células epiteliales de pacientes con EII que precisaron cirugía por fracaso a los corticoides (197). Aunque algunos polimorfismos como C3435T o 69
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C1236T en los exones 26 y 12 de este gen alteran la función y en la expresión de la Pgp-‐170, no se ha logrado asociarla a la resistencia terapéutica en la EII (195) . • Corticorresistencia a nivel de transcripción Los GCs pueden favorecer la condensación de la cromatina para impedir la expresión de algunos genes inflamatorios. La reducida expresión de HDCA2 detectada en PBMC y macrófagos de pacientes con asma que no responden a los GCs (198), podría ser la causa de la resistencia al tratamiento. También en enfermedad pulmonar obstructiva crónica, donde los pacientes apenas responden al tratamiento esteroideo, se ha comprobado que una de las principales causas es la reducción en la actividad de HDCA2 por el estrés oxidativo (150, 157). En la EII también existe un cierto grado de estrés oxidativo que podría explicar, en parte, la deficiente respuesta a corticosteroides (150). Por otro lado, el complejo SWI/SNF encargado de la remodelación de la cromatina necesaria para la transcripción, es reclutado por el GCR-‐ligando. En pacientes con leucemia linfocítica aguda la menor expresión de algunos de los componentes de el complejo SWI/SNF (como por ejemplo, el SMARCB1) se ha relacionado con la resistencia a los GCs (199). • Influencia de los mediadores inflamatorios Como se ha definido anteriormente uno de los mecanismos de represión génica de los GCs, es mediante la unión a factores de transcripción pro-‐ inflamatorios como el NF-‐kB. De la misma forma, este factor (200) podría regular negativamente la transcripción mediada por el complejo GCR-‐ligando (149) . En células mononucleares de pacientes con artritis reumatoide no respondedores al tratamiento, los GCs fueron incapaces de bloquear la elevada actividad de NF-‐kB in vitro (200). Bantel H y cols. (201) demostraron un patrón diferente de localización del NF-‐kB y proteínas de sus vías de señalización, entre pacientes con enfermedad de Crohn con diferente respuesta al tratamiento con esteroides. Así pues, la localización del NF-‐kB activo, como la p38 MAPK y la quinasa c-‐Jun N-‐terminal (JNK), se observó en macrófagos de la lamina propria en pacientes corticosensibles, mientras que 70
Introducción
sen corticorresistentes el marcaje se observó en células epiteliales. Por lo que los autores sugieren que una excesiva y constitutiva activación del NF-‐kB en el epitelio intestinal, podría estar involucrado en la corticorresistencia de la enfermedad de Crohn. Existen varios estudios que sugieren que las citocinas modifican los efectos de los Gcs. Ya hemos comentado el papel que jugarían las citocinas IL-‐2 y IL-‐4 en la corticorresistencia, disminuyendo la afinidad del GCR por su ligando. Pero también la IL-‐1β es un mediador clave en el mantenimiento de la inflamación que contrarresta los efectos de los GCs sobre la represión de NF-‐ kB en líneas celulares epiteliales intestinales (202). El TNF-‐α disminuye la sensibilidad de los GCs en monocitos y se encuentra más elevado en la mucosa de pacientes con colitis ulcerosa corticorresistentes (203). Otra citocina que tiene potentes efectos pro-‐inflamatorios que antagoniza los efectos de los GCs es el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) (204). Niveles elevados de esta citocina se han encontrado en células mononucleares de la lamina propria de pacientes con colitis ulcerosa corticorrefractaria (205). Además en el mismo estudio aparece una elevada producción de IL-‐8 y una activación del eje MIF/p38 MAPK que se relaciona con la aparición de la resistencia al tratamiento con esteroides. Aunque otros estudios relacionan los efectos de la MIF sobre los GCs mediante la inhibición de la expresión de IkB-‐α y MKP-‐1 (206, 207). La deficiencia observada de la citocina antiinflamatoria IL-‐10 en pacientes con enfermedad de Crohn corticorresistentes antes de la administración del tratamiento (208), sugiere la existencia de una relación entre la presencia de esta proteína con una buena respuesta a los GCs. En el mismo estudio, se propone esta citocina como un buen marcador predictivo de respuesta a corticoides. En esta misma línea, otro estudio muestra una menor secreción de IL-‐10 por parte de células dendríticas en pacientes de Crohn con un fenotipo de la enfermedad más agresivo, y por ende, con una respuesta inadecuada a los GCs (209). Por lo tanto, la aparición de ciertas citocinas pro-‐ inflamatorias, o bien la deficiencia en la producción de citocinas 71
Introducción
antiinflamatorias o corticorrefractariedad.
reguladoras
pueden
ser
claves
en
la
• Corticorresistencia a nivel celular La secreción de IL-‐10 por células Treg en respuesta a los GCs esta inhibida en pacientes con asma resistentes a esteroides. No obstante, el tratamiento con vitamina D revierte el proceso, sensibilizando a los pacientes frente a los corticoides (210). Dado que la Vitamina D es importante para el desarrollo de las células Treg, una dieta escasa en esta vitamina o la falta de luz solar, podrían ser factores que contribuirían a la resistencia a GCs (198). Tanto la apoptosis de linfocitos T como de monocitos, se considera un mecanismo clave en la acción antiinflamatoria de los GCs, por lo que existen varios estudios en este sentido. Células T de lamina propria de pacientes con enfermedad de Crohn muestran una expresión baja de la proteína pro-‐ apoptótica Bax de forma que aumenta el ratio Bcl-‐xl (proteína anti-‐ apoptótica)/Bax (110). De hecho, en la etiopatogenia de la enfermedad de Crohn se considera que uno de los componentes capaces de perpetuar la inflamación es un defecto que hace insensibles a las células T activas a la apoptosis (211). Más recientemente, se ha demostrado que no todos los pacientes Crohn tienen una deficiencia en la apoptosis, sino solo aquellos que son refractarios o dependientes al tratamiento con corticoides (208). Además, el mismo estudio mostró una mayor apoptosis en células B de pacientes sensibles al tratamiento, involucrando también a este subgrupo celular en la fisiopatogénia de la corticorrefractariedad.
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Antecedentes, hipótesis y objetivos 73
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Antecedentes e hipótesis
4. Antecedentes e hipótesis La EII es una compleja patología cuya incidencia está en aumento en nuestro país, representado en la actualidad una de las enfermedades crónicas de manejo hospitalario más frecuentes y que conlleva la utilización de numerosos recursos sanitarios. Los esteroides son el fármaco de primera línea en los brotes de actividad moderada o grave en la colitis ulcerosa (123), a pesar de que distintos estudios han demostrado que hasta un 60% de los pacientes no responde adecuadamente al tratamiento esteroidal, siendo ineficaces en un 30% y sólo parcialmente eficaces en otro 30% (171). La refractariedad a esteroides es una grave complicación en el tratamiento de la colitis ulcerosa y en la EII en general. La pérdida de eficacia no reduce los efectos secundarios de los corticosteroides y supone la substitución terapéutica. En este sentido, se ha comprobado que una indicación terapéutica correcta y precoz reduce drásticamente las complicaciones de la enfermedad (175). Trabajos de nuestro grupo sobre las complicaciones terapéuticas en la EII han revelado un aumento de la apoptosis en las células T y B de la mucosa intestinal en pacientes con enfermedad de Crohn sensibles al tratamiento con GCs (208). De hecho, estudios anteriores ya habían sugerido que defectos en la inducción de la apoptosis de las células T de la lamina propria intestinal estarían relacionados con la patogénesis de la enfermedad de Crohn (211). Pero este mecanismo no es el único atribuido a la corticorresistencia. Distintos trabajos han relacionado el fracaso a esteroides con la presencia de polimorfismos en el gen MDR-‐1 que inducen un aumento de los niveles de la Pgp-‐170, cuya actividad es la detoxificación celular lo que se relaciona con un descenso de los niveles intracelulares de GCs (197). Aunque la mayoría de acciones inmunosupresoras de los GCs se han descrito sobre células inmunes (141, 212), existen estudios donde las células diana de los corticoides son los enterocitos. La reabsorción intestinal de glucosa observada tras la administración oral de dexametasoma es revertida en ratones deficientes para el GCR (83) en enterocitos, evidenciando la 75
Antecedentes e hipótesis
implicación de las células epiteliales en algunos mecanismos de acción de los HIPÓTESIS: GCs (213). La IL-‐10 influye en la actividad del epitelio intestinal favoreciendo el Nuestro grupo propria, ha demostrado que la presencia RNAm de la IL-‐10 en aislamiento de la lamina facilitando la respuesta a los de esteroides biopsias de upacientes con enfermedad de Crohn activa, antes del en pacientes con colitis lcerosa activa. tratamiento con esteroides (208), se asoció con una buena respuesta a los GCs. La deficiencia de esta misma citocina inmunoreguladora en modelos animales se ha asociado con un aumento de la permeabilidad intestinal y al desarrollo de colitis espontánea (83). Asimismo, la IL-‐10 es capaz de reducir el estrés del retículo endoplasmático en células epiteliales del intestino producido por TNF-‐α (62). En conjunto, las premisas anteriores sugieren un papel clave de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal, capaz de regular la función barrera e introducir cambios antiinflamatorios. No obstante, los mecanismos moleculares promovidos por la IL-‐10 sobre las células del epitelio intestinal y si estos influyen sobre la respuesta a los GCs, son poco conocidos.
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Objetivos
5. Objetivos • Comprobar en un modelo in vitro si la presencia de IL-‐10 puede favorecer la respuesta a los GCs actuando sobre la función barrera en las células epiteliales del intestino. • Averiguar si estos cambios in vitro también son percibidos en la mucosa cólica de pacientes con colitis ulcerosa activa con diferente respuesta al tratamiento con GCs.
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Objetivos
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Material y métodos 79
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Métodos
6. Métodos 6.1.-‐ Evaluación de la apoptosis inducida por dexametasona en células T aisladas de sangre de controles sanos 6.1.1.-‐ Muestras y procedencia Se partió de 20 ml de sangre periférica de 7 individuos sanos, a partir de la cual se aislaron las células T para los posteriores experimentos. La sangre se recogió en nuestro centro, Hospital Universitari “Germans Trias i Pujol”, por personal autorizado y para ello se usaron tubos con anticoagulante EDTA de 10 ml. 6.1.2.-‐ Aislamiento de linfocitos T de sangre periférica Se llevó a cabo una separación celular por gradiente de ficoll® (Linfoprep). Para conseguirlo se diluyó la sangre 1:1 con suero fisiológico y la mezcla se depositó, con cuidado de no romper el gradiente, encima de una capa de 10 ml de ficoll previamente añadidos. A continuación se centrifugó a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1500 rpm sin freno. Se recuperó la interfase que es donde se encontraban los linfocitos y otras células mononucleares y se hicieron 3 lavados de 7 minutos a 1500 rpm con medio RPMI más antibióticos. Después del último lavado se resuspendió el pellet con un volumen conocido de medio, para el recuento y viabilidad celular en la cámara de Neubauer con azul de tripano. A continuación, se resuspendió el pellet en solución MACS a relación de 40 µl por cada 107 células para proceder a la selección celular. La separación de las células T se hizo mediante selección negativa por el sistema de separación MACS® (Figura 10) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Este método se basa en el aislamiento de las células de nuestro interés presentes en una mezcla mediante el reconocimiento por anticuerpos específicos conjugados con partículas metálicas que permiten la retención del resto de células no deseadas en columnas magnéticas. Para ello se usó el kit comercial para muestras humanas: Pan T Cell insolation. 81
Métodos
A la suspensión se le añadieron 10 µl del cóctel de anticuerpos biotinilados anti-‐células no T y se incubó durante 10 minutos a 4ºC. Seguidamente, se añadieron 20 µl de las microesferas magnéticas anti-‐biotina y se dejaron incubar 15 minutos a 4ºC. Pasado ese tiempo, se añadió unas 10 veces el volumen de la suspensión celular resultante de solución MACS y se centrifugó todo a 300xg durante 10 minutos. El pellet se volvió a resuspender con 500 µl de solución MACS. Después de montar la columna de retención LS en el sistema MACS, se hizo pasar la muestra a través de ella. Los complejos formados por las microesferas-‐anticuerpo-‐célula no T, fueron retenidos en la columna dejando pasar las células T, que se recogieron con la elución en un tubo aparte (Figura 10). De nuevo se hizo un recuento celular, para saber el número de linfocitos con los cuales contábamos para los experimentos de estimulación a través de TCR.
Microesferas metálicas unidas a células no T Células T
Columna de retención MACS Imán sistema MACS
Tubo de recolección con las células T
FIGURA 10: Sistema y principio de separación por selección negativa MACS para células T.
6.1.3.-‐ Diseño experimental Para llevar a cabo los experimentos con células T, estas se activaron con un estímulo proliferativo vía TCR/MEK, mediante anticuerpos CD3 y CD28, de 82
Métodos
duración breve (durante 24h) o prolongada (durante 72h). La apoptosis se indujo mediante dexametasona (GCs) en comparación con el inhibidor de la MEK (PD98059), o bien con la combinación de ambos. Las condiciones experimentales resultantes fueron las siguientes:
Condición CD3/CD28 24h (basal) CD3/CD28 72h (basal) CD3/CD28 24h_GCs CD3/CD28 72h_GCs CD3/CD2824h_PD98059 CD3/CD2872h_PD98059 CD3/CD28 24h_GCs_PD98059 CD3/CD28 72h_GCs_PD98059
GCs
CD3
CD28
(5µg/ml)
(2.5µg/ml)
(Dexametasona, 0.1µM)
X X X X X X X X
X X X X X X X X
X X X X
PD98059 (100µM)
X X X X
Para la estimulación, se incubaron los linfocitos T en placas de 96 pocillos, de fondo plano y con una superficie de alta adherencia. El anti-‐CD3 se añadió diluido en 100 µl de PBS 1x estéril a cada pocillo y dejándolo 90 minutos a 37ºC para conseguir unirlo a la placa. Pasado ese tiempo, se retiró el volumen de los pocillos por inversión y seguidamente, se bloqueó la placa con albúmina de suero bovino (BSA) al 3% en PBS 1x estéril, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se hicieron dos lavados con PBS 1x estéril y el último se hizo con medio para el cultivo de linfocitos AIM-‐ V. Una vez preparada la placa, se sembraron 105 linfocitos T por pocillo en medio 100 µl AIM-‐V con CD28, al cual se le añadió dexametasona y/o PD98059 según las condiciones. Para los estímulos breves, a las 24h se cambiaron las células a una placa nueva sin estímulo y se añadió el medio con el resto de los componentes hasta las 72h. En cambio, la incubación con el estímulo continuado se prolongó durante 72h, con una renovación del medio correspondiente, a las 24h (Figura 11). En las condiciones con PD98059, las células se incubarán previamente al inicio de la estimulación solo con el inhibidor. Esta pre-‐incubación se hará en eppendorfs a 37ºC 83
Métodos
durante 1 hora, como indica el fabricante. Los grupos basales se incubaron solo con el estímulo CD3/CD28 de forma breve o prolongada, siguiendo las mismas pautas anteriores. Pasadas 72h se recogieron las células de todas las condiciones en tubos y se hicieron 2 lavados con PBS 1x estéril. Siembra células T
Retirada o renovación del estímulo (según condición) y cambio de medio
0h
24h
Estímulos breve y prolongado BASALES
Estímulo C D3/CD28
Estímulo breve
Estímulo C D3/CD28
Estímulo prolongado
Valoración apoptosis
72h
Estímulo C D3/CD28
Dexametasona PD98059 Estímulo C D3/CD28 Dexametasona PD98059
FIGURA 11: Esquema de estimulación y diseño experimental con células T estimuladas con CD3/CD28 y tratadas con o sin GCs y/o PD98059.
6.1.4-‐ Valoración del grado de apoptosis en linfocitos CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo La apoptosis se evaluó mediante Anexina V-‐PE y 7-‐AAD, mientras el fenotipo se identificó con anti-‐CD4-‐APC o anti-‐CD8-‐FITC. Se añadieron 5 µl por 106 células de cada anticuerpo conjugado y se dejó incubar durante 20 minutos en oscuridad a 4ºC. Luego, para eliminar el exceso de anticuerpo no unido, se hicieron dos lavados con PBS 1x (10 minutos a 1300 rpm). Para la valoración del grado de apoptosis se usó el kit Annexin V-‐PE apoptosis detection. Este kit se basa en la afinidad de la anexina V por la fosfatidilserina, fosfolípido presente en la parte interna de La membrana plasmática que cuando las células entran en apoptosis se externaliza, y en el 84
Métodos
marcador vital 7-‐AAD, que solo entrará en las células con una membrana degradada. Por lo que este kit puede detectar células viables (Anexina V negativa y 7-‐AAD positivo), células en apoptosis (Anexina V positiva y 7-‐AAD negativo) y necrosis (Anexina V y 7-‐AAD positivos) (Figura 12).
7-‐AAD
Apoptosis t ardía o muerte celular
Células viables
Apoptosis temprana Anexina V
FIGURA 12: Cuadrantes de identificación del grado de apoptosis mediante los marcadores Anexina V y 7-‐AAD por citometría de flujo.
La muestra resultante de la centrifugación anterior se resuspendió con la solución de unión 1x del kit, 100 µl por 105 células, a la que se añadió 5 µl de los marcadores Anexina V-‐PE y 7-‐AAD. Se vortearon suavemente las muestra para mezclarlas y se incubaron durante 15 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente. Para pasar la muestra por el citómetro de flujo de cuatro canales (BD, Franklin Lakes, USA.) antes se añadieron 400 µl de solución de unión. La adquisición de las muestras en el citómetro se hizo hasta tener un mínimo de 10.000 linfocitos valorados. Anteriormente se habían calibrado las fluorescencias de todos los marcadores por separado, para delimitar bien las regiones de captación y evitar el solapamiento de señal (Figura 13).
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Métodos
A CD4 +
CD8 +
CD8 +
CD4 +
7.41 % Apoptosis
B CD4 +
CD8 +
CD8 +
CD4+
22.74 % Apoptosis
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Figura 13: Plots de citometria de flujo donde se valora el fenotipo de linfocitos T, CD4 y CD8, además del grado de apoptosis mediante Anexina V-‐PE y 7-‐ ADD. La Figura A, sería un ejemplo de los grupos con un % de apoptosis bajo, en comparación con la figura B, donde se observa un valor más elevado.
Métodos
Los resultados se expresaron como incrementos porcentuales respecto a sus condiciones con estímulo basal a 24h o 72h, para restar el posible efecto de r condición experimental -‐ valor condición basal este en la apoptosis celular. Esta normalización de los resultados se hizo Valor condición basal mediante la fórmula:
6.2.-‐ Estudios in vitro sobre monocapas de células Caco-‐2 confluentes. 6.2.1.-‐ Muestras y procedencia La línea celular utilizada fue la línea epitelial Caco-‐2, derivada del carcinoma de colon humano. Bajo condiciones estándar de cultivo dan lugar a monocapas celulares y presentan características morfológicas y bioquímicas similares a las de los enterocitos diferenciados (214, 215). Las células se obtuvieron de la European collection of cell cultures (ECACC) con un número de pases +8. Se almacenaron en alícuotas de 106 células en medio D-‐MEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector 6.2.2.-‐ Cultivo celulares sobre transwells y estimulaciones El cultivo en transwells o filtros semipermeables favorece la polarización de las células Caco-‐2 (215). Estos sistemas poseen una membrana de polietileno en la base, de 0.4µm de poro, donde se adhieren las células (Figura 14) y les permite crecer en monocapa, con una gran semejanza funcional a las células epiteliales del intestino.
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Métodos FIGURA 14: Detalle del sistema transwell usado para el cultivo de monocapas de células Caco-‐2.
Transwell
Células adheridas a membrana de polietileno
Primero, se descongelaron 106 células almacenadas en nitrógeno líquido (-‐ 196ºC) en un baño a 37ºC. Una vez descongeladas se añadieron a un tubo con 5 ml de medio cultivo D-‐MEM y se centrifugaron a 900 rpm 5minutos para eliminar el DMSO. El pellet se resuspendió en 6 ml de medio de cultivo, que se añadió directamente a un frasco de 75 cm2. El cultivo celular se mantuvo a 37ºC con 5% de CO2, realizando un cambio de medio a días alternos, hasta llegar al 80% de confluencia, momento en que las células se sub-‐cultivaron aumentando así el número de pase. Para ello, se separaron las células adheridas a la superficie de los frascos de 75 cm2 realizando una suspensión de las mismas, mediante la adición de 3 ml de tripsina 0.25%, incubándolas a 37°C durante 4 minutos. Para inactivar la acción de la tripsina, se añadieron 5 ml de medio D-‐MEM y la resuspensión se transfirió a un tubo de 15 ml que se centrifugó a 900 rpm durante 5 minutos. Luego se descartó el sobrenadante y el pellet se volvió a resuspender de forma homogénea con 4-‐5 ml de medio D-‐MEM. A partir de esta suspensión se hizo el recuento de células viables mediante la cámara de Neubauer y se sembraron en un nuevo frasco entre 6-‐7.105 células con 6 ml de medio de cultivo. Son necesarios dos pases a partir de las células descongeladas para poder obtener una buena diferenciación celular en los transwells. Por lo tanto, una vez hechos dos pases, se volvieron a tripsinizar las células para recuperarlas 88
Métodos
pero esta vez se sembraron en los transwells a razón de 3.104 células por cada uno. En la parte basal del transwell se añadió 700 µl y 350 µl en la parte apical de medio D-‐MEM. A los 21 días post-‐siembra, cuando este tipo celular se diferencia totalmente creando una monocapa celular con función barrera, se estimularon según las condiciones experimentales (ver punto 6.2.3). La estimulación se añadió al medio basal del filtro, que después de validar el tiempo de duración se acordó mantenerlo durante 48 horas con una renovación a las 24 horas (Figura 15).
FIGURA 15: Diseño experimental de las estimulaciones con células Caco-‐2.
6.2.3.-‐ Diseño experimental Con las células Caco-‐2 se llevaron a cabo dos estudios: a) Estudio I: Efecto de la sinergia entre IL-‐10 y GCs sobre la función barrera en monocapas de células Caco-‐2. Para este estudio se les indujo un estímulo inflamatorio mediante TNFα y se valoraron las capacidades antiinflamatorias o reparadoras de los GCs y la IL-‐ 10 en combinación o por separado. El grupo control se incubo sólo con medio D-‐MEM. 89
Métodos
Se hicieron 7 réplicas de cada una de las siguientes condiciones:
Condición Control TNF-‐α
TNF-‐α_GCs TNF-‐α_IL-‐10
TNFα_GCs_ IL-‐10
D-‐MEM
TNF-‐α
GCs
IL-‐10
(100ng/ml)
(Metilprednisolona, 50µM )
(20ng/ml)
X X X X
X X
X X
X X X X X
b) Estudio II: Efecto de fosforilación de la p38 MAPK sobre las uniones intercelulares de células Caco-‐2. En el segundo estudio las células Caco-‐2 fueron igualmente tratadas con TNFα, y para determinar el papel que juega la fosforilación de p38 MAPK en las funciones reparativas de los GCs y IL-‐10, se añadió el inhibidor de la fosforilación de p38 MAPK, SB203580. Al estar el inhibidor disuelto en DMSO, a parte del control con medio de cultivo sólo, se incluyó un control con D-‐MEM y DMSO a la misma concentración final que en la condición inflamatoria, tal y como se observa en tabla siguiente:
Condición Control DMSO TNFα_GCs TNFα_GCs_ IL-‐10 TNFα_GCs_ IL10_SB203580
D-‐MEM
TNF-‐α
GCs
(100ng/ml)
(Metilprednisolona, 50µM )
X X X
X
X X
IL-‐10
Inhibidor
DMSO
(20ng/ml)
(SB203580, 20µM)
(20µM)
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
De las condiciones anteriores se realizaron 8 réplicas de cada una. 6.2.4.-‐ Medida de la Resistencia Eléctrica Transepitelial La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) mide el paso de electrones a través de una monocapa celular. Este es un buen indicador de la confluencia celular y de la integridad de la monocapa, así como de la formación de las 90
Métodos
uniones estrechas intercelulares y del estatus de la función barrera (216). Con la ayuda de un Volt-‐óhmetro se determinó el potencial de membrana y la resistencia transepitelial entre el compartimento basal y el apical de las monocapas confluentes de células Caco-‐2 (Figura 16).
FIGURA 16: Detalle de la medida de TEER
Para saber la evolución de este parámetro en nuestras monocapas de Caco-‐2 como consecuencia de las diferentes condiciones experimentales, se recogió el valor basal de TEER (TEERi) a los 21 días post-‐siembra (antes del inicio de la estimulación) como referencia y se comparó con el valor final (TEERf), a las 48h de estimulación. Anteriormente, a los 14 días post-‐siembra, se hizo un registró de este parámetro como control del buen crecimiento celular y del desarrollo de la barrera (Figura 15). Para la medición de la TEER, los transwells se trasladaron a una placa de 24 pocillos con PBS estéril y a temperatura ambiente. Al valor TEER obtenido se le restó el valor blanco (resistencia ofrecida por un transwell sin monocapa de células adheridas) y los valores resultantes (en ohms, ) se multiplicaron por el área del transwell (0.3 cm2) para obtener la resistencia eléctrica transepitelial en /cm2. Todos los estudios se llevaron a cabo con una TEERi a los 21 días post-‐siembra, igual o superior a 450 /cm2. Los resultados fueron expresados como incrementos percentuales de TEER, mediante la fórmula siguiente: 91
TEERf-‐TEERi x100 TEERi
Métodos
6.2.5.-‐ Cuantificación de IL-‐8 mediante ELISA La cuantificación de IL-‐8 como medida indirecta de inflamación, se hizo mediante la técnica ELISA a partir de los sobrenadantes basales de los cultivos celulares de Caco-‐2. Para ello se usó el kit comercial BD OptEIA set human IL-‐8 siguiendo las indicaciones del fabricante en placas de 96 pocillos. Inicialmente, se diluyó el anticuerpo de captura en carbonato sódico 0.1M y se añadieron 100 µl de esta solución a cada pocillo, dejándolo durante toda la noche a 4ªC para la buena adhesión del anticuerpo a la superficie. Al día siguiente, se bloqueó la placa durante 1 hora con FBS al 10% en PBS y se hicieron los lavados indicados. Paralelamente, se prepararon los estándares de IL-‐8 (de 200 pg/ml a 3.1 pg/ml de proteína) mediante diluciones sucesivas a partir del stock (100ng/ml) con una solución de 10% FBS en PBS. Posteriormente, se añadió 100 µl de los sobrenadantes de los cultivos celulares y los estándares en cada pocillo, para incubarlos durante 2 horas a temperatura ambiente. Una vez desechado el contenido de los pocillos, se procedió a la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, con 100 µl los anticuerpos conjugados con estreptavidina unida a HRP, la detección se realizó a 450nm con el Varioskan (ThermoScientific, Waltham (MA), USA). Todas las muestras se valoraron por duplicado. 6.2.6.-‐ Extracción proteica y determinación de proteínas mediante Western blot 6.2.6.1.-‐ Obtención de proteína total Las células Caco-‐2 se recuperaron con el medio de cultivo del transwell con la ayuda de una pipeta. El volumen se traspasó a un eppendorf estéril y se lavaron con PBS 1x a 4ºC. Para la extracción de la proteína total se incubaron las células durante 45 minutos en agitación y a 4ºC con 200 µl de la solución 92
Métodos
de lisado RIPA. A continuación se centrifugaron los tubos 15 minutos a 14000 rpm a 4ºC. El sobrenadante resultante con las proteínas se congeló en alícuotas a -‐80ºC. 6.2.6.2.-‐ Obtención de proteína soluble e insoluble Para la obtención de la fracción proteica soluble e insoluble por separado se modificó el protocolo de extracción proteica total. Después de la incubación y centrifugación con el tampón RIPA, el sobrenadante se recuperará igual que para la proteína total considerando estas las proteínas más solubles. Esta vez el pellet resultante se incubó durante 50 minutos a temperatura ambiente con una solución de UREA/Thiourea. Después se realizó una ultracentrifugación (50000xg) de 1hora a 21ºC, de la cual se obtuvo un sobrenadante que contenía las proteínas insolubles. Igualmente, los sobrenadantes se almacenaron a -‐80ºC hasta su uso. En ambos casos se cuantificó la concentración proteica mediante el método de Bradford, con el kit comercial Kit Quickstard® Bradford protein assay. 6.2.6.3.-‐ Inmunoblotting Mediante la técnica de western blot se determinaron los niveles de las proteínas implicadas en vías de señalización (p38 MAPK, AKT, JNK, MLCK), proteínas de las uniones estrechas (ZO-‐1, Ocludina) y la proteína housekeeping α-‐tubulina. Para ello se utilizó el sobrenadante con el contenido proteico total, soluble e insoluble. Debido a la escasa concentración de proteína, los sobrenadantes procedentes de las células Caco-‐2 se concentraron con el método TCA-‐DOC (ácido Tricloroacético/detergente Na-‐deoxycholate). Los cálculos se hicieron para poder cargar 40 µg de proteína en cada carril del gel de electroforesis. Al volumen de muestra necesario para ello, se le añadió 1/100 volúmenes de DOC al 2%. La mezcla se dejó incubar 30 minutos en a 4ªC. Pasado ese tiempo se añadieron 1/10 volúmenes de TCA al 100% y se dejó otra vez a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente se centrifugaron a 15000xg 15 minutos en frío, y se descartó el sobrenadante por inversión de los eppendorfs sobre un papel absorbente. El pellet se lavó con acetona a -‐20ºC 93
Métodos
para retirar cualquier resto de TCA. El lavado se hizo con 300 µl de acetona y una centrifugación de 10 minutos a 10000xg. Una vez descartada la acetona, se dejaron secar al aire los pellets durante 10 minutos. Los 40 g de proteína precipitada se suspendieron con 23 l de LDS 1x y 2.5 l de agente reductor 10x, para iniciar el protocolo de inmunoblotting. La suspensión se desnaturalizó durante 10 minutos a 70ºC, con la ayuda de un baño seco. Luego, las muestras proteicas se separaron según su peso molecular en un gel del 4-‐12% de poliacrilamida durante aproximadamente 45 minutos 200V en buffer MOPS. Una vez finalizada la electroforesis se hizo la transferencia húmeda de estas proteínas a una membrana de nitrocelulosa, (Figura 17) en solución de transferencia a 100V durante 90 minutos.
Dirección de la transferencia
Papeles de filtro Gel de poliacrilamida Membrana Esponja
FIGURA 17: Esquema del “sandwich” para la transferencia húmeda
A continuación se bloqueó la membrana en buffer de bloqueo Odyssey durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación. Pasado ese tiempo se hicieron tres lavados consecutivos de 15 minutos con PBS-‐T y se procedió a la incubación overnight a 4ºC con el anticuerpo primario (Phospho-‐p38 MAPK 1/250, MLCK 1/100, phospho-‐AKT 1/100, phospho-‐JNK 1/100, ZO-‐1 1/100, Ocludina 1/100, α-‐tubulina 1/6000) en solución de bloqueo. Al día siguiente se lavó la membrana para eliminar el exceso de anticuerpo primario y se incubó la membrana con el anticuerpo secundario correspondiente conjugados con moléculas fluorescentes (Donkey anti-‐ mouse IRDye 800CW o Donkey anti-‐rabbit IRDye 680 a 1/20000 en solución de Bloqueo). La incubación en este caso, fue de 1 hora a temperatura 94
Métodos
ambiente. De nuevo se lavó la membrana para la detección y cuantificación de la señal mediante el escáner Odyssey. La cuantificación de las bandas se hizo a través del software Odyssey Infrared Imaging system (versión 3.0), expresando los valores en intensidad integrada que corresponde a la suma de intensidad de todos los píxeles de una banda (restándole los valores del fondo) y multiplicado por el área de esta. Los valores de cada condición fueron normalizados por la intensidad de la proteína referencia, en este caso la α-‐tubulina, y se expresaron como incrementos respecto al grupo control. 6.2.7.-‐ Inmunofluorescencia en células Caco-‐2 Para poder conocer la localización de las proteínas de las uniones estrechas (ZO-‐1) y de las vías de señalización (p38-‐MAPK fosforilada) se hicieron tinciones sobre las monocapas de Caco-‐2 adheridas a las membranas de los transwells. Una vez finalizadas las estimulaciones, los transwells se cambiaron a una nueva placa de 24 pocillos para iniciar el protocolo de inmunofluorescencia. En un primer lugar se hicieron 2 lavados de 5 minutos a temperatura ambiente, depositando 300 l en la parte apical y 700 l en la parte basal de PBS 1X. A continuación para fijar las células, se añadió de la misma forma que con los lavados, 4% paraformaldehído/2% sucrosa y se dejó durante 40 minutos a 4ºC. Se volvieron a hacer tres lavados y se procedió a la permeabilización de las células con metanol frío durante 8 minutos a -‐20ºC. Sin dejar que se secasen las muestras, se hicieron 3 lavados más y se pasó al bloqueo de estas mediante la incubación con una solución al 3% de BSA (en PBS). En este punto, se recortaron las membranas de los transwells con las células adheridas y se colocaron en un portaobjetos, teniendo especial cuidado con la orientación de la membrana, dejando las células hacia arriba. A continuación se incubaron con los anticuerpos primarios (ZO1 2 µg/ml, fosfo-‐p38 MAPK 1/100) depositando 100 l de solución 1%BSA con el anticuerpo sobre las membranas durante toda la noche a 4ºC. Al día 95
Métodos
siguiente se hicieron tres lavados sumergiendo las membranas en 300 l de PBS 1X durante 5 minutos y con una ligera agitación. Inmediatamente después se añadieron 200 l de los anticuerpos anti-‐rabbit Alexa 488 o anti-‐ mouse Cy3 (dilución 1/200 en BSA 1% en PBS), que se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente y al resguardo de la luz. Una vez retirada la solución con el anticuerpo secundario, se añadió el marcaje nuclear Hoechst a una concentración de 0,4 µg/ml y se dejó durante 10 minutos más. Luego se hicieron tres lavados para eliminar los restos de anticuerpos o marcaje y las muestras se montaron con medio Fluoroprep y se sellaron con un cubreobjetos y laca de uñas. Para la adquisición de las imágenes se utilizó el microscopio AxioObserver Z1 (Carl Zeiss S.A., Alemania) con el software AxioVision (versión 4.8.1). Se cuantificó el porcentaje de células con marcaje positivo en el núcleo y su localización en el citoplasma (homogénea o periférica). 6.2.8.-‐ Expresión de genes mediante PCR a tiempo real La expresión de diferentes genes implicados en vías antiinflamatorias (BCL-‐3, SOCS-‐3, IkB-‐α, IL10Rα y GCRα) y en las uniones intercelulares (E-‐CADHERINA) se valoraron sobre el RNA procedente del estudio II en los cultivos de monocapa Caco-‐2 preservado a -‐80ºC en Qiazol. 6.2.8.1-‐ Extracción de RNA total Todo el material que se usó (tubos y puntas de pipeta) era libre de RNAsas/DNAsas, al igual que el área trabajo que se limpió con Termi-‐DNA-‐ Tor, tanto para impedir la degradación del RNA como la contaminación del material con DNA. La extracción de RNA total se hizo mediante el kit miRNeasy Mini en el sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos QIAcube (QIAGEN, Madrid, España). Las muestras se descongelaron en hielo y se dejaron 5 minutos a temperatura ambiente con el Qiazol, lo que permitió la lisis celular. Luego se añadió 140 µl de cloroformo por cada 700 µl de Qiazol, se mezcló bien y se 96
Métodos
dejó a temperatura ambiente 3 minutos más. Seguidamente se centrifugó a 12000xg durante 15 minutos para la formación de 3 fases líquidas: superior (dónde se encuentra el RNA), Interfase (dónde está el DNA) y inferior (dónde se encuentran las proteínas y restos celulares). Se recuperó la parte superior, procurando no coger material de la interfase y se traspasó a un tubo nuevo. A partir de aquí la extracción se hizo automatizada siguiendo el protocolo del fabricante: “Purification of total RNA, including small RNAs, from animal tissues and cells (aqueous phase)”. Se recogió un volumen de 30µl donde estaba el RNA. 6.2.8.2-‐ Cuantificación, pureza e integridad del RNA Una vez extraído el RNA se valoró la concentración y pureza mediante el Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, USA). El ratio de absorbancia A260/280nm indica la pureza de la muestra, siendo óptima entre 1.8 y 2. La absorbancia a 260nm corregida por el coeficiente de extinción molar, indicará la concentración del RNA en ng/ml. La integridad se midió mediante el sistema automatizado de electroforesis Experion (Bio-‐Rad, Hercules, USA) usando chips para RNA con un rango de sensibilidad de 25-‐500 ng/µl. Para ello se desnaturalizaron 2µl de RNA total y del marcador de peso molecular por muestra, a 70ºC durante 2 minutos. Se cargará el gel y las muestras en los pocillos del chip y se montará en la estación Experion. Una vez finalizada la electroforesis el software nos devolverá una imagen virtual de la fluorescencia captada donde la presencia de las dos bandas del RNA ribosómico (18S/28S) demuestra una buena integridad. En cambio, si el RNA estuviera degradado se observaría un conjunto de bandas continuo a lo largo del carril (Figura 18). El valor de integridad de RNA (RQI) se obtiene mediante un algoritmo que compara electroferogramas estándares de RNA de muestras eucariotas, siendo 10 para el RNA intacto y 1 para el degradado. En este trabajo se usaron las muestras con un RQI ≥ 7. 97
Métodos 18S
RQI = 5 .7 28S
18S
RQI = 8.2
28S
FIGURA 18: Imagen virtual de la electroforesis con chip de RNA: del carril 1-‐4 son muestras donde el RNA esta degradado a diferencia de los carriles 5-‐12. A la derecha, se muestran el detalle de los carriles 2 y 6, donde se pueden apreciar los picos que corresponden a la subunidad 18S y 28S del RNA ribosómico, y el valor de RQI.
6.2.8.3-‐ Retro-‐transcripción a DNA complementario Para la retro-‐transcripción del RNAm a DNA complementario (cDNA) se usó el kit PrimeScriptTM RT reagent (Perfect Real Time). Se emplearon 800ng de RNA total (a una concentración de 200ng/µl) por reacción de transcripción reversa, en un volumen de 40µl para obtener una concentración de 20ng/µl de cDNA. Se preparó la master mix (MM) de la reacción para todas las muestras a valorar según las siguientes proporciones: Reactivo
µl por muestra
5X PrimeScript buffer (for Real Time) PrimeScript RT Enzyme MIX Oligo dT Primer (50µM) Random 6 Mers (100µM) RNAse free H2O Volumen final
8 2 2 2 22 36
A continuación se mezclaron 36 µl de MM con 4 µl de muestra (un total de 800ng de RNA total) en un tubo de 0.2µl RNAsa free y se pusieron en el termociclador con las siguientes condiciones: 15 min, 37ºC _ 5 seg, 85ºC _ 98
Métodos
HOLD 4ºC. Se harán alícuotas del cDNA resultante de la reacción y se almacenará a -‐80ºC hasta su uso. 6.2.8.4.-‐ PCR a tiempo real La PCR en tiempo real (RT-‐qPCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la cual amplifica y cuantifica de forma absoluta el producto de la amplificación, DNA. En este caso se mide la fluorescencia depués de cada ciclo de amplificación y es por esto que se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). La fluorescencia viene dada por el SYBR Green añadido a la reacción, que por su gran afinidad por el DNA de cadena doble se incorporará a las nuevas cadenas sintetizadas. En nuestro caso, se usó el kit SYBR Premix Ex Taq para formato de placas de 384 pocillos y la fluorescencia fué captada por el equipo LightCycler 480 (Roche Applied Science, Barcelona, España). Se diseñaron los primers (Tabla 1) con la ayuda del programa Primer express® (Life Technologies), para valorar la expresión de los genes IL-‐10, BCL-‐3, SOCS-‐ 3, IkB-‐α, receptor IL-‐10 α/β, receptor GC α/β, E-‐Cadherina, y GAPDH como gen de referencia o “housekeeping gen” (HKG). El HKG normaliza la expresión de los genes problema, equilibrando las posibles variaciones de carga de cDNA entre muestras. Cada gen se valoró por duplicado. GEN IL10 IL10R α IL10R β GCR α GCR β IkB α BCL-‐3
Parejas de Primers Forward 5”-‐AGATCTCCGAGATGCCTTCAG-‐3” Reverse 5”-‐CCCTTAAAGTCCTCCAGCAAG-‐3” Forward 5”-‐ATGAGATTGCCATTCGCAAG-‐3” Reverse 5”-‐AAGCGACAGATGGTTTCACCT-‐3” Forward 5”-‐GTACCACCTCCCGAAAATGTC-‐3” Reverse 5”-‐GCTGTGAAAGTCAGGTTCCCT-‐3” Forward 5”-‐CTTGGATTCTATGCATGAAGTGGTT -‐3” Reverse 5”-‐TTGGAAGCAATAGTTAAGGAGATTTTC-‐3” Forward 5”-‐ACT CTTGGATTCTATGCATGAAAATG-‐3” Reverse 5”-‐TGTGTGAGATGTGCTTTCTGGTTT -‐3” Forward 5”-‐GAAGAAAAGGCACTGACCATGG-‐ 3” Reverse 5”-‐TTCTGGCTGGTTGGTGATCAC-‐3” Forward 5”-‐AACACCGAGTGCCAAGAAACC-‐3” Reverse 5”-‐TGTTGTTTTCCACGGCGT-‐3”
99
Métodos SOCS-‐3 E-‐CADHERINA GAPDH
Forward 5”-‐CCCCCCAGAAGAGCCTATTACA-‐3” Reverse 5”-‐ACAGAGATGCTGAAGAGTGGCC-‐3” Forward 5”-‐GGCCTGAAGTGACTCGTAACGA-‐3” Reverse 5”-‐CAGCCGCTTTCAGATTTTCATC-‐3” Forward 5”-‐ TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-‐3” Reverse 5”-‐ ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-‐3”
TABLA 1: Secuencias de los primers forward y reverse para la valoración por RT-‐PCR
En cada pocillo se añadieron 9µl de MM (Tabla 2) a 20ng de cDNA y después de centrifugar la placa, se configuró el programa del LightCycler con las condiciones adecuadas (Tabla 3) para amplificación y valoración de la expresión. Reactivos
Volumen (uL)
Concentración final
5 0.2 0.2 1 3.6 10
1x 0.2uM 0.2uM
SYBR Premix Ex Taq (2x) PCR Forward primer (10uM) PCR Reverse primer (10uM) Muestra (200ng/uL) dH2O Total
TABLA 2: Composición y concentraciones de la MM para la RT-‐PCR Desnaturalización Amplificación
Enfriamiento
Tiempo
Temperatura
Ciclos
30” 5” 20” 10” HOLD
95º 95º 60º 72º 4º
1 35
1
TABLA 3: Condiciones de PCR
El software del equipo nos indicó para cada muestra, el primer ciclo de la PCR en el que se detecto fluorescencia (Ct). El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de RNAm de partida por muestra. En nuestro caso la expresión génica se cuantificó de forma relativa mediante el método 2-‐ΔΔCt, lo que significa que cada caso se referenció respecto a la condición basal, 100
Métodos
normalizando ambas con su valor de HKG. La condición basal fue para todas la condición control, excepto para TNF_GCs_IL10_SB203580, que fue la condición DMSO. La fórmula que se usó para ello fue la siguiente: 2-‐ΔΔCt
ΔΔCt= (Ct muestra – Ct HKG) condición problema -‐ (Ct muestra – Ct HKG)condición basal
6.2.9.-‐ Microscopia electrónica de transmisión Una total de dos réplicas de cada condición del estudio II con cultivos celulares Caco-‐2, se emplearon para captar imágenes mediante microscopia electrónica de transmisión (MET) y valorar la cantidad y localización de las oberturas en las uniones intercelulares. Par ello, una vez finalizada la estimulación de las células se fijaron con solución de Karnovsky a pH 7.4 durante 5 horas. A continuación se lavaron con solución de cacodilato (0.1M, pH 7.4) con 2 cambios de 10 minutos, para luego fijarlas con tetróxido de Osmio al 1% durante 1 hora. Luego se deshidrató la muestra por inmersión en una serie de alcoholes (2x10 minutos en etanol 96%, 2x10 minutos en etanol absoluto y finalmente, 2x 5minutos en óxido de propileno). Para la inclusión de la muestra en la resina primero se cortaron las membranas de los transwells con las células adheridas, y luego se incubaron con la resina a diferente proporción, de la siguiente forma: -‐ 1:3 de resina y óxido de propileno, 20 minutos -‐ 1:1 de resina y óxido de propileno, 20 minutos -‐ 3:1 de resina y óxido de propileno, 20 minutos -‐ Resina pura, 2 horas Luego se dejó durante 12 horas en estufa a 60ºC para que se acabara de solidificar. Para identificar la región del bloque de resina donde se encontraba nuestra muestra, se hicieron unos cortes de 0.5 µm que se tiñeron con azul de Toluidina y se miraron al microscopio óptico. Una vez seleccionada la región, se cortaron secciones de 0.1 µm para hacer la preparación final para la visualización en el MET. Estas se secaron en estufa a 37ºC durante toda la noche y se depositaron en una rejilla de cobre. Se 101
Métodos
tiñeron con acetato de uranilo al 5% durante 20 minutos en estufa. Se lavaron con agua destilada y se acabaron de teñir con citrato de plomo. Por último se montaron con medio DPX. Se capturaron varias imágenes a diferentes aumentos (6000x-‐10000x) de cada muestra, con la ayuda del microscopio JeoL-‐1011 (Jeol Ltd., Tokyo, Japón) del servicio de anatomía patológica del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol.
102
Métodos
6.3.-‐ Estudios con biopsias procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa e individuos sanos 6.3.1.-‐ Procedencia de las biopsias Para este ensayo se usó la colección de biopsias cólicas incluidas en parafina generadas por el trabajo de Domènech E. y cols. 2008 (181) (Anexo 5). Los pacientes con colitis ulcerosa activa incluidos en este estudio estaban libres de infección por citomegalovirus y se estratificaron en función a la respuesta a GCs en corticosensibles (n=6) y corticorresistentes (n=5) (grupos 1 y 2 del artículo). Los pacientes clasificados como corticosensibles se les trató con prednisolona (1mg/Kg/día) y a los corticorresistentes se les administró tratamiento reemplazo con ciclosporina A intravenosa (4mg/Kg/día) al no mostrar mejora a los 7 días con tratamiento esteroideo. Además, también dispusimos de biopsias intestinales de pacientes con colonoscopia normal y sin historia familiar de EII, a los que se les practicó un control endoscópico por algún otro motivo (n=6) (grupo 5 del artículo). Otros datos sobre los pacientes incluidos en el trabajo de Domènech y cols. se recogen en la tabla 4.
Grupo 1 (n=25)
Grupo 2 (n=19)
Grupo 5 (n=25)
38 (20-‐81)
40 (20-‐70)
48 (20-‐70)
76
68
44
Meses desde diagnóstico
62 (0-‐213)
46 (1-‐180)
-‐
Índice Truelove-‐witts
12( 8-‐17)
13 (8-‐10)
-‐
Edad (años) Sexo (% hombres)
TABLA 4: Medianas IIQ de edad, sexo, meses de diagnostico e índice de truelove-‐witts de los pacientes incluidos.
Las biopsias se recogieron antes del inicio de tratamiento con corticosteroides y 7-‐10 días después (pre-‐ y post-‐tratamiento, respectivamente) del centro de las úlceras, cuando era posible. De los controles solo se obtuvieron muestras en un único momento (Figura 19). Todas las biopsias fueron incluidas en parafina por el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. 103
Métodos
Clasificación pacientes según respuesta a tratamiento
Inicio tratamiento corticoesteroides
Día 0
Día 7-‐10
Recogida de biopsias pre-‐tratamiento Grupo 1,2 y 5
Recogida de biopsias Post-‐tratamiento Grupo 1 y 2
FIGURA 19: Diseño experimental de recogida de biopsias en pacientes con EII y
controles.
6.3.2.-‐ Inmunohistoquímica en muestras de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal e individuos sanos Para el estudio inmunohistoquímico de fosfo-‐p38 MAPK en muestras de pacientes con EII se hicieron cortes histológicos de 4 µm de grosor. Se hicieron cortes de 4 µm para adherirlos al cristal secándolos a 62ºC durante 3 horas. Se desparafinaron con incubaciones consecutivas en soluciones alcohólicas (3x8 minutos en xilol, 5 minutos en xilol/etanol absoluto (1:1), 4 minutos en etanol absoluto, 4 minutos en etanol 96%, 4 minutos en etanol 80%) y finalmente se hizo un lavado de 5 minutos con agua destilada. EL anticuerpo primario, anti-‐fosfo-‐p38MAPK, se usó a una dilución de 1/50. En lugar de anticuerpos secundarios se usó el kit de marcaje Ultaview Universal DAB (para reconocer anticuerpos primarios procedentes de conejo y ratón). Todo el protocolo se hizo de forma automática con la plataforma de tinción BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Arizona, USA). La contra-‐ tinción se hizo con hematoxilina y se montó con medio DEPEX. La positividad para p38 MAPK y localización se cuantificó según el baremo de la Figura 20, en paralelo con un anatopatólogo de nuestro centro desconociendo los grupos de pacientes analizados. Las valoraciones se 104
Métodos
hicieron a 400x aumentos en 10-‐20 campos por muestra en el microscopio Axioskop 2 (Carl Zeiss S.A., Alemania), y las imágenes se capturaron con el programa AxioObserver (versión 4.8.1). No tinción nuclear
0
Escasos núcleos
Bastantes núcleos
1
2
Todos o casi todos los núcleos
3
FIGURA 20: Baremo de tinción nuclear para la p38 MAPK fosforilada (imágenes a 400x).
6.3.3.-‐ Inmunofluorescencia en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa y controles Se realizó una doble tinción para los receptores alfa de los GCs (GCRα) y de la IL-‐10 (IL10Rα), en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa y de individuos controles para poder observar el patrón de marcaje de ambas moléculas según la respuesta a los GCs. El protocolo de fijación al portaobjetos y desparafinización se realizó de igual forma que para la técnica de inmunohistoquímica (apartado 6.3.2). Para la recuperación antigénica se utilizó una solución de citrato a pH6 que se incubó a 100ºC durante 45 minutos. A continuación, se realizaron una serie de lavados primero con agua destilada y luego con PBS-‐T y se dejaron las muestras incubando durante toda la noche con los anticuerpos primarios (GCRα, 1/50; IL10Rα, 1/100). Un vez finalizado, se lavaron los portaobjetos para eliminar restos del anticuerpo primario para a continuación incubarlos con los anticuerpos secundarios Donkey anti-‐rabbit Alexa-‐546 y Donkey anti-‐ goat Alexa-‐488, 1/100, durante 1 hora en oscuridad. Para contra-‐teñir los núcleos se usó directamente medio de montaje con DAPI. Las valoraciones se hicieron con el microscopio AxioObserver Z1 (Carl Zeiss S.A., Alemania). Se cuantificó la intensidad de marcaje del epitelio con un baremo de 0-‐3 (Figura 21) para ambas tinciones en 10-‐20 campos. Las comprobaciones y fotografías se hicieron con el microscopio confocal SP5 (Leica, Alemania), con el programa de procesamiento Leica LAS AF v.3. 105
Métodos
IL10Rα
GCRα
Negativo
1
2
3
FIGURA 21: Baremo de intensidad de marcaje para los receptores GCRα e IL10Rα en biopsias de pacientes con colitis activa (imágenes a 630x).
106
Métodos
6.4.-‐ Estudio estadístico El análisis estadístico se realizó mediante el programa estadístico SPSS.15 (SPSS Inc.). Los resultados se expresaron como medianas (intervalo intercuartil, IIQ) o como medias ± error estándar (ES). Para las comparaciones intragrupo se ha empleado el test no-‐paramétrico de Wilcoxon. Mientras que para los resultados intergrupo de TEER, ELISAs, expresión, western blot y análisis histológicos e inmunofluorescencia se utilizó el test U-‐Mann Whitney. El criterio adoptado como significación estadística fue p≤0.05 Existen límites que se han de considerar. Por una parte la escasez de muestras procedentes de pacientes hace que los resultados de estos análisis deban ser corroborados en posteriores estudios. Mientras que los resultados obtenidos de la MET no permitieron comparar si las aberturas paracelulares eran más frecuentes en un grupo que en otro ante la dificultad de localización de las áreas de unión y por el escaso número de muestras por condición. No obstante, está claro que de todas las oberturas intercelulares analizadas se daban exclusivamente a nivel de AJ y desmosomas.
107
Métodos
108
Material
7.1.-‐ Reactivos utilizados Generales NaCl, DTT, Xilol, Urea, TRIS-‐base/-‐ HCl, Tween-‐20, NaF, Etanoles,TBS, PBS, IL-‐2, Cóctel inhibidor proteasas, SDS, Glicina, NP-‐40, Na3VO4, PMSF, DOC, Thiourea, Cacodilato de sodio , Glutaraldehído, Formaldehído, DMSO, Linfoprep‚, Azul de tripano, Acetrona, Sucrosa, Metanol, TCA, Carbonato sódico, BSA, Cloroformo, oxido de propileno, Urea
Sigma-‐Aldrich
St. Louis, USA.
Invitrogen TM (LifeTechnologies )
Paisley, UK.
Pierce (Thermo Fisher)
Rockford, USA.
Membrana nitrocelulosa 0.2μ PROTAN®
Millipore
Billerica, USA.
Solución de bloqueo Odyssey‚
LI-‐COR biosciences
Nebraska, USA
Específicos para western blot NuPAGE‚ : Reducing Agent (10x), LDS Sample Buffer (4x), MOPS SDS Running Buffer (20x), Antioxidant. Novex®: 4-‐12% Bis-‐Tris Gel 1.0 mm. SeeBlue® Plus2 prestained standard 1x (marcador pes molecular) Quick Start® Bradford protein assay
Específicos para cultivos celulares Líneas celulares Caco-‐2 RPMI-‐L-‐Glutamina DMEM-‐L-‐Glutamina Penicilina/estreptomicina, Human rTNF-‐α Human rIL-‐10 Tripsina Aminoácidos no esenciales (NEAA) AIM-‐V
ECACC
Salisbury, UK
Invitrogen TM (LifeTechnologies )
Paisley, UK.
Sigma-‐Aldrich
St. Louis, USA.
109
Material PD98059 (MEK1 inhibitor)
CellSignaling Technologies
Danvers, USA.
CD3 unlabel, CD28 unlabel
BD
Franklin Lakes, USA.
SB203580 (p38/RK MAP Kinase Inhibitor)
InvivoGen
San Diego, USA
Metil-‐prednisolona (Urbason) 40mg
SANOFI
Paris, Francia
Dexametasona (Fortecortín)
Merck S.L
Darmstadt, Alemania
FBS
LabClinics
Sta. Perpètua de la Mogoda, España
Específicos para Inmunotinciones Medio montaje DePeX®
VWR
Radnor, USA.
Fluoroprep®
BioMérieux
Marcy d’Etoile,Francia.
Medio de montaje con DAPI Hematoxilina
Sigma-‐Aldrich
St. Louis, USA.
Ultra view Universal DAB
Ventana medical systems
Arizona, USA
Termi-‐DNA-‐Tor
Biotools
Madrid, España
Primers
IDT
Iowa, USA
Qiazol
QIAGEN
Maryland, USA
Específicos para RT-‐PCR
Anticuerpos primarios Rabbit anti-‐Phospho-‐p38MAPK TM (Thr180/Tyr182) XP Rabbit anti-‐p38MAPK Rabbit anti-‐phospho-‐JNK Rabbit anti-‐phospho-‐AKT
Cell Signaling Technologies Danvers, USA.
Rabbit anti-‐Ocludina (N-‐term) Rabbit-‐ anti ZO1 (Mid) Mouse anti -‐MLCK (clone K36) Hoechst
Invitrogen TM (LifeTechnologies )
110
Paisley, UK.
Material Mouse anti-‐α-‐Tubulina
Sigma-‐Aldrich
St. Louis, USA.
Goat Anti-‐IL-‐10α receptor
R&D systems
Minneapolis, USA
Rabbit anti-‐Glucocorticoid-‐α Receptor
Abcam
Cambridge, UK
Donkey Anti-‐Mouse IRDye® 800 Donkey Anti-‐Rabbit IRDye® 680
LI-‐COR biosciences
Nebraska, USA
Donkey anti-‐rabbit Alexa-‐546 Donkey anti-‐goat Alexa-‐488 Donkey anti-‐rabbit Alexa-‐488 Donkey anti-‐mouse Cy3
Invitrogen TM (LifeTechnologies )
Paisley, UK.
BD
Franklin Lakes, USA.
OptEIA set human IL-‐8 Annexin V-‐PE apoptosis detection
BD
Franklin Lakes, USA.
Pan T Cell Insolation Kit (Human) + Columnas de retención LS
Miltenyi Biotec
Bergisch Gladbach, Alemania.
miRNeasy mini kit
Ambion TM (LifeTechnologies )
Paisley, UK.
Anticuerpos secundarios
Anticuerpos citometria Anti-‐CD4-‐APC Anti-‐CD8-‐FITC
Kits comerciales
TM
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect TAKARA Bio Inc. Real Time)
Otsu, Japan
tEPON 812 embedding kit
TOUSIMIS
Rockville, USA
Bio-‐Rad Laboratories
Carolina, USA
TM
Experion RNA StdSens analysis kit
111
Material
7.2.-‐ Soluciones y medios de cultivo utilizados Medio cultivo linfocitos T RPMI
RPMI 100 µg/ml Estreptomicina 100 U Penicilina
AIM-‐V
AIM-‐V 10% FBS 20U IL-‐2 100 µg/ml Estreptomicina 100 U Penicilina PBS 1x pH 7.2
Aislamiento de linfocitos T Solución MACS
PBS 1x pH 7.2 0.5% FBS 2mM EDTA
Cultivo células Caco-‐2 D-‐MEM
D-‐MEM con L-‐Glutamina 10% FBS 2% NEAA 100 µg/ml Estreptomicina 100 U Penicilina
Extracción de proteínas Solución lisado RIPA
25mM TRIS-‐HCl 150mM NaCl 1% NP-‐40 1% DOC 0.1% SDS 1mM Na3VO4 1mM PMSF 1mM NaF 10µl/ml Inhibidores proteasas sigma Agua destilada
112
Material Solución UREA/Thiourea
5M UREA 2M Thiourea 50mM DTT 0.1% SDS PBS 1X.
Inmunoblotting PBS-‐T
PBS 1X 0.1% Tween-‐20
Buffer MOPS
1x MOPS SDS Running Buffer (20x) 0.25% Antioxidant Agua destilada
Buffer de transferencia
20% Metanol 27mM TRIS-‐BASE 197mM Glicina Agua destilada
Microscopia electrónica de transmisión Solución de Karnosvky
10% Formaldehído 25% Glutaraldehído 0.2M Cacodilato de sodio
Resina para inclusión (8 bloques)
22,5 ml EPON 812 15 ml DDSA 9 ml NMA 0.8ml DMP-‐30
113
Material
114
Resultados 115
116
Resultados
8. Resultados 8.1.-‐ La estimulación prolongada vía TCR de la población CD3+CD4+ disminuye la inducción de apoptosis por dexametasona en comparación a un estímulo breve Para reforzar las hipótesis de partida nos propusimos evaluar si células T estimuladas vía TCR durante 24h responderían diferente a las estimuladas durante 72h. Con ello, pretendíamos comprobar si la presencia prolongada o no de antígenos comprometía la apoptosis de las células T inducida por esteroides. El estímulo muestra escasos cambios en la diferenciación del fenotipo de las células CD3+ (Anexo 1). Por lo que respecta al grado de apoptosis destaca el incremento que registran las células T CD4+ estimuladas 24h y tratadas con GCs o con GCs más el inhibidor respecto a sus homólogas estimuladas durante 72h (Figura 22A). En cambio, cuando calculamos la apoptosis más necrosis lo que pudimos comprobar que esta solo aumentaba en los grupos tratados con inhibidor (Figura 22B). Estos cambios no fueron evidentes para el fenotipo CD8+ (Anexo 1 C y D). Hay que destacar que con el empleo del inhibidor bloquemos la vía de señalización proliferativa TCR/MEK, que en nuestras condiciones se relaciona con el aumento de la necrosis en células estimuladas durante 24h (Figura 22B) Los aspectos evaluados demuestran una mayor sensibilidad a la apoptosis del fenotipo CD4+ frente a los corticosteroides cuando el estímulo es de duración breve. En otras palabras, este experimento sugiere que una reducción de antígenos luminales que irrumpen en la lamina propia intestinal facilitaría la inducción de la apoptosis de las células potencialmente colitogénicas por parte de los corticosteroides. Por ello, la capacidad de impermeabilización del epitelio intestinal puede jugar un papel clave en la respuesta a esteroides en pacientes con colitis ulcerosa.
117
Resultados
B
* *
GCs 72H
*
Incremento apoptosis + necrosis de células T C D4+
Incremento apoptosis células T C D4+
A
PD98059 72h
*
GCs + PD98059 72h
GCs 72H
PD98059 72h
GCs + PD98059 72h
FIGURA 22: Variaciones en la apoptosis inducida por GCs en las células T sanguíneas en función del tiempo de estímulo. Los valores representan la mediana (IIQ) de los incrementos respecto a las condiciones con estímulo CD3/CD28 basales, durante 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros). La figura A representa los incrementos de apoptosis y la E los incrementos de apoptosis más necrosis, en células T CD4 . *p≤0,041 vs 72h (los valores de +
las condiciones basales se agrupan en la tabla ANEXO 2)
8.2.-‐ La cooperación entre la interleucina-‐10 y los glucocorticoides refuerza la unión intercelular del epitelio intestinal Para comprobar si el epitelio intestinal y la IL-‐10 podrían facilitar la respuesta al tratamiento esteroidal en la colitis ulcerosa decidimos realizar un estudio in vitro con monocapas de células Caco-‐2. Para ello, las sometimos a una noxa inflamatoria o no, en presencia de GCs, IL-‐10 o de ambos. A las 48h del cultivo medimos el paso de electrones para valorar en la confluencia la integridad de la monocapa celular, así como la fortaleza de las uniones paracelulares.
118
Incrementos TEER (%)
Resultados
* *
Control
TNF
TNF_GCs
*
TNF_IL10
TNF_GCs_ IL10
FIGURA 23: Incrementos de TEER en cultivos monocapa de células Caco-‐2 a las 48h de ser estimuladas o no con TNFα. Las medidas representan el incremento porcentual entre TEERi y TEERf en condiciones no inflamatorias (control; boxes blancos) e inflamatorias (grupos con TNFα; TNFα_GCs; TNFα_IL-‐10; y TNFα_GCs_IL-‐10; boxes grises). Los resultados se expresan como mediana (IIQ); *p≤0.02 vs control y TNF_GCs_IL10
Así, mientras que las condiciones sin TNF-‐α no mostraron cambios destacados entre ellas (Anexo 3), en los cultivos tratados con TNFα (con o sin IL-‐10 o GCs) desciende la TEER muy por debajo del valor control. Por el contrario, el tratamiento combinado con GCs e IL-‐10 lo elevaba a niveles cercanos a los del control (Figura 23). Este hecho destacable sugiere la posibilidad de una sinergia entre la citocina reguladora y los esteroides que podría ayudar a la impermeabilización de la lamina propria intestinal. Adicionalmente, se midieron las concentraciones de IL-‐8 como indicador de la actividad inflamatoria de las células epiteliales según la condición analizada.
119
Resultados
A
B
IL8 pg/ml
IL8 pg/ml
*
#
* Control
* TNF
TNF_GCs TNF_IL10
TNF_GCs _IL10
Control
TNF
TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs _IL10
FIGURA 24: Niveles de IL-‐8 en el sobrenadante basal a las 24h (A) y a las 48h (B) de cultivo celular. Los resultados muestran la mediana (IIQ) de la concentración. *p≤ 0,025 vs resto de #
grupos; p≤ 0,01 vs TNF_IL10 y TNF_GCs_IL10
Como era de esperar tanto a las 24h como a las 48h el grupo control (sin TNF) mantiene unos niveles de IL-‐8 muy inferiores al resto de grupos experimentales (Figuras 24 A y B). Las células Caco-‐2 tratadas con esteroides mostraron un incremento significativo en la producción de IL-‐8 respecto al resto de grupos a las 24h (Figura 24 A). Este hecho se revierte por acción de la IL-‐10, especialmente a las 48h (Figura 24 A y B).
8.3.-‐ La fosforilación de la p38 MAPK constituye un elemento clave en las acciones sinérgicas entre la IL-‐10 y los glucocorticoides Para esclarecer los cambios observados sobre el epitelio se exploraron distintas vías de señalización y proteínas de las TJ mediante western blot. No se registraron cambios en AKT, JNK o MLCK, ni tan siquiera en las proteínas de las TJ (ZO-‐1, Occludina) (Anexo 4). El hecho de no observar cambios relevantes en los componentes de las TJ analizados no significa que no existan procesos de redistribución intracelular, o bien que el tempo de expresión no coincida con el del análisis efectuado. Además, el análisis reveló el potencial papel de la p38 MAPK en la sinergia entre IL-‐10 y los GCs. El TNF-‐α incrementa la fosforilación de p38 MAPK muy por encima de los 120
Resultados
niveles alcanzados por las monocapas celulares tratadas con IL-‐10 y/o GCs (Figura 25A). Pero a la vez, las células que recibieron GCs presentaban menor fosforilación de p38 MAPK que la tratadas con IL-‐10, mientras que el co-‐ tratamiento mostró una fosforilación intermedia (Figura 25A). En cualquier caso, los resultados alcanzados muestran que IL-‐10 fue capaz de fortalecer las uniones intercelulares con unos niveles de fosforilación de p38 MAPK lejos de la excesiva actividad inducida por el TNF-‐α, o del bloqueo provocado por los GCs. De hecho, la presencia IL-‐10 consigue que los GCs no reduzcan excesivamente la fosforilación de p38 MAPK. B n.s
* Incrementos MAPK p38 (Intensidad Integrada )
#
TNF
TNF_GCs
TNF_IL10
TNF_GCs
TNF_IL10
TNF_GCs_ IL10
TNF
TNF_GCs
TNF_IL10
TNF_GCs_IL10
TNF_IL10
Marcador de peso m olecular
†
TNF_GCs
D
TNF
C Ratio incrementos MAPK p38 fosforilada/total (Intensidad Integrada )
TNF
TNF_GCs_ IL10
Control
Incrementos fosforilación MAPK p38 (Intensidad Integrada )
A
43KDa
P38 MAPK Fosforilada
43KDa
P38 MAPK Total
50KDa
α-‐Tubulina
TNF_GCs_ IL10
FIGURA 25: Representación de la búsqueda de mediadores moleculares implicados en la sinergia IL-‐10/GCs mediante western blot. Las figuras A y B representan los incrementos en medias±ES respecto el grupo control de la cantidad de p38 MAPK fosforilada y de p38 MAPK total, respectivamente y la Figura C los ratios de ambos incrementos. La Figura D es un ejemplo de las bandas obtenidas del western blot para estas proteínas y para la α-‐tubulina, #
utilizada como HKG.*p≤0,026 vs resto de grupos; p= 0,028 vs TNF_IL10; †p= 0,026 vs TNF_GCs
121
Resultados
8.4.-‐ La inhibición de la fosforilación de la p38 MAPK revierte la colaboración entre la IL-‐10 y los esteroides Debido a los resultados anteriores se iniciaron una serie de estudios, de nuevo sobre cultivos monocapa de células Caco-‐2 confluentes. De esta manera se pretendía comprobar la implicación de la p38 MAPK en el sinergismo entre la IL-‐10 y los GCs. Para ello comparamos las condiciones TNF_GCs y TNF_GCs_IL10 con o sin inhibidor de la fosforilación de p38 MAPK, además del control sin TNF-‐α. Los resultados reproducían los alcanzados en el primer estudio con células Caco-‐2 que analizaba 5 condiciones. La IL-‐10 provoca un incremento en la unión paracelular, más evidente a las 48h, superior al de las células incubadas con TNF-‐α y GCs, y cercano al valor del control (Figura 26 A y B). No obstante, la inhibición de la fosforilación de la p38 MAPK (SB203580) bloquea el incremento de TEER mediado por la IL-‐10.
A
B
Incrementos TEER (%)
Incrementos TEER (%)
n.s
Control
TNF_GCs
TNF_GCs _IL10
Control
TNF_GCs_IL10 _SB203580
*
*
TNF_GCs
TNF_GCs _IL10
TNF_GCs_IL10 _SB203580
FIGURA 26: Influencia del bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK sobre la TEER en monocapas de células Caco-‐2. Los valores representan la mediana (IIQ) del incremento porcentual entre TEER inicial y las 24h (A) o 48h (B) de la estimulación. Las condiciones analizadas fueron no inflamatorias (control; boxes blancos) e inflamatorias (TNFα_GCs;TNFα_GCs_IL-‐10 y TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580; boxes grises).*p≤0.042 vs control
122
Resultados
Por otra parte, el TNFα y GCs provocan el incremento más pronunciado en la producción de IL-‐8, mientras que al incorporar la IL-‐10 se produce un descenso (significativo a las 24h) y que se acentúa cuando se inhibe la fosforilación de p38 MAPK (Figuras 27 A y B).
A
B
IL8 pg/ml
IL8 pg/ml
* *
* * Control
* TNF_GCs
TNF_GCs _IL10
TNF_GCs_IL10 _SB203580
Control
TNF_GCs
TNF_GCs_ TNF_GCs_IL10 IL10 _SB203580
FIGURA 27: Efecto de la IL-‐10 y de la inhibición de p38 MAPK sobre la producción de IL-‐8 por parte de las células Caco-‐2 tratadas con TNF-‐α y GCs. Las concentraciones de IL-‐8 medidas mediante ELISA a las 24h del cultivo (A) o a las 48h (B) de los grupos: control, TNFα_GCs; TNFα_GCs_IL-‐10 y TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580. Los valores se representan como medianas (IIQ); *p≤0.036 vs resto de grupos
Estos resultados confirman el papel clave de la p38 MAPK en la modulación de la adherencia intercelular. No obstante, aparecen dos aspectos destacables. Por una parte, a pesar que la inhibición de la fosforilación p38 MAPK produce un descenso considerable de la TEER y de la producción de IL-‐ 8 en el cotratamiento IL-‐10 y GCs, el patrón de respuesta es distinto, la TEER aumenta y los niveles de IL-‐8 disminuyen en el grupo tratado con IL-‐10 y GCs respecto al que solo recibió GCs en condiciones inflamatorias. Por otra parte, los niveles de TEER se incrementan entre las 24 y 48h, mientras que los de IL-‐ 8 sufren un claro descenso. De nuevo estamos ante un patrón evolutivo distinto. 123
Resultados
8.5.-‐ Fosforilación de la p38 MAPK en la mucosa intestinal de pacientes con colitis ulcerosa activa Para comprender la implicación patológica de la fosforilación de la p38 MAPK en la respuesta a los GCs se estudiaron biopsias intestinales procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa. Para ello, mediante inmunohistoquimica, marcamos la p38 MAPK fosforilada en biopsias de pacientes respondedores y no respondedores, obtenidas antes y después del tratamiento con esteroides. A pesar, del escaso número de pacientes incluidos (n=5-‐6/grupo) los resultados obtenidos nos muestran claramente la disposición nuclear de la p38 MAPK fosforilada que, en las biopsias previas al tratamiento de pacientes corticorefractarios, se halla significativamente disminuida (Figura 28). Por otra parte, hay que destacar que los controles sanos mantienen un sorprendente elevado nivel de fosforilación de p38 MAPK (media±ES: 2.67±0.24); sin embargo estos resultados se han de tomar con una cierta cautela ya que los controles sanos incluidos, fueron el resultado de endoscopias por sospecha de otras alteraciones intestinales (IBS, neoplasias, etc) Pre-‐tratamiento
Fosforilación p38 MAPK (Baremo marcaje)
Post-‐tratamiento
*
Cortico-‐ sensibles
Cortico-‐ resistentes
FIGURA 28: Detección de p38 MAPK fosforilada en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa. La gráfica muestra los resultados del baremo de fosforilación de p38 MAPK expresado como media±ES; *p=0.028 vs Cortico-‐sensibles pre-‐tratamiento.
124
Resultados
8.6.-‐ La IL-‐10 facilita la nuclearización de la p38 MAPK fosforilada en presencia de TNF-‐α y glucocorticoides El estudio con inmunofluorescencia en monocapas de células Caco-‐2 permitió comprobar que la incorporación de IL-‐10 al medio de cultivo con TNF-‐α y GCs facilitaba la translocación al núcleo de la p38 MAPK fosforilada. En cambio, al añadir el inhibidor SB203580 se revertía el efecto de la IL-‐10 (Figura 29 A y C). A las 24h las células tratadas con TNF-‐α, GCs e IL-‐10 muestran un mayor índice de p38 MAPK nuclear (fosforilada) que a las 48h; no obstante, ambos casos fueron más elevados significativamente que en el resto de grupos (Figura 30). En la mayoría de los casos, la detección nuclear de p38 MAPK fosforilada coincidía con la aparición de un marcaje en la periferia celular, coincidente con los límites de la célula (Figura 29 B y D; figura 30 ).
125
Resultados
FIGURA 29: Disposición nuclear o periférica de de la p38 MAPK fosforilada en cultivos de células Caco-‐2 a 24h y 48h. Los gráficos representan la mediana (IIQ) del % células con marcaje positivo nuclear (figuras A y C) y/o en la periferia celular (figuras B y D) de p38 MAPK fosforilada a las 24h y 48h de incubación. Las condiciones analizadas fueron no inflamatorias (control; boxes blancos) e inflamatorias (TNFα_GCs; TNFα_GCs_IL-‐10 y #
TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580; boxes grises).*p≤0,021 vs resto de grupos; p≤0,043 vs TNFα_GCs_IL-‐10_SB203580; †p≤0,021 vs control; p≤0,043 vs TNFα_GCs y TNFα_GCs_IL-‐ Φ
10_SB203580
126
Resultados
p38 MAPK fosforilada
Control/ DMSO
TNF_GCs
TNF_GCs_IL10
TNF_GCs_IL10 _SB203580
24H
127
Resultados
p38 MAPK fosforilada
Control/ DMSO
TNF_GCs
TNF_GCs_IL10
TNF_GCs_IL10 _SB203580
48H FIGURA 30 (y página anterior): Inmunotinción de p38 MAPK fosforilada en monocapas de células Caco-‐2 a 24h y 48h. Las imágenes son representativas del marcaje para las condiciones basales (Control y DMSO) y de las condiciones inflamatorias (TNF_GCs y TNF_GCs_IL-‐10, con y sin SB203580). Se marcaron con anti-‐p38 MAPK fosforilada (Thr180/Tyr182) (rojo) y con Hoechst el núcleo (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 400x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
128
Resultados
8.7.-‐ Rastreo de los mecanismos implicados en el eje IL-‐10/p38 MAPK Con el objetivo de averiguar como la IL-‐10 modula la función de p38 MAPK en un entorno inflamatorio y con GCs, estudiamos la expresión de genes potencialmente implicados. Sobre el mismo diseño anterior y los mismos grupos experimentales (TNF_GCs; TNF_GCs_IL-‐10; TNF_GCs_IL-‐ 10_SB203580), se analizaron los cambios que se producen en la expresión de E-‐cadherina, GCRα y β, IL-‐10Rα y β, IL-‐10, SOCS-‐3, BCL-‐3 e IkBα.
A
B
C
D
129
Resultados
E
F
G
FIGURA 31: Expresión de genes influenciados por la IL-‐10 vía fosforilación de la quinasa -‐AACt p38. Los valores representan los 2 de las condiciones inflamatorias (TNF_GCs; TNF_GCs_IL10; TNF_GCs_IL10_SB203580) respecto a su respectiva condición basal (control #
o DMSO). Medianas (IIQ). *p=0.014 vs TNF_GCs_IL10; p≤0.04 vs resto de grupos; †p≤0.037 vs TNF_GCs_IL10_SB203580
La presencia de IL-‐10 junto con TNF y GCs incrementa la expresión de los genes E-‐Cadherina, GCRα, IL-‐10Rα, SOCS-‐3, IkBα y BCL-‐3, los 3 primeros significativamente respecto a las monocapas celulares tratadas con TNF y GC (Figura A, B y C). Por otro lado, la inhibición de la fosforilación de p38 MAPK reduce ligeramente la expresión de E-‐Cadherina y bloquea la de GCRα (Figura 8.7 A y B). Sin embargo, SOCS-‐3 e IkBα incrementaron significativamente su expresión como consecuencia de inhibir la activación 130
Resultados
de p38 MAPK. En el caso de las evaluaciones efectuadas sobre IL-‐10 y GCRβ, no se detectó expresión (Anexo 5). Estos resultados muestran dos patrones de expresión diferenciados, el que constituyen la E-‐caherina y el GCRα, y el formado por genes capaces de introducir cambios antiinflamatorios (IL-‐10Rα, SOCS-‐3, IkBα y BCL-‐3). De hecho, el perfil de expresión de IL-‐10Rα, SOCS-‐3, IkBα y BCL-‐3 coincide, pero en sentido opuesto, al de la producción de IL-‐8.
8.8.-‐ Efecto de la inhibición de la p38 MAPK sobre las adherens junctions y los desmosomas Los cambios en la expresión de E-‐Cadherina que muestran los resultados anteriores, así como los estudios sobre las proteínas de las TJ por western blot donde no se registraron excesivos cambios entre condiciones (Anexo 4) hicieron sospechar que la regulación del paso de electrones medido a través de la TEER se produjera en otras uniones paracelulares. Mediante el MET analizamos las monocapas de células confluentes sometidas a las condiciones anteriores. De esta manera se constató que mientras en todas las condiciones analizados la TJ permanecían cerradas, los grupos TNF_GCs y TNF_GCs_IL-‐10_ SB203580 presentaban con más frecuencia zonas de separación preferentemente a la altura de las uniones adherentes y desmosomas (zonas de adherencia entre células ricas en Cadherinas) (Figura 32). FIGURA 32 (página posterior): Resultados obtenidos mediante MET de las uniones paracelulares en las monocapas de células Caco-‐2. Las imágenes A-‐C, AJ y desmosomas principalmente sellados (espacio intermedio gris o oscuro) observado en el grupo experimental tratado con TNF_GCs_IL10,. Las imágenes D-‐F pertenecen a los grupos tratados con TNF_GCs y TNF_GCs_IL10_SB203580, donde se observa la apertura a nivel de AJ y, en mayor medida, en los desmosomas. Las fotografías de la derecha son una magnificación de los cuadrados rojos. El aumento oscila de 12000x a 100000x. Las uniones indicadas con flechas rojas: AJ, adhrens junctions; D, desmosomas; y TJ, tight junctions
131
Resultados
A
D
TJ
25000x
B
D
AJ TJ
40000x
C TJ D 40000x
132
Resultados
D
D TJ 25000x
12000x
E TJ D
40000x
30000x
F D TJ
100000x
133
Resultados
8.9.-‐ Determinación de los cambios de expresión de los receptores α de IL-‐10 y glucocorticoides en la mucosa de pacientes con colitis ulcerosa activa Dado que en los resultados de la qPCR los receptores α de GCs e IL-‐10 en monocapas de células Caco-‐2 se mostraron influenciados por la IL-‐10 (ver punto 8.7, figuras 31 B y C), se analizó mediante inmunofluorescencia en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa los cambios que aparecen en la presencia epitelial del IL-‐10Rα y del GCRα. Los resultados indican que en los pacientes respondedores hay una menor presencia significativa del GCRα y del IL-‐10Rα respecto a sus homólogos con una respuesta inadecuadamente al tratamiento (Figura 33 A y B). No obstante, durante el transcurso inflamatorio los individuos respondedores incrementan la presencia y difusión de GCRα, aunque no es significativa, a diferencia de lo que ocurre con los no respondedores (Figura 33 A). B Pre-‐tratamiento
Pre-‐tratamiento
Post-‐tratamiento
Post-‐tratamiento
*
Intensidad de marcaje IL10Rα (Baremo marcaje)
Intensidad de marcaje GCRα (Baremo marcaje)
A
*
Cortico-‐ sensibles
#
* *
Cortico-‐ sensibles
Cortico-‐ resistentes
#
Cortico-‐ resistentes
FIGURA 33: Medias ± ES de las valoraciones de las tinciones por inmunofluorescencia para los GCRα e IL-‐10Rα, en muestras de mucosa cólica procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa, sensibles y refractarios al tratamiento con GCs. Figura A representa los valores de marcaje para GCRα, mientras que la B lo hace para los valores del IL10Rα. # *p≤0.038 vs corticorresistentes; p≤0.008 vs post-‐tratamiento; Medias ±ES del grupo control: GCRα 2.4±0.074; IL10Rα 0.95±0.091.
134
Resultados
Por lo que hace referencia a la intensidad de la fluorescencia para el IL10Rα, ambos grupos de respuesta a los GCs experimentaron un descenso significativo post-‐tratamiento, aunque más acusado en el grupo de pacientes que no respondieron al adecuadamente (Figura 33 B). El patrón observado de marcaje para los GCRα y IL-‐10Rα tanto en pacientes como en controles es difuso de forma homogénea (Figura 34) por toda la célula epitelial. A pesar de ello, en la mayoría de pacientes sensibles a los GCs se han distinguido unas agrupaciones de alta intensidad de marcaje y más delimitadas, en las que en ocasiones co-‐localizan los dos receptores. (Figura 35). FIGURA 34 (página posterior, superior): Marcaje por inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en biopsias de pacientes con CU activa. Se observa un marcaje difuso en el citoplasma de las células epiteliales del intestino tanto para el GCRα (rojo), como para la IL10Rα (verde) El núcleo marcado con DAPI (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 630x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
FIGURA 35 (página posterior, inferior): Detalle del patrón observado para la inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en pacientes con CU activa y sensibles al tratamiento con glucocorticoides. Se marcaron con anti-‐GCRα (rojo), con anti-‐IL10Rα (verde) y con DAPI el núcleo (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 630x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
135
Resultados
Merge
GCRα
IL10Rα
DAPI
GCRα
IL10Rα
DAPI
136
DISCUSIÓN
137
138
Discusión
9. Discusión La respuesta inadecuada a los GCs constituye una de las principales complicaciones en el tratamiento de la EII con una grave repercusión en la curación del paciente. Los GCs son la primera línea terapéutica en la colitis ulcerosa activa, no obstante la corticorrefractariedad puede llegar a afectar más del 30% de pacientes (171, 178). Por ello, conocer los mecanismos implicados en la falta de respuesta a esteroides es básico para mejorar su efectividad. Hasta la fecha, los mecanismos implicados en esta falta de sensibilidad a los corticoides se han relacionado con alteraciones en la expresión del GCR y con disfunciones de los mecanismos de desintoxicación celular (MDR-‐1 y Pgp-‐170) (103, 197). Estos estudios han evidenciado una posible relación de la refractariedad terapéutica con la incapacidad de los esteroides en inducir apoptosis a macrófagos y células T activas, y por consiguiente, con una perpetuación la inflamación en la mucosa intestinal (184, 211) . En este sentido, nuestro grupo inició hace unos años una aproximación experimental en pacientes con enfermedad de Crohn para comprender los mecanismos moleculares y celulares implicados en el fracaso terapéutico a esteroides. Este estudio mostró un menor grado de apoptosis en células T y B de la lamina propria intestinal en los pacientes con enfermedad de Crohn activa no respondedores (208). En el mismo estudio, también pudimos comprobar que la sensibilidad a los esteroides se asociaba significativamente a la presencia de RNAm de la IL-‐10 en la mucosa intestinal de los pacientes respondedores. En el presente estudio se muestra la reducción de la apoptosis que sufren las células T CD4+ cuando son activadas vía TCR de forma prolongada en comparación con las activadas de forma breve (Figura 21 A). Este fenómeno, recuerda lo importante que puede llegar a ser el epitelio intestinal en la respuesta terapéutica regulando la entrada excesiva de antígenos luminales. Muchos de los polimorfismos asociados a la predisposición de padecer colitis ulcerosa se relacionan con disfunciones de la barrera a nivel del epitelio (MDR-‐1 , CDH1, HNF4α y MAGI2) (87, 217, 218). La implicación patológica de este funcionamiento erróneo es incluso percibido en los familiares de primer 139
Discusión
grado de pacientes con colitis ulcerosa, libres de la enfermedad, que registran un aumento de la permeabilidad intestinal superior a la población sana sin antecedentes de EII (219). Además, la deficiencia de IL-‐10 en ratones también aumenta la permeabilidad intestinal como antesala de la aparición de lesiones intestinales (83). En cambio, si los ratones IL-‐10 (-‐/-‐) son tratados con un inhibidor de la zonulina (AT-‐1001), capaz de disminuir la permeabilidad intestinal, los signos de la colitis se reducen (220). A pesar que la IL-‐10 ejerce funciones inmunoreguladoras y antiinflamatorias en el intestino, polarizando la respuesta inmune celular en la lamina propria hacia la tolerancia (221, 126), evidencias recientes sugieren su capacidad de influir sobre funciones de la inmunidad innata y adaptativa en el epitelio intestinal (222) . De hecho, otras citocinas de la familia de la IL-‐10 también ejercen acciones sobre el epitelio en la EII, como la IL-‐22 que participa en la remodelación y recuperación de las lesiones activando STAT-‐3 en las células del epitelio intestinal (223, 224). En consecuencia, parece plausible pensar que una baja expresión de IL-‐10 en la mucosa intestinal facilitaría el contacto de los antígenos luminales con la lamina propria y, por ende, se favorecería la respuesta inadecuada a los corticosteroides en la EII. En cualquier caso, explorar la función de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal representa un reto de especial interés en la colitis ulcerosa. Los cultivos monocapa de células Caco-‐2 confluentes revelan un hecho destacado y a la vez sorprendente, mientras el TNF-‐α incrementaba significativamente el paso de electrones a través de las monocapas celulares, la presencia conjunta, y no por separado, de IL-‐10 y GCs lo bloqueaba (Figura 23). Esta acción sinérgica no ha sido descrita con anterioridad, a pesar que existen indicios de la capacidad de cada uno de ellos por separado en modular la permeabilidad en condiciones inflamatorias. Así, mientras el tratamiento de IL-‐10 fue capaz de prevenir la pérdida de la ZO-‐1, ocludina y E-‐cadherina en un modelo experimental de nutrición parenteral total (225), los GCs regularon la barrera epitelial del intestino bloqueando la expresión de MLCK y facilitando el cierre de las TJs (226). Sin embargo, en nuestras condiciones, la colaboración entre la IL-‐10 y los GCs no produjo cambios 140
Discusión
destacables en el contenido de ZO-‐1, ocludina y MLCK (Anexo 3), ni en la obertura o cierre de las TJ (Figura 32). Entre las vías de señalización analizadas, la fosforilación de la p38 MAPK mostraba una modulación distinta de su actividad en función de si las monocapas celulares habían sido tratadas con GCs o IL-‐10. De hecho el tratamiento conjunto de GCs e IL-‐10 mantuvo los niveles de fosforilación de p38 MAPK muy por debajo a los alcanzados por la administración de TNFα, pero a la vez sin llegar a niveles tan bajos como los inducidos por GCs (Figura 25A). En relación a esto, estudios en células epiteliales de vías aéreas han demostrado que la inhibición de la p38 MAPK por la dexametasona es ejercida a través de la mitogen-‐activated protein kinase fosfatase-‐1 (227, 228). Por otro lado, la presencia de IL-‐10 estimula la p38 MAPK que reduce el estrés del retículo endoplasmático de las células epiteliales del intestino en condiciones inflamatorias por el bloqueo del eje activating traslocation factor (ATF)-‐6/glucose-‐regulated protein (grp)-‐78 (62). La actividad p38 MAPK juega un papel clave en la respuesta inflamatoria en la EII, mostrando un incremento destacado en las mucosas intestinales de estos pacientes (25, 229, 230). Sin embargo, estudios clínicos y experimentales han mostrado resultados contradictorios respecto a la función de p38 MAPK en el intestino. Pacientes de enfermedad de Crohn con una actividad grave muestran una favorable remisión clínica al ser tratados con CNI-‐1493 (231), un inhibidor de la fosforilación p38 MAPK; mientras que en otros estudios no se observa mejoría al inhibir con SB203580 (232). Por otro lado, ratones con colitis inducida con TNBS o DSS empeoran su evolución al ser tratados con distintos inhibidores de la activación de p38 MAPK, a pesar de mostrar signos antiinflamatorios como la reducción de algunas citocinas (233, 234). En cambio, Hollenbach y cols. comprobaron que la inhibición de p38 MAPK era capaz de reducir drásticamente la actividad NF-‐kB con la consiguiente mejora de las lesiones intestinales (235). Nuestros resultados indican que la acción conjunta de GCs e IL-‐10 modula la fosforilación de p38 MAPK en las células del epitelio intestinal a un nivel adecuado para reforzar las uniones paracelulares y disminuir ligeramente la producción de IL-‐8 respecto de lo que ocurre con el 141
Discusión
grupo tratado con GC en condiciones inflamatorias. Esto sugiere la existencia de distintos niveles de participación de esta quinasa aportando un potencial efecto protector de la línea epitelial. De hecho, incluso la producción autocrina o paracrina de IL-‐8 se han relacionado con la activación de procesos protectores sobre la línea epitelial que favorecen la recuperación de las lesiones (236, 237). La dicotomía en la actividad de p38 MAPK también ha sido reportada en un excelente estudio con ratones portadores de una deleción en las células mieloides, que resulta en una reducción de la actividad inflamatoria inducida por DSS, mientras que si esta deleción era exclusiva de las células epiteliales se potencian los efectos deletéreos producidos por el modelo (238), corroborando el papel protector de la p38 MAPK en el epitelio. Reforzando esta idea, existen estudios in vitro que han demostrado la participación de p38 MPAK en distintas funciones protectoras sobre el epitelio intestinal controlando el ciclo celular, la autofagia y reforzando la función barrera (239-‐ 242) . Se ha demostrado que una cierta actividad de p38 MAPK mediada por probióticos en condiciones inflamatorias refuerzan las TJ (243-‐245), lo que promueve la reepitelización y curación de las lesiones intestinales (241). Para averiguar el papel de la IL-‐10 sobre p38 MAPK en la adhesión lateral de las células epiteliales del intestino, y por ende, en la respuesta a los esteroides, se realizaron una serie de experimentos in vitro con células Caco-‐ 2 a las que añadimos el inhibidor de la fosforilación de la p38 MAPK, SB203580. En estos ensayos comprobamos que la presencia conjunta de IL-‐ 10 y GCs coincidía con un mayor número de núcleos positivos para p38 MAPK fosforilada (Figura 29) y con un aumento de la TEER, mientras que el bloqueo de la actividad de la p38 MAPK revertía estos indicadores. Por lo tanto, el papel de la fosforilación de p38 MAPK es clave para entender la función de la IL-‐10 en condiciones inflamatorias sobre el epitelio intestinal. En este sentido, la presencia nuclear de la p38 MAPK fosforilada también fue más elevada en las biopsias intestinales previas al tratamiento de pacientes respondedores que en las de los no respondedores (Figura 28), lo que podría suponer mayor capacidad de aislamiento de la lamina propria en los 142
Discusión
pacientes sensibles. Estudios previos de nuestro grupo mostraron que los pacientes corticosensibles tenían un incremento de la expresión de IL-‐10 en la mucosa cólica muy superior a la de los pacientes refractarios antes del tratamiento con GCs (40,0 vs 2,4; p=0,023. Anexo 6) (246). Aunque la evolución del proceso inflamatorio en pacientes no es del todo equiparable a las observaciones in vitro, existen coincidencias sutiles que implican una mayor actividad del eje IL-‐10/MAPK en el epitelio intestinal de los pacientes sensibles a los GCs. Sin embargo, estos resultados han de considerarse con cautela, ya que los grupos según la respuesta terapéutica estuvieron constituidos por un total de 5-‐6 pacientes. De todas formas, la localización nuclear de la forma fosforilada de p38 también ha sido detectada en el epitelio intestinal de pacientes con enfermedad de Crohn activa no respondedores a los esteroides (201). No obstante, la producción intestinal de citocinas en la enfermedad de Crohn es muy diferente al de la colitis ulcerosa (208) , donde la expresión de IL-‐10 es diez veces superior. Por consiguiente, con un patrón de activación de p38 MAPK distinto entre ambas entidades de EII. En definitiva, la IL-‐10 aporta una ventaja en la recuperación de la barrera epitelial a través de la activación de p38 MAPK en la colitis ulcerosa activa tratada con GCs. Esta recuperación del epitelio a través del eje IL-‐10/p38 MAPK se concreta en nuestros estudios con un aumento de la TEER y puede llegar a suponer una más eficaz curación de las lesiones. Dada la poca implicación de las proteínas de las TJ analizadas en el aumento de las uniones paracelulares, exploramos otros mecanismos de adhesión celular. Las cadherinas juegan un importante papel en la regulación de la permeabilidad intestinal, modulando la expresión de Claudina-‐5 y regulando la función de Akt/FoxO (247). En el presente estudio, la IL-‐10 era capaz de aumentar la expresión de la E-‐cadherina de forma independiente a p38 MAPK en las células epiteliales tratadas con GCs en un entorno inflamatorio. El hecho que las cadherinas sean las proteínas más abundantes en las AJ y desmosomas, hicieron pensar que la regulación de la TEER vía p38 MAPK se produjera a este nivel y no a través de las TJ. De hecho, el análisis efectuado por MET puso de relieve que la principal área de desacoplamiento celular se producía a nivel de desmosomas (Figura 32). Los desmosomas son claves en 143
Discusión
la regulación de la permeabilidad, de hecho distintos estudios demuestran que el bloqueo mediante anti-‐desmogleína-‐2 o -‐3 (cadherinas desmosomales) son capaces de romper la integridad del epitelio y su función barrera (248-‐250), no obstante la función de p38 MAPK en estos procesos es controvertida. Por otro lado, es destacable el patrón de expresión del GCRα que coincide con el de la TEER, aumentado por acción del eje IL-‐10/p38 MAPK. Estos datos, junto con evidencias anteriores (226), sugieren una posible asociación entre las acciones antiinflamatorias propias de la activación del GCRα con el fomento de las uniones intercelulares. La expresión de IL-‐10Rα está claramente influenciada por la IL-‐10, pero a diferencia del GCRα, el bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK supone un aumento considerable de su expresión. El patrón observado para el IL-‐10Rα, es similar al de SOCS-‐3 e IkBα, y a la vez antagónico al de la producción de IL-‐8. En cualquier caso, la actividad generada por IL-‐10 parece influir en una modulación de la actividad p38 MAPK distinta al bloqueo de esta por SB203580. La expresión in vitro de los receptores α de IL-‐10 y GCs se contrastó en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa. Los receptores se hallaron distribuidos homogéneamente por el citoplasma de las células epiteliales intestinales, pero en los pacientes sensibles al tratamiento aparecían unas agrupaciones adicionales donde co-‐localizaban ambos receptores (Figuras 34 y 35). A pesar que la IL-‐10 incrementa la expresión de ambos receptores en las monocapas celulares, en las biopsias cólicas están incrementados en los pacientes no respondedores. Estos resultados podrían considerarse contradictorios si consideramos que la expresión de la IL-‐10 está muy disminuida en estos pacientes refractarios (Anexo 6). No obstante, en la complejidad del intestino el descenso de actividad en una vía de señalización se suele compensar con feedback que produce un aumento en la expresión de receptores activadores. Esto sugiere una disfunción en la trasmisión de señales a través de IL-‐10Rα y/o GCRα en los pacientes resistentes a los GCs, mientras que en los sensibles las agrupaciones de ambos receptores se asocian a una correcta activación de la señalización intercelular. 144
Discusión
En definitiva, este estudio demuestra que la presencia de la IL-‐10 influye sobre el epitelio intestinal reforzando las uniones intercelulares a través de un mecanismo que implica a la fosforilación de p38 MAPK, a la vez que se favorece la expresión de los receptores α de IL-‐10 y GCs. La acción sinérgica sobre el refuerzo paracelular que aparece por acción de la IL-‐10 y los GCs puede favorecer la recuperación del epitelio lesionado en la colitis ulcerosa. Probablemente a través de una disminución del estrés que genera el proceso inflamatorio sobre la célula epitelial. Lo que ayuda a recuperar la homeostasis y aislar la lamina propria de antígenos luminales. Además, los cambios moleculares que afectan a la respuesta frente a los GCs pueden ser detectados en el epitelio intestinal de pacientes con colitis ulcerosa. En todo caso, los resultados alcanzados sugieren posibles dianas en el epitelio intestinal respecto al problema de la respuesta inadecuada a los GCs en la colitis ulcerosa, lo que deberá ser concretado en posterior estudios.
145
Discusión
146
CONCLUSIONES 147
148
Conclusiones
10. CONCLUSIONES 1. La colaboración entre IL-‐10 y GCs fomenta la unión intercelular del epitelio intestinal. 2. La activación de p38 MAPK juega un papel importante en el sinergismo entre la IL-‐10 y los GCs en las células epiteliales del intestino. 3. La consecuencia biológica de esta sinergia es la regulación de la adherencia intercelular a nivel de desmosomas y, probablemente, modulando la expresión de cadherinas. 4. La presencia de IL-‐10 y GCs no se traduce en un cambio de la cantidad de proteínas de las TJ en células epiteliales tratadas con TNF-‐α. 5. La acción de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal induce la nuclearización de la p38 MAPK fosforilada que se evidencia en pacientes con colitis ulcerosa antes del tratamiento con corticosteroides. 6. La IL-‐10 en presencia de GCs modula la expresión del receptor α de los glucocorticoides y de la IL-‐10, implicando de nuevo la actividad de p38 MAPK. 7. La expresión de ambos receptores es detectada en el epitelio intestinal de pacientes con colitis ulcerosa mostrando cambios según la respuesta terapéutica.
149
Conclusiones
150
ANEXO 151
152
Anexo
Anexo 1: Valores de incrementos de fenotipo, apoptosis, apoptosis y necrosis y células vivas del estudio en linfocitos de sangre periférica de individuos sanos, estimulados vía TCR. A
B n.s
Incremento células T fenotipo C D4+
*
#
GCs 72H
PD98059 72h
Incremento células T fenotipo C D8+
#
GCs + PD98059 72h
GCs 72H
PD98059 72h
GCs + PD98059 72h
Representación gráfica de la mediana IIQ de los incrementos de las células T con fenotipo CD4+ (Figura A) y con fenotipo CD8+ (figura B), después de 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR. Los resultados de estos estudios in vitro nos muestran un escaso cambio en los fenotipos celulares según la condición analizada. No existen cambios entre las poblaciones sometidas a estímulo de 24h respecto a las estimuladas durante 72h, excepto en la población de células T CD4+ tratadas con inhibidor y GCs conjuntamente (Anexo 1 A; *p≤0.04 vs 72h). Esta condición también muestra un incremento tanto a las 24h como en las 72h respecto a las células tratadas sólo con GCs (Anexo 1 A; #p=0.044 vs GCs).
153
Anexo
D
C
n.s
Incremento apoptosis + necrosis de células T C D8+
Incremento apoptosis células T C D8+
n.s
GCs 72H
PD98059 72h
GCs + PD98059 72h
GCs 72H
PD98059 72h
GCs + PD98059 72h
Mediana IIQ de los incrementos de apoptosis (Anexo 1 C) y apoptosis más
necrosis (Anexo 1 D) de células T CD8 + a las 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR. E F
GCs 72H
*
*
PD98059 72h
GCs + PD98059 72h
Incremento células T vivas CD8+
Incremento células T vivas CD4+
n.s.
GCs 72H
PD98059 72h
GCs + PD98059 72h
Incrementos (medianas IIQ) de células T vivas CD4+ (figura E) y CD8 + (figura F) a las 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR. Estos resultados muestran una disminución en la viabilidad de las células T CD4+ en las condiciones tratadas con inhibidor con o sin GCs y un estímulo breve (24h) respecto a un estimulo de 72h (Anexo 1 E; *p≤0.025 vs 72h)
154
Anexo
Anexo 2: Medianas (IIQ) de los grupos basales de estimulación CD3+CD28+ de linfocitos de sangre periférica de individuos sanos.
24h +
+
Porcentaje fenotipo CD3 CD4 + + Porcentaje fenotipo CD3 CD8 + + Apoptosis CD3 CD4 + + Apoptosis CD3 CD8 + + Apoptosis y necrosis CD3 CD4 + + Apoptosis y necrosis CD3 CD8
21.8 (15.30-‐26.26) 8.99 (6.15-‐17.93) 11.75 (7.9-‐13.84)* 16.92 (10.65-‐32.31) 27.28 (24.44-‐45.06)* 27.9 (16.56-‐48.01) *p≤0.031 vs 72h
155
72h 24.63 (17.72-‐34.70) 9.92 (4.97-‐12.66) 18.7 (14.1-‐23.96) 35.7 (22.06-‐56.05) 52.14 (39.25-‐80.56) 41.7 (24.5-‐61.84)
Anexo
Anexo 3: Valores de TEER de las condiciones sin TNF-‐α de los cultivos monocapa Caco-‐2. Control
GCs
IL-‐10
-‐5.9 (-‐10.5-‐4.5) -‐4.39 (-‐25.2-‐3.71) -‐6.8 (-‐13.2-‐8.5) Medianas IIQ; n.s.
156
GCs_IL-‐10 7.9 (-‐20.7-‐14.1)
Incrementos MLCK (Intensidad Integrada )
Incrementos Ocludina_Insoluble (Intensidad Integrada )
Incrementos Ocludina _soluble (Intensidad Integrada )
Incrementos ZO-‐1_Insoluble (Intensidad Integrada )
Incrementos ZO-‐1 _soluble (Intensidad Integrada )
Anexo
Anexo 4: Resultados de los western blot realizados en células Caco-‐2 (Estudio I).
A B
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_ IL10
C D
E TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_ IL10
TNF
TNF_GCs
TNF_IL10
TNF_GCs_ IL10
157 TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_ IL10
TNF TNF_GCs TNF_IL10 TNF_GCs_ IL10
Anexo
TNF_GCs_IL10
TNF_IL10
TNF_GCs
TNF
Control
Marcador de peso molecular
F
190KDa
A
190KDa
B
61KDa
C
61KDa
D
50KDa
E
50KDa
α-‐Tubulina
Los gráficos A-‐E representan las medias ± E.S. del resto de proteínas determinadas por western blot, sin significación estadística. En la imagen F se observa un ejemplo de las bandas obtenidas a partir de las membranas mediante el escáner Odyssey, para cada proteína representada en los gráficos anteriores y de la α-‐Tubulina, usada como gen de referencia. Por contra, mediante la misma técnica de inmunobloting se validaron las formas fosforiladas de las quinasas JNK y AKT, y de ninguna de ellas se obtuvo señal.
158
Anexo
Anexo 5: Curvas de amplificación de la RT-‐PCR de los genes GCRβ e IL-‐ 10 valorados en monocapas de células Caco-‐2.
Imagen de las curvas de amplificación de RT-‐PCR donde se observa que no hay expresión de los genes IL10 y GCRβ.
159
Anexo
Anexo 6: Clasificación de pacientes con colitis ulcerosa activa, utilizados para el estudio de la fosforilación de p38 MAPK por Inmunohistoquímica en la mucosa intestinal.
GRUPO
Respuesta
Número
1
Colitis ulcerosa/corticosensibles
Negativo
6
2
Colitis Ulcerosa /corticorresistentes
Negativo
5
5
Individuos controles
Negativo
6
160
CMV
Resultados representan los incrementos respecto a los controles sanos (apartado 6.2.8.4) Los resultados fueron normalizados a β2-‐microglobulina
Anexo
Anexo 7: Trabajo presentado en el congreso “Digestive Disease Week” de la American Gastroenterological Association.
Pre-‐tratamiento
Post-‐tratamiento
Sensibles Refractarios IL-‐10 40.0(8.85-‐1355.8)* 2.4(0.2-‐26.8) TNF-‐α 5.6(0.4-‐67.9) 80.9(1.68-‐223.38) *p=0.023 sensibles vs refractarios
161
Sensibles Refractarios 11.8(2.9-‐25.2) 7.6(0.1-‐41.5) 0.2(0.1-‐9.7)** 22.4(0.8-‐244.0) **p=0.025 sensibles vs refractarios
Anexo
162
Referencias bibliográficas 163
164
1. Bischoff SC, Kramer S. Human mast cells, bacteria, and intestinal immunity. Immunol Rev. 2007 Jun;217:329-‐37. 2. Hofmann C, Obermeier F, Artinger M, Hausmann M, Falk W, Schoelmerich J, et al. Cell-‐cell contacts prevent anoikis in primary human colonic epithelial cells. Gastroenterology. 2007 Feb;132(2):587-‐600. 3. Cunliffe RN, Kamal M, Rose FR, James PD, Mahida YR. Expression of antimicrobial neutrophil defensins in epithelial cells of active inflammatory bowel disease mucosa. J Clin Pathol. 2002 Apr;55(4):298-‐304. 4. Dahan S, Roth-‐Walter F, Arnaboldi P, Agarwal S, Mayer L. Epithelia: Lymphocyte interactions in the gut. Immunol Rev. 2007 Feb;215:243-‐53. 5. Elphick DA, Mahida YR. Paneth cells: Their role in innate immunity and inflammatory disease. Gut. 2005 Dec;54(12):1802-‐9. 6. Miller H, Zhang J, Kuolee R, Patel GB, Chen W. Intestinal M cells: The fallible sentinels? World J Gastroenterol. 2007 Mar 14;13(10):1477-‐86. 7. Al-‐Sadi R, Boivin M, Ma T. Mechanism of cytokine modulation of epithelial tight junction barrier. Front Biosci. 2009 Jan 1;14:2765-‐78. 8. Turner JR. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 2009 Nov;9(11):799-‐809. 9. Shirazi T, Longman RJ, Corfield AP, Probert CS. Mucins and inflammatory bowel disease. Postgrad Med J. 2000 Aug;76(898):473-‐8. 10. Moncada DM, Kammanadiminti SJ, Chadee K. Mucin and toll-‐like receptors in host defense against intestinal parasites. Trends Parasitol. 2003 Jul;19(7):305-‐11. 11. Rhodes JM. Mucins and inflammatory bowel disease. QJM. 1997 Feb;90(2):79-‐82. 12. Pullan RD, Thomas GA, Rhodes M, Newcombe RG, Williams GT, Allen A, et al. Thickness of adherent mucus gel on colonic mucosa in humans and its relevance to colitis. Gut. 1994 Mar;35(3):353-‐9. 13. Lu P, Burger-‐van Paassen N, van der Sluis M, Witte-‐Bouma J, Kerckaert JP, van Goudoever JB, et al. Colonic gene expression patterns of mucin Muc2 knockout mice reveal various phases in colitis development. Inflamm Bowel Dis. 2011 Oct;17(10):2047-‐57.
165
14. Mestecky J, Russell MW, Elson CO. Intestinal IgA: Novel views on its function in the defence of the largest mucosal surface. Gut. 1999 Jan;44(1):2-‐5. 15. Porter EM, van Dam E, Valore EV, Ganz T. Broad-‐spectrum antimicrobial activity of human intestinal defensin 5. Infect Immun. 1997 Jun;65(6):2396-‐401. 16. Oppenheim JJ, Biragyn A, Kwak LW, Yang D. Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity. Ann Rheum Dis. 2003 Nov;62 Suppl 2:ii17-‐21. 17. Shi J, Aono S, Lu W, Ouellette AJ, Hu X, Ji Y, et al. A novel role for defensins in intestinal homeostasis: Regulation of IL-‐1beta secretion. J Immunol. 2007 Jul 15;179(2):1245-‐53. 18. Yang D, Chen Q, Chertov O, Oppenheim JJ. Human neutrophil defensins selectively chemoattract naive T and immature dendritic cells. J Leukoc Biol. 2000 Jul;68(1):9-‐14. 19. Wehkamp J, Salzman NH, Porter E, Nuding S, Weichenthal M, Petras RE, et al. Reduced paneth cell alpha-‐defensins in ileal crohn's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Dec 13;102(50):18129-‐34. 20. Bevins CL, Stange EF, Wehkamp J. Decreased paneth cell defensin expression in ileal crohn's disease is independent of inflammation, but linked to the NOD2 1007fs genotype. Gut. 2009 Jun;58(6):882,3; discussion 883-‐4. 21. Wehkamp J, Wang G, Kubler I, Nuding S, Gregorieff A, Schnabel A, et al. The paneth cell alpha-‐defensin deficiency of ileal crohn's disease is linked to Wnt/Tcf-‐4. J Immunol. 2007 Sep 1;179(5):3109-‐18. 22. Simms LA, Doecke JD, Walsh MD, Huang N, Fowler EV, Radford-‐Smith GL. Reduced alpha-‐defensin expression is associated with inflammation and not NOD2 mutation status in ileal crohn's disease. Gut. 2008 Jul;57(7):903-‐10. 23. Walport MJ. Complement. first of two parts. N Engl J Med. 2001 Apr 5;344(14):1058-‐66. 24. Walport MJ. Complement. second of two parts. N Engl J Med. 2001 Apr 12;344(15):1140-‐ 4. 25. Wagner E, Frank MM. Therapeutic potential of complement modulation. Nat Rev Drug Discov. 2010 Jan;9(1):43-‐56.
166
26. Nevalainen TJ, Haapamaki MM, Gronroos JM. Roles of secretory phospholipases A(2) in inflammatory diseases and trauma. Biochim Biophys Acta. 2000 Oct 31;1488(1-‐2):83-‐90. 27. Kjellev S. The trefoil factor family -‐ small peptides with multiple functionalities. Cell Mol Life Sci. 2009 Apr;66(8):1350-‐69. 28. Park WS, Oh RR, Park JY, Lee JH, Shin MS, Kim HS, et al. Somatic mutations of the trefoil factor family 1 gene in gastric cancer. Gastroenterology. 2000 Sep;119(3):691-‐8. 29. Giraud AS, Pereira PM, Thim L, Parker LM, Judd LM. TFF-‐2 inhibits iNOS/NO in monocytes, and nitrated protein in healing colon after colitis. Peptides. 2004 May;25(5):803-‐ 9. 30. Utech M, Mennigen R, Bruewer M. Endocytosis and recycling of tight junction proteins in inflammation. J Biomed Biotechnol. 2010;2010:484987. 31. Simon DB, Lu Y, Choate KA, Velazquez H, Al-‐Sabban E, Praga M, et al. Paracellin-‐1, a renal tight junction protein required for paracellular Mg2+ resorption. Science. 1999 Jul 2;285(5424):103-‐6. 32. Colegio OR, Van Itallie C, Rahner C, Anderson JM. Claudin extracellular domains determine paracellular charge selectivity and resistance but not tight junction fibril architecture. Am J Physiol Cell Physiol. 2003 Jun;284(6):C1346-‐54. 33. Amasheh S, Meiri N, Gitter AH, Schoneberg T, Mankertz J, Schulzke JD, et al. Claudin-‐2 expression induces cation-‐selective channels in tight junctions of epithelial cells. J Cell Sci. 2002 Dec 15;115(Pt 24):4969-‐76. 34. Hermiston ML, Gordon JI. In vivo analysis of cadherin function in the mouse intestinal epithelium: Essential roles in adhesion, maintenance of differentiation, and regulation of programmed cell death. J Cell Biol. 1995 Apr;129(2):489-‐506. 35. Evans WH, Martin PE. Gap junctions: Structure and function (review). Mol Membr Biol. 2002 Apr-‐Jun;19(2):121-‐36. 36. Shen L, Black ED, Witkowski ED, Lencer WI, Guerriero V, Schneeberger EE, et al. Myosin light chain phosphorylation regulates barrier function by remodeling tight junction structure. J Cell Sci. 2006 May 15;119(Pt 10):2095-‐106.
167
37. Zolotarevsky Y, Hecht G, Koutsouris A, Gonzalez DE, Quan C, Tom J, et al. A membrane-‐ permeant peptide that inhibits MLC kinase restores barrier function in in vitro models of intestinal disease. Gastroenterology. 2002 Jul;123(1):163-‐72. 38. Al-‐Sadi R, Ye D, Said HM, Ma TY. IL-‐1beta-‐induced increase in intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by MEKK-‐1 activation of canonical NF-‐kappaB pathway. Am J Pathol. 2010 Nov;177(5):2310-‐22. 39. Stamatovic SM, Keep RF, Wang MM, Jankovic I, Andjelkovic AV. Caveolae-‐mediated internalization of occludin and claudin-‐5 during CCL2-‐induced tight junction remodeling in brain endothelial cells. J Biol Chem. 2009 Jul 10;284(28):19053-‐66. 40. Cario E, Gerken G, Podolsky DK. Toll-‐like receptor 2 controls mucosal inflammation by regulating epithelial barrier function. Gastroenterology. 2007 Apr;132(4):1359-‐74. 41. Suzuki T, Elias BC, Seth A, Shen L, Turner JR, Giorgianni F, et al. PKC eta regulates occludin phosphorylation and epithelial tight junction integrity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan 6;106(1):61-‐6. 42. Gonzalez-‐Mariscal L, Tapia R, Chamorro D. Crosstalk of tight junction components with signaling pathways. Biochim Biophys Acta. 2008 Mar;1778(3):729-‐56. 43. Fujita Y, Krause G, Scheffner M, Zechner D, Leddy HE, Behrens J, et al. Hakai, a c-‐cbl-‐like protein, ubiquitinates and induces endocytosis of the E-‐cadherin complex. Nat Cell Biol. 2002 Mar;4(3):222-‐31. 44. Heller F, Florian P, Bojarski C, Richter J, Christ M, Hillenbrand B, et al. Interleukin-‐13 is the key effector Th2 cytokine in ulcerative colitis that affects epithelial tight junctions, apoptosis, and cell restitution. Gastroenterology. 2005 Aug;129(2):550-‐64. 45. Kinugasa T, Sakaguchi T, Gu X, Reinecker HC. Claudins regulate the intestinal barrier in response to immune mediators. Gastroenterology. 2000 Jun;118(6):1001-‐11. 46. Porporatto C, Dario Bianco I, Graciela Correra S. La modulación del sistema inmune de mucosas con polisacáridos bases para una atractiva alternativa en terapia Acta Bioquím Clín Latinoam. 2007;41 (2):203-‐ 11. 47. Coombes JL, Siddiqui KR, Arancibia-‐Carcamo CV, Hall J, Sun CM, Belkaid Y, et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells
168
via a TGF-‐beta and retinoic acid-‐dependent mechanism. J Exp Med. 2007 Aug 6;204(8):1757-‐ 64. 48. Shale M, Ghosh S. How intestinal epithelial cells tolerise dendritic cells and its relevance to inflammatory bowel disease. Gut. 2009 Sep;58(9):1291-‐9. 49. Wershil BK, Furuta GT. 4. gastrointestinal mucosal immunity. J Allergy Clin Immunol. 2008 Feb;121(2 Suppl):S380,3; quiz S415. 50. Bowman EP, Kuklin NA, Youngman KR, Lazarus NH, Kunkel EJ, Pan J, et al. The intestinal chemokine thymus-‐expressed chemokine (CCL25) attracts IgA antibody-‐secreting cells. J Exp Med. 2002 Jan 21;195(2):269-‐75. 51. Collins JE. Adhesion between dendritic cells and epithelial cells maintains the gut barrier during bacterial sampling. Gut. 2002 Apr;50(4):449-‐50. 52. Niess JH, Brand S, Gu X, Landsman L, Jung S, McCormick BA, et al. CX3CR1-‐mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 2005 Jan 14;307(5707):254-‐8. 53. Kaser A, Nieuwenhuis EE, Strober W, Mayer L, Fuss I, Colgan S, et al. Natural killer T cells in mucosal homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 2004 Dec;1029:154-‐68. 54. Cheroutre H. Starting at the beginning: New perspectives on the biology of mucosal T cells. Annu Rev Immunol. 2004;22:217-‐46. 55. Chen Y, Chou K, Fuchs E, Havran WL, Boismenu R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 29;99(22):14338-‐43. 56. Ghoreschi K, Laurence A, Yang XP, Tato CM, McGeachy MJ, Konkel JE, et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-‐beta signalling. Nature. 2010 Oct 21;467(7318):967-‐71. 57. Davidson TS, DiPaolo RJ, Andersson J, Shevach EM. Cutting edge: IL-‐2 is essential for TGF-‐ beta-‐mediated induction of Foxp3+ T regulatory cells. J Immunol. 2007 Apr 1;178(7):4022-‐6. 58. Carrier Y, Yuan J, Kuchroo VK, Weiner HL. Th3 cells in peripheral tolerance. I. induction of Foxp3-‐positive regulatory T cells by Th3 cells derived from TGF-‐beta T cell-‐transgenic mice. J Immunol. 2007 Jan 1;178(1):179-‐85.
169
59. Roncarolo MG, Gregori S, Battaglia M, Bacchetta R, Fleischhauer K, Levings MK. Interleukin-‐10-‐secreting type 1 regulatory T cells in rodents and humans. Immunol Rev. 2006 Aug;212:28-‐50. 60. Saurer L, Mueller C. T cell-‐mediated immunoregulation in the gastrointestinal tract. Allergy. 2009 Apr;64(4):505-‐19. 61. Yurchenko E, Shio MT, Huang TC, Da Silva Martins M, Szyf M, Levings MK, et al. Inflammation-‐driven reprogramming of CD4+ Foxp3+ regulatory T cells into pathogenic Th1/Th17 T effectors is abrogated by mTOR inhibition in vivo. PLoS One. 2012;7(4):e35572. 62. Shkoda A, Ruiz PA, Daniel H, Kim SC, Rogler G, Sartor RB, et al. Interleukin-‐10 blocked endoplasmic reticulum stress in intestinal epithelial cells: Impact on chronic inflammation. Gastroenterology. 2007 Jan;132(1):190-‐207. 63. Kaser A, Zeissig S, Blumberg RS. Inflammatory bowel disease. Annu Rev Immunol. 2010;28:573-‐621. 64. Melmed GY, Targan SR. Future biologic targets for IBD: Potentials and pitfalls. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2010 Feb;7(2):110-‐7. 65. Duerr RH, Taylor KD, Brant SR, Rioux JD, Silverberg MS, Daly MJ, et al. A genome-‐wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science. 2006 Dec 1;314(5804):1461-‐3. 66. Stange EF, Travis SP, Vermeire S, Reinisch W, Geboes K, Barakauskiene A, et al. European evidence-‐based consensus on the diagnosis and management of ulcerative colitis: Definitions and diagnosis. J Crohns Colitis. 2008 Mar;2(1):1-‐23. 67. Van Assche G, Dignass A, Panes J, Beaugerie L, Karagiannis J, Allez M, et al. The second european evidence-‐based consensus on the diagnosis and management of crohn's disease: Definitions and diagnosis. J Crohns Colitis. 2010 Feb;4(1):7-‐27. 68. Tremaine WJ. Diagnosis and treatment of indeterminate colitis. Gastroenterol Hepatol (N Y). 2011 Dec;7(12):826-‐8. 69. Engel MA, Neurath MF. New pathophysiological insights and modern treatment of IBD. J Gastroenterol. 2010 Jun;45(6):571-‐83.
170
70. Mañé Almero J. Influence of toll-‐like receptor 2 and interleukin 10 on the intestinal epithelial barrier and their roles in inflammatory bowel disease. Inmunología. 2011; 30(1): 8-‐16. 2011;30 (1):8-‐16. 71. Loftus EV,Jr. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: Incidence, prevalence, and environmental influences. Gastroenterology. 2004 May;126(6):1504-‐17. 72. Halme L, Paavola-‐Sakki P, Turunen U, Lappalainen M, Farkkila M, Kontula K. Family and twin studies in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2006 Jun 21;12(23):3668-‐72. 73. Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H, Lesage S, Cezard JP, Belaiche J, et al. Association of NOD2 leucine-‐rich repeat variants with susceptibility to crohn's disease. Nature. 2001 May 31;411(6837):599-‐603. 74. Peluso I, Pallone F, Monteleone G. Interleukin-‐12 and Th1 immune response in crohn's disease: Pathogenetic relevance and therapeutic implication. World J Gastroenterol. 2006 Sep 21;12(35):5606-‐10. 75. Watanabe T, Kitani A, Murray PJ, Wakatsuki Y, Fuss IJ, Strober W. Nucleotide binding oligomerization domain 2 deficiency leads to dysregulated TLR2 signaling and induction of antigen-‐specific colitis. Immunity. 2006 Sep;25(3):473-‐85. 76. Kuballa P, Huett A, Rioux JD, Daly MJ, Xavier RJ. Impaired autophagy of an intracellular pathogen induced by a crohn's disease associated ATG16L1 variant. PLoS One. 2008;3(10):e3391. 77. Fuss IJ, Neurath M, Boirivant M, Klein JS, de la Motte C, Strong SA, et al. Disparate CD4+ lamina propria (LP) lymphokine secretion profiles in inflammatory bowel disease.. J Immunol. 1996 Aug 1;157(3):1261-‐70. 78. Cadwell K, Liu JY, Brown SL, Miyoshi H, Loh J, Lennerz JK, et al. A key role for autophagy and the autophagy gene Atg16l1 in mouse and human intestinal paneth cells. Nature. 2008 Nov 13;456(7219):259-‐63. 79. Nedjic J, Aichinger M, Emmerich J, Mizushima N, Klein L. Autophagy in thymic epithelium shapes the T-‐cell repertoire and is essential for tolerance. Nature. 2008 Sep 18;455(7211):396-‐400. 80. McGovern D, Powrie F. The IL23 axis plays a key role in the pathogenesis of IBD. Gut. 2007 Oct;56(10):1333-‐6.
171
81. Sarra M, Pallone F, Macdonald TT, Monteleone G. IL-‐23/IL-‐17 axis in IBD. Inflamm Bowel Dis. 2010 Oct;16(10):1808-‐13. 82. Hollander D, Vadheim CM, Brettholz E, Petersen GM, Delahunty T, Rotter JI. Increased intestinal permeability in patients with crohn's disease and their relatives. A possible etiologic factor. Ann Intern Med. 1986 Dec;105(6):883-‐5. 83. Madsen KL, Malfair D, Gray D, Doyle JS, Jewell LD, Fedorak RN. Interleukin-‐10 gene-‐ deficient mice develop a primary intestinal permeability defect in response to enteric microflora. Inflamm Bowel Dis. 1999 Nov;5(4):262-‐70. 84. Muise AM, Walters TD, Glowacka WK, Griffiths AM, Ngan BY, Lan H, et al. Polymorphisms in E-‐cadherin (CDH1) result in a mis-‐localised cytoplasmic protein that is associated with crohn's disease. Gut. 2009 Aug;58(8):1121-‐7. 85. Peltekova VD, Wintle RF, Rubin LA, Amos CI, Huang Q, Gu X, et al. Functional variants of OCTN cation transporter genes are associated with crohn disease. Nat Genet. 2004 May;36(5):471-‐5. 86. Vermeire S. DLG5 and OCTN. Inflamm Bowel Dis. 2004 Nov;10(6):888-‐90. 87. Ho GT, Nimmo ER, Tenesa A, Fennell J, Drummond H, Mowat C, et al. Allelic variations of the multidrug resistance gene determine susceptibility and disease behavior in ulcerative colitis. Gastroenterology. 2005 Feb;128(2):288-‐96. 88. Ishihara S, Aziz MM, Yuki T, Kazumori H, Kinoshita Y. Inflammatory bowel disease: Review from the aspect of genetics. J Gastroenterol. 2009;44(11):1097-‐108. 89. Cho JH, Weaver CT. The genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2007 Oct;133(4):1327-‐39. 90. Abraham C, Cho JH. Inflammatory bowel disease. N Engl J Med. 2009 Nov 19;361(21):2066-‐78. 91. Sartor RB. Mechanisms of disease: Pathogenesis of crohn's disease and ulcerative colitis. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 2006 Jul;3(7):390-‐407. 92. Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2008 Feb;134(2):577-‐94.
172
93. Gill SR, Pop M, Deboy RT, Eckburg PB, Turnbaugh PJ, Samuel BS, et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 2006 Jun 2;312(5778):1355-‐9. 94. Rakoff-‐Nahoum S, Paglino J, Eslami-‐Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-‐like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 2004 Jul 23;118(2):229-‐41. 95. Macpherson AJ, Harris NL. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 2004 Jun;4(6):478-‐85. 96. Schultz M, Tonkonogy SL, Sellon RK, Veltkamp C, Godfrey VL, Kwon J, et al. IL-‐2-‐deficient mice raised under germfree conditions develop delayed mild focal intestinal inflammation. Am J Physiol. 1999 Jun;276(6 Pt 1):G1461-‐72. 97. Behr MA, Schurr E. Mycobacteria in crohn's disease: A persistent hypothesis. Inflamm Bowel Dis. 2006 Oct;12(10):1000-‐4. 98. Frank DN, St Amand AL, Feldman RA, Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. Molecular-‐ phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Aug 21;104(34):13780-‐5. 99. Zeissig S, Burgel N, Gunzel D, Richter J, Mankertz J, Wahnschaffe U, et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active crohn's disease. Gut. 2007 Jan;56(1):61-‐72. 100. Gerova VA, Stoynov SG, Katsarov DS, Svinarov DA. Increased intestinal permeability in inflammatory bowel diseases assessed by iohexol test. World J Gastroenterol. 2011 May 7;17(17):2211-‐5. 101. Sheng YH, Hasnain SZ, Florin TH, McGuckin MA. Mucins in inflammatory bowel diseases and colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol. 2012 Jan;27(1):28-‐38. 102. Watanabe T, Asano N, Murray PJ, Ozato K, Tailor P, Fuss IJ, et al. Muramyl dipeptide activation of nucleotide-‐binding oligomerization domain 2 protects mice from experimental colitis. J Clin Invest. 2008 Feb;118(2):545-‐59. 103. Raddatz D, Middel P, Bockemuhl M, Benohr P, Wissmann C, Schworer H, et al. Glucocorticoid receptor expression in inflammatory bowel disease: Evidence for a mucosal down-‐regulation in steroid-‐unresponsive ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 2004 Jan 1;19(1):47-‐61.
173
104. Shih DQ, Targan SR. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2008 Jan 21;14(3):390-‐400. 105. Fuss IJ, Heller F, Boirivant M, Leon F, Yoshida M, Fichtner-‐Feigl S, et al. Nonclassical CD1d-‐restricted NK T cells that produce IL-‐13 characterize an atypical Th2 response in ulcerative colitis. J Clin Invest. 2004 May;113(10):1490-‐7. 106. Raza A, Yousaf W, Giannella R, Shata MT. Th17 cells: Interactions with predisposing factors in the immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Expert Rev Clin Immunol. 2012 Feb;8(2):161-‐8. 107. Mucida D, Park Y, Kim G, Turovskaya O, Scott I, Kronenberg M, et al. Reciprocal TH17 and regulatory T cell differentiation mediated by retinoic acid. Science. 2007 Jul 13;317(5835):256-‐60. 108. Maloy KJ. The interleukin-‐23 / interleukin-‐17 axis in intestinal inflammation. J Intern Med. 2008 Jun;263(6):584-‐90. 109. Maloy KJ, Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 2011 Jun 15;474(7351):298-‐306. 110. Itoh J, de La Motte C, Strong SA, Levine AD, Fiocchi C. Decreased bax expression by mucosal T cells favours resistance to apoptosis in crohn's disease. Gut. 2001 Jul;49(1):35-‐41. 111. Lakatos PL. Recent trends in the epidemiology of inflammatory bowel diseases: Up or down? World J Gastroenterol. 2006 Oct 14;12(38):6102-‐8. 112. Molodecky NA, Soon IS, Rabi DM, Ghali WA, Ferris M, Chernoff G, et al. Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review. Gastroenterology. 2012 Jan;142(1):46,54.e42; 113. Molodecky NA, Kaplan GG. Environmental risk factors for inflammatory bowel disease. Gastroenterol Hepatol (N Y). 2010 May;6(5):339-‐46. 114. Koloski NA, Bret L, Radford-‐Smith G. Hygiene hypothesis in inflammatory bowel disease: A critical review of the literature. World J Gastroenterol. 2008 Jan 14;14(2):165-‐73. 115. Gent AE, Hellier MD, Grace RH, Swarbrick ET, Coggon D. Inflammatory bowel disease and domestic hygiene in infancy. Lancet. 1994 Mar 26;343(8900):766-‐7.
174
116. Hou JK, El-‐Serag H, Thirumurthi S. Distribution and manifestations of inflammatory bowel disease in asians, hispanics, and african americans: A systematic review. Am J Gastroenterol. 2009 Aug;104(8):2100-‐9. 117. Nguyen GC, Torres EA, Regueiro M, Bromfield G, Bitton A, Stempak J, et al. Inflammatory bowel disease characteristics among african americans, hispanics, and non-‐ hispanic whites: Characterization of a large north american cohort. Am J Gastroenterol. 2006 May;101(5):1012-‐23. 118. Bernstein CN, Shanahan F. Disorders of a modern lifestyle: Reconciling the epidemiology of inflammatory bowel diseases. Gut. 2008 Sep;57(9):1185-‐91. 119. Garcia-‐Paredes J, Mendoza JL. Descriptive epidemiology of inflammatory bowel disease in spain. An Med Interna. 2003 Jan;20(1):1-‐2. 120. Lopez-‐Serrano P, Perez-‐Calle JL, Carrera-‐Alonso E, Perez-‐Fernandez T, Rodriguez-‐ Caravaca G, Boixeda-‐de-‐Miguel D, et al. Epidemiologic study on the current incidence of inflammatory bowel disease in madrid. Rev Esp Enferm Dig. 2009 Nov;101(11):768-‐72. 121. Anton Martinez J, Ortega Gomez A, Arranz Carrero A, Molina Sanchez A, Alvarez Garcia JF, Moreiras Jimenez JL, et al. Incidence of inflammatory bowel disease in the health area of navalmoral de la mata (caceres, spain) between 2000 and 2009. Gastroenterol Hepatol. 2010 Dec;33(10):694-‐9. 122. D'Haens G, Baert F, van Assche G, Caenepeel P, Vergauwe P, Tuynman H, et al. Early combined immunosuppression or conventional management in patients with newly diagnosed crohn's disease: An open randomised trial. Lancet. 2008 Feb 23;371(9613):660-‐7. 123. Pithadia AB, Jain S. Treatment of inflammatory bowel disease (IBD). Pharmacol Rep. 2011;63(3):629-‐42. 124. Messori A, Trallori G, D'Albasio G, Milla M, Vannozzi G, Pacini F. Defined-‐formula diets versus steroids in the treatment of active crohn's disease: A meta-‐analysis. Scand J Gastroenterol. 1996 Mar;31(3):267-‐72. 125. Rutgeerts P, Vermeire S, Van Assche G. Biological therapies for inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2009 Apr;136(4):1182-‐97.
175
126. Rugtveit J, Nilsen EM, Bakka A, Carlsen H, Brandtzaeg P, Scott H. Cytokine profiles differ in newly recruited and resident subsets of mucosal macrophages from inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 1997 May;112(5):1493-‐505. 127. Fuss IJ, Becker C, Yang Z, Groden C, Hornung RL, Heller F, et al. Both IL-‐12p70 and IL-‐23 are synthesized during active crohn's disease and are down-‐regulated by treatment with anti-‐IL-‐12 p40 monoclonal antibody. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jan;12(1):9-‐15. 128. Barbara G, Xing Z, Hogaboam CM, Gauldie J, Collins SM. Interleukin 10 gene transfer prevents experimental colitis in rats. Gut. 2000 Mar;46(3):344-‐9. 129. Minguez Perez M, Benages Martinez A, Mora Miguel F. Megacolon tóxico y colitis fulminante. In: Enfermedad Inflamatoria Intestinal. III edición. España: Arán Ediciones; 2007. p. 289-‐97. 130. Autenrieth DM, Baumgart DC. Toxic megacolon. Inflamm Bowel Dis. 2011 Aug 29. 131. Lledo Matoses S, García Armengol J. Tratamiento quirúrgico de la colitis ulcerosa. In: Enfermedad inflamatoria Intestinal. III edición. España: Arán Ediciones; 2007. p. 299-‐310. 132. Rotholtz N, Bun M. Tratamiento quirurgico de la enfermedad de crohn: Cuándo operar y cómo. In: Enfermedad Inflamatoria Intestinal. III edición. España: Arán Ediciones; 2007. p. 365-‐76. 133. Spinelli A, Sacchi M, Fiorino G, Danese S, Montorsi M. Risk of postoperative recurrence and postoperative management of crohn's disease. World J Gastroenterol. 2011 Jul 21;17(27):3213-‐9. 134. Shen B. Acute and chronic pouchitis-‐-‐pathogenesis, diagnosis and treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012 Apr 17;9(6):323-‐33. 135. Gasche G, Evstatiev R. Anemia en enfermedad inflamatoria intestinal. In: Enfermedad Inflamatoria intestinal. III edición. España: Arán Ediciones; 2007. p. 469-‐74. 136. Gassull M, Cabre E. Nutrición y enfermedad inflamatoria intestinal. In: Enfermedad inflamatoria intestinal. III edición. España: Arán ediciones; 2007. p. 497-‐507. 137. El-‐Haj T, Poole S, Farthing MJ, Ballinger AB. Anorexia in a rat model of colitis: Interaction of interleukin-‐1 and hypothalamic serotonin. Brain Res. 2002 Feb 8;927(1):1-‐7.
176
138. Guagnozzi D, Lucendo AJ. Colorectal cancer surveillance in patients with inflammatory bowel disease: What is new? World J Gastrointest Endosc. 2012 Apr 16;4(4):108-‐16. 139. Canavan C, Abrams KR, Mayberry J. Meta-‐analysis: Colorectal and small bowel cancer risk in patients with crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther. 2006 Apr 15;23(8):1097-‐104. 140. Jess T, Simonsen J, Jorgensen KT, Pedersen BV, Nielsen NM, Frisch M. Decreasing risk of colorectal cancer in patients with inflammatory bowel disease over 30 years. Gastroenterology. 2012 Aug;143(2):375,381.e1. 141. Franchimont D. Overview of the actions of glucocorticoids on the immune response: A good model to characterize new pathways of immunosuppression for new treatment strategies. Ann N Y Acad Sci. 2004 Jun;1024:124-‐37. 142. De Bosscher K, Haegeman G. Minireview: Latest perspectives on antiinflammatory actions of glucocorticoids. Mol Endocrinol. 2009 Mar;23(3):281-‐91. 143. Schacke H, Docke WD, Asadullah K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther. 2002 Oct;96(1):23-‐43. 144. Stellato C. Post-‐transcriptional and nongenomic effects of glucocorticoids. Proc Am Thorac Soc. 2004;1(3):255-‐63. 145. Encio IJ, Detera-‐Wadleigh SD. The genomic structure of the human glucocorticoid receptor. J Biol Chem. 1991 Apr 15;266(11):7182-‐8. 146. de Castro M, Elliot S, Kino T, Bamberger C, Karl M, Webster E, et al. The non-‐ligand binding beta-‐isoform of the human glucocorticoid receptor (hGR beta): Tissue levels, mechanism of action, and potential physiologic role. Mol Med. 1996 Sep;2(5):597-‐607. 147. Cheung J, Smith DF. Molecular chaperone interactions with steroid receptors: An update. Mol Endocrinol. 2000 Jul;14(7):939-‐46. 148. Pratt WB, Toft DO. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr Rev. 1997 Jun;18(3):306-‐60. 149. Smoak KA, Cidlowski JA. Mechanisms of glucocorticoid receptor signaling during inflammation. Mech Ageing Dev. 2004 Oct-‐Nov;125(10-‐11):697-‐706.
177
150. Barnes PJ. How corticosteroids control inflammation: Quintiles prize lecture 2005. Br J Pharmacol. 2006 Jun;148(3):245-‐54. 151. Kurihara I, Shibata H, Suzuki T, Ando T, Kobayashi S, Hayashi M, et al. Expression and regulation of nuclear receptor coactivators in glucocorticoid action. Mol Cell Endocrinol. 2002 Mar 28;189(1-‐2):181-‐9. 152. Stoecklin E, Wissler M, Schaetzle D, Pfitzner E, Groner B. Interactions in the transcriptional regulation exerted by Stat5 and by members of the steroid hormone receptor family. J Steroid Biochem Mol Biol. 1999 Apr-‐Jun;69(1-‐6):195-‐204. 153. Langlais D, Couture C, Balsalobre A, Drouin J. The Stat3/GR interaction code: Predictive value of Direct/Indirect DNA recruitment for transcription outcome. Mol Cell. 2012 May 23. 154. Dostert A, Heinzel T. Negative glucocorticoid receptor response elements and their role in glucocorticoid action. Curr Pharm Des. 2004;10(23):2807-‐16. 155. Ito K, Yamamura S, Essilfie-‐Quaye S, Cosio B, Ito M, Barnes PJ, et al. Histone deacetylase 2-‐mediated deacetylation of the glucocorticoid receptor enables NF-‐kappaB suppression. J Exp Med. 2006 Jan 23;203(1):7-‐13. 156. Chen CY, Shyu AB. AU-‐rich elements: Characterization and importance in mRNA degradation. Trends Biochem Sci. 1995 Nov;20(11):465-‐70. 157. Barnes PJ. Corticosteroids: The drugs to beat. Eur J Pharmacol. 2006 Mar 8;533(1-‐3):2-‐ 14. 158. Kracht M, Saklatvala J. Transcriptional and post-‐transcriptional control of gene expression in inflammation. Cytokine. 2002 Nov 7;20(3):91-‐106. 159. Dean JL, Sully G, Clark AR, Saklatvala J. The involvement of AU-‐rich element-‐binding proteins in p38 mitogen-‐activated protein kinase pathway-‐mediated mRNA stabilisation. Cell Signal. 2004 Oct;16(10):1113-‐21. 160. Lowenberg M, Stahn C, Hommes DW, Buttgereit F. Novel insights into mechanisms of glucocorticoid action and the development of new glucocorticoid receptor ligands. Steroids. 2008 Oct;73(9-‐10):1025-‐9. 161. Urbach V, Walsh DE, Mainprice B, Bousquet J, Harvey BJ. Rapid non-‐genomic inhibition of ATP-‐induced cl-‐ secretion by dexamethasone in human bronchial epithelium. J Physiol. 2002 Dec 15;545(Pt 3):869-‐78.
178
162. Buttgereit F, Scheffold A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids. 2002 May;67(6):529-‐34. 163. Song IH, Buttgereit F. Non-‐genomic glucocorticoid effects to provide the basis for new drug developments. Mol Cell Endocrinol. 2006 Feb 26;246(1-‐2):142-‐6. 164. Croxtall JD, Choudhury Q, Flower RJ. Glucocorticoids act within minutes to inhibit recruitment of signalling factors to activated EGF receptors through a receptor-‐dependent, transcription-‐independent mechanism. Br J Pharmacol. 2000 May;130(2):289-‐98. 165. Bartholome B, Spies CM, Gaber T, Schuchmann S, Berki T, Kunkel D, et al. Membrane glucocorticoid receptors (mGCR) are expressed in normal human peripheral blood mononuclear cells and up-‐regulated after in vitro stimulation and in patients with rheumatoid arthritis. FASEB J. 2004 Jan;18(1):70-‐80. 166. Lowenberg M, Verhaar AP, van den Brink GR, Hommes DW. Glucocorticoid signaling: A nongenomic mechanism for T-‐cell immunosuppression. Trends Mol Med. 2007 Apr;13(4):158-‐63. 167. Zamoyska R, Basson A, Filby A, Legname G, Lovatt M, Seddon B. The influence of the src-‐family kinases, lck and fyn, on T cell differentiation, survival and activation. Immunol Rev. 2003 Feb;191:107-‐18. 168. Schreiber S, Nikolaus S, Hampe J. Activation of nuclear factor kappa B inflammatory bowel disease. Gut. 1998 Apr;42(4):477-‐84. 169. Nissen RM, Yamamoto KR. The glucocorticoid receptor inhibits NFkappaB by interfering with serine-‐2 phosphorylation of the RNA polymerase II carboxy-‐terminal domain. Genes Dev. 2000 Sep 15;14(18):2314-‐29. 170. Leis H, Page A, Ramirez A, Bravo A, Segrelles C, Paramio J, et al. Glucocorticoid receptor counteracts tumorigenic activity of akt in skin through interference with the phosphatidylinositol 3-‐kinase signaling pathway. Mol Endocrinol. 2004 Feb;18(2):303-‐11. 171. Faubion WA,Jr, Loftus EV,Jr, Harmsen WS, Zinsmeister AR, Sandborn WJ. The natural history of corticosteroid therapy for inflammatory bowel disease: A population-‐based study. Gastroenterology. 2001 Aug;121(2):255-‐60.
179
172. de Vries F, Pouwels S, Lammers JW, Leufkens HG, Bracke M, Cooper C, et al. Use of inhaled and oral glucocorticoids, severity of inflammatory disease and risk of hip/femur fracture: A population-‐based case-‐control study. J Intern Med. 2007 Feb;261(2):170-‐7. 173. Reynolds RM, Labad J, Sears AV, Williamson RM, Strachan MW, Deary IJ, et al. Glucocorticoid treatment and impaired mood, memory and metabolism in people with diabetes: The edinburgh type 2 diabetes study. Eur J Endocrinol. 2012 May;166(5):861-‐8. 174. Mitchell F. Therapy: Glucocorticoid-‐induced cushing syndrome increases the risk of cardiovascular events. Nat Rev Endocrinol. 2012 Aug 21. 175. Jakobovits SL, Travis SP. Management of acute severe colitis. Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-‐76:131-‐44. 176. Bernal I, Manosa M, Domenech E, Garcia-‐Planella E, Navarro M, Lorenzo-‐Zuniga V, et al. Predictors of clinical response to systemic steroids in active ulcerative colitis. Dig Dis Sci. 2006 Aug;51(8):1434-‐8. 177. Benazzato L, D'Inca R, Grigoletto F, Perissinotto E, Medici V, Angriman I, et al. Prognosis of severe attacks in ulcerative colitis: Effect of intensive medical treatment. Dig Liver Dis. 2004 Jul;36(7):461-‐6. 178. Ho GT, Mowat C, Goddard CJ, Fennell JM, Shah NB, Prescott RJ, et al. Predicting the outcome of severe ulcerative colitis: Development of a novel risk score to aid early selection of patients for second-‐line medical therapy or surgery. Aliment Pharmacol Ther. 2004 May 15;19(10):1079-‐87. 179. Maconi G, Colombo E, Zerbi P, Sampietro GM, Fociani P, Bosani M, et al. Prevalence, detection rate and outcome of cytomegalovirus infection in ulcerative colitis patients requiring colonic resection. Dig Liver Dis. 2005 Jun;37(6):418-‐23. 180. Kambham N, Vij R, Cartwright CA, Longacre T. Cytomegalovirus infection in steroid-‐ refractory ulcerative colitis: A case-‐control study. Am J Surg Pathol. 2004 Mar;28(3):365-‐73. 181. Domenech E, Vega R, Ojanguren I, Hernandez A, Garcia-‐Planella E, Bernal I, et al. Cytomegalovirus infection in ulcerative colitis: A prospective, comparative study on prevalence and diagnostic strategy. Inflamm Bowel Dis. 2008 Oct;14(10):1373-‐9.
180
182. Consigny Y, Modigliani R, Colombel JF, Dupas JL, Lemann M, Mary JY, et al. A simple biological score for predicting low risk of short-‐term relapse in crohn's disease. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jul;12(7):551-‐7. 183. Gelbmann CM, Rogler G, Gross V, Gierend M, Bregenzer N, Andus T, et al. Prior bowel resections, perianal disease, and a high initial crohn's disease activity index are associated with corticosteroid resistance in active crohn's disease. Am J Gastroenterol. 2002 Jun;97(6):1438-‐45. 184. Hearing SD, Norman M, Probert CS, Haslam N, Dayan CM. Predicting therapeutic outcome in severe ulcerative colitis by measuring in vitro steroid sensitivity of proliferating peripheral blood lymphocytes. Gut. 1999 Sep;45(3):382-‐8. 185. Hearing SD, Norman M, Smyth C, Foy C, Dayan CM. Wide variation in lymphocyte steroid sensitivity among healthy human volunteers. J Clin Endocrinol Metab. 1999 Nov;84(11):4149-‐54. 186. Lee RW, Creed TJ, Schewitz LP, Newcomb PV, Nicholson LB, Dick AD, et al. CD4+CD25(int) T cells in inflammatory diseases refractory to treatment with glucocorticoids. J Immunol. 2007 Dec 1;179(11):7941-‐8. 187. Flood L, Lofberg R, Stierna P, Wikstrom AC. Glucocorticoid receptor mRNA in patients with ulcerative colitis: A study of responders and nonresponders to glucocorticosteroid therapy. Inflamm Bowel Dis. 2001 Aug;7(3):202-‐9. 188. Creed TJ, Lee RW, Newcomb PV, di Mambro AJ, Raju M, Dayan CM. The effects of cytokines on suppression of lymphocyte proliferation by dexamethasone. J Immunol. 2009 Jul 1;183(1):164-‐71. 189. Irusen E, Matthews JG, Takahashi A, Barnes PJ, Chung KF, Adcock IM. p38 mitogen-‐ activated protein kinase-‐induced glucocorticoid receptor phosphorylation reduces its activity: Role in steroid-‐insensitive asthma. J Allergy Clin Immunol. 2002 Apr;109(4):649-‐57. 190. Honda M, Orii F, Ayabe T, Imai S, Ashida T, Obara T, et al. Expression of glucocorticoid receptor beta in lymphocytes of patients with glucocorticoid-‐resistant ulcerative colitis. Gastroenterology. 2000 May;118(5):859-‐66. 191. Fujishima S, Takeda H, Kawata S, Yamakawa M. The relationship between the expression of the glucocorticoid receptor in biopsied colonic mucosa and the glucocorticoid responsiveness of ulcerative colitis patients. Clin Immunol. 2009 Nov;133(2):208-‐17.
181
192. Hausmann M, Herfarth H, Scholmerich J, Rogler G. Glucocorticoid receptor isoform expression does not predict steroid treatment response in IBD. Gut. 2007 Sep;56(9):1328-‐9. 193. Farrell RJ, Kelleher D. Glucocorticoid resistance in inflammatory bowel disease. J Endocrinol. 2003 Sep;178(3):339-‐46. 194. Baschant U, Frappart L, Rauchhaus U, Bruns L, Reichardt HM, Kamradt T, et al. Glucocorticoid therapy of antigen-‐induced arthritis depends on the dimerized glucocorticoid receptor in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Nov 29;108(48):19317-‐22. 195. De Iudicibus S, Franca R, Martelossi S, Ventura A, Decorti G. Molecular mechanism of glucocorticoid resistance in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2011 Mar 7;17(9):1095-‐108. 196. Qian X, Zhu Y, Xu W, Lin Y. Glucocorticoid receptor and heat shock protein 90 in peripheral blood mononuclear cells from asthmatics. Chin Med J (Engl). 2001 Oct;114(10):1051-‐4. 197. Farrell RJ, Murphy A, Long A, Donnelly S, Cherikuri A, O'Toole D, et al. High multidrug resistance (P-‐glycoprotein 170) expression in inflammatory bowel disease patients who fail medical therapy. Gastroenterology. 2000 Feb;118(2):279-‐88. 198. Barnes PJ, Adcock IM. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases. Lancet. 2009 May 30;373(9678):1905-‐17. 199. Pottier N, Yang W, Assem M, Panetta JC, Pei D, Paugh SW, et al. The SWI/SNF chromatin-‐remodeling complex and glucocorticoid resistance in acute lymphoblastic leukemia. J Natl Cancer Inst. 2008 Dec 17;100(24):1792-‐803. 200. Chikanza IC, Kozaci DL. Corticosteroid resistance in rheumatoid arthritis: Molecular and cellular perspectives. Rheumatology (Oxford). 2004 Nov;43(11):1337-‐45. 201. Bantel H, Schmitz ML, Raible A, Gregor M, Schulze-‐Osthoff K. Critical role of NF-‐kappaB and stress-‐activated protein kinases in steroid unresponsiveness. FASEB J. 2002 Nov;16(13):1832-‐4. 202. Dinarello CA. Blocking IL-‐1 in systemic inflammation. J Exp Med. 2005 May 2;201(9):1355-‐9.
182
203. Franchimont D, Martens H, Hagelstein MT, Louis E, Dewe W, Chrousos GP, et al. Tumor necrosis factor alpha decreases, and interleukin-‐10 increases, the sensitivity of human monocytes to dexamethasone: Potential regulation of the glucocorticoid receptor. J Clin Endocrinol Metab. 1999 Aug;84(8):2834-‐9. 204. Flaster H, Bernhagen J, Calandra T, Bucala R. The macrophage migration inhibitory factor-‐glucocorticoid dyad: Regulation of inflammation and immunity. Mol Endocrinol. 2007 Jun;21(6):1267-‐80. 205. Ishiguro Y, Ohkawara T, Sakuraba H, Yamagata K, Hiraga H, Yamaguchi S, et al. Macrophage migration inhibitory factor has a proinflammatory activity via the p38 pathway in glucocorticoid-‐resistant ulcerative colitis. Clin Immunol. 2006 Sep;120(3):335-‐41. 206. Daun JM, Cannon JG. Macrophage migration inhibitory factor antagonizes hydrocortisone-‐induced increases in cytosolic IkappaBalpha. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2000 Sep;279(3):R1043-‐9. 207. Roger T, Chanson AL, Knaup-‐Reymond M, Calandra T. Macrophage migration inhibitory factor promotes innate immune responses by suppressing glucocorticoid-‐induced expression of mitogen-‐activated protein kinase phosphatase-‐1. Eur J Immunol. 2005 Dec;35(12):3405-‐13. 208. Santaolalla R, Mane J, Pedrosa E, Loren V, Fernandez-‐Banares F, Mallolas J, et al. Apoptosis resistance of mucosal lymphocytes and IL-‐10 deficiency in patients with steroid-‐ refractory crohn's disease. Inflamm Bowel Dis. 2011 Jul;17(7):1490-‐500. 209. Correa I, Veny M, Esteller M, Pique JM, Yague J, Panes J, et al. Defective IL-‐10 production in severe phenotypes of crohn's disease. J Leukoc Biol. 2009 May;85(5):896-‐903. 210. Xystrakis E, Kusumakar S, Boswell S, Peek E, Urry Z, Richards DF, et al. Reversing the defective induction of IL-‐10-‐secreting regulatory T cells in glucocorticoid-‐resistant asthma patients. J Clin Invest. 2006 Jan;116(1):146-‐55. 211. Ina K, Itoh J, Fukushima K, Kusugami K, Yamaguchi T, Kyokane K, et al. Resistance of crohn's disease T cells to multiple apoptotic signals is associated with a bcl-‐2/Bax mucosal imbalance. J Immunol. 1999 Jul 15;163(2):1081-‐90. 212. Zen M, Canova M, Campana C, Bettio S, Nalotto L, Rampudda M, et al. The kaleidoscope of glucorticoid effects on immune system. Autoimmun Rev. 2011 Apr;10(6):305-‐10.
183
213. Reichardt SD, Foller M, Rexhepaj R, Pathare G, Minnich K, Tuckermann JP, et al. Glucocorticoids enhance intestinal glucose uptake via the dimerized glucocorticoid receptor in enterocytes. Endocrinology. 2012 Apr;153(4):1783-‐94. 214. Artursson P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (caco-‐2) cells. J Pharm Sci. 1990 Jun;79(6):476-‐82. 215. Grasset E, Pinto M, Dussaulx E, Zweibaum A, Desjeux JF. Epithelial properties of human colonic carcinoma cell line caco-‐2: Electrical parameters. Am J Physiol. 1984 Sep;247(3 Pt 1):C260-‐7. 216. Lu S, Gough AW, Bobrowski WF, Stewart BH. Transport properties are not altered across caco-‐2 cells with heightened TEER despite underlying physiological and ultrastructural changes. J Pharm Sci. 1996 Mar;85(3):270-‐3. 217. van Sommeren S, Visschedijk MC, Festen EA, de Jong DJ, Ponsioen CY, Wijmenga C, et al. HNF4alpha and CDH1 are associated with ulcerative colitis in a dutch cohort. Inflamm Bowel Dis. 2011 Aug;17(8):1714-‐8. 218. Wapenaar MC, Monsuur AJ, van Bodegraven AA, Weersma RK, Bevova MR, Linskens RK, et al. Associations with tight junction genes PARD3 and MAGI2 in dutch patients point to a common barrier defect for coeliac disease and ulcerative colitis. Gut. 2008 Apr;57(4):463-‐ 7. 219. Buning C, Geissler N, Prager M, Sturm A, Baumgart DC, Buttner J, et al. Increased small intestinal permeability in ulcerative colitis: Rather genetic than environmental and a risk factor for extensive disease? Inflamm Bowel Dis. 2012 Oct;18(10):1932-‐9. 220. Arrieta MC, Madsen K, Doyle J, Meddings J. Reducing small intestinal permeability attenuates colitis in the IL10 gene-‐deficient mouse. Gut. 2009 Jan;58(1):41-‐8. 221. Maynard CL, Weaver CT. Diversity in the contribution of interleukin-‐10 to T-‐cell-‐ mediated immune regulation. Immunol Rev. 2008 Dec;226:219-‐33. 222. Pedrosa E, Loren V, Cabre E, Domenech E, Ojanguren I, Gassull MA, et al. Bacteria and spontaneous experimental colitis: Immunological changes. Eur J Clin Invest. 2011 Oct;41(10):1047-‐53.
184
223. Pickert G, Neufert C, Leppkes M, Zheng Y, Wittkopf N, Warntjen M, et al. STAT3 links IL-‐ 22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. J Exp Med. 2009 Jul 6;206(7):1465-‐72. 224. Neufert C, Pickert G, Zheng Y, Wittkopf N, Warntjen M, Nikolaev A, et al. Activation of epithelial STAT3 regulates intestinal homeostasis. Cell Cycle. 2010 Feb 15;9(4):652-‐5. 225. Sun X, Yang H, Nose K, Nose S, Haxhija EQ, Koga H, et al. Decline in intestinal mucosal IL-‐10 expression and decreased intestinal barrier function in a mouse model of total parenteral nutrition. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2008 Jan;294(1):G139-‐47. 226. Boivin MA, Ye D, Kennedy JC, Al-‐Sadi R, Shepela C, Ma TY. Mechanism of glucocorticoid regulation of the intestinal tight junction barrier. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Feb;292(2):G590-‐8. 227. Dauletbaev N, Eklove D, Mawji N, Iskandar M, Di Marco S, Gallouzi IE, et al. Down-‐ regulation of cytokine-‐induced interleukin-‐8 requires inhibition of p38 mitogen-‐activated protein kinase (MAPK) via MAPK phosphatase 1-‐dependent and -‐independent mechanisms. J Biol Chem. 2011 May 6;286(18):15998-‐6007. 228. King EM, Holden NS, Gong W, Rider CF, Newton R. Inhibition of NF-‐kappaB-‐dependent transcription by MKP-‐1: Transcriptional repression by glucocorticoids occurring via p38 MAPK. J Biol Chem. 2009 Sep 25;284(39):26803-‐15. 229. Docena G, Rovedatti L, Kruidenier L, Fanning A, Leakey NA, Knowles CH, et al. Down-‐ regulation of p38 mitogen-‐activated protein kinase activation and proinflammatory cytokine production by mitogen-‐activated protein kinase inhibitors in inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol. 2010 Oct;162(1):108-‐15. 230. Waetzig GH, Seegert D, Rosenstiel P, Nikolaus S, Schreiber S. p38 mitogen-‐activated protein kinase is activated and linked to TNF-‐alpha signaling in inflammatory bowel disease. J Immunol. 2002 May 15;168(10):5342-‐51. 231. Hommes D, van den Blink B, Plasse T, Bartelsman J, Xu C, Macpherson B, et al. Inhibition of stress-‐activated MAP kinases induces clinical improvement in moderate to severe crohn's disease. Gastroenterology. 2002 Jan;122(1):7-‐14. 232. Malamut G, Cabane C, Dubuquoy L, Malapel M, Derijard B, Gay J, et al. No evidence for an involvement of the p38 and JNK mitogen-‐activated protein in inflammatory bowel diseases. Dig Dis Sci. 2006 Aug;51(8):1443-‐53.
185
233. Nishimura T, Andoh A, Nishida A, Shioya M, Koizumi Y, Tsujikawa T, et al. FR167653, a p38 mitogen-‐activated protein kinase inhibitor, aggravates experimental colitis in mice. World J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5851-‐6. 234. ten Hove T, van den Blink B, Pronk I, Drillenburg P, Peppelenbosch MP, van Deventer SJ. Dichotomal role of inhibition of p38 MAPK with SB 203580 in experimental colitis. Gut. 2002 Apr;50(4):507-‐12. 235. Hollenbach E, Vieth M, Roessner A, Neumann M, Malfertheiner P, Naumann M. Inhibition of RICK/nuclear factor-‐kappaB and p38 signaling attenuates the inflammatory response in a murine model of crohn disease. J Biol Chem. 2005 Apr 15;280(15):14981-‐8. 236. Maheshwari A, Lu W, Guida WC, Christensen RD, Calhoun DA. IL-‐8/CXC ligand 8 survives neonatal gastric digestion as a result of intrinsic aspartyl proteinase resistance. Pediatr Res. 2005 Mar;57(3):438-‐44. 237. Yew TL, Hung YT, Li HY, Chen HW, Chen LL, Tsai KS, et al. Enhancement of wound healing by human multipotent stromal cell conditioned medium: The paracrine factors and p38 MAPK activation. Cell Transplant. 2011;20(5):693-‐706. 238. Otsuka M, Kang YJ, Ren J, Jiang H, Wang Y, Omata M, et al. Distinct effects of p38alpha deletion in myeloid lineage and gut epithelia in mouse models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2010 Apr;138(4):1255,65, 1265.e1-‐9. 239. Yu J, Liu F, Yin P, Zhao H, Luan W, Hou X, et al. Involvement of oxidative stress and mitogen-‐activated protein kinase signaling pathways in heat stress-‐induced injury in the rat small intestine. Stress. 2012 May 9. 240. Wakeman D, Guo J, Santos JA, Wandu WS, Schneider JE, McMellen ME, et al. p38 MAPK regulates bax activity and apoptosis in enterocytes at baseline and after intestinal resection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012 May 1;302(9):G997-‐1005. 241. Chaturvedi LS, Marsh HM, Basson MD. Role of RhoA and its effectors ROCK and mDia1 in the modulation of deformation-‐induced FAK, ERK, p38, and MLC motogenic signals in human caco-‐2 intestinal epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2011 Nov;301(5):C1224-‐ 38. 242. Homer CR, Kabi A, Marina-‐Garcia N, Sreekumar A, Nesvizhskii AI, Nickerson KP, et al. A dual role for receptor-‐interacting protein kinase 2 (RIP2) kinase activity in nucleotide-‐binding oligomerization domain 2 (NOD2)-‐dependent autophagy. J Biol Chem. 2012 Jul 20;287(30):25565-‐76.
186
243. Dai C, Zhao DH, Jiang M. VSL#3 probiotics regulate the intestinal epithelial barrier in vivo and in vitro via the p38 and ERK signaling pathways. Int J Mol Med. 2012 Feb;29(2):202-‐ 8. 244. Segawa S, Fujiya M, Konishi H, Ueno N, Kobayashi N, Shigyo T, et al. Probiotic-‐derived polyphosphate enhances the epithelial barrier function and maintains intestinal homeostasis through integrin-‐p38 MAPK pathway. PLoS One. 2011;6(8):e23278. 245. Ueno N, Fujiya M, Segawa S, Nata T, Moriichi K, Tanabe H, et al. Heat-‐killed body of lactobacillus brevis SBC8803 ameliorates intestinal injury in a murine model of colitis by enhancing the intestinal barrier function. Inflamm Bowel Dis. 2011 Nov;17(11):2235-‐50. 246. Santaolalla R., Mañé J., Pedrosa E., Lorén V., Mallolas F., Carrasco A., et al. IL-‐ 10/TNFalpha antagonism in the intestinal mucosa od IBD patients. relation with steroid response. Gastroenterology 2009; 136 (suppl1); S1746. 2009;136 (Suppl). 247. Taddei A, Giampietro C, Conti A, Orsenigo F, Breviario F, Pirazzoli V, et al. Endothelial adherens junctions control tight junctions by VE-‐cadherin-‐mediated upregulation of claudin-‐ 5. Nat Cell Biol. 2008 Aug;10(8):923-‐34. 248. Schlegel N, Meir M, Heupel WM, Holthofer B, Leube RE, Waschke J. Desmoglein 2-‐ mediated adhesion is required for intestinal epithelial barrier integrity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010 May;298(5):G774-‐83. 249. Mao X, Sano Y, Park JM, Payne AS. p38 MAPK activation is downstream of the loss of intercellular adhesion in pemphigus vulgaris. J Biol Chem. 2011 Jan 14;286(2):1283-‐91. 250. Lee HE, Berkowitz P, Jolly PS, Diaz LA, Chua MP, Rubenstein DS. Biphasic activation of p38MAPK suggests that apoptosis is a downstream event in pemphigus acantholysis. J Biol Chem. 2009 May 1;284(18):12524-‐32.
187